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CN116555046A - 一种裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法 - Google Patents

一种裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法 Download PDF

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CN116555046A
CN116555046A CN202310529409.1A CN202310529409A CN116555046A CN 116555046 A CN116555046 A CN 116555046A CN 202310529409 A CN202310529409 A CN 202310529409A CN 116555046 A CN116555046 A CN 116555046A
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fermentation
glucan
mycelium
beta
schizophyllum commune
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CN202310529409.1A
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杨震寰
杨志豪
刘青
周菲
陈其龙
王吉超
张树义
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Original Assignee
Shanghai Jiakai Biological Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种裂褶菌深层发酵高产β‑葡聚糖的方法，具体包括将斜面培养的裂褶菌制成菌丝体水悬液后直接加入发酵培养基中进行分段控制发酵培养的步骤。该方法首次采用菌丝体水悬液直接进行发酵培养来生产发酵产物，省略了对菌株进行传代培养、种子培养等步骤，大大提高了生产效率、节约了成本，可广泛应用于真菌、霉菌和部分放线菌的发酵培养中；以及通过采用特定种类的缓冲盐和加入特定的代谢调控因子的改良培养基，并进行分段溶氧控制，大大提高了β‑葡聚糖的产量。本发明还进一步通过采用“交替五柱联用系统”进行纯化，实现脱色、脱盐、脱蛋白、去离子，得到澄清透明的β‑葡聚糖溶液，可直接进行后续应用。

Description

一种裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵培养技术领域，具体涉及一种裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法，尤其涉及一种裂褶菌深层发酵培养基及高产β-葡聚糖的方法。
背景技术
裂褶菌(Schizophyllum commune)，属担子菌纲伞菌目裂褶菌科裂褶菌属，子实体可供药用，嫩时亦可食用。我国很多省市均有分布，资源十分丰富。裂褶菌产的β-葡聚糖具有增强免疫力、抗肿瘤以及保湿功效等，能应用于化妆品、医药等领域。
现有的利用裂褶菌生产β-葡聚糖的方法中，如专利文献CN111440832A提供了一种高产生物多糖的真菌培养方法，其通过采用改良PDA固体培养基进行传代，以及在种子培养基和/或发酵培养基中加入固型不容物等，改变裂褶菌在平板上的生长状态和活性，从而提高后期发酵培养β-葡聚糖的产量(7-100g/L)。但该方法需经过传代培养、摇瓶培养等繁琐操作后才进行发酵培养，整个生产周期很长，至少要20天；而且其记载的进行多糖测试的方法是将发酵液(不确定是否包含裂褶菌)先80度煎煮4小时，发酵前培养基也高温灭菌，这两点都可以提取出培养基(如玉米淀粉)中的多糖，因此其测定的多糖产量不准确，并不都是由裂褶菌所产生的β-葡聚糖；此外，其采用的培养基成分不利于菌种形态的观察，同时豆粕粗粉经微生物发酵水解会产生活性肽类，玉米粗粉和玉米芯粗粉含有多糖、脂肪等，均为多糖后续的纯化带来困难。
专利文献CN107557407A中提供了一种调控裂褶菌发酵产物裂褶多糖分子量的方法，通过采用斜面接种培养、制备发酵种子液、将种子液进行发酵培养，再进行分离纯化得到精制裂褶多糖。该方法虽然无传代培养，但仍然需进行发酵种子液的制备；且我们前期研究证实采用该方法制得的发酵液中β-葡聚糖的产量不高(达不到本发明的多糖含量)；此外其纯化步骤采用浓缩、醇沉、复溶工艺，浓缩增加能耗，醇沉、复溶使用大量乙醇，却不能确保绝对无乙醇残留。
综上可见，现有通过裂褶菌发酵生产β-葡聚糖的方法，要么制备的发酵液中β-葡聚糖的含量不高(在2g/L到8g/L不等)；要么生产步骤繁多、生产周期长。未见有兼顾高产量和生产周期短的β-葡聚糖制备方法。此外，现有的裂褶菌发酵生产β-葡聚糖的方法中，采用的纯化制备工艺应用于工业化生产中也存在一些缺陷，如工序繁琐，耗时较长，使用较多的有机溶剂，不够环保等。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种菌丝体水悬液在菌株发酵培养中的应用，所述菌丝体水悬液通过以下方法制备得到：
将菌株接种至斜面培养基上，培养4-10天后，加入无菌水，并刮取斜面培养基上生长的菌苔至无菌水中，收集含有菌苔的无菌水，即得菌丝体水悬液。
作为优选方案，所述菌株包括真菌、霉菌、放线菌中的至少一种。例如，基于前述方法用于生产多糖(包含β-葡聚糖和/或杂多糖)时，所述真菌选自裂褶菌(Schizophyllumcommune)、灰树花(Polyporus frondosus)、绣球菌(Sparassis crispa)、灵芝(Ganoderma lucidum)、冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、羊肚菌(Morchellaesculenta)；
所述霉菌选自少孢根霉菌(Rhizonus oligosporus)、哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)、米根霉(Rhizopus oryzae)；
所述放线菌选自链霉菌(streptomyces spp.)、嗜盐多孢放线菌(Actinopolyspora halophila)、嗜酸放线菌(Acidophilic actinomycetes)。
作为优选方案，基于前述方法用于生产β-葡聚糖时，所述真菌选自裂褶菌(Schizophyllum commune)、绣球菌(Sparassis crispa)、灰树花(Polyporus frondosus)。
第二方面，本发明提供了一种基于菌丝体水悬液的发酵培养方法，包括以下步骤：
A、菌丝体水悬液的制备：将菌株接种至斜面培养基上，培养4-10天后，加入无菌水，并刮取斜面培养基上生长的菌苔至无菌水中，收集含有菌苔的无菌水，即得菌丝体水悬液；
B、菌丝体水悬液的发酵培养：将菌丝体水悬液接种至发酵培养基中，发酵培养4-10天，得发酵产物。
第三方面，本发明提供了一种基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
S1、菌丝体水悬液的制备：将裂褶菌接种至斜面培养基上，斜面培养5-7天后，加入无菌水，并刮取斜面培养基上生长的菌苔至无菌水中，收集含有菌苔的无菌水，即得菌丝体水悬液；
S2、菌丝体水悬液的发酵培养：将菌丝体水悬液接种至含有裂褶菌深层发酵培养基的第一组分的发酵罐中，进行第一阶段发酵培养；然后在发酵罐中加入裂褶菌深层发酵培养基的第二组分，进行第二阶段发酵培养，即得含β-葡聚糖的发酵液。
作为优选方案，步骤S1中，所述斜面培养基的制备方法为：将去皮马铃薯切块后加入水中煮沸20-40min，然后用纱布过滤，所得滤液中加入葡萄糖、酵母浸粉、琼脂粉，加热搅拌溶解后，加水定量；
所述斜面培养的温度为26-30℃；
所述无菌水的加入体积与斜面培养基的体积的比例为1:0.8-1.2。
作为优选方案，步骤S2中，所述菌丝体水悬液与裂褶菌深层发酵培养基的第一组分的体积比为0.5-0.7:35；
所述裂褶菌深层发酵培养基的第一组分包括以下浓度的各组成成分：葡萄糖25-30g/L、酵母浸粉2-6g/L、缓冲盐0.5-1.0g/L、七水硫酸镁0.2-0.5g/L、其余为水；
所述裂褶菌深层发酵培养基的第二组分为代谢调控因子，所述代谢调控因子的终浓度为0.5-5ppm。
作为优选方案，所述第一阶段发酵培养的条件为：发酵温度26-30℃、溶解氧70-80％、培养时间3-4天；
作为优选方案，所述第二阶段发酵培养的条件为：发酵温度26-30℃、溶解氧15-25％、培养时间1-3天。
作为优选方案，所述溶解氧通过控制搅拌转速和通风量来调节；例如所述第一阶段发酵培养时，控制搅拌转速100-200rpm、通风量1.8-5.5m3/h，使溶解氧为70-80％；所述第二发酵培养时，控制搅拌转速50-120rpm、通风量1.0-3.0m3/h，使溶解氧为15-25％。
作为优选方案，所述代谢调控因子选自腺嘌呤核苷酸、对氨基苯甲酸、叶酸、潘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸中的一种或几种；
所述缓冲盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种。
作为进一步优选方案，所述代谢调控因子选自腺嘌呤核苷酸、对氨基苯甲酸、叶酸中的一种或几种，其可进一步提高β-葡聚糖的产量。
作为进一步优选方案，所述缓冲盐选自磷酸氢二钾，其可进一步提高β-葡聚糖的产量。在本发明的前期试验中发现，缓冲盐种类选择对β-葡聚糖产量高低的结果为：磷酸氢二钾高于磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
作为优选方案，所述方法还包括以下步骤：
S3、将含β-葡聚糖的发酵液灭活后离心，所得离心液通入“交替五柱联用系统”中进行纯化，精滤后即得无色透明的β-葡聚糖液体；
所述“交替五柱联用系统”包括串联设置的颗粒活性炭柱、阴离子交换树脂柱、第一大孔吸附树脂柱、阳离子交换树脂柱、第二大孔吸附树脂柱；各柱子的连接顺序可任意调整。在本发明前期的实验中发现，若采用的柱子缺少一种或多种时、树脂柱的种类进行替换时，均会导致纯化效果变差，要么颜色偏深，要么多糖损耗大，要么蛋白去除效果不佳等。
作为进一步优选方案，所述“交替五柱联用系统”包括依次设置的颗粒活性炭柱、阴离子交换树脂柱、第一大孔吸附树脂柱、阳离子交换树脂柱、第二大孔吸附树脂柱。
作为优选方案，所述颗粒活性炭柱的径高比为1:4-1:6，更优选1:5，采用的颗粒活性炭为8-30目木质活性炭、果壳活性炭、煤质活性炭中的至少一种；
所述阴离子交换树脂柱的径高比为1:4-1:6，更优选1:5，采用的阴离子交换树脂选自含有-N(CH3)2的阴离子交换树脂，且碱性弱于强碱型阴离子交换树脂；例如D301。
所述阳离子交换树脂柱的径高比为1:4-1:6，更优选1:5，采用的阳离子交换树脂选自带有羧酸基团阳离子交换树脂；例如D113。
所述第一大孔吸附树脂柱和第二大孔吸附树脂柱的径高比均为1:2-1:4，更优选1:3，且均选自HYA系列树脂。例如第一大孔吸附树脂柱为HYA106，第二大孔吸附树脂柱为HYA605。
作为优选方案，所述精滤采用0.45μm聚丙烯膜精滤。
本发明采用的“交替五柱联用系统”中，首先通过颗粒活性炭柱对离心液进行去部分色素和杂质，然后通过阴离子交换树脂柱进行去离子，再通过第一大孔吸附树脂柱进行去部分色素和蛋白，再通过阳离子交换树脂柱进行去离子，再通过第二大孔吸附树脂柱进行去气味，最后过0.45μm聚丙烯膜精滤，从而达到了去离子、去蛋白、去色、去气味以及澄清等目的，制得的β-葡聚糖溶液澄清透明，β-葡聚糖含量在1.5％以上，且该溶液无需进行干燥、粉碎及复溶等处理即可直接应用。
第二方面，本发明提供了一种裂褶菌深层发酵培养基，包括第一组分和第二组分，所述第一组分包括以下浓度的各组成成分：葡萄糖25-30g/L、酵母浸粉2-6g/L、缓冲盐0.5-1.0g/L、七水硫酸镁0.2-0.5g/L、水补足定量；
所述第二组分为代谢调控因子，所述代谢调控因子的终浓度为0.5-5ppm；
其中，所述代谢调控因子选自腺嘌呤核苷酸、对氨基苯甲酸、叶酸、潘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸中的一种或几种；
所述缓冲盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种。
作为优选方案，所述代谢调控因子选自腺嘌呤核苷酸、对氨基苯甲酸、叶酸中的一种或几种。更优选所述代谢调控因子为叶酸；所述缓冲盐为磷酸氢二钾。
与现有技术相比，本发明具有如下的显著效果：
1.本发明首次将仅经过活化的斜面培养菌株悬浮于水中形成菌丝体水悬液后，直接进行发酵培养来生产发酵产物，该方法省略了对菌株进行传代培养、种子培养等步骤，大大提高了生产效率、节约了成本，可广泛应用于真菌、霉菌和部分放线菌的发酵培养中。且采用菌丝直接制备菌丝水悬液可以使菌种快速适用在液体培养基中生长，缩短在液体培养基中的迟缓期，省去摇瓶培养周期，避免了过多的操作步骤而带来的菌种染菌风险。
2.本发明基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵培养生产β-葡聚糖的方法中，通过改良发酵培养基配方，采用特定种类的缓冲盐，以及加入特定的代谢调控因子，大大提高了β-葡聚糖的产量。其中采用磷酸氢二钾既作为磷、钾矿物元素，又起到对数期pH值的适当缓冲；这一技术的好处是使菌种在对数期在缓冲剂的作用下，维持更适宜的pH值生长环境，使其快速增殖，到了稳定期pH值能维持相对的弱酸性，以抑制裂褶菌继续疯狂繁殖，同时刺激胞外多糖的分泌。而采用代谢调控因子可以促进胞外多糖的高效合成，最终达到胞外多糖的高产。
3.本发明基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵培养生产β-葡聚糖的方法中，进一步通过分段控制发酵技术，在裂褶菌生长对数期通过调整转速和通风量使发酵液有较高的溶氧(80-70％)，促使菌体快速生长；在裂褶菌生长稳定期通过调整转速和通风量使发酵液有较低的溶氧(25-15％)，可以抑制裂褶菌继续疯狂繁殖，刺激菌体分泌胞外多糖。由此可进一步提高β-葡聚糖的产量。
4.本发明进一步针对发酵液的纯化，提供了一种将发酵液灭活离心后，采用“交替五柱联用系统”进行吸附的方法，经吸附后即可实现脱色、脱盐、脱蛋白、去离子，得到澄清透明的β-葡聚糖溶液。该纯化过程操作简单，生产效率高，低能耗，不用有机溶剂。同时，可实现从发酵培养到纯化制备自动化，亦可选择手动操作。此外，相比现有方法中采用浸煮液固液分离，活性炭吸附后再次固液分离，清液醇沉干燥，所得β-葡聚糖需经粉碎后复溶进行应用；采用本发明纯化方法得到的β-葡聚糖溶液可直接进行后续的应用，而无需进行干燥、粉碎、复溶等操作。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中采用的“交替五柱联用系统”的示意图；
图2为实施例1采用“交替五柱联用系统”进行纯化前的离心液和纯化后的β-葡聚糖液体照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
在本发明的研究之前，现有报道的裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖及其纯化制备工艺中，大多数发酵培养工艺是通过改良培养基组分，特别是改良活化、传代固体培养基，来改变菌种的生长状态和活性，此外，对上发酵罐培养的菌悬液基本按传统摇瓶菌悬液。纯化制备工艺大多是发酵液或菌丝体浸煮、固液分离、活性炭脱色、再次固液分离、浓缩后或直接醇沉、最后干燥或进一步复溶，本质上没有跳出传统发酵培养与纯化制备工艺设计思路。
而在本发明的研究中，大胆创新地对上发酵罐培养的菌悬液进行了替换，采用斜面菌丝水悬液作为发酵培养菌种，避免了多个摇瓶、多量菌悬液转接的繁琐操作和长时间摇瓶培养。进一步通过改良发酵培养基的配方，以采用特定缓冲盐(如磷酸氢二钾)和代谢调控因子可实现裂褶菌快速生长和促进胞外多糖高效合成来提高β-葡聚糖的产量；以及还进一步通过分段调控发酵过程中的溶解氧含量，进一步达到提高β-葡聚糖的产量的效果。本发明深层发酵培养后得到的发酵液中β-葡聚糖产量在10g/L以上，更佳产量在18g/L以上，最佳产量达到了23g/L。
本发明的研究中，还对发酵液纯化的方法进行了改进，摒弃了传统的纯化步骤，仅通过特定的“交替五柱联用系统”依次进行交换和吸附，最后膜精滤，即可实现脱色、去味、去蛋白、去离子等目的，最终得无色无味且澄清的β-葡聚糖溶液，该方法有效规避了有机溶剂的使用和辅料超微粒残留问题，可实现连续化生产，降低了劳动强度、提高了生产效率。且纯化后获得的β-葡聚糖溶液可直接进行后续的应用。
以下实施例中，斜面培养基的制备方法为现有PDA培养基的配制方法。
以下实施例中，进行β-葡聚糖含量测定采用的具体方法如下：
1.苯酚-硫酸法测总糖含量
精密称取无水葡萄糖标准品10mg，置100ml容量瓶中，加水溶解定容至刻度，得对照品溶液。
取7组试管，除空白为1支外，其余6组每组均为2支平行试管。精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.4ml分别置具塞比色管中，分别加水补至2.0ml。空白管加水2.0ml。然后各管精密加入5％苯酚溶液1ml，摇匀。迅速精密加入硫酸5ml，盖上塞盖摇匀，沸水浴中放置15分钟，冷却至室温后，在490nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。
分别取供试品(各实施例和对比例制备的发酵液、纯化后的β-葡聚糖溶液)0.2ml,置于两个具塞试管中，各加水补至2.0ml。然后各管精密加入5％苯酚溶液1ml，摇匀。迅速精密加入硫酸5ml，盖上塞盖摇匀，沸水浴中放置15分钟，冷却至室温后，测490nm波长处的吸光度。根据标准曲线计算供试品中的总糖含量。
2.生物传感仪法测游离葡萄糖含量
利用SBA-40E生物传感分析仪(山东省科学研究生物研究所)，按照仪器说明书的步骤直接测定供试品中游离葡萄糖的含量。
3.β-葡聚糖含量计算
采用以下公式计算得到β-葡聚糖含量，该含量单位为百分比。
β-葡聚糖含量＝总糖含量-游离葡萄糖含量
以下实施例中，进行固含量测定采用的具体方法如下：
称取发酵液1g左右(准确至0.001g)，置于已恒重的蒸发皿中，放入105±2℃烘箱中，干燥4h。取出放入干燥器中，冷却至室温，称重。重复干燥，每次干燥时间1h，直至连续两次干燥后的重量差异在5mg以下。按下式计算固含量:
式中：X—固含量，％；
m1—空蒸发皿重量，g；
m2—烘至恒重后蒸发皿与固含物重量，g；
m—发酵液取样量，g。
以下实施例中，进行电导率测定采用的具体方法如下：
利用雷磁DDS-307电导率仪直接测量。
以下实施例中，进行蛋白质含量测定采用的具体方法如下：
《中国药典》2020版4部，通则0731蛋白质含量测定法(第二法，福林酚法)。
以下实施例中，所采用的叶酸、对氨基苯甲酸、腺嘌呤核苷酸、潘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸均为市售原料，通过购买得到。具体使用时，先将购买得到的固体原料配成一定浓度的溶液，再将各溶液加入到发酵罐中。
实施例1
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵培养生产β-葡聚糖的方法，具体步骤如下：
1.制备裂褶菌菌丝体水悬液
(1)斜面培养基的制备：称取去皮马铃薯120g，切成小块，加纯水500ml煮沸30min，然后用2层纱布过滤。向所得滤液中加入葡萄糖12g、酵母浸粉3g预热搅拌溶解后，最后加琼脂粉11g，加热搅拌溶化后补水至600ml。将培养基趁热分装到干灭好的试管中，装液量40ml/试管，最后塞好试管硅胶泡沫塞，分装15支。经121℃、30min湿灭后摆斜面，斜面摆至试管2/3处定型。
(2)斜面培养：从活化斜面菌种用接种钩挑取一小块裂褶菌菌苔(各实施例采用的均为“菌株编号：CICC 2591，来源中国工业微生物菌种保藏管理中心”的裂褶菌)接入斜面置底部，塞好试管硅胶泡沫塞，如此逐支接完15支斜面,放生化培养箱，28℃培养6天。
(3)菌丝体水悬液制备：取干灭后的试管15支，分别加纯水40ml/支，塞好硅胶泡沫塞。121℃，30min湿灭成无菌水，放凉后，每支斜面倒一支40ml的无菌水，用接种刮，刮取菌苔入无菌水中，最后集中于1000ml无菌三角瓶(菌丝水悬液600ml)，塞好硅胶泡沫塞，冷藏备用。
2.菌丝体发酵罐悬浮培养
(1)培养基制备：称取葡萄糖1.0kg、酵母浸粉105g、磷酸氢二钾26.3g、七水硫酸镁13.1g，纯水溶解后，转移至50L发酵罐中，并用纯水定容至35L，经115℃，20min灭菌后，降温至28℃后，接入菌丝水悬液600ml。
(2)50L罐发酵：0—80h，控制温度28℃、转速170rpm、通风量2.0m3/h培养(溶氧在80％-70％)。到80h时以补料形式加入单一的叶酸溶液(加入终浓度为3ppm)，80—120h温度保持28℃、转速110rpm、通风量1.2m3/h培养(溶氧25％-15％)。120h停止发酵。此时发酵液中β-葡聚糖产量达2.3％，即23g/L，具有特征性气味，颜色棕黄色，电导率3900μS/cm，蛋白质含量0.62％。
3.β-葡聚糖纯化
将发酵液加热到90℃，保温30min灭活。然后通过管道输入碟片离心机离心，离心液(图2所示纯化前的离心液，颜色为黄色)进入储液罐，再泵入“交替五柱联用系统”，即依次连接的颗粒活性炭柱(径高比1:5，8-30目木质活性炭，尺寸为100*500mm)、阴离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D301，尺寸为100*500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA106，尺寸为100*300mm)、阳离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D113，尺寸为100*500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA605，尺寸为100*300mm)进行处理(控制流速为3-4BV/h)，最后0.45μm膜精滤，即得β-葡聚糖液体产品，固含量2.1％，所得产品中β-葡聚糖含量为1.9％，无色无味透明(图2所示的纯化后的β-葡聚糖液体，颜色为无色)，电导率37μS/cm，蛋白质含量0.12％，可以直接应用。
实施例2
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵培养生产β-葡聚糖的方法，具体步骤如下：
1.制备裂褶菌菌丝体水悬液
(1)斜面培养基的制备：称取去皮马铃薯120g，切成小块，加纯水500ml煮沸30min，然后用2层纱布过滤。向所得滤液中加入葡萄糖12g、酵母浸粉3g预热搅拌溶解后，最后加琼脂粉11g，加热搅拌溶化后补水至600ml。将培养基趁热分装到干灭好的试管中，装液量40ml/试管，最后塞好试管硅胶泡沫塞，分装15支。经121℃、30min湿灭后摆斜面，斜面摆至试管2/3处定型。
(2)斜面培养：从活化斜面菌种用接种钩挑取一小块菌苔接入斜面置底部，塞好试管硅胶泡沫塞，如此逐支接完15支斜面,放生化培养箱，29℃培养5天。
(3)菌丝体水悬液制备：取干灭后的试管15支，分别加纯水40ml/支，塞好硅胶泡沫塞。121℃，30min湿灭成无菌水，放凉后，每支斜面倒一支40ml的无菌水，用接种刮，刮取菌苔入无菌水中，最后集中于1000ml无菌三角瓶(菌丝水悬液600ml)，塞好硅胶泡沫塞，冷藏备用。
2.菌丝体发酵罐悬浮培养
(1)培养基制备：称取葡萄糖0.875kg、酵母浸粉70g、磷酸氢二钾17.5g、七水硫酸镁7g，纯水溶解后，转移至50L发酵罐中，并用纯水定容至35L，经115℃，20min灭菌后，降温至29℃后，接入菌丝水悬液600ml。
(2)50L罐发酵0—80h，控制温度29℃、转速200rpm、通风量2.2m3/h培养(溶氧在80％-70％)。到80h时以补料形式加入单一的对氨基苯甲酸溶液(终浓度0.5ppm)，80—120h温度保持29℃、转速120rpm、通风量1.5m3/h培养(溶氧25％-15％)。120h停止发酵。此时发酵液中β-葡聚糖产量1.8％，即18g/L，具有特征性气味，颜色黄色，电导率3870μS/cm，蛋白质含量0.60％。
3.β-葡聚糖纯化
将发酵液加热到90℃，保温30min灭活。然后通过管道输入碟片离心机离心，离心液进入储液罐，再泵入“交替五柱联用系统”即依次连接的颗粒活性炭柱(径高比1:5，8-30目木质活性炭，尺寸为100*500mm)、阴离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D301，尺寸为100*500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA106，尺寸为100*300mm)、阳离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D113，尺寸为100*500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA605，尺寸为100*300mm)进行处理(控制流速为3-4BV/h)，最后0.45μm膜精滤，即得β-葡聚糖液体产品，固含量1.7％。所得产品中β-葡聚糖含量为1.5％，无色无味透明，电导率32μS/cm，蛋白质含量0.13％，可直接应用。
实施例3
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵培养生产β-葡聚糖的方法，具体步骤如下：
1.制备裂褶菌菌丝体水悬液
(1)斜面培养基的制备：称取去皮马铃薯120g，切成小块，加纯水500ml煮沸30min，然后用2层纱布过滤。向所得滤液中加入葡萄糖12g、酵母浸粉3g预热搅拌溶解后，最后加琼脂粉11g，加热搅拌溶化后补水至600ml。将培养基趁热分装到干灭好的试管中，装液量40ml/试管，最后塞好试管硅胶泡沫塞，分装15支。经121℃、30min湿灭后摆斜面，斜面摆至试管2/3处定型。
(2)斜面培养：从活化斜面菌种用接种钩挑取一小块菌苔接入斜面置底部，塞好试管硅胶泡沫塞，如此逐支接完15支斜面,放生化培养箱，27℃培养7天。
(3)菌丝体水悬液制备：取干灭后的试管15支，分别加纯水40ml/支，塞好硅胶泡沫塞。121℃，30min湿灭成无菌水，放凉后，每支斜面倒一支40ml的无菌水，用接种刮，刮取菌苔入无菌水中，最后集中于1000ml无菌三角瓶(菌丝水悬液600ml)，塞好硅胶泡沫塞，冷藏备用。
2.菌丝体发酵罐悬浮培养
(1)培养基制备：称取葡萄糖1.05kg、酵母浸粉210g、磷酸氢二钾35g、七水硫酸镁17.5g，纯水溶解后，转移至50L发酵罐中，并用纯水定容至35L，经115℃，20min灭菌后，降温至27℃后，接入菌丝水悬液600ml。
(2)50L罐发酵：0—66h温度27℃、转速150rpm、通风量1.8m3/h培养(溶氧在80％-70％)。
(3)500L罐培养基制备：称取葡萄糖10.5kg、酵母浸粉2.1kg、磷酸氢二钾350g、七水硫酸镁175g纯水溶解后，转移至500L发酵罐中，用纯水定容350L，经115℃，20min灭菌后，降温至27℃后，将50L发酵罐66h菌龄的菌种转入500L发酵罐；500L发酵罐0—80h温度27℃、转速100rpm、通风量5.5m3/h培养(溶氧80％-70％)。到80h时以补料形式加入单一的腺嘌呤核苷酸溶液(终浓度5ppm)后，80—120h温度保持27℃、转速50rpm、通风量3.0m3/h培养(溶氧25％-15％)。120h停止发酵。此时发酵液中β-葡聚糖产量2.1％，即21g/L，具有特征性气味，颜色黄色，电导率3930μS/cm，蛋白质含量0.57％。
3.β-葡聚糖纯化
将发酵液加热到90℃，保温30min灭活。然后通过管道输入碟片离心机离心，离心液进入储液罐，再泵入“交替五柱联用系统”(如图1所示)，即图1中从左到右依次连接的颗粒活性炭柱(径高比1:5，8-30目木质活性炭，尺寸为300*1500mm)、阴离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D301，尺寸为300*1500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA106，尺寸为300*900mm)、阳离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D113，尺寸为300*1500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA605，尺寸为300*900mm)进行处理(控制流速为3-4BV/h)，最后0.45μm膜精滤，即得β-葡聚糖液体产品，固含量1.9％。所得产品中β-葡聚糖含量为1.7％，无色无味透明，电导率41μS/cm，蛋白质含量0.11％，可直接应用。
实施例4
本对比例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，到80h时以补料形式加入单一的潘氨酸溶液(加入终浓度为3ppm)代替叶酸。发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量1.46％，即14.6g/L。
实施例5
本对比例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，到80h时以补料形式加入单一的N,N-二甲基甘氨酸溶液(加入终浓度为3ppm)代替叶酸。发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量1.37％，即13.7g/L。
实施例6
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：将实施例1得到的发酵液进行后续β-葡聚糖纯化步骤中，采用依次连接的颗粒活性炭柱(径高比1:5，8-30目木质活性炭，尺寸为100*500mm)、阴离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D301，尺寸为100*500mm)、阳离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D113，尺寸100*500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA605，尺寸100*300mm)进行处理(控制流速为3-4BV/h)，最后0.45μm膜精滤，即得β-葡聚糖液体产品。所得产品中β-葡聚糖含量为1.87％，浅黄色，无味透明，电导率35μS/cm，蛋白质含量0.36％。与实施例1相比，采用本实施例的四柱联用系统得到的最终产品的蛋白质含量明显提高，去离子效果相当，脱色效果降低。
实施例7
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：将实施例1得到的发酵液进行后续β-葡聚糖纯化步骤中，采用依次连接的颗粒活性炭柱(径高比1:5，8-30目木质活性炭，尺寸为100*500mm)、阳离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D113，尺寸100*500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA605，尺寸100*300mm)、阴离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D301，尺寸100*500mm)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA106，尺寸100*300mm)进行处理(控制流速为3-4BV/h)，最后0.45μm膜精滤，即得β-葡聚糖液体产品。所得产品中β-葡聚糖含量为1.63％，无色无味透明，电导率40μS/cm，蛋白质含量0.14％。与实施例1相比，采用本实施例的五柱联用系统得到的最终产品的β-葡聚糖含量下降，去离子、去蛋白和脱色效果相当，也能直接应用。
实施例8
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：将实施例1得到的发酵液进行后续β-葡聚糖纯化步骤中，采用依次连接的颗粒活性炭柱(径高比1:5，8-30目木质活性炭，尺寸为100*500)、阳离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为724，尺寸100*500)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA605，尺寸100*300)、阴离子交换树脂柱(径高比1:5，型号为D301，尺寸100*500)、大孔吸附树脂柱(径高比1:3，型号为HYA106，尺寸100*300)进行处理(控制流速为3-4BV/h)，最后0.45μm膜精滤，即得β-葡聚糖液体产品。所得产品中β-葡聚糖含量为1.82％，无色无味透明，电导率900μS/cm，蛋白质含量0.11％。与实施例1相比，采用本实施例的五柱联用系统得到的最终产品的电导率偏高，其他特征相似。
实施例9
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(1)培养基制备中，使用磷酸二氢钾代替磷酸氢二钾，其他培养基成分及发酵参数(包括pH)与实施例1相同。发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量1.1％，即11g/L。
实施例10
本实施例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，发酵液在0-80h时控制溶氧量在60-50％。发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量1.43％，即14.3g/L。
对比例1
本对比例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，发酵液在0-80h时控制溶氧量在25％-15％，在80-120h时控制溶解氧在80％-70％。发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量0.56％，即5.6g/L。
对比例2
本对比例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，发酵液中的溶氧量不做分段控制，始终保持较高溶氧量(80-70％),发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量0.8％，即8g/L。
对比例3
本对比例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，发酵液中的溶氧量不做分段控制，始终保持较低溶氧量(25-15％),发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量0.9％，即9g/L。
对比例4
本对比例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，到80h时不添加代谢调控因子(叶酸),发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量0.6％，即6g/L。
对比例5
本对比例提供了一种裂褶菌深层发酵产β-葡聚糖的方法，与实施例1相比，不同之处仅在于：菌丝体发酵罐悬浮培养的步骤(2)中，到80h时添加磷酸二氢钠(加入终浓度为3ppm)代替代谢调控因子(叶酸),发酵120h后，发酵液中β-葡聚糖产量0.83％，即8.3g/L。
需要说明的是，本发明实施例的方法已证明采用裂褶菌的菌丝制备菌丝水悬液，然后将该菌丝水悬液直接发酵培养即可制备得到发酵产物。基于相同的原理，该方法也可应用于其他真菌、霉菌和部分放线菌的菌丝水悬液制备，并可同样应用于其发酵培养中来获得发酵产物，以此大大提高生产效率。本发明不再一一列举。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种菌丝体水悬液在菌株发酵培养中的应用，其特征在于，所述菌丝体水悬液通过以下方法制备得到：
将菌株接种至斜面培养基上，培养4-10天后，加入无菌水，并刮取斜面培养基上生长的菌苔至无菌水中，收集含有菌苔的无菌水，即得菌丝体水悬液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菌株包括真菌、霉菌、放线菌中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌选自裂褶菌、灰树花、绣球菌、灵芝、冬虫夏草、羊肚菌；
所述霉菌选自少孢根霉菌、哈茨木霉菌、米根霉；
所述放线菌选自链霉菌、嗜盐多孢放线菌、嗜酸放线菌。
4.一种基于菌丝体水悬液的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、菌丝体水悬液的制备：将菌株接种至斜面培养基上，培养4-10天后，加入无菌水，并刮取斜面培养基上生长的菌苔至无菌水中，收集含有菌苔的无菌水，即得菌丝体水悬液；
B、菌丝体水悬液的发酵培养：将菌丝体水悬液接种至发酵培养基中，发酵培养4-10天，得发酵产物。
5.一种基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌丝体水悬液的制备：将裂褶菌接种至斜面培养基上，斜面培养5-7天后，加入无菌水，并刮取斜面培养基上生长的菌苔至无菌水中，收集含有菌苔的无菌水，即得菌丝体水悬液；
S2、菌丝体水悬液的发酵培养：将菌丝体水悬液接种至含有裂褶菌深层发酵培养基的第一组分的发酵罐中，进行第一阶段发酵培养；然后在发酵罐中加入裂褶菌深层发酵培养基的第二组分，进行第二阶段发酵培养，即得含β-葡聚糖的发酵液。
6.根据权利要求5所述的基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述斜面培养基的制备方法为：将去皮马铃薯切块后加入水中煮沸20-40min，然后用纱布过滤，所得滤液中加入葡萄糖、酵母浸粉、琼脂粉，加热搅拌溶解后，加水定量；
所述斜面培养的温度为26-30℃；
所述无菌水的加入体积与斜面培养基的体积的比例为1:0.8-1.2。
7.根据权利要求5所述的基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法，其特征在于，步骤S2中，所述菌丝体水悬液与裂褶菌深层发酵培养基的第一组分的体积比为0.5-0.7:35；
所述裂褶菌深层发酵培养基的第一组分包括以下浓度的各组成成分：葡萄糖25-30g/L、酵母浸粉2-6g/L、缓冲盐0.5-1.0g/L、七水硫酸镁0.2-0.5g/L、其余为水；
所述裂褶菌深层发酵培养基的第二组分为代谢调控因子，所述代谢调控因子的终浓度为0.5-5ppm；
所述第一阶段发酵培养的条件为：发酵温度26-30℃、溶解氧70-80％、培养时间3-4天；
所述第二阶段发酵培养的条件为：发酵温度26-30℃、溶解氧15-25％、培养时间1-3天。
8.根据权利要求7所述的基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法，其特征在于，所述代谢调控因子选自腺嘌呤核苷酸、对氨基苯甲酸、叶酸、潘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸中的一种或几种；
所述缓冲盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种。
9.根据权利要求5所述的基于菌丝体水悬液的裂褶菌深层发酵高产β-葡聚糖的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
S3、将含β-葡聚糖的发酵液灭活后离心，所得离心液通入“交替五柱联用系统”中进行纯化，精滤后即得无色透明的β-葡聚糖液体；
所述“交替五柱联用系统”包括串联设置的颗粒活性炭柱、阴离子交换树脂柱、第一大孔吸附树脂柱、阳离子交换树脂柱、第二大孔吸附树脂柱。
10.一种裂褶菌深层发酵培养基，其特征在于，包括第一组分和第二组分，所述第一组分包括以下浓度的各组成成分：葡萄糖25-30g/L、酵母浸粉2-6g/L、缓冲盐0.5-1.0g/L、七水硫酸镁0.2-0.5g/L、水补足定量；
所述第二组分为代谢调控因子，所述代谢调控因子的终浓度为0.5-5ppm；
其中，所述代谢调控因子选自腺嘌呤核苷酸、对氨基苯甲酸、叶酸、潘氨酸、N,N-二甲基甘氨酸中的一种或几种；
所述缓冲盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠中的一种或几种。
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