CN116554278A

CN116554278A - 变异型腺相关病毒及其在疾病治疗中的应用

Info

Publication number: CN116554278A
Application number: CN202210114837.3A
Authority: CN
Inventors: 钟桂生; 储岑凤
Original assignee: Shanghai Weimei Gene Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Weimei Gene Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-30
Filing date: 2022-01-30
Publication date: 2023-08-08
Also published as: WO2023143366A1

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种变异型腺相关病毒及其在介导耳蜗的基因治疗和毛细胞再生中的应用。所述变异型腺相关病毒能高效地转导耳蜗中的毛细胞和/或支持细胞，促进类HC细胞的再生，帮助恢复听力。所述变异型腺相关病毒作为安全的载体，在治疗耳蜗损伤导致的听力障碍疾病尤其是由毛细胞死亡引起的听力损失方面具有较大临床潜力。

Description

变异型腺相关病毒及其在疾病治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种变异型腺相关病毒及其在疾病治疗中的应用，特别涉及AAV-ie-K558R及其在介导耳蜗基因治疗和毛细胞再生中的应用。

背景技术

耳蜗由多种类型的细胞组成，包括毛细胞、支持细胞和螺旋神经节神经元，负责将机械能转换为电信号，以实现听觉。组成耳蜗的细胞，对听力至关重要。遗传和环境因素可导致耳蜗和听觉系统的功能障碍。虽然感音神经性耳聋可由耳蜗毛细胞(HCs)和支持细胞(SCs)的基因突变导致，但非基因的因素，如噪音、耳毒性药物或老化，也可通过损伤HCs诱发耳聋。在任何一种情况下，这些损伤对于不具备再生耳蜗细胞能力的哺乳动物来说都是不可逆的。虽然目前的治疗方法，如助听器和人工耳蜗，可以缓解一些患者的听力损失，但这些方法并不能支持他们在嘈杂环境中对自然声音的敏感性和感知能力。

耳蜗中的HCs包括两种不同的类型：负责放大声音的外毛细胞(OHCs)和将机械能转化为电信号的内毛细胞(IHCs)。HCs将感觉上皮细胞固定在基底膜上，这对维持HCs正常功能的环境至关重要。值得注意的是，由于SCs有可能转分化为类HC(HC-like)细胞，因此HCs再生被认为是一种用于治疗由非遗传性因素引发的后天获得性耳聋的潜在方法。

基因治疗已经成为治疗遗传性疾病的重要手段。事实上，目前的研究进展也证明了它在治疗听力损失方面的潜力。当一些基因，如tmc1，clrn和otof，被传递到耳蜗时，可以恢复动物模型的听力功能。之前的研究表明，成年耳蜗的HCs再生可以恢复耳聋豚鼠模型的听觉功能，但还需要进一步研究，将这一发现扩展到其他动物模型。

近年来，基因治疗已经成为耳聋的一种有前景的治疗方法。基因治疗耳聋的一个主要挑战是如何有效地将基因传递给耳蜗的特定细胞。腺相关病毒(AAVs)已被证明在动物模型和人类中都具有很高的安全性，并被广泛用于向细胞传递遗传物质，用于许多不同器官和疾病的基因治疗。在听力领域，早期的研究发现，Anc80L65是一个很有前景的载体，可以传递Harmonin来治疗由HCs功能障碍引发的耳聋。然而，其转导HCs的效率还有待提高。本发明已经开发的一种合成的AAV，AAV-ie，可以靶向SCs和HCs；并通过传递转录因子Atoh1使SCs转分化为类HC细胞以再生类HC细胞。然而，它对SCs或HCs的靶向效率还有待进一步提高，特别是在耳蜗的基底区。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种变异型腺相关病毒及其在介导耳蜗基因治疗和毛细胞再生中的应用，用于解决现有技术中AAV对毛细胞和支持细胞转导效率不高，无法高效率利用基因治疗或者诱导毛细胞再生以用于治疗听力障碍疾病等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种变异型腺相关病毒及其在介导耳蜗基因治疗和毛细胞再生中的应用。

本发明的目的之一是提供一种变异型腺相关病毒衣壳蛋白，所述衣壳蛋白相比野生型腺相关病毒AAV-DJ衣壳蛋白VP1，包括第558位氨基酸K的突变。所述第558位氨基酸K的突变优选为K558R突变。

本发明的另一目的是提供一种核酸，所述核酸编码如上所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种构建体，所述构建体含有如上所述的核酸。

本发明的另一目的是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的构建体或基因组中整合有外源的如上所述的核酸。

本发明的另一目的是提供一种变异型腺相关病毒，所述变异型腺相关病毒的衣壳结构含有如上所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白。

本发明的另一目的是提供使用如上所述的变异型腺相关病毒转化的宿主细胞。

本发明的另一目的是提供一种变异型腺相关病毒载体系统，包含包装质粒，所述包装质粒中包含如上所述的核酸片段。

本发明的另一目的是提供一种变异型腺相关病毒，由如上所述的变异型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的变异型腺相关病毒以及药学上可接受的载体。

本发明的另一目的是提供一种如上所述的变异型腺相关病毒、宿主细胞、载体系统、药物组合物在制备治疗疾病的药物中的用途。

相对于现有技术，本发明的有益效果包括：

本发明提供的所述变异型腺相关病毒具有减少的泛素化或磷酸化，能高效地转导耳蜗(如转导新生小鼠)中的毛细胞和支持细胞，可以使Prestin敲除小鼠的听力损失部分恢复，可以将Atoh1送入耳蜗支持细胞，产生类HC(HC-like)细胞。本发明所述的变异型腺相关病毒是一个安全的载体，使用该载体的听力损伤相关疾病的基因治疗在人中是安全和有效的，对听觉和前庭系统没有负面作用，例如，对HCs的形态没有显著影响，不会造成毛细胞的损失，也不会影响听力阈值，不会使个体步态或者前庭功能异常等，在治疗由毛细胞死亡引起的听力损失方面具有临床潜力。

附图说明

图1.衣壳蛋白氨基酸突变增强了AAV的转导。(a)氨基酸突变策略。磷酸化部位的丝氨酸(S)被丙氨酸(A)取代，泛素化部位的赖氨酸(K)被精氨酸(R)取代。选择结构最相似的氨基酸是为了在防止磷酸化或泛素化修饰的同时，避免对衣壳蛋白产生任何重大的属性变化。(b)AAV突变体载体的筛选示意图。P3小鼠通过圆窗注射AAV-ie突变体，剂量为每耳4.5×10⁹个含基因组(颗粒)(GCs)，病毒注射后11天将耳蜗解剖成虚线所示的三个部分，分别代表低频(顶端)、中频(中部)和高频(基底)。然后固定耳蜗并进行免疫组化标记，接着进行共聚焦成像。(c)AAV-ie和AAV-ie-S/K突变体载体在同等剂量下(4.5×10⁹GCs)对外毛细胞和内毛细胞的转导效率。AAV-ie-K558R显示出与AAV-ie相当的转导效率。(d,e)比较AAV-ie和AAV-ie-K558R的转导效率。对病毒表达的NLS-mNeonGreen(绿色)进行成像，对Myo7a(品红色)和SOX2(红色)进行染色。鉴于虽然AAV-ie和AAV-ie-K558R都能有效地转导整个耳蜗的毛细胞和支持细胞，但AAV-ie-K558R在部分耳蜗显示出相同甚至更高的转导效率。(Scale bar:50μm)(f)AAV-ie和AAV-ie-K558R转导效率的统计分析。这里显示的数据是平均值±SEM。AAV-ie和AAV-ie-K558R之间进行了显著性检验，P值通过t检验计算。*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。

图2.AAV-ie-K558R是一个安全的载体。(a)AAV-ie-K558R研究的实验装置示意图，研究载体的安全性。(b)WT对照组和AAV-ie-K558R-NLS-mNeonGreen注射的耳蜗的顶端、中部和基底区域的代表性SEM图像。(Scale bar:10μm)(c)未注射的WT小鼠和AAV-ie-K558R-NLS-mNeonGreen注射的耳蜗顶端、中间和基底区域每100μm的OHCs和IHCs的数量。(d)P14WT对照组和AAV-ie K558R-NLS-mNeonGreen注射的耳蜗的外毛细胞(OHCs)和内毛细胞(IHCs)的放大SEM图像，在顶端、中部和基底区域。(Scale bar:1μm)(e,f)注射AAV-ie-K558R-NLS-mNeonGreen的耳朵在P3注射病毒后第27天和未注射的对侧耳朵的ABR和DPOAE阈值。病毒注射和AAV载体对小鼠听力没有影响。

图3.AAV-ie-K558R-Prestin恢复了Prestin KO小鼠的听觉功能。(a)Prestin敲除小鼠听力恢复实验示意图。AAV-ie和AAV-ie-K558R载体被用来包装一个单链基因组，表达由CAG启动子驱动的Prestin。(b)未注射的WT小鼠、未经处理的Prestin敲除小鼠和注射了AAV-ie-Prestin或AAV-ie-K558R-Prestin的Prestin敲除小鼠在P28记录的ABR波形家族。ABRs是用以16kHz的声音变化的，声压水平以10dB为单位递增。阈值由峰1的存在决定，并由彩色痕迹表示。比例尺适用于所有家族。(c,d)注射AAV-ie-Prestin(黑色)或AAV-ie-K558R-Prestin(红色)的Prestin敲除小鼠的ABR和DPOAE阈值是刺激频率的函数。未注射的Prestin敲除小鼠的对侧耳朵被用作阴性对照(蓝色)，未注射的WT小鼠被用作阳性对照(紫色)。数据显示为平均值±SEM。显著性(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)用AAV注射组和对侧未注射组的多重t检验计算。

图4.AAV-ie-K558R-Atoh1能使新生小鼠的HC样细胞再生。(a)AAV诱导的毛细胞再生在WT C57BL/6新生小鼠的AAV诱导毛细胞再生示意图。(b)用AAV-ie-Atoh1和AAV-ie-K558R-Atoh1转导的耳蜗的免疫荧光成像，剂量为1×10¹⁰GCs。(Scale bar:20μm)(c)P14时注射了AAV-ie-K558R-Atoh1的耳蜗的顶端、中部和基底区域的SEM图像。顶行，三行OHCs的编号。底行，方框内显示由AAV-ie-K558R-Atoh1再生的未成熟(白色)和成熟(黄色)HC样细胞。(Scale bar:5μm)。(d)中所示的未成熟和成熟的再生HC样细胞的放大的SEM图像，并进行了编号。在这些再生细胞中观察到立体细胞，而静纤毛被人为地染成了红色。不成熟的再生细胞没有明显的极性，而那些长出动纤毛(黄色箭头)并有一定极性的再生细胞被认为是比较成熟的。(Scale bar:1μm)

图5.AAV-ie变体的转导效率。AAV-ie S/K突变体载体转导耳蜗、毛细胞层的免疫荧光图像。所有耳蜗在P3时用1.5微升AAV原液显微注射后，在P14时收获，用抗Myo7a抗体(品红色)染色，并对NLS-mNeonGreen荧光(绿色)进行成像。(Scale bar:50μm)从左至右、从上至下依次为K39R、K61R、K137R、K142R、K143R、K161R、K258R、K332R、K492R、K546R、K551R、K558R、K676R、K699R、K703R、K717R、S225A、S269A、S314A、S392A、S393A、S425A、S431A、S491A、S505A、S539A、S675A、S679A。

图6.AAV-ie-K558R广泛转导小鼠耳蜗、前庭感觉上皮细胞。(a)AAV-ie-K558R在其他细胞类型中转导的实验设置示意图。P3 WT小鼠注射AAV-ie-K558R-NLS-mNeonGreen，剂量为1×10¹⁰GCs。注射后11天收获了组织。(b)注射AAV-ie-K558R-NLS-mNeonGreen的耳蜗冷冻切片，用抗SOX2(红色)和Myo7a(品红色)的抗体染色，并对NLS-mNeonGreen的荧光(绿色)进行成像。图中显示AAV-ie-K558R有效地转导了耳蜗毛细胞和各种类型的支持细胞。(Scale bar:20μm)(c)左图，染色的小鼠支持细胞的代表性共聚焦图像。右图，左图中方框内区域的放大图。(d)与c中一样，为椭圆形毛细胞层。比例尺(c和d)：左，100μm，右：10μm。

图7.AAV-ie-K558R不影响前庭功能。(a)在P2注射了AAV-ie-K558R的P28小鼠的窄梁行走试验路径轨迹(120秒)。(b)与a相同，但没有注射。(c)每分钟旋转次数。(d)每秒速度。(e)注射AAV-ie-K558R的小鼠和对照组小鼠穿越80厘米窄梁。

图8.Prestin敲除小鼠的产生和验证。(a)Prestin敲除小鼠是CRISPR的碱基替换构建的。在Prestin第4外显子和第11外显子的编码序列中同时引入两个终止密码子，以导致早期转录终止。(b)通过方法中描述的引物在突变位点周围进行PCR扩增，验证Prestin敲除小鼠的基因型，并进行测序检测。(c)通过对WT小鼠和Prestin敲除小鼠的Prestin特异性抗体(绿色)进行免疫组织化学检测，清楚地显示Prestin敲除小鼠的OHCs中没有Prestin表达。(Scale bar:20μm)

图9.AAV-ie-K558R-Prestin使Prestin在OHCs和IHCs中都能表达。(a)AAV-ie-K558R被用来包装一个单链(ss)AAV基因组，该基因组通过组成型CAG启动子表达Prestin。(b)Phalloidin(绿色)被用来标记F-actin和HCs的形态。Dapi(蓝色)被用来标记细胞核。Prestin敲除小鼠不表达Prestin。(Scale bar:10μm)(c)AAV-ie-K558R-Prestin使Prestin在HCs和其他类型的细胞中表达。(Scale bar:10μm)(d)AAV-ie-Prestin能诱导Prestin在HCs和其他类型细胞中的表达，但程度较低。(Scale bar:10μm)。

图10.AAV-ie-Atoh1诱导新生小鼠的HC样细胞。注射了AAV-ie-Atoh1(1×1010GCs)的耳蜗在P14的顶端、中部和基底区域的扫描图像。(Scale bar:10μm)

图11.AAV-ie-K558R-Atoh1诱导GER区域的HC样细胞。(a)用AAV-ie-Atoh1和AAV-ie-K558R-Atoh1以1×10¹⁰GCs的剂量转导的耳蜗GER的免疫荧光成像。AAV-ie-Atoh1和AAV-ie-K558R-Atoh1都能在GER区域产生Myo7a阳性细胞。(Scale bar:5μm)(b)耳蜗注射AAV-ie-Atoh1和AAV-ie-K558R-Atoh1后，在GER区域的P14的扫描图像。SEM图像验证了载体诱导的类似HC的细胞再生，形成了纤毛束。(Scale bar:left,20μm,right,1μm.)

图12.实施例1中AAV-ie-K558R载体的构建流程图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

腺相关病毒(AAV)是一种含有两个开放读框(rep和cap)的单链DNA病毒。rep基因编码基因组复制所需的4种蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，cap基因表达装配形成病毒衣壳的3种结构蛋白(VP1-3)。本发明基于野生型腺伴随病毒AAV-DJ，在其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的衣壳蛋白VP1的N589与R590之间插入SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段，获得变异性腺相关病毒AAV-ie(参见专利文献CN110437317 A)，然后在AAV-ie衣壳蛋白VP1的氨基酸序列上产生了一系列突变，以操纵AAV-ie在细胞中的磷酸化或泛素化，构建获得多种突变体。本发明经过多次研发筛选，获得一个包含特定的衣壳蛋白氨基酸突变体的变异型腺相关病毒AAV-ie-K558R，它可以高效地转导HCs和SCs，适用于纠正功能障碍的基因突变和类HC细胞再生等。

本发明提供了一种变异型腺相关病毒衣壳蛋白，所述衣壳蛋白相比野生型腺相关病毒AAV-DJ衣壳蛋白VP1，包括第558位氨基酸K的突变。

作为优选，所述第558位氨基酸K的突变为K558R突变。所述第558位氨基酸K的突变包括氨基酸的缺失或替代。所述替代是指将第558位氨基酸残基K替换为其他非K氨基酸或其衍生物，如替换为G、A、V、L、I、P、F、W、M、Y、S、T、C、N、Q、D、E、R、H氨基酸残基。

作为优选，将野生型腺相关病毒AAV-DJ衣壳蛋白VP1的N589与R590之间，插入如SEQ ID NO.1所示的氨基酸片段，获得腺相关病毒AAV-ie衣壳蛋白VP1，然后将第558位氨基酸K突变为R，获得如SEQ ID NO.5所示的腺相关病毒AAV-ie-K558R衣壳蛋白VP1。

DGTLAVPFK(SEQ ID NO.1)。

在本发明一些实施方式中，所述野生型AAV-DJ衣壳蛋白VP1的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTTNTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO.3)。

在本发明一些实施方式中，所述腺相关病毒AAV-ie衣壳蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTTNTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNDGTLAVPFKRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ IDNO.4)。

所述腺相关病毒AAV-ie-K558R衣壳蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTTNTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIERVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNDGTLAVPFKRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ IDNO.5).

本发明还提供了一种核酸，所述核酸编码如上所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白。

本发明还提供了一种构建体，所述构建体含有上述的核酸。所述构建体通常可以通过将上述核酸插入合适的表达载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的构建体或基因组中整合有外源的上述核酸。

作为适当宿主细胞的代表性示例，可举例哺乳动物细胞(如CHO或COS)、植物细胞、人细胞(人胚胎肾细胞如HEK293FT)、细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)、真菌细胞(如酵母)、昆虫细胞(如Sf9)等。本领域技术人员根据本文教导能够选择合适的宿主。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，且更优选是人细胞。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体(如人)中分离。该宿主细胞可以是粘附性细胞或悬浮的细胞，即悬液形式生长的细胞。

本发明还提供了一种变异型腺相关病毒，所述变异型腺相关病毒含有如上述变异型腺相关病毒衣壳蛋白VP1。在一些优选实施方式中，所述变异型腺相关病毒为AAV-ie-K558R。

所述变异型腺相关病毒AAV-ie-K558R相比野生型腺相关病毒AAV-DJ，在衣壳蛋白VP1的N589与R590之间包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸片段以及第558位氨基酸的突变。所述变异型腺相关病毒可以通过将生产野生型腺相关病毒AAV-DJ的载体系统中，将编码衣壳蛋白VP1的核苷酸替换为编码所述变异型腺相关病毒AAV-ie-K558R衣壳蛋白VP1的核苷酸后包装获得。

所述腺相关病毒AAV-ie-K558R相比腺相关病毒AAV-ie(可参考专利文献CN110437317A获得)，包含第558位氨基酸的突变。所述变异型腺相关病毒可以通过将生产腺相关病毒AAV-ie的载体系统中，将编码衣壳蛋白VP1的核苷酸替换为编码所述变异型腺相关病毒AAV-ie-K558R衣壳蛋白VP1的核苷酸后包装获得；或通过将腺相关病毒AAV-ie进行突变获得。

在一些实施方式中，所述AAV-ie的包装过程中，采用的Rep-Cap质粒序列如SEQ IDNO.2所示(同AAV-ie专利文献CN 110437317A的SEQ ID NO.6)。

SEQ ID NO.2

进一步地，所述变异型腺相关病毒还包括编码目的产物的异源核苷酸序列，所述编码目的产物的异源核苷酸序可以是各种衣壳蛋白能包裹携带的。上述编码目的产物的异源核苷酸序列通常可以是构建体，所述构建体通常可以含有编码目的产物的核酸。所述构建体通常可以通过将编码目的产物的核酸插入合适的表达载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的表达载体，例如，上述表达载体可以是包括但不限于pAAV-CAG、pAAV-TRE、pAAV-EF1a、pAAV-GFAP promoter、pAAV-Lgr5 promoter、pAAV-Sox2 promoter表达载体等。本发明中，当所述变异型腺相关病毒编码目的产物的异源核苷酸序列时，所述变异型腺相关病毒含有衣壳，所述病毒载体携有编码基因产物的转基因，所述转基因受指导其在宿主细胞内表达的调控序列的调控；在一些优选实施方式中，所述衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:5所示。

进一步地，所述目的产物可以为核酸或蛋白质，所述核酸可以是小向导RNA(sgRNA)、干扰RNA(RNAi)等，所述蛋白质编码基因可以是Prestin、Atoh1。

所述腺相关病毒AAV-ie-K558R可以作为载体材料，将外源的基因导入受试个体的细胞中，相比于亲本野生型AAV-DJ和腺相关病毒AAV-ie，所述AAV-ie-K558R对毛细胞和支持细胞的转导效率显著提高。

本发明还提供了一种使用如上所述的变异型腺相关病毒转化获得的工程化宿主细胞。所述工程化宿主细胞包含上述变异型腺相关病毒。所述宿主细胞可以是真核细胞和/或原核细胞。

本发明还提供了一种变异型腺相关病毒载体系统，所述载体系统包含包装质粒，所述包装质粒中包含如上所述的核酸片段。

进一步地，所述包装质粒中还包含腺相关病毒的rep基因片段。其中所述rep基因包含内含子，所述内含子包含转录终止序列。

进一步地，所述腺相关病毒载体系统还包括表达质粒，所述表达质粒包含负责编码目的产物的异源核苷酸。

进一步地，所述腺相关病毒载体系统还包括辅助病毒质粒。

进一步地，所述腺相关病毒载体系统还包括宿主细胞。

将所述的包装质粒、表达质粒、辅助病毒质粒转入宿主细胞，其中的核酸序列全部整合于宿主细胞中，以生产所述变异型腺相关病毒。在一些实施方式中，所述核酸序列全部一起整合在所述宿主细胞细胞基因组内的单一基因座处。在一些实施方式中，编码各种基因的核酸序列作为单独的表达盒存在，其防止任何重组以形成能够复制的病毒的风险；编码rep和cap基因的核酸序列存在于同一表达盒中。

本发明还提供了一种变异型腺相关病毒，由如上所述的变异型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的腺相关病毒以及药学上可接受的载体。

所述可接受的载体例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，PEG等)、非离子表面活性剂(吐温80，HCO-50)等。

本发明所提供的药物组合物中，所述AAV-ie-K558R可以是单一有效成分，也可以与其他一种或多种对于听力损伤有用的活性组分进行组合，构成联合制剂。所述其他活性组分可以是其他各种可以用于治疗听力损伤的药物。组合物中活性组分的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述AAV-ie-K558R和药物组合物的活性成分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的所述双功能化合物的施用量通常可以为1～1000mg/kg/day、20～200mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～20mg/kg/day、20～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～150mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、或500～1000mg/kg/day。

本发明所提供的变异型腺相关病毒可以适应于合适的给药方式，可以是注射到耳蜗、眼睛、肌肉、神经系统或者血液循环系统。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的剂量。

本发明还提供了上述变异型腺相关病毒、宿主细胞、载体系统或药物组合物在制备预防和/或治疗疾病药物中的用途；优选地，在用于制备预防和/或治疗基因治疗疾病的药物中的用途；所述疾病包括但不限于是听力障碍疾病、炎症、肿瘤、代谢疾病、疼痛、神经退行性炎症疾病等中的一种或几种。

所述听力障碍疾病选自听力下降、耳聋、耳鸣。

所述炎症选自皮肤炎症、脉管炎症、变态反应、自身免疫性疾病、纤维组织形成、硬皮病或移植物排斥；所述自身免疫性疾病选自风湿关节炎、系统性硬化症、系统性红斑狼疮、类口眼干燥综合征、多发性肌炎等中的一种或多种。

所述癌症选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤；具体选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤肿瘤细胞中的一种或多种；优选地，所述肿瘤为结直肠癌和/或黑色素细胞瘤等中的一种或几种。

所述代谢疾病选自糖尿病，包括I型和II型糖尿病以及与糖尿病相关的疾病和病症；所述代谢性疾病包括但不限于动脉粥样硬化，心血管疾病，肾病，神经病，视网膜病，β-细胞机能障碍，血脂异常，高血糖，胰岛素抵抗、慢性阻塞性肺病等中的一种或几种。

在一些更优选实施方式中，所述基因治疗是指听力障碍疾病的治疗。所述变异型腺相关病毒或药物组合物可通过将目的产物递送至个体的毛细胞和/或支持细胞以实现听力障碍疾病的治疗。

本发明所述变异型腺相关病毒、宿主细胞、载体系统或药物组合物在用于将目的产物递送至个体的毛细胞和/或支持细胞中的用途中，所述目的产物递送可以是非诊断治疗目的的，例如，可以是体外的，对离体的毛细胞和/或支持细胞进行目的产物递送。所述毛细胞通常包括外毛细胞和/或内毛细胞。

进一步地，所述目的产物为核酸或蛋白质，所述核酸可以是小向导RNA(sgRNA)、干扰RNA(RNAi)等。

本发明中，所述听力障碍疾病可以是由环境因素引起的耳蜗损伤导致的。因此，本发明还提供了上述变异型腺相关病毒在治疗个体中环境因素导致的听力障碍疾病的药物中的用途。

进一步地，所述听力障碍疾病为毛细胞和/或支持细胞和/或螺旋神经元细胞相关疾病。

进一步地，所述听力障碍疾病为基因缺陷、环境损伤或衰老的相关疾病，例如，可以是基因突变等所导致的相关疾病，再例如，可以是噪声所致的、药物所导致的相关疾病，再例如，可以是衰老所导致的相关疾病。

进一步地，听力障碍疾病可以为细胞损伤等的相关疾病，具体可以是耳蜗毛细胞损伤、支持细胞损伤等，更具体可以是基因突变导致的耳蜗毛细胞损伤、基因突变导致的支持细胞损伤等、噪声所致的细胞损伤、药物所导致的细胞损伤或者衰老所导致的细胞损伤。

进一步地，所述变异型腺相关病毒作为递送目的产物的载体。

本发明还提供了一种治疗听力障碍疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予有效量的本发明所述的变异型腺相关病毒、本发明所述宿主细胞、载体系统或药物组合物。通常，医师都可确定对单个患者而言最适用的实际剂量且其会根据特定个体的年龄、体重和反应而变化。

在本发明中，可向患者给予本发明的变异型腺相关病毒或宿主细胞或载体系统或药物组合物。本领域技术人员能够确定适当的给药方式和剂量。

通过本发明所述变异型腺相关病毒递送一种或多种治疗基因，可单独使用或与其他治疗方法或治疗组分联用。

本发明还提供了一种偶联物，所述偶联物包括如上所述的变异型腺相关病毒或连接的生物活性多肽。

本发明的变异型腺相关病毒用于感染细胞，从而将基因和/或连接的(例如但不限于，共价连接的)生物活性多肽递送至细胞。因此，本发明提供了一种将转基因递送至细胞的方法，所述方法通过使一个或多个本发明的变异型腺相关病毒或偶联物至细胞来感染细胞，其中所述变异型腺相关病毒或偶联物包含一个或多个转基因。

本发明还提供了产生稳定的变异型腺相关病毒载体的生产细胞系的方法，其包括：

(a)将如本文所定义的变异型腺相关病毒载体引入哺乳动物宿主细胞的培养物中；和

(b)在所述培养物内选择具有在整合至所述哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。

所述AAV载体生产细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、K562细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物。在一些实施方式中，所述哺乳动物宿主细胞是HEK293细胞，或源自HEK293细胞。在一些实施方式中，所述HEK293细胞是HEK293T细胞。

AAV的各种血清型的基因组序列以及天然ITR、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域中已知的。此类序列可见于文献中或公共数据库诸如GenBank中。其公开内容通过引用并入本文用于教导AAV核酸和氨基酸序列。

本发明化合物及其应用中，当所述变异型腺相关病毒与其他治疗剂联用时，所述活性化合物与其他治疗剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在两种或多种不同化合物的给药之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。

在某些实施方式中，本发明的变异型腺相关病毒及其方法可用于预防听力损伤，可作为预防性治疗方法在听力损伤之前施用或在接触易造成听力损伤的环境后的一段时间后施用。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本文述及“载体”指含有多肽或与多肽结合并可用于介导多肽递送至细胞的大分子或大分子的联合体。说明性的载体包括，例如质粒、病毒载体、脂质体或其它基因递送载体。

本文述及“AAV”是腺相关病毒的缩写，可用于指病毒自身或其衍生物。

本文述及“重组AAV载体”指含有异源性多核苷酸序列的AAV载体，通常是用于遗传性转化细胞的感兴趣的序列。总体上，异源多核苷酸的两侧连接有至少一条，一般是两条AAV末端反向重复序列(ITR)。

本文述及“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”指至少含有一种AAV衣壳蛋白和一种包裹的多核苷酸的AAV载体的病毒颗粒。如果该颗粒含有异源性多核苷酸(即，除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如要递送至哺乳动物细胞的转基因)，一般称为“AAV载体颗粒”、或“AAV载体”。

本文述及“包装”指导致AAV颗粒装配和包裹的一系列胞内过程。

本文述及AAV“rep”和“cap”基因指编码腺相关病毒的复制和包裹蛋白的多核苷酸序列。文中AAV rep和cap指AAV“包装基因”。

本文述及AAV的“辅助病毒”指能使AAV被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。各种这样的AAV辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。

本文述及“感染性”病毒或病毒颗粒是含有能将多核苷酸成分递送进该病毒种类具有嗜性的细胞。该术语无需暗示病毒有任何复制能力。

术语“生产细胞”是指具有稳定整合至宿主细胞基因组中的AAV包装基因(rep和cap基因)、所需的辅助病毒基因和重组AAV载体的DNA基因组(例如，由两个AAV反向末端重复(ITR)侧接的目标转基因)的细胞系。

本文述及“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。

本文述及“个体”通常包括人类、非人类的灵长类，如哺乳动物、狗、猫、马、羊、猪、牛等，其可因利用所述制剂、试剂盒或联合制剂进行治疗而获益。

本文述及“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如上所列出的疾病的效果。

本文述及“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会感染疾病病症。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。

本发明中，进行治疗性或预防性治疗的对象或个体优选哺乳动物，例如但不限于人、灵长类、牲畜(如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、家兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)或被捕获的野生动物(如狐狸、鹿)。所述对象优选灵长类。所述对象最优选人。

本文述及“转染(transfection)”、“转化(transformation)”和“转导(transduction)”可用于描述将非哺乳动物或病毒的载体插入靶细胞。插入载体通常称为细菌细胞的转化和真核细胞的转染，尽管插入病毒载体也可称为转导。技术人员将意识到通常使用的不同的非病毒转染方法，其包括但不限于使用物理方法(例如，电穿孔、细胞挤压(cell squeezing)、声致穿孔、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)、磁转染、基因枪或颗粒轰击)、化学试剂(例如，磷酸钙、高度支化的有机化合物或阳离子聚合物)或阳离子脂质(例如，脂质转染)。许多转染方法需要使载体DNA溶液与细胞接触，然后使其生长并针对标记基因表达进行选择。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

材料与方法：

材料与来源：

幼鼠：上海灵畅生物科技有限公司

各种AAV：南京金斯瑞公司合成构建

驴血清：上海翊圣生物科技有限公司

各个抗体与染色时的稀释比：

一抗：myosin 7A(Myo7a,#25-6790Proteus Biosciences,1:1000),Sox2(Sox-2,#sc-17320,Santa Cruz Biotechnology,1:1000),Flag(Flag,#F3165,Sigma Aldrich,1:1000),NeuN(NeuN,#12943S,Cell Signaling Technology,1:500)。

二抗：二抗标记物anti-rat、mouse、rabbit及goat的各三种不同标记颜色(TRIC,FITC,Cy5)的二抗，来源于invitrogen公司。

细胞和组织培养试剂：DMEM(Hyclone公司)，胎牛血清(Lensa公司)，添加物N2(ThermoFisher公司)，氨苄西林(ThermoFisher公司)，双抗(ThermoFisher公司)。

细胞与组织培养耗材：包括各类培养皿、离心管、移液管，一次性滤器等常用耗材购于Corning公司。

实施例1衣壳蛋白表面氨基酸的突变提高了AAV-ie在体内的耳蜗转导效率

(1.1)蛋白泛素化与AAV转导效率有关，阻断泛素化可以提高AAV在体外和体内的转导效率。本发明以前的研究表明，AAV-ie可以转导啮齿动物和人类的耳蜗细胞。然而，AAV-ie在耳蜗基底区的转导效率很低。本发明认为，在AAV-ie暴露侧突变衣壳蛋白氨基酸可以提高其转导效率(图1a)。为了验证这一假设，本发明构建了28个衣壳蛋白序列不同的AAV-ie变体(表1)。

(1.2)AAV-ie变体的构建

以下以AAV-ie-K558R的构建作为示例性说明，其他AAV-ie变体的构建步骤相似。

AAV-ie-K558R的构建：

AAV的包装需要三个质粒：含有目的基因的基因组质粒、Capsid质粒(Rep-Cap质粒)和Helper质粒。

其中，Capsid质粒中的Cap蛋白的序列决定了AAV的不同血清型，进而影响了AAV感染细胞的偏好性。因此，改造Cap蛋白能够得到新的AAV血清型。

AAV-ie-K558R是在亲本AAV-ie的Cap蛋白序列上通过558位的单个氨基酸K突变成R而产生的。

(a)AAV-ie capsid载体线性化

首先对于AAV-ie capsid的质粒进行线性化切割，通过Sma1和Xho1两个酶切位点，将其切开，产生AAV-ie capsid载体，回收线性化AAV-ie capsid片段(Axygen：AP-GX-250G)。回收后的片段经过Nanodrop2000检测浓度。

(b)突变片段的构建

首先，针对Xho1酶切位点到558氨基酸的片段设计引物，在Xho1酶切位点处设计正向引物，并在引物5’端加入15-20nt与线性化AAV-ie capsid载体结合的同源臂(Primer1)。再在558氨基酸处设计反向引物，并在5’端加入15-20nt与重组片段2结合的同源臂(Primer 2)，Primer2中引入K558R突变。通过聚合酶链式反应(PCR)产生重组片段1。回收重组片段1(Axygen：AP-GX-250G)。回收后的片段经过Nanodrop2000检测浓度。

再针对558氨基酸到Sma1酶切位点片段设计引物，在Cap蛋白的序列558处设计正向引物，引入K558R突变，并在引物5’端中加入15-20nt与重组片段1结合的同源臂(Primer3)。再在Sma1酶切位点处设计反向引物，并在引物5’端加入15-20nt与线性化AAV-iecapsid载体结合的同源臂(Primer 4)。通过聚合酶链式反应(PCR)产生重组片段2。回收重组片段2(Axygen：AP-GX-250G)。回收后的片段经过Nanodrop2000检测浓度。

引物设计如下，灰色表明引物中引入K558R的突变碱基：

正向引物Primer 1：5’-TTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGAC-3’(SEQ ID NO.6)；

反向引物Primer 2：

正向引物Primer 3：

反向引物Primer 4：5’-CGCCCGCTGTTTAAACGCCCGGGCTGTAGTTAATGATTAACCCG-3’(SEQ ID NO.9)。

(c)AAV-ie-K558R载体的构建和纯化

利用多片段同源重组的方法，将线性化AAV-ie capsid载体和PCR反应获得的重组片段1，2进行重组，产生AAV-ie-K558R。重组体系为：线性化AAV-ie capsid载体，50ng；重组片段1，30ng；重组片段2，30ng；重组连接酶，1μL；重组连接buffer，5μL；ddH₂O，补齐20μL；50℃反应20分钟，产生重组产物。

流程图如图12所示。

(d)载体的转化与质粒提取

转化步骤如下：取100μL感受态细胞(TransGen:CD201)在冰上解冻；10μL的重组产物与感受态细胞混合，冰上放置20分钟；42℃热激60秒；冰上放置2分钟，加入400μL复苏LB培养基(MDBio:L001-1kg)，摇床30分钟；取70μL涂氨苄平板(50μg/ml，37℃培养箱，培养14个小时。

挑选单克隆菌，在4ml液体LB培养基中扩大培养，14小时后提取质粒(Axygene:AP-MN-P-250G)。

步骤如下：菌液经过4000转/分钟离心10分钟，倒掉上清培养基；加入350μL的buffer S1，将菌体吹散，转移到2ml离心管中；加入250μL的buffer S2，上下颠倒8次；加入250μL的buffer S3，颠倒混匀6次，产生沉淀；12000转/分钟离心10分钟，取上清过柱；离心1分钟，倒掉废液，加入500μL的W1，离心一分钟，倒掉废液；加入750μL的W2，离心，倒掉上清；加入500μL的W2，离心，倒掉上清；空转1分钟；加入50μL的洗脱液，静置2分钟，离心。获得质粒经过浓度检测，取10μL送测序，阳性质粒保存在-20℃。测序结果表明，获得质粒能够编码变异型衣壳蛋白VP1。

进一步的实验结果表明，制备获得的质粒能够表达变异型衣壳蛋白VP1，其中，AAV-ie-K558R capsid VP1的多核苷酸编码序列如SEQ ID NO.10所示，构建获得的Rep-Cap质粒的全序列如SEQ ID NO.11所示。

(e)AAV变异体(命名为AAV-ie-K558R)病毒的包装与纯化

将得到的Rep-Cap质粒，表达一个绿色荧光蛋白mNeonGreen(GenBank:LC279210.1)的基因组质粒pAAV-CAG-mNeonGreen(质粒全序列如SEQ ID NO.12所示(同AAV-ie专利文献CN 110437317A的SEQ ID NO.11))，pHelper质粒(质粒全序列如SEQ IDNO.13(同AAV-ie专利文献CN 110437317A的SEQ ID NO.12)所示)以合适的量共转于HEK-293T细胞中，采用碘二烷醇梯度超高速离心纯化AAV病毒，测量病毒滴度在1E+12-1E+13GC/mL为合适浓度，放置-80℃备用。

在用DMEM+10％胎牛血清培养的HEK 293T细胞中加入衣壳蛋白变异体和其亲本衣壳蛋白产生的AAV病毒(分别为AAV-ie和AAV-DJ)。病毒加入的MOI值为1000。48小时后，用荧光显微镜观察了绿色荧光蛋白mNeonGreen的表达。

结果显示：AAV变异体与其亲本AAV感染HEK 293T细胞的比例相似。

SEQ ID NO.10(AAV-ie-K558R capsid VP1):

SEQ ID NO.11(AAV-ie-K558R Rep-Cap质粒):

SEQ ID NO.12

SEQ ID NO.13

(1.3)对AAV-ie变体进行筛选

为了提高筛选的准确性，本发明将等量(4.5×10⁹)的含基因组的AAV-ie-K558R颗粒通过圆窗膜(RWM)注射到新生小鼠P3的耳蜗中，来对(1.1)中的这些AAV-ie变体进行体内筛选(图1b)。取P14时期的耳蜗进行免疫染色：用Myo7a抗体标记毛细胞，核定位信号(NLS)-mNeonGreen信号显示转导的细胞在耳蜗中的细胞核定位。本发明对这些AAV-ie变体的转导效率进行了分析，并与相同条件下的AAV-ie进行了比较。如图1c所示，相对于AAV-ie，虽然大多数AAV-ie变体在耳蜗基底区的转导效率没有增加(图5)，有些甚至反而下降，但变体AAV-ie-K558R在耳蜗基底区的OHCs和IHCs都有显著提高的转导效率。本发明进一步比较AAV-ie-K558R和AAV-ie的转导情况，发现AAV-ie-K558R在耳蜗中间区域的OHCs和基底区域的SCs的转导效率都有显著提高(图1d-f)。本发明也评估了AAV-ie-K558R在负责检测直线运动和感知重力的前庭系统的靶向效率，观察到NLS-mNeonGreen在整个小鼠感觉上皮表达，AAV-ie-K558R在HCs和SCs的转导效率接近100％(图6)。

这些实验结果共同证明了AAV-ie-K558R可以有效地靶向耳蜗中的不同类型的细胞，揭示了它可以作为合适的载体来介导听觉疾病的基因纠正或在耳蜗或前庭系统中再生类HC细胞的潜力。

表1.AAV-ie衣壳蛋白氨基酸突变的序列(大写字母代表编码氨基酸的密码子，红色字母代表变异后的碱基)。

实施例2 AAV-ie-K558R的安全性验证

本课题组早期的研究表明，AAV-ie是一个安全的载体，并对HCs和听觉功能没有表现出任何毒性的作用。本发明检测了AAV-ie-K558R是否具有与AAV-ie类似的安全特性。

2.1实验分组和处理

AAV-ie-K558R注射组(每组3只)：通过圆窗膜(RWM)给小鼠的每只耳朵注射AAV-ie-K558R-NLS-mNeonGreen(1×10¹⁰GCs)；

WT对照组(Control，每组3只)：通过圆窗膜(RWM)给小鼠的每只耳朵注射AAV-ie-NLS-mNeonGreen(1×10¹⁰GCs)。

2.2对HCs的形态和数量的影响

经步骤2.1处理两个星期后，对耳蜗进行扫描电子显微镜(SEM)分析。SEM的结果表明，HCs在注射后没有或几乎没有形态上的变化，毛束方向正确(图2b，2d)。本实施例同时计算了视野中的HCs数量，观察到AAV注射组和对照组之间没有差异，表明没有出现明显的毛细胞损失(图2c)。

2.3测定AAV-ie-K558R对听力的影响

本实施例通过测定反映活体动物听觉功能的听觉脑干反应(ABRs)和反映外毛细胞完整性的畸变产物耳声发射(DPOAE)来验证AAV-ie-K558R注射是否影响听力。同样，在注射组和对照组之间，阈值没有表现出显著差异(图2e，2f)。

2.4测定AAV-ie-K558R对听觉和前庭系统的影响

本实施例接下来检测了AAV-ie-K558R对表现严重前庭功能损伤的动物行为是否存在像转圈行为或其他步态异常等类似的副作用。

在步骤2.1处理四周后，在开放路径跟踪试验中未观察到AAV-ie-K558R注射组任何步态或循环行为的异常。

在进一步的窄梁行走试验中，注射病毒的AAV-ie-K558R注射组小鼠和未注射病毒的对照组小鼠之间没有观察到明显的差异(图7)。

根据这些结果，本发明得出结论，AAV-ie-K558R对听觉和前庭系统没有负面作用。

实施例3 Prestin敲除小鼠的产生和验证。

构建Prestin敲除小鼠：利用Crispr-Cas体系进行在Prestin第4外显子和第11外显子的编码序列中同时引入两个终止密码子，导致prestin蛋白翻译提前停止，达到敲除prestin在耳蜗中外毛的表达，以构建Prestin敲除小鼠。

如图8b所示，通过方法中描述的引物(SEQ ID NO.42-45：正向引物1:5’-CCACCACGTTTAGTAGCATC-3’、反向引物1：5’-ACTGTGATGAACATGAGCCA-3’,正向引物2：5’-AGAGCACACCTGCGCTCTTC-3’，反向引物2：5’-AGTGTGGATGTCAGGCAGAGTA-3’)在突变位点周围进行PCR扩增，验证Prestin敲除小鼠的基因型，并进行测序检测。

如图8c所示，通过对WT小鼠和Prestin敲除小鼠的Prestin特异性抗体(绿色)进行免疫组织化学检测，清楚地显示Prestin敲除小鼠的OHCs中没有Prestin表达。

实施例4 AAV-ie-K558R-Prestin能使Prestin敲除小鼠的耳聋部分恢复

由于缺乏可以高效转导OHC的AAV，在OHC基因缺失引起的耳聋模型中进行基因治疗是具有挑战性的。为了测试AAV-ie-K558R是否有可能恢复OHC基因功能障碍引发的听力损失，本实施例采用了在OHCs中除去Prestin蛋白表达基因的Prestin敲除小鼠。Prestin是一个只定位在OHCs的关键分子，在介导OHCs的电动性方面起着关键作用。在Prestin敲除小鼠中，听觉阈值明显高于野生型(WT)(图3a-b)。Prestin敲除小鼠没有出现转圈行为或其他步态异常(数据未显示)。

4.1小鼠及病毒构建

构建AAV-ie-K558R-Prestin：在启动子CAG的驱动下，prestin基因slc26a5包装到AAV-ie-K558R载体。

构建AAV-ie-Prestin：在启动子CAG的驱动下，prestin基因slc26a5包装到AAV-ie载体。

4.2实验分组及处理

本实施例将AAV-ie-K558R-Prestin病毒注射到P1-2(“P1-2”的含义为小鼠出生后1天或者2天)的Prestin敲除小鼠体内，以研究它在治疗OHCs中基因功能缺陷引发的遗传性听觉疾病的效果。为了测试由AAV介导的Prestin在HCs中的过表达是否能恢复Prestin敲除小鼠的听力功能，本发明对不同组的小鼠中进行了ABR实验。

4.3实验结果

在步骤4.2处理后1个月，测定各组小鼠的ABR阈值，观察到AAV-ie-K558R-Prestin实验组的ABR阈值的部分降低(图3b，3c)；DPOAE结果表明，AAV-ie-K558R-Prestin在16kHz有10dB的缓解作用。

在步骤4.2处理后两个月，检测耳蜗中Prestin的表达，并检测Prestin敲除小鼠的毛细胞中Prestin的表达情况。观察到AAV-ie-K558R-Prestin实验组在病毒注射两个月后，Prestin在小鼠的耳蜗OHCs中大量表达(图9)。AAV-ie-Prestin实验组中，将Prestin整合到AAV-ie载体并注射到新生Prestin敲除小鼠体内后，ABR阈值没有降低，注射一个月后，也没有观察到Prestin在耳蜗OHCs的大量表达(图3c，3d)。

本实施例的结果表明，AAV-ie-K558R可以作为一个潜在的载体，将基因传递到OHCs，并用于毛细胞缺陷的耳聋小鼠模型的基因治疗。

实施例5 AAV-ie-K558R-Atoh1介导的体内类HC细胞再生

5.1AAV-ie-K558R-Atoh1病毒构建：在启动子CAG的驱动下，Atoh1包装到AAV-ie-K558R载体

AAV-ie-Atoh1病毒构建：在启动子CAG的驱动下，Atoh1包装到AAV-ie载体

5.2实验分组及处理

研究表明，HC的再生可能有助于恢复由老化、噪音或耳毒性药物引起的听力损失。转录因子Atoh1被证明能够使SCs转分化为HCs。本发明早期的研究表明，AAV-ie能将Atoh1传递给SCs并使其转分化为类HC细胞。

为了评估AAV-ie-K558R载体用于HC再生的潜力，本发明使用AAV-ie-K558R-Atoh1在体内将小鼠Atoh1送入新生小鼠耳蜗(图4a)。

AAV-ie-Atoh1注射组：在P3时通过RWM将AAV-ie-Atoh1(每只耳朵1×10¹⁰GCs)注入耳蜗。

AAV-ie-K558R-Atoh1注射组：在P3时通过RWM将AAV-ie-K558R-Atoh1病毒(每只耳朵1×10¹⁰GCs)注入耳蜗。

在P14时取耳蜗。在AAV-ie-Atoh1注射组中，感觉区出现了一些表达Myo7a的类HC细胞(图4b)。在AAV-ie-K558R-Atoh1注射组，观察到在上皮脊(GER)区域有大量新的表达Myo7a的HCs。值得注意的是，在AAV-ie-Atoh1注射组和AAV-ie-K558R-Atoh1注射组中一些新的类HC细胞有Sox2的持续表达，这意味着这些新的再生HCs细胞可能处于不同的发育阶段(图4b)。与其他Atoh1过表达方法，如以前研究中使用的遗传方法相比，本实施例AAV-ie-K558R-Atoh1注射组的再生HCs细胞数量差别不显著，这表明AAV-ie-K558R是一种高效的HCs再生病毒载体。

最后，本实施例用SEM对新再生的HCs细胞的形态进行了定量。AAV-ie-K558R-Atoh1引起了很多类HC细胞的再生，毛束从IHC区域下面的类HC细胞生长出来(图4c)。与本发明早期的研究一致，AAV-ie-Atoh1也能诱导类HC细胞再生(图10)。然而SEM证明AAV-ie-K558R-Atoh1能在GER区域诱导产生一些类HC细胞(图11)，而AAV-ie-Atoh1不能产生类似的效果。本发明观察到新再生的类HC细胞产生了代表毛细胞步入更成熟发育阶段的动纤毛(图4d)。这些结果表明，AAV-ie-K558R可以通过传递Atoh1有效诱导耳蜗中的类HC细胞再生。

本发明通过突变AAV-ie暴露侧衣壳蛋白氨基酸来减少泛素化或磷酸化从而优化AAV-ie。本发明的研究结果表明，新产生的AAV变体AAV-ie-K558是安全的，而且对毛细胞再生和基因治疗都有益。大多数AAV-ie变体都未表现出高靶向效率，反而表现出较低的靶向效率，这表明泛素化或磷酸化的减少并不一定能引发更高的转导效率。因此，转导效率的确切机制有待进一步研究。这些结果也揭示了进行筛选实验对确定不同组织最佳AAV的重要性。尽管如此，本发明的结果表明，肽的插入和氨基酸的突变对于改造产生合适的AAVs以有效地转导细胞在耳蜗和其他组织中是可行的。

本发明发现AAV-ie-K558R能使Prestin敲除小鼠的听觉功能部分恢复，因为将基因有效传递到OHCs一直是一个重大挑战，所以这是针对听觉疾病的基因治疗领域的重大进展。在这项研究中，本发明用AAV-ie-K558R只实现了部分听觉功能的恢复。有以下几个因素来解释这种部分恢复的现象。首先，AAV-ie-K558R也能转导IHCs，Prestin在IHCs中的过表达可能导致IHCs功能障碍，从而阻止听觉功能的完全恢复。其次，想要完全恢复OHCs的功能，Prestin在OHCs中的表达水平可能要被精确控制。在这项研究中，本发明使用了一个广泛使用的基因调控启动子，CAG，这可能不是控制Prestin在OHCs中表达的最佳选择，需要进一步的研究来发现AAV传递方式中用于耳蜗的最佳基因调节元件。开发一种用AAVs控制耳蜗和其他组织的基因表达的调节方法将是很重要的。

早期的研究使用了几种病毒载体，如慢病毒和腺病毒，将Atoh1递送到耳蜗，据报道，Atoh1的过表达能引起类HC细胞的再生，甚至实现了聋豚鼠听力的部分恢复。FDA批准了一项使用腺病毒载体将人Atoh1基因递送到耳蜗的人体临床试验(NCT02132130)，然而，腺病毒介导的HC再生的效率和效果需要精进。在此，本发明表明AAV-ie-K558R-Atoh1能在感觉区诱导产生许多新的HC，而且效率与以前的遗传小鼠相当。衡量腺病毒的再生效率和强烈的免疫反应后，AAV-ie-K558R在HC再生方面有更多的优势。

总之，AAV-ie-K558R是第一个可用于耳聋小鼠模型基因治疗且能诱导新生小鼠的类HC细胞再生的AAV载体。AAV-ie-K558R的进一步发展和完善将对不同听觉疾病的基因治疗或HC细胞再生的更好疗效起到至关重要的作用。AV-ie-K558R介导的基因治疗不仅可以恢复由HCs或SCs的遗传功能障碍引起的耳聋小鼠模型的听力功能，而且还可以缓解环境和年龄引发的耳聋，对于听力损伤的治疗具有较大应用潜力。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海玮美基因科技有限责任公司

<120> 变异型腺相关病毒及其在疾病治疗中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Gly Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys

1 5

<210> 2

<211> 7360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgcgccgat atcgttaacg ccccgcgccg gccgctctag aactagtgga tcccccggaa 60

gatcagaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgatctg 120

cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 180

gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 240

gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 300

gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 360

tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 420

caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 480

tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 540

cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 600

gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 660

cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 720

gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 780

atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 840

ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 900

caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 960

taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 1020

gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 1080

gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1140

taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1200

aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1260

ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1320

caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1380

cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1440

ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1500

ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1560

ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1620

cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1680

gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1740

cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1800

aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1860

tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1920

gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1980

catctttgaa caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt 2040

ggctcgagga cactctctct gaaggaataa gacagtggtg gaagctcaaa cctggcccac 2100

caccaccaaa gcccgcagag cggcataagg acgacagcag gggtcttgtg cttcctgggt 2160

acaagtacct cggacccttc aacggactcg acaagggaga gccggtcaac gaggcagacg 2220

ccgcggccct cgagcacgac aaagcctacg accggcagct cgacagcgga gacaacccgt 2280

acctcaagta caaccacgcc gacgccgagt tccaggagcg gctcaaagaa gatacgtctt 2340

ttgggggcaa cctcgggcga gcagtcttcc aggccaaaaa gaggcttctt gaacctcttg 2400

gtctggttga ggaagcggct aagacggctc ctggaaagaa gaggcctgta gagcactctc 2460

ctgtggagcc agactcctcc tcgggaaccg gaaaggcggg ccagcagcct gcaagaaaaa 2520

gattgaattt tggtcagact ggagacgcag actcagtccc agaccctcaa ccaatcggag 2580

aacctcccgc agccccctca ggtgtgggat ctcttacaat ggctgcaggc ggtggcgcac 2640

caatggcaga caataacgag ggcgccgacg gagtgggtaa ttcctcggga aattggcatt 2700

gcgattccac atggatgggc gacagagtca tcaccaccag cacccgaacc tgggccctgc 2760

ccacctacaa caaccacctc tacaagcaaa tctccaacag cacatctgga ggatcttcaa 2820

atgacaacgc ctacttcggc tacagcaccc cctgggggta ttttgacttt aacagattcc 2880

actgccactt ttcaccacgt gactggcagc gactcatcaa caacaactgg ggattccggc 2940

ccaagagact cagcttcaag ctcttcaaca tccaggtcaa ggaggtcacg cagaatgaag 3000

gcaccaagac catcgccaat aacctcacca gcaccatcca ggtgtttacg gactcggagt 3060

accagctgcc gtacgttctc ggctctgccc accagggctg cctgcctccg ttcccggcgg 3120

acgtgttcat gattccccag tacggctacc taacactcaa caacggtagt caggccgtgg 3180

gacgctcctc cttctactgc ctggaatact ttccttcgca gatgctgaga accggcaaca 3240

acttccagtt tacttacacc ttcgaggacg tgcctttcca cagcagctac gcccacagcc 3300

agagcttgga ccggctgatg aatcctctga ttgaccagta cctgtactac ttgtctcgga 3360

ctcaaacaac aggaggcacg acaaatacgc agactctggg cttcagccaa ggtgggccta 3420

atacaatggc caatcaggca aagaactggc tgccaggacc ctgttaccgc cagcagcgag 3480

tatcaaagac atctgcggat aacaacaaca gtgaatactc gtggactgga gctaccaagt 3540

accacctcaa tggcagagac tctctggtga atccgggccc ggccatggca agccacaagg 3600

acgatgaaga aaagtttttt cctcagagcg gggttctcat ctttgggaag caaggctcag 3660

agaaaacaaa tgtggacatt gaaaaggtca tgattacaga cgaagaggaa atcaggacaa 3720

ccaatcccgt ggctacggag cagtatggtt ctgtatctac caacctccag agaggcaacg 3780

atgggacttt ggcggtgcct tttaagagac aagcagctac cgcagatgtc aacacacaag 3840

gcgttcttcc aggcatggtc tggcaggaca gagatgtgta ccttcagggg cccatctggg 3900

caaagattcc acacacggac ggacattttc acccctctcc cctcatgggt ggattcggac 3960

ttaaacaccc tccgcctcag atcctgatca agaacacgcc tgtacctgcg gatcctccga 4020

ccaccttcaa ccagtcaaag ctgaactctt tcatcaccca gtattctact ggccaagtca 4080

gcgtggagat cgagtgggag ctgcagaagg aaaacagcaa gcgctggaac cccgagatcc 4140

agtacacctc caactactac aaatctacaa gtgtggactt tgctgttaat acagaaggcg 4200

tgtactctga accccgcccc attggcaccc gttacctcac ccgtaatctg taattgcttg 4260

ttaatcaata aaccgtttaa ttcgtttcag ttgaactttg gtctctgcgt atttctttct 4320

tatctagttt ccatggctac gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacagcc 4380

cgggcgttta aacagcgggc ggaggggtgg agtcgtgacg tgaattacgt catagggtta 4440

gggaggtcct gtattagagg tcacgtgagt gttttgcgac attttgcgac accatgtggt 4500

ctcgctgggg gggggggccc gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggttt 4560

gaacgagcgc tggcgcgctc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 4620

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 4680

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggaaa 4740

ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt 4800

tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 4860

gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taagaacgtg gactccaacg 4920

tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat 4980

caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc 5040

gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga 5100

aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac 5160

ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 5220

gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 5280

aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 5340

tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 5400

aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 5460

aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 5520

tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 5580

aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 5640

tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 5700

ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 5760

taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 5820

agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 5880

caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 5940

tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 6000

gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 6060

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 6120

caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 6180

ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 6240

aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 6300

gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 6360

atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 6420

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 6480

gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 6540

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 6600

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 6660

agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 6720

ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 6780

aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 6840

cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 6900

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 6960

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 7020

cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca 7080

gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 7140

aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 7200

actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac 7260

cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac 7320

aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 7360

<210> 3

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr Thr

405 410 415

Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Thr Asn Thr Gln Thr Leu Gly Phe

450 455 460

Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp

485 490 495

Asn Asn Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu

500 505 510

Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His

515 520 525

Lys Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe

530 535 540

Gly Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met

545 550 555 560

Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu

565 570 575

Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala

580 585 590

Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp

595 600 605

Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro

610 615 620

His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly

625 630 635 640

Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro

645 650 655

Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe Ile

660 665 670

Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu

675 680 685

Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser

690 695 700

Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly

705 710 715 720

Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn

725 730 735

Leu

<210> 4

<211> 746

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

20 25 30

Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly

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Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

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Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

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Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

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Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala Asn

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Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu

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Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

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130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

145 150 155 160

Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly

195 200 205

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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actctgggct tcagccaagg tgggcctaat acaatggcca atcaggcaaa gaactggctg 1440

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<210> 11

<211> 1866

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

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caataa 1866

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<212> DNA

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<400> 12

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

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tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc 480

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aagggcgagg aggataacat ggccagcctg cctgctacac acgagctgca catcttcgga 1260

agcatcaacg gcgtggactt tgatatggtg ggccagggaa ccggcaaccc aaacgacgga 1320

tacgaggagc tgaacctgaa gagcacaaag ggcgatctgc agttctcccc ctggattctg 1380

gtgcctcaca tcggatacgg ctttcaccag tacctgccat acccagacgg aatgagccca 1440

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gatggcgact acaaggatca cgacatcgat tacaaggacg atgacgataa gaagcggaca 1980

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atcaagctta tcgataatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt 2100

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caatgtatct tatcatgtct ggctagacac gtggccgcta ccccgaccac atgaagcagc 2820

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aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 2940

accgcacgtg cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 3000

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tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 3720

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tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg 3840

atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 3900

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atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 4020

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 4080

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 4140

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tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 4320

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 4380

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 4440

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 4500

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 4560

atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 4620

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 4680

cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 4740

tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 4800

tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 4860

gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 4920

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 4980

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 5040

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 5100

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 5160

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 5220

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 5280

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 5340

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 5400

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 5460

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 5520

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 5580

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 5640

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 5700

atgt 5704

<210> 13

<211> 11635

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtacccaac tccatgctta acagtcccca ggtacagccc accctgcgtc gcaaccagga 60

acagctctac agcttcctgg agcgccactc gccctacttc cgcagccaca gtgcgcagat 120

taggagcgcc acttcttttt gtcacttgaa aaacatgtaa aaataatgta ctaggagaca 180

ctttcaataa aggcaaatgt ttttatttgt acactctcgg gtgattattt accccccacc 240

cttgccgtct gcgccgttta aaaatcaaag gggttctgcc gcgcatcgct atgcgccact 300

ggcagggaca cgttgcgata ctggtgttta gtgctccact taaactcagg cacaaccatc 360

cgcggcagct cggtgaagtt ttcactccac aggctgcgca ccatcaccaa cgcgtttagc 420

aggtcgggcg ccgatatctt gaagtcgcag ttggggcctc cgccctgcgc gcgcgagttg 480

cgatacacag ggttgcagca ctggaacact atcagcgccg ggtggtgcac gctggccagc 540

acgctcttgt cggagatcag atccgcgtcc aggtcctccg cgttgctcag ggcgaacgga 600

gtcaactttg gtagctgcct tcccaaaaag ggtgcatgcc caggctttga gttgcactcg 660

caccgtagtg gcatcagaag gtgaccgtgc ccggtctggg cgttaggata cagcgcctgc 720

atgaaagcct tgatctgctt aaaagccacc tgagcctttg cgccttcaga gaagaacatg 780

ccgcaagact tgccggaaaa ctgattggcc ggacaggccg cgtcatgcac gcagcacctt 840

gcgtcggtgt tggagatctg caccacattt cggccccacc ggttcttcac gatcttggcc 900

ttgctagact gctccttcag cgcgcgctgc ccgttttcgc tcgtcacatc catttcaatc 960

acgtgctcct tatttatcat aatgctcccg tgtagacact taagctcgcc ttcgatctca 1020

gcgcagcggt gcagccacaa cgcgcagccc gtgggctcgt ggtgcttgta ggttacctct 1080

gcaaacgact gcaggtacgc ctgcaggaat cgccccatca tcgtcacaaa ggtcttgttg 1140

ctggtgaagg tcagctgcaa cccgcggtgc tcctcgttta gccaggtctt gcatacggcc 1200

gccagagctt ccacttggtc aggcagtagc ttgaagtttg cctttagatc gttatccacg 1260

tggtacttgt ccatcaacgc gcgcgcagcc tccatgccct tctcccacgc agacacgatc 1320

ggcaggctca gcgggtttat caccgtgctt tcactttccg cttcactgga ctcttccttt 1380

tcctcttgcg tccgcatacc ccgcgccact gggtcgtctt cattcagccg ccgcaccgtg 1440

cgcttacctc ccttgccgtg cttgattagc accggtgggt tgctgaaacc caccatttgt 1500

agcgccacat cttctctttc ttcctcgctg tccacgatca cctctgggga tggcgggcgc 1560

tcgggcttgg gagaggggcg cttctttttc tttttggacg caatggccaa atccgccgtc 1620

gaggtcgatg gccgcgggct gggtgtgcgc ggcaccagcg catcttgtga cgagtcttct 1680

tcgtcctcgg actcgagacg ccgcctcagc cgcttttttg ggggcgcgcg gggaggcggc 1740

ggcgacggcg acggggacga cacgtcctcc atggttggtg gacgtcgcgc cgcaccgcgt 1800

ccgcgctcgg gggtggtttc gcgctgctcc tcttcccgac tggccatttc cttctcctat 1860

aggcagaaaa agatcatgga gtcagtcgag aaggaggaca gcctaaccgc cccctttgag 1920

ttcgccacca ccgcctccac cgatgccgcc aacgcgccta ccaccttccc cgtcgaggca 1980

cccccgcttg aggaggagga agtgattatc gagcaggacc caggttttgt aagcgaagac 2040

gacgaggatc gctcagtacc aacagaggat aaaaagcaag accaggacga cgcagaggca 2100

aacgaggaac aagtcgggcg gggggaccaa aggcatggcg actacctaga tgtgggagac 2160

gacgtgctgt tgaagcatct gcagcgccag tgcgccatta tctgcgacgc gttgcaagag 2220

cgcagcgatg tgcccctcgc catagcggat gtcagccttg cctacgaacg ccacctgttc 2280

tcaccgcgcg taccccccaa acgccaagaa aacggcacat gcgagcccaa cccgcgcctc 2340

aacttctacc ccgtatttgc cgtgccagag gtgcttgcca cctatcacat ctttttccaa 2400

aactgcaaga tacccctatc ctgccgtgcc aaccgcagcc gagcggacaa gcagctggcc 2460

ttgcggcagg gcgctgtcat acctgatatc gcctcgctcg acgaagtgcc aaaaatcttt 2520

gagggtcttg gacgcgacga gaaacgcgcg gcaaacgctc tgcaacaaga aaacagcgaa 2580

aatgaaagtc actgtggagt gctggtggaa cttgagggtg acaacgcgcg cctagccgtg 2640

ctgaaacgca gcatcgaggt cacccacttt gcctacccgg cacttaacct accccccaag 2700

gttatgagca cagtcatgag cgagctgatc gtgcgccgtg cacgacccct ggagagggat 2760

gcaaacttgc aagaacaaac cgaggagggc ctacccgcag ttggcgatga gcagctggcg 2820

cgctggcttg agacgcgcga gcctgccgac ttggaggagc gacgcaagct aatgatggcc 2880

gcagtgcttg ttaccgtgga gcttgagtgc atgcagcggt tctttgctga cccggagatg 2940

cagcgcaagc tagaggaaac gttgcactac acctttcgcc agggctacgt gcgccaggcc 3000

tgcaaaattt ccaacgtgga gctctgcaac ctggtctcct accttggaat tttgcacgaa 3060

aaccgcctcg ggcaaaacgt gcttcattcc acgctcaagg gcgaggcgcg ccgcgactac 3120

gtccgcgact gcgtttactt atttctgtgc tacacctggc aaacggccat gggcgtgtgg 3180

cagcaatgcc tggaggagcg caacctaaag gagctgcaga agctgctaaa gcaaaacttg 3240

aaggacctat ggacggcctt caacgagcgc tccgtggccg cgcacctggc ggacattatc 3300

ttccccgaac gcctgcttaa aaccctgcaa cagggtctgc cagacttcac cagtcaaagc 3360

atgttgcaaa actttaggaa ctttatccta gagcgttcag gaattctgcc cgccacctgc 3420

tgtgcgcttc ctagcgactt tgtgcccatt aagtaccgtg aatgccctcc gccgctttgg 3480

ggtcactgct accttctgca gctagccaac taccttgcct accactccga catcatggaa 3540

gacgtgagcg gtgacggcct actggagtgt cactgtcgct gcaacctatg caccccgcac 3600

cgctccctgg tctgcaattc gcaactgctt agcgaaagtc aaattatcgg tacctttgag 3660

ctgcagggtc cctcgcctga cgaaaagtcc gcggctccgg ggttgaaact cactccgggg 3720

ctgtggacgt cggcttacct tcgcaaattt gtacctgagg actaccacgc ccacgagatt 3780

aggttctacg aagaccaatc ccgcccgcca aatgcggagc ttaccgcctg cgtcattacc 3840

cagggccaca tccttggcca attgcaagcc atcaacaaag cccgccaaga gtttctgcta 3900

cgaaagggac ggggggttta cctggacccc cagtccggcg aggagctcaa cccaatcccc 3960

ccgccgccgc agccctatca gcagccgcgg gcccttgctt cccaggatgg cacccaaaaa 4020

gaagctgcag ctgccgccgc cgccacccac ggacgaggag gaatactggg acagtcaggc 4080

agaggaggtt ttggacgagg aggaggagat gatggaagac tgggacagcc tagacgaagc 4140

ttccgaggcc gaagaggtgt cagacgaaac accgtcaccc tcggtcgcat tcccctcgcc 4200

ggcgccccag aaattggcaa ccgttcccag catcgctaca acctccgctc ctcaggcgcc 4260

gccggcactg cctgttcgcc gacccaaccg tagatgggac accactggaa ccagggccgg 4320

taagtctaag cagccgccgc cgttagccca agagcaacaa cagcgccaag gctaccgctc 4380

gtggcgcggg cacaagaacg ccatagttgc ttgcttgcaa gactgtgggg gcaacatctc 4440

cttcgcccgc cgctttcttc tctaccatca cggcgtggcc ttcccccgta acatcctgca 4500

ttactaccgt catctctaca gcccctactg caccggcggc agcggcagcg gcagcaacag 4560

cagcggtcac acagaagcaa aggcgaccgg atagcaagac tctgacaaag cccaagaaat 4620

ccacagcggc ggcagcagca ggaggaggag cgctgcgtct ggcgcccaac gaacccgtat 4680

cgacccgcga gcttagaaat aggatttttc ccactctgta tgctatattt caacaaagca 4740

ggggccaaga acaagagctg aaaataaaaa acaggtctct gcgctccctc acccgcagct 4800

gcctgtatca caaaagcgaa gatcagcttc ggcgcacgct ggaagacgcg gaggctctct 4860

tcagcaaata ctgcgcgctg actcttaagg actagtttcg cgccctttct caaatttaag 4920

cgcgaaaact acgtcatctc cagcggccac acccggcgcc agcacctgtc gtcagcgcca 4980

ttatgagcaa ggaaattccc acgccctaca tgtggagtta ccagccacaa atgggacttg 5040

cggctggagc tgcccaagac tactcaaccc gaataaacta catgagcgcg ggaccccaca 5100

tgatatcccg ggtcaacgga atccgcgccc accgaaaccg aattctcctc gaacaggcgg 5160

ctattaccac cacacctcgt aataacctta atccccgtag ttggcccgct gccctggtgt 5220

accaggaaag tcccgctccc accactgtgg tacttcccag agacgcccag gccgaagttc 5280

agatgactaa ctcaggggcg cagcttgcgg gcggctttcg tcacagggtg cggtcgcccg 5340

ggcgttttag ggcggagtaa cttgcatgta ttgggaattg tagttttttt aaaatgggaa 5400

gtgacgtatc gtgggaaaac ggaagtgaag atttgaggaa gttgtgggtt ttttggcttt 5460

cgtttctggg cgtaggttcg cgtgcggttt tctgggtgtt ttttgtggac tttaaccgtt 5520

acgtcatttt ttagtcctat atatactcgc tctgtacttg gcccttttta cactgtgact 5580

gattgagctg gtgccgtgtc gagtggtgtt ttttaatagg tttttttact ggtaaggctg 5640

actgttatgg ctgccgctgt ggaagcgctg tatgttgttc tggagcggga gggtgctatt 5700

ttgcctaggc aggagggttt ttcaggtgtt tatgtgtttt tctctcctat taattttgtt 5760

atacctccta tgggggctgt aatgttgtct ctacgcctgc gggtatgtat tcccccgggc 5820

tatttcggtc gctttttagc actgaccgat gttaaccaac ctgatgtgtt taccgagtct 5880

tacattatga ctccggacat gaccgaggaa ctgtcggtgg tgctttttaa tcacggtgac 5940

cagttttttt acggtcacgc cggcatggcc gtagtccgtc ttatgcttat aagggttgtt 6000

tttcctgttg taagacaggc ttctaatgtt taaatgtttt tttttttgtt attttatttt 6060

gtgtttaatg caggaacccg cagacatgtt tgagagaaaa atggtgtctt tttctgtggt 6120

ggttccggaa cttacctgcc tttatctgca tgagcatgac tacgatgtgc ttgctttttt 6180

gcgcgaggct ttgcctgatt ttttgagcag caccttgcat tttatatcgc cgcccatgca 6240

acaagcttac ataggggcta cgctggttag catagctccg agtatgcgtg tcataatcag 6300

tgtgggttct tttgtcatgg ttcctggcgg ggaagtggcc gcgctggtcc gtgcagacct 6360

gcacgattat gttcagctgg ccctgcgaag ggacctacgg gatcgcggta tttttgttaa 6420

tgttccgctt ttgaatctta tacaggtctg tgaggaacct gaatttttgc aatcatgatt 6480

cgctgcttga ggctgaaggt ggagggcgct ctggagcaga tttttacaat ggccggactt 6540

aatattcggg atttgcttag agacatattg ataaggtggc gagatgaaaa ttatttgggc 6600

atggttgaag gtgctggaat gtttatagag gagattcacc ctgaagggtt tagcctttac 6660

gtccacttgg acgtgagggc agtttgcctt ttggaagcca ttgtgcaaca tcttacaaat 6720

gccattatct gttctttggc tgtagagttt gaccacgcca ccggagggga gcgcgttcac 6780

ttaatagatc ttcattttga ggttttggat aatcttttgg aataaaaaaa aaaaaacatg 6840

gttcttccag ctcttcccgc tcctcccgtg tgtgactcgc agaacgaatg tgtaggttgg 6900

ctgggtgtgg cttattctgc ggtggtggat gttatcaggg cagcggcgca tgaaggagtt 6960

tacatagaac ccgaagccag ggggcgcctg gatgctttga gagagtggat atactacaac 7020

tactacacag agcgagctaa gcgacgagac cggagacgca gatctgtttg tcacgcccgc 7080

acctggtttt gcttcaggaa atatgactac gtccggcgtt ccatttggca tgacactacg 7140

accaacacga tctcggttgt ctcggcgcac tccgtacagt agggatcgcc tacctccttt 7200

tgagacagag acccgcgcta ccatactgga ggatcatccg ctgctgcccg aatgtaacac 7260

tttgacaatg cacaacgtga gttacgtgcg aggtcttccc tgcagtgtgg gatttacgct 7320

gattcaggaa tgggttgttc cctgggatat ggttctgacg cgggaggagc ttgtaatcct 7380

gaggaagtgt atgcacgtgt gcctgtgttg tgccaacatt gatatcatga cgagcatgat 7440

gatccatggt tacgagtcct gggctctcca ctgtcattgt tccagtcccg gttccctgca 7500

gtgcatagcc ggcgggcagg ttttggccag ctggtttagg atggtggtgg atggcgccat 7560

gtttaatcag aggtttatat ggtaccggga ggtggtgaat tacaacatgc caaaagaggt 7620

aatgtttatg tccagcgtgt ttatgagggg tcgccactta atctacctgc gcttgtggta 7680

tgatggccac gtgggttctg tggtccccgc catgagcttt ggatacagcg ccttgcactg 7740

tgggattttg aacaatattg tggtgctgtg ctgcagttac tgtgctgatt taagtgagat 7800

cagggtgcgc tgctgtgccc ggaggacaag gcgtctcatg ctgcgggcgg tgcgaatcat 7860

cgctgaggag accactgcca tgttgtattc ctgcaggacg gagcggcggc ggcagcagtt 7920

tattcgcgcg ctgctgcagc accaccgccc tatcctgatg cacgattatg actctacccc 7980

catgtaggcg tggacttccc cttcgccgcc cgttgagcaa ccgcaagttg gacagcagcc 8040

tgtggctcag cagctggaca gcgacatgaa cttaagcgag ctgcccgggg agtttattaa 8100

tatcactgat gagcgtttgg ctcgacagga aaccgtgtgg aatataacac ctaagaatat 8160

gtctgttacc catgatatga tgctttttaa ggccagccgg ggagaaagga ctgtgtactc 8220

tgtgtgttgg gagggaggtg gcaggttgaa tactagggtt ctgtgagttt gattaaggta 8280

cggtgatcaa tataagctat gtggtggtgg ggctatacta ctgaatgaaa aatgacttga 8340

aattttctgc aattgaaaaa taaacacgtt gaaacataac atgcaacagg ttcacgattc 8400

tttattcctg ggcaatgtag gagaaggtgt aagagttggt agcaaaagtt tcagtggtgt 8460

attttccact ttcccaggac catgtaaaag acatagagta agtgcttacc tcgctagttt 8520

ctgtggattc actagaatcg atgtaggatg ttgcccctcc tgacgcggta ggagaagggg 8580

agggtgccct gcatgtctgc cgctgctctt gctcttgccg ctgctgagga ggggggcgca 8640

tctgccgcag caccggatgc atctgggaaa agcaaaaaag gggctcgtcc ctgtttccgg 8700

aggaatttgc aagcggggtc ttgcatgacg gggaggcaaa cccccgttcg ccgcagtccg 8760

gccggcccga gactcgaacc gggggtcctg cgactcaacc cttggaaaat aaccctccgg 8820

ctacagggag cgagccactt aatgctttcg ctttccagcc taaccgctta cgccgcgcgc 8880

ggccagtggc caaaaaagct agcgcagcag ccgccgcgcc tggaaggaag ccaaaaggag 8940

cgctcccccg ttgtctgacg tcgcacacct gggttcgaca cgcgggcggt aaccgcatgg 9000

atcacggcgg acggccggat ccggggttcg aaccccggtc gtccgccatg atacccttgc 9060

gaatttatcc accagaccac ggaagagtgc ccgcttacag gctctccttt tgcacggtct 9120

agagcgtcaa cgactgcgca cgcctcaccg gccagagcgt cccgaccatg gagcactttt 9180

tgccgctgcg caacatctgg aaccgcgtcc gcgactttcc gcgcgcctcc accaccgccg 9240

ccggcatcac ctggatgtcc aggtacatct acggattacg tcgacgttta aaccatatga 9300

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 9360

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 9420

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 9480

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 9540

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 9600

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 9660

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 9720

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 9780

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 9840

cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 9900

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 9960

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 10020

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 10080

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 10140

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 10200

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 10260

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 10320

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 10380

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 10440

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 10500

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 10560

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 10620

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 10680

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 10740

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 10800

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 10860

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 10920

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 10980

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 11040

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 11100

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 11160

aaagtgccac ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt 11220

aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 11280

aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 11340

acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 11400

aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc 11460

ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 11520

aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 11580

gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgatg gatcc 11635

Claims

1.一种变异型腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述衣壳蛋白相比野生型腺相关病毒AAV-DJ衣壳蛋白VP1，包括第558位氨基酸K的突变。

2.如权利要求1所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述第558位氨基酸K的突变为K558R突变。

3.如权利要求2所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述衣壳蛋白相比野生型AAV-DJ衣壳蛋白VP1，还插入有SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段，插入位点为野生型AAV-DJ衣壳蛋白VP1的N589与R590之间。

4.如权利要求3所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述野生型AAV-DJ衣壳蛋白VP1的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求1所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白，其特征在于，所述变异型腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～5任一项所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白。

7.一种构建体，所述构建体含有如权利要求6所述的核酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求7所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求6所述的核酸。

9.一种变异型腺相关病毒，其特征在于，所述变异型腺相关病毒的衣壳结构含有如权利要求1～5任一项所述的变异型腺相关病毒衣壳蛋白。

10.如权利要求9所述的变异型腺相关病毒，其特征在于，所述变异型腺相关病毒还包括编码目的产物的异源核苷酸序列。

11.使用如权利要求9或10所述的变异型腺相关病毒转化的宿主细胞。

12.一种变异型腺相关病毒载体系统，其特征在于，包含包装质粒，所述包装质粒中包含权利要求6所述的核酸片段。

13.如权利要求12所述的变异型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述包装质粒中还包含腺相关病毒的rep基因片段。

14.根据权利要求12所述的变异型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括表达质粒，所述表达质粒包含负责编码目的产物的异源核苷酸。

15.根据权利要求12-14任一项所述的变异型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括辅助病毒质粒，和/或，所述腺相关病毒载体系统还包括宿主细胞。

16.一种变异型腺相关病毒，由权利要求12-15任一权利要求所述变异型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。

17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求9、10或16所述的变异型腺相关病毒以及药学上可接受的载体。

18.如权利要求9、10或16所述的变异型腺相关病毒或如权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12-15任一所述的变异型腺相关病毒载体系统，或如权利要求17所述的药物组合物在制备治疗疾病的药物中的用途；优选地，在制备基因治疗疾病的药物中的用途。

19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病选自听力障碍疾病、炎症、肿瘤、代谢疾病、疼痛、神经退行性炎症疾病中的一种或几种。

20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，包括以下1)～5)中的至少一项：

1)所述听力障碍疾病由耳蜗损伤导致；

2)所述听力障碍疾病为细胞损伤的相关疾病；

3)所述听力障碍疾病为由基因缺陷导致的相关疾病；

4)所述听力障碍疾病为由环境因素导致的相关疾病；所述环境因素选自噪声或耳毒性药物；

5)所述听力障碍疾病为由衰老导致的相关疾病。

21.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述药物包括以下1)～4)中的至少一项的功能：

1)诱导HC细胞再生或类HC细胞再生；

2)诱导HC细胞再生或类HC细胞再生，所述再生的HC细胞或类HC细胞表达Myo7a和/或Sox2；

3)在GER区域诱导产生HC细胞或类HC细胞；

4)通过过表达Atoh1以及其它再生因子诱导耳蜗中的类HC细胞再生。