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CN116549626A - 一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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CN116549626A
CN116549626A CN202210103281.8A CN202210103281A CN116549626A CN 116549626 A CN116549626 A CN 116549626A CN 202210103281 A CN202210103281 A CN 202210103281A CN 116549626 A CN116549626 A CN 116549626A
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freeze
lipid nanoparticle
loaded lipid
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CN202210103281.8A
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胡勇
李亚霏
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Shenzhen Ruiji Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Ruiji Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用。本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法包括步骤：配制含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液；降温进行预冻；在真空条件下升温进行干燥，使体系含水量在3％以下，制备得到载核酸脂质纳米颗粒的干燥制剂。本发明制备得到载核酸脂质纳米颗粒的干燥制剂可在常温下长期保存，复溶后，依然维持着稳定的纳米粒径和zeta电位，具有相当高的核酸包封率以及生物活性，特别适用于针对新型冠状病毒的mRNA疫苗冻干粉制剂的制备。

Description

一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及核酸药物技术领域，具体而言，是关于一种载核酸脂质纳米颗粒特别是针对新型冠状病毒的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻制剂、其制备方法与相关应用。
背景技术
新型冠状病毒感染已知可引起呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，较严重感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征等。世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”。面对复杂的流行形势，业内先后开发了灭活疫苗、蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、mRNA疫苗，其中，mRNA疫苗作为研发的最新热点，具有研发周期短、能快速应对病毒变异、体液免疫及T细胞免疫双重机制、免疫原性强等优势。但是，目前上市的mRNA疫苗均为液体产品，一直未能实现新型冠状病毒mRNA疫苗的冻干工艺突破，导致当前疫苗产品存在保存条件苛刻、保存周期短等问题。
mRNA疫苗中，功效成分mRNA是以载核酸脂质纳米颗粒形式存在。通常而言，载核酸脂质纳米颗粒在水相介质中稳定性极差，其原因主要包括两方面：一是mRNA本身很容易因氧化、水解、酶解等失活；二是脂质纳米颗粒由多个组分组成，各组分间存在复杂的相互作用力，易受溶剂盐分、pH、温度、氧气等各类因素影响，导致mRNA的释放或纳米颗粒的团聚，进而极大地影响药效(International Journal of Pharmaceutics601(2021):120586)。
为了延长载核酸纳米颗粒类药物的保存周期，往往需要在超低温环境下运输及保存。以辉瑞公司的COVID-19疫苗BNT162b2为例，它需在﹣80℃～﹣60℃条件下运输存储，室温解冻后仅能稳定2小时。如此苛刻的保存条件极大地限制了核酸药物的可及性。目前市面上尚无可常温或低温(2℃～8℃)长期保存的核酸类COVID-19疫苗(Journal ofPharmaceutical Sciences 110.3(2021):997-1001)。
为了克服脂质纳米颗粒长期储存时的物理和化学不稳定性问题，可以将脂质纳米颗粒冷冻干燥，干燥粉末可长期保存于4℃，给药前再水化复溶即可。然而，脂质纳米颗粒成分复杂，对冷冻和干燥工艺敏感，特别是对于核酸大分子来说，冷冻干燥过程产生的应力极容易破坏其活性结构，且脂质纳米颗粒额外引入了可离子化脂质组分，颗粒内增加的静电作用力会极大影响其物理和化学性质。Zhao等人研究了一份载核酸脂质纳米颗粒的冻干工艺，冻干后的颗粒虽然保持了良好的粒径和体外转染活性，但体内转染效果急剧降低。其原因可能在于冻干过程改变了纳米颗粒的各组分分布和相互作用方式，使其体内富集和稳定性等性质发生了变化(Bioactive materials,5(2),358-363)。亦有研究表明，尽管常规防冻添加剂的添加防止冷冻期间的颗粒聚集，但仍可能会使得冻干制剂不具备功能性(例如，W.Abdelwahed等人，Adv.Drug Del.Rev.58(2006)，1688-1713；J.C.Kasper等人，J.Contr.Rel.151(2011)，246-255)。现有技术的研究表明，用标准冷冻保护剂(如糖类)不能可靠地实现冷冻期间纳米颗粒或微颗粒的稳定化(CN112153985A)。
为了提高载核酸脂质纳米颗粒的稳定性和可及性，维持其高生物活性，研发一份合适的冻干技术迫在眉睫。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种载核酸大分子脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法，以避免或减少载核酸脂质纳米颗粒在冻干及储藏过程中的结构破坏，延长核酸药物的保存期限，方便运输和储藏。
本发明的另一目的在于提供一种载核酸脂质纳米颗粒的冷冻制剂。
本发明的另一目的在于提供载核酸脂质纳米颗粒的冷冻制剂的相关用途。
本发明的另一目的在于提供一种用于载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护组合物。
一方面，本发明提供了一种载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法，该方法包括步骤：
a)配制含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液；
b)降温进行预冻；
c)在真空条件下升温进行干燥，使体系含水量在3％以下，制备得到载核酸脂质纳米颗粒的干燥制剂。
本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法，可制备得到一种干燥粉形式的载核酸脂质纳米颗粒的干燥制剂，其含水量在3％以下，优选在2％以下，其复溶后，依然维持着稳定的纳米粒径和zeta电位、具有相当高的核酸包封率以及生物活性，可在常温下长期保存。
根据本发明的具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所述的冷冻干燥保护剂包括以下保护剂1至保护剂3中的一种或多种：
保护剂1：蔗糖；
保护剂2：蔗糖和非离子表面活性剂；
保护剂3：蔗糖和海藻糖。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所述的冷冻干燥保护剂包括蔗糖，还可选择性地包括非离子表面活性剂和/或海藻糖。
根据本发明的具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，蔗糖的质量体积浓度为10％～20％(即，10～20g/100mL)，优选为12～18％。
根据本发明的具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，海藻糖的质量体积浓度为0％～20％，优选为0％～5％，更优选为0.5％～3％。
根据本发明的具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，非离子表面活性剂的质量体积浓度为0％～2％。在本发明的一些具体实施方案中，所述非离子表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆，例如可以是Pluronic F-68。泊洛沙姆在所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中的质量体积浓度优选为0.005％～1％，更优选为0.01％～0.5％。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，蔗糖的质量体积浓度为10％～20％，海藻糖的质量体积浓度为0.5％～5％。非离子表面活性剂的质量体积浓度为0％～1％。
在一些更具体的实施方案中，本发明所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，包括质量体积浓度15％的蔗糖与2.5％的海藻糖。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，蔗糖的质量体积浓度为10％～20％，非离子表面活性剂(泊洛沙姆)的质量体积浓度为0.01％～1％，海藻糖的质量体积浓度为0％～5％。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，缓冲体系为Tris、柠檬酸盐、醋酸盐或磷酸盐缓冲体系。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，Tris的浓度为10-50mM。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液的pH值为6.5～8.5，优选为6.9～7.9。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所述的降温进行预冻的方式为：降温至﹣80℃～﹣45℃进行预冻；优选地，以每分钟0.5℃～2.0℃的速率进行降温。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，降温至2℃～6℃时维持恒温20min～60min。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，降温至﹣80℃～﹣45℃后维持恒温冷冻1小时～6小时。优选地，维持在﹣55℃～﹣45℃冷冻2～4小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，预冻之后控制在真空条件下升温进行干燥。为达到所述真空条件，本发明的方法具体还可包括抽真空的过程。本发明中，所述抽真空的过程可以在预冻过程特别是在“降温至﹣80℃～﹣45℃后维持恒温冷冻2小时～4小时”结束之后或即将结束时进行，也可在升温进行干燥的初期(例如升温开始15min之内)进行。抽真空的具体操作按照所属领域的常规操作进行即可。根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，控制抽真空至0.5Pa～10Pa，优选抽真空至1Pa～6Pa。通常从常温抽真空至1Pa～6Pa的时间在10min以内。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，控制在真空条件下(0.5Pa～10Pa，优选1Pa～6Pa)温度上升至4℃～22℃进行干燥。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，干燥过程至少包括：
控制在﹣60℃～﹣2℃干燥16小时～48小时；以及
控制在2℃～8℃干燥5小时～20小时。
本发明中，在﹣60℃～﹣2℃的干燥基本上为升华干燥，在2℃～8℃的干燥基本上为解析干燥。
根据本发明的优选实施方案，在2℃～8℃的干燥过程为6～16小时。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，升温时，控制温度以每分钟0.3℃～2.0℃优选为0.5℃～1.5℃的速率上升。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，控制在﹣60℃～﹣2℃干燥16小时～48小时的过程包括：
第一阶段：从﹣80℃～﹣45℃升温至﹣60℃～﹣22℃，并控制在﹣60℃～﹣22℃干燥12小时～40小时；
第二阶段：然后升温至﹣22℃～﹣2℃，并控制在﹣22℃～﹣2℃干燥2小时～20小时。
更具体地，上述第一阶段、第二阶段的干燥过程优选维持在所述温度范围内的预定温度恒温进行。所述第一阶段、第二阶段均可设定一个或多个预定的恒温温度，优选地，相邻的预定恒温温度的温差为5℃～45℃，优选为5℃～20℃。在本发明的一些具体实施方案中，第一阶段包括2、3或4个预定恒温温度，第二阶段包括1个或2个预定的恒温温度。各预定恒温温度下维持至少1小时进行干燥。根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，控制在﹣60℃～﹣5℃干燥16小时～48小时的过程中，分别在以下温度段设置恒温温度：﹣60℃～﹣32℃，﹣32℃～﹣22℃，﹣22℃～﹣12℃，﹣12℃～﹣2℃。
本发明中，所述“恒温”允许与目标温度存在±1℃误差。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，干燥过程还可包括：控制在2℃～8℃(可在该温度范围内某一温度维持恒温)干燥5小时～20小时之后，进一步升温至15℃～22℃，并在15℃～22℃(可在该温度范围内某一温度维持恒温)干燥20min～4小时。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，升温干燥过程包括采用如下梯度升温干燥：
以每分钟0.5℃～2.0℃的升温速率从﹣80℃～﹣45℃升温至﹣60℃～﹣32℃，并在﹣60℃～﹣32℃维持恒温干燥10小时～30小时；优选地，维持12小时～28小时；
然后以每分钟0.5℃～2.0℃的升温速率升温至﹣32℃～﹣22℃，并在﹣32℃～﹣22℃维持恒温干燥2小时～15小时；优选地，维持2小时～10小时；
然后以每分钟0.5℃～2.0℃的升温速率升温至﹣22℃～﹣12℃，并在﹣22℃～﹣12℃维持恒温干燥1小时～10小时；优选地，维持1小时～5小时；
然后以每分钟0.5℃～2.0℃的升温速率升温至﹣12℃～﹣2℃，并在﹣12℃～﹣2℃维持恒温干燥1小时～10小时；优选地，维持1小时～5小时；
然后以每分钟0.5℃～2.0℃的升温速率升温至2℃～8℃，并在2℃～8℃维持恒温干燥5小时～20小时；优选地，维持6小时～16小时；
然后以每分钟0.5℃～2.0℃的升温速率升温至18℃～22℃，并在18℃～22℃维持恒温干燥20min～4小时；优选地，维持30min～2小时；。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，优选控制在真空条件下干燥过程的总时间小于72小时，优选为24小时～60小时，更优选为24小时～48小时。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，抽真空及升温进行干燥的过程在玻璃容器中进行，每单元玻璃容器中的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液体积为0.1mL至5mL。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，核酸的浓度为0.01-1.0mg/mL，优选为0.05～0.5mg/mL。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，载核酸脂质纳米颗粒的粒径为50nm～200nm，优选为50nm～150nm。
根据本发明的具体实施方案，所述的载核酸脂质纳米颗粒中的核酸包括但不限于DNA，siRNA，mRNA，ASO，或其任意组合。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中的核酸包括自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA或长非编码RNA(IncRNA)的核糖核苷酸。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的核酸其序列至少包含300个核苷酸。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的核酸其序列至少包含1000个核苷酸。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的核酸为编码冠状病毒抗原、荧光素酶或癌抗原的mRNA。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的编码冠状病毒抗原的mRNA为编码新型冠状病毒NTD-RBD天然结构域的mRNA。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述mRNA的编码区序列具有如SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列。所述mRNA还可包括UTR区，以及根据需要进行加尾、加帽和/或其他修饰。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒的组分包括核酸与脂质，所述脂质包括正电荷脂质、可离子化脂质、中性辅助脂质、胆固醇和PEG修饰的脂质中的一种或多种，优选包括两种或更多种。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述脂质包括：
a)正电荷脂质和/或可离子化脂质中的至少一种；
b)中性辅助脂质；
c)胆固醇；以及
d)PEG修饰的脂质。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，正电荷脂质和/或可离子化脂质与核酸的氮磷摩尔比为5:1～10:1。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，以脂质的总摩尔量为100％计，各脂质成分的摩尔比为：
正电荷脂质或可离子化脂质 46％～50％；
中性辅助脂质 5％～10％；
胆固醇 38.5％～48％；
PEG修饰的脂质 0～3％。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的正电荷脂质包括但不限于：DOTMA、DOTAP中的一种或多种。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的可离子化脂质包括但不限于：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(Dlin-MC3-DMA)、SM-102、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)中的一种或多种。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的中性辅助脂质包括但不限于：DSPC、DOPE、DSPE中的一种或多种。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，所述的PEG修饰的脂质包括但不限于：甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、DMG-PEG中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供了一种载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，其是载核酸脂质纳米颗粒与冷冻干燥保护剂混合后经冷冻干燥制备得到的冻干制剂，其含水量3％以下，优选2％以下。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，外观均匀饱满无凹陷，复溶后溶液均一透明，粒径较小且多分散系数低，血清稳定性良好，维持了原本的生物活性。本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂是一种可在非冷冻条件下储存的制剂。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的冻干制品能在25℃下保存至少14天无明显变化。本发明的冻干制剂的保存最佳条件可为2-8℃。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，该冻干制剂复溶后的颗粒粒径为50nm～220nm，优选为50nm～200nm，更优选为70nm～180nm，更进一步优选为70nm～150nm；多分散系数0.3以下(通常为0.06～0.2)。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，包封率70％以上，优选75％以上，进一步优选80％以上，更进一步优选85％以上。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，复溶时间20秒以内，肉眼观察溶液澄清无沉淀。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，其是根据本发明前述的方法制备得到的。
另一方面，本发明还提供了本发明所述的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂在制备核酸疫苗中的应用。
具体应用时，可以水将本发明的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂复溶，作为注射疫苗使用。优选地，控制复溶后的溶液中核酸的浓度为0.01-1.0mg/mL，优选为0.05～0.5mg/mL。
根据本发明的一些具体实施方案，上述含载核酸脂质纳米颗粒的疫苗包括但不限于核酸类COVID-19疫苗。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明通过调控脂质体组分、盐分、保护剂种类和浓度以及冻干工艺，应用到荧光素酶mRNA和新型冠状病毒mRNA疫苗进行验证。在一些优选的实施方案中，本发明采用程序降温法，在-50℃进行预冻后，梯度升温至-10℃进行升华干燥，再升温至4℃进行解析干燥，采用的冻干保护剂配方为：20mM Tris缓冲液(pH 6.9～7.9)，15％蔗糖+2.5％海藻糖，所制备的载荧光素酶mRNA和新型冠状病毒mRNA疫苗的冻干粉复溶后，均展现了良好的粒径分布、包封率、高血清稳定性和体内活性。
另一方面，本发明还提供了一种用于载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护组合物，该组合物包括前述本发明的冷冻干燥保护剂与缓冲体系试剂，其中：
所述冷冻干燥保护剂包括以下保护剂1至保护剂3中的一种或多种：
保护剂1：蔗糖；
保护剂2：蔗糖和非离子表面活性剂；非离子表面活性剂优选包括泊洛沙姆；
保护剂3：蔗糖和海藻糖。
所述缓冲体系试剂包括Tris、柠檬酸盐、醋酸盐或磷酸盐。
本发明的用于载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护组合物中，蔗糖在本发明的冻干过程中有利于保护脂质纳米颗粒的结构，海藻糖有利于维持冻干制剂骨架结构，使冻干产品形状饱满，孔隙酥松，易复溶。
本发明中，所述“脂质体”可分为可离子化脂质、正电荷脂质和电中性的脂质体。所述可离子化脂质在血液循环中不带电荷，但是在较低的pH环境下被质子化，比如在内涵体和溶酶体中。所述正电荷脂质体是指一直带有正电荷的脂质体。
本发明中，除特殊注明外，所述颗粒的粒径是指平均粒径。
本发明中，除特殊注明外，所述操作温度和压力在常温常压或所述领域的常规操作条件下进行。
综上所述，本发明提供了一种载核酸药物脂质纳米颗粒的冷冻制剂及其制备方法与相关应用，可实现载核酸药物脂质纳米颗粒的冷冻干燥和长期保存，改变以往核酸药物无实用的冻干工艺的情况。
附图说明
图1显示本发明一具体实施例中Luc-LNP1冻干前后体内荧光亮度实验结果。
图2显示本发明一具体实施例中部分冻干产品形貌。
图3显示本发明一具体实施例中21日各组小鼠中和抗体滴度实验结果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。未详细注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或商厂说明书建议的操作进行。
在以下具体实例部分，在制备脂质体时，如未另外提及，以相应摩尔比例的物料来列明配方。
试剂材料：
((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(2-hexyl-decanoic acid,1,1'-[[(4-hydroxybutyl)imino]di-6,1-hexanediyl]ester,ALC-0315,>99％)，2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵((2,3-Dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium-chloride,DOTAP,>99％)，二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,DOPE,>99％)，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine,DSPC,>99％)，甲氧基聚乙二醇二硝基乙酰胺(2-[(polyethyleneglycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide,ALC-0159,>99％)，1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000,DMG-PEG2000,>99％)，购自厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司；
胆固醇(Cholesterol)，海藻糖，蔗糖，购自艾伟拓(上海)医药科技有限公司；
柠檬酸，柠檬酸钠，三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，购自Sigma-Aldrich；
无水乙醇购于湖南湘易康制药有限公司。
实验所用的Covid-19mRNA为本发明自行制备。
实验中使用的雌性C57Bl/6小鼠(15周龄)来源于拓普生物科技有限公司，动物安置在拓普生物科技有限公司实验动物房，可以自由摄取食物和水(SPF级，22℃，55％湿度，12小时白天/黑夜)。
Covid-19 mRNA的制备实施例
1、根据SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示mRNA序列，合成对应的DNA片段，并将所述DNA片段克隆至表达质粒获得重组质粒，将所述重组质粒转入宿主细胞获得重组细胞，从扩繁后的重组细胞中提取质粒。构建好表达质粒按如下反应体系进行DNA模板的扩增：
反应体积50μl(为单个管的反应体积，一次同时反应多管)；
PCR扩增的体系(50μl)：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl、引物F(10μmol/L)1.2μl、引物R(10μmol/L)1.2μl、DNA模板(1ng/μl)1μl和水21.6μl。
PCR的扩增程序：预变性98℃3min；变性98℃10s，退火60℃5s，延伸72℃2min，34个循环；最后延伸72℃，10min。
反应结束后，将反应液合并于1.5ml Tube管中。取10μl进行DNA琼脂糖凝胶电泳(1.5％琼脂糖，5V/min，40min)。根据电泳目的条带的大小对反应成功与否进行确认。
合格标准：电泳检测出现单一的条带，且大小正确。
测定结果：条带大小单一，大小符合要求。
2、DNA模板超滤
利用Millipore 30Kd超滤管浓缩上述获得的DNA模板。
3、DNA模板FPLC纯化
将上述超滤得到的DNA，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液(苯酚/氯仿/异戊醇＝25/24/1)，充分震荡后，12000g离心15min。
去掉沉淀，转移上清至新的离心管中，加入上清体积的1/10 3M NaAc(PH5.2)，混匀，然后加入2倍体积的无水乙醇，混匀，至于-20℃静置30min。
4℃，12000g离心10min，弃上清。
用70％乙醇洗涤沉淀，12000g离心5min，取上清，于超净台晾干5min。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的DNA模板。
用NanoDrop分光光度计检测纯化后模板的浓度，以及吸收波长(nm)260/280、260/230的比值。取样进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测(1.5％琼脂糖，5V/min，40min)。
合格标准：260/280介于1.8至2.1之间，260/230在1.6至2.2之间。
测定结果：浓度为500ng/μl，260/280＝1.90，260/230＝1.7。
4、FPLC纯化后模板超滤
Millipore 30Kd超滤管浓缩FPLC纯化后的DNA模板，用RNase-free水洗脱溶解。用NanoDrop分光光度计检测超滤后模板的浓度，以及260/280、260/230的比值。最终用RNase-free水稀释至150ng/μl。
测定结果：浓度为150ng/μl，260/280＝1.95，260/230＝1.85。
5、mRNA的体外合成
在恒温反应器中，进行mRNA的体外合成。
按照如下合成体系进行(反应试剂按照从上至下添加)：
反应体积，1600μl(置于2ml RNase-free Tube管中，为单个管的反应体积，一次同时反应多管)：RNA-free水440μl、7.5mM的ATP 160μl、7.5mM的N1-甲基-假尿苷160μl、7.5mM的CTP 160μl、7.5mM的GTP 160μl、7.5mM的M7G(2’OMeA)pG 160μl、150ng/μl的DNA模板40μl、10×Buffer 160μl和Enzyme Mix 160μl。
所述RNA体外合成的程序为37℃，10h。
6、DNase I消化去除DNA模板
向mRNA体外合成后的每个Tube管中各加入120μl DNase I。
上下颠倒10次混匀，1000rpm离心10s。
重新置于恒温反应器中，37℃，1h。
反应结束后，将反应液合并到RNase-free 50ml Tube管中，检测DNA片段的残留。三次测量结果为0.013ng，0.016ng，0.017ng每100ug mRNA。
7、mRNA沉淀回收
向上一步骤中的每个50ml Tube管中，加入等体积的醋酸铵溶液。
上下颠倒10次混匀。
置于-20℃2h，沉淀。
17000g，4℃离心，30min。
去掉上清，用70％乙醇洗涤沉淀。
17000g，4℃离心，10min。
去掉70％乙醇，于超净台中蒸干，每管加入RNase-free水20ml。
静置10min后，用枪头轻吹混匀。
用NanoDrop检测回收后的mRNA浓度为5μg/μl，A260/A280为1.90、A260/A230为2.0。
取1μl，稀释10倍，进行RNA ScreenTape assay以及琼脂糖凝胶电泳检测其片段完整性。
检测结果为：条带符合大小，片段完整。
8、LiCl沉淀纯化mRNA
将上一步骤中回收的mRNA按照其1.5倍体积加入Rnase-free水，混匀。
加入原mRNA 1.5倍体积-20预冷的LiCl溶液，混匀。
然后于-20℃静至2h。
16000g离心20min。
弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，16000g离心15min。
取上清，于超净台晾干5min。
用适当的RNase-free水溶解纯化后的mRNA。
纯化后的mRNA用0.1M柠檬酸稀释至2μg/μl，备用。
实施例1：载Luciferase脂质纳米颗粒1(Luc-LNP1)的冻干制剂及其制备工艺
本实施例中的载核酸脂质纳米颗粒采用经典的微流控方式制备。微流控仪器由安徽智微科技有限公司提供，主要制备步骤包括：脂质化合物溶于乙醇相，mRNA溶于水相，二者通过层流方式，在狭窄的芯片通道中混合作用，进而形成纳米颗粒。具体过程包括：
2.01mg Luciferase mRNA溶于15mL pH 4.7的醋酸钠缓冲液，简称A相。各脂质化合物溶于5mL无水乙醇，总浓度10mg/mL，简称B相。Luc-LNP1脂质体组分摩尔比如下，ALC-0315:DSPC:胆固醇:ALC-0159＝46.3:9.4:42.7:1.6。
设总流速为20mL/min，A相和B相流速比3：1。A相和B相混合形成纳米颗粒。收集制备的纳米颗粒溶液，隔20mM Tris缓冲液(pH7.4)透析(截留分子量：10KDa)6小时，随后用超滤离心管(截留分子量：30KDa)离心浓缩，再用0.22μm水相滤膜过滤，得到纯化后的载Luciferase脂质纳米颗粒溶液(Luc-LNP1)。
Luc-LNP1溶液按表1所示加入不同种类及质量体积分数(w/v％)的保护剂，放入冷冻干燥机(新芝Scientz-10N)，冷阱预冻4小时后，采用两种方式进行干燥。方式一：在上层样品架冻干64小时，温度为室温；方式二：先在冷阱中冻干48小时，温度为-30℃左右，随后转移到上层样品架冻干16小时，温度为室温。
干燥结束后收集产物(即Luc-LNP1冻干粉)，使用与冻干前等体积的超纯水复溶，方式一的冻干粉末复溶困难，需反复吹打2min左右，且肉眼可见一些颗粒沉淀。方式二使用保护剂的冻干粉末加入超纯水后能迅速溶解，整个过程不超过20s，用RiboGreenTM测定纳米颗粒包封率，欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪测定纳米颗粒粒径及zeta电位。实验结果见表1。
表1.Luc-LNP1冻干前后包封率、粒径、zeta电位变化
本实施例的实验结果表明，采用低温冻干的冻干效果(方式二)略优于常温冻干(方式一)，冻干粉末复溶后的粒径更小，分散系数更小，包封率也更高，有利于维持生物活性。同时，无保护剂的脂质颗粒冻干后复溶困难，复溶后的粒径增长很大，多分散系数大于0.5，包封率下降为14.31％，说明其纳米结构被严重破坏，核酸泄漏，失去了已有的生物活性。而添加高浓度蔗糖作为保护剂的纳米粒，在冻干后包封率维持在80％左右或更高，随着保护剂浓度上升，粒径逐渐下降、包封率逐渐上升，整体冻干效果尚佳。
实施例2：载Luciferase mRNA脂质纳米颗粒2(Luc-LNP2)的冻干制剂及其制备工艺
制备载Luciferase mRNA脂质纳米颗粒2(Luc-LNP2)，其中，Luc-LNP2脂质体组分摩尔比如下，ALC-0315:DSPC:胆固醇:DMG-PEG2000＝46.3:9.4:42.7:1.6。其余制备方法与冻干过程与实施例1方式二相同。
冻干结束后得到的Luc-LNP2冻干粉经超纯水复溶，冻干粉能迅速溶解，整个过程不超过20s，用RiboGreenTM测定纳米颗粒包封率，欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪测定纳米颗粒粒径及zeta电位。实验结果见表2。
表2.Luc-LNP2冻干前后包封率、粒径、zeta电位变化
保护剂种类 包封率(％) 粒径(nm) 多分散系数 Zeta电位(mV)
Luc-LNP2冻干前 93.15 97.2 0.08 -2.97
10％蔗糖 68.4 260 0.16 -5.3
10％蔗糖+2％海藻糖 71.53 240.8 0.18 -6.99
15％蔗糖 82.05 195.2 0.13 -5.84
15％蔗糖+0.01％F-68 80.74 182.1 0.15 -3.84
15％蔗糖+1％海藻糖 86.08 178.6 0.15 -6.96
15％蔗糖+2％海藻糖 93.33 176.4 0.14 -7.24
本实施例的实验结果表明，高浓度蔗糖作为保护剂的纳米粒，在冻干后包封率维持在80％以上，随着保护剂浓度上升，粒径逐渐下降、包封率逐渐上升，整体冻干效果尚佳。
实施例3：正电荷载Luciferase mRNA脂质纳米颗粒3(Luc-LNP3)的冷冻制剂及其制备工艺
制备正电荷载Luciferase mRNA脂质纳米颗粒3(Luc-LNP3)，其中，Luc-LNP3脂质体组分摩尔比如下，DOTAP:DSPC:胆固醇＝42:10:48。其余制备方法与冻干过程与实施例1方式二相同。
冻干结束后得到的Luc-LNP3冻干粉经超纯水复溶，冻干粉能迅速溶解，整个过程不超过20s，用RiboGreenTM测定纳米颗粒包封率，欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪测定纳米颗粒粒径及zeta电位。实验结果见表3。
表3.Luc-LNP3冻干前后包封率、粒径、zeta电位变化
保护剂种类 包封率(％) 粒径(nm) 多分散系数 Zeta电位(mV)
Luc-LNP3冻干前 92.7 87.0 0.25 7.20
10％蔗糖 96.5 139.3 0.20 7.98
本实施例的实验结果表明，10％蔗糖作为保护剂的正电荷脂质纳米颗粒，在冻干后包封率维持在96.5％，粒径有稍许增大，整体冻干效果尚佳。
实施例4：Luc-LNP冷冻干燥粉末生物活性验证
复溶后的样品按7μg每只，采用尾静脉注射给药，24小时后检测小鼠荧光亮度。结果参见表4与图1。
表4.Luc-LNP冻干前后体内生物活性变化
冻干前(107p/s) 15％蔗糖(107p/s) 15％蔗糖+2％海藻糖(107p/s)
Luc-LNP1 7.08±2.53 2.07±0.43 3.69±2.23
Luc-LNP2 8.54±2.07 0.74±0.09 1.14±0.43
本实施例的实验结果表明，Luc-LNP1冻干后的生物活性维持优于Luc-LNP2，即剂型选择上ALC-0159优于DMG-PEG2000。
实施例5：程序控温法制备载Luciferase mRNA脂质纳米颗粒
按照实施例1记载的方法制备所述Luc-LNP1溶液，之后采用程序降温法制备冻干粉末。所述程序降温法中设定的冷冻干燥程序参见表5。
表5.冻干曲线设置
干燥结束后收集产物，加入与冻干前等体积的超纯水复溶，复溶时间10s内，轻轻晃动则可完全溶解，肉眼观察澄清无沉淀。用RiboGreenTM测定纳米颗粒包封率，欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪测定纳米颗粒粒径及zeta电位。结果参见表6与图2。
表6.程序控温制备Luc-LNP1冷冻干燥粉末
蔗糖浓度(％) 海藻糖浓度(％) 粒径(nm) PDI 电位(mV) 包封率(％)
15(冻干前) 0(冻干前) 80.4 0.157 -9.04 95.50
10 0 177.9 0.146 -6.37 93.04
10 2.5 115.8 0.193 -5.92 88.59
10 5 116.6 0.185 -6.58 87.16
12.5 0 125.2 0.193 -8.07 88.34
12.5 2.5 113.1 0.214 -7.29 88.40
12.5 5 116.6 0.266 -7.30 85.04
15 0 114.0 0.189 -6.82 87.16
15 2.5 109.1 0.167 -7.41 88.48
15 5 107.3 0.191 -8.03 87.65
本实施例的实验结果表明，经表5所记载的程序缓慢降温、预冻、及超低温干燥后，产品的质量有所提升。冻干前后粒径差整体变小，包封率整体提高超过85％。且随着保护剂浓度提升，粒径逐渐减小。各干燥样品的含水率在3％以下。
实施例6：冻干粉末中脂质纳米颗粒浓度调节
按照实施例1记载的方法制备所述Luc-LNP1溶液，之后采用表5所记载的程序降温法，制备冻干粉末。本实施例中，对比了不同mRNA浓度的冻干产品，结果参见表7。
表7.程序控温制备Luc-LNP1冷冻干燥粉末
本实施例的实验结果表明，上述各实验冻干的整体效果不错，0.24mg/mL mRNA冻干后粒径增长略高于0.12mg/mL，但平均增长幅度不超过5nm。说明冻干前的mRNA浓度会影响整体冻干效果，但影响不是很大。0.24mg/mL和0.12mg/mL的冻干效果均可接受。各干燥样品的含水率在3％以下。
实施例7：载Luciferase mRNA脂质纳米颗粒粉末稳定性测试
重新制备一批Luc-LNP1溶液，添加质量体积分数为15％蔗糖和2.5％海藻糖后，经表5的冻干曲线进行冻干，得到一批Luc-LNP1的冻干产品。冻干产品常温下保存2周后粒径和包封率均无显著变化。实验结果参见表8。
表8.不同保存条件下的包封率、粒径、zeta电位变化
包封率(％) 粒径(nm) 多分散系数 Zeta电位(mV)
原样 97.9 81.4 0.09 -3.51
冻干后 83.6 105.5 0.18 -8.95
4度 83.2 108.4 0.19 -6.76
25度 81.9 121.8 0.16 -8.31
实施例8：程序控温法制备载新型冠状mRNA疫苗脂质纳米颗粒冻干粉末
分别合成了针对能够编码原始株(COV1 mRNA)、德尔塔株(COV2 mRNA)和奥密克戎株(COV3 mRNA)NTD-RBD天然结构域的新型冠状病毒mRNA，具体mRNA的编码序列为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，按照实施例1的工艺制备LNP溶液，添加质量体积分数为15％蔗糖配制缓冲液，采用表5的冻干曲线，制备冻干粉末。COV1-LNP1的冻干粉末用等体积无酶水复溶后，分别在第0天、第7天采用肌肉注射给药。每只鼠给药2μg、5μg或者10μg。第21天采集血液，用ELISA法测量中和抗体滴度。实验结果参见表9及图3。
表9.不同新型冠状mRNA疫苗脂质纳米颗粒冻干粉末表征
本实施例的实验结果表明，经程序缓慢降温、预冻、及超低温干燥后，不同新型冠状mRNA疫苗脂质纳米颗粒冻干产品质量都很好：粒径较小、多分散系数小、包封率高，冻干前后引起的中和抗体滴度上升没有显著区别，冻干粉末保持了良好的生物活性。
应当指出的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市瑞吉生物科技有限公司
<120> 一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用
<130> GAI22CN0025
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1623
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mRNA疫苗
<400> 1
auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagcc agugcgugaa ccugaccacc 60
aggacccagc ugccccccgc cuacaccaac agcuucacca ggggcgugua cuaccccgac 120
aagguguuca ggagcagcgu gcugcacagc acccaggacc uguuccugcc cuucuucagc 180
aacgugaccu gguuccacgc cauccacgug agcggcacca acggcaccaa gagguucgac 240
aaccccgugc ugcccuucaa cgacggcgug uacuucgcca gcaccgagaa gagcaacauc 300
aucaggggcu ggaucuucgg caccacccug gacagcaaga cccagagccu gcugaucgug 360
aacaacgcca ccaacguggu gaucaaggug ugcgaguucc aguucugcaa cgaccccuuc 420
cugggcgugu acuaccacaa gaacaacaag agcuggaugg agagcgaguu caggguguac 480
agcagcgcca acaacugcac cuucgaguac gugagccagc ccuuccugau ggaccuggag 540
ggcaagcagg gcaacuucaa gaaccugagg gaguucgugu ucaagaacau cgacggcuac 600
uucaagaucu acagcaagca cacccccauc aaccugguga gggaccugcc ccagggcuuc 660
agcgcccugg agccccuggu ggaccugccc aucggcauca acaucaccag guuccagacc 720
cugcuggccc ugcacaggag cuaccugacc cccggcgaca gcagcagcgg cuggaccgcc 780
ggcgccgccg ccuacuacgu gggcuaccug cagcccagga ccuuccugcu gaaguacaac 840
gagaacggca ccaucaccga cgccguggac ugcgcccugg acccccugag cgagaccaag 900
ugcacccuga agagcuucac cguggagaag ggcaucuacc agaccagcaa cuucagggug 960
cagcccaccg agagcaucgu gagguucccc aacaucacca accugugccc cuucggcgag 1020
guguucaacg ccaccagguu cgccagcgug uacgccugga acaggaagag gaucagcaac 1080
ugcguggccg acuacagcgu gcuguacaac agcgccagcu ucagcaccuu caagugcuac 1140
ggcgugagcc ccaccaagcu gaacgaccug ugcuucacca acguguacgc cgacagcuuc 1200
gugaucaggg gcgacgaggu gaggcagauc gcccccggcc agaccggcaa gaucgccgac 1260
uacaacuaca agcugcccga cgacuucacc ggcugcguga ucgccuggaa cagcaacaac 1320
cuggacagca aggugggcgg caacuacaac uaccuguaca ggcuguucag gaagagcaac 1380
cugaagcccu ucgagaggga caucagcacc gagaucuacc aggccggcag cacccccugc 1440
aacggcgugg agggcuucaa cugcuacuuc ccccugcaga gcuacggcuu ccagcccacc 1500
aacggcgugg gcuaccagcc cuacagggug guggugcuga gcuucgagcu gcugcacgcc 1560
cccgccaccg ugugcggccc caagaagagc accaaccugg ugaagaacaa gugcgugaac 1620
uuc 1623
<210> 2
<211> 1623
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mRNA疫苗
<400> 2
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gagaacggca ccaucaccga cgccguggac ugcgcccugg acccccugag cgagaccaag 900
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<210> 3
<211> 1623
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mRNA疫苗
<400> 3
auguucgugu uccuggugcu gcugccccug gugagcagcc agugcgugaa ccugaccacc 60
aggacccagc ugccccccgc cuacaccaac agcuucacca ggggcgugua cuaccccgac 120
aagguguuca ggagcagcgu gcugcacagc acccaggacc uguuccugcc cuucuucagc 180
aacgugaccu gguuccacgu gaucagcggc accaacggca ccaagagguu cgacaacccc 240
gugcugcccu ucaacgacgg cguguacuuc gccagcaucg agaagagcaa caucaucagg 300
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gccaccaacg uggugaucaa ggugugcgag uuccaguucu gcaacgaccc cuuccuggac 420
cacaagaaca acaagagcug gauggagagc gaguucaggg uguacagcag cgccaacaac 480
ugcaccuucg aguacgugag ccagcccuuc cugauggacc uggagggcaa gcagggcaac 540
uucaagaacc ugagggaguu cguguucaag aacaucgacg gcuacuucaa gaucuacagc 600
aagcacaccc ccauccuggu gagggagccc gaggaccugc cccagggcuu cagcgcccug 660
gagccccugg uggaccugcc caucggcauc aacaucacca gguuccagac ccugcuggcc 720
cugcacagga gcuaccugac ccccggcgac agcagcagcg gcuggaccgc cggcgccgcc 780
gccuacuacg ugggcuaccu gcagcccagg accuuccugc ugaaguacaa cgagaacggc 840
accaucaccg acgccgugga cugcgcccug gacccccuga gcgagaccaa gugcacccug 900
aagagcuuca ccguggagaa gggcaucuac cagaccagca acuucagggu gcagcccacc 960
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gccaccaggu ucgccagcgu guacgccugg aacaggaaga ggaucagcaa cugcguggcc 1080
gacuacagcg ugcuguacaa ccuggccccc uucuucaccu ucaagugcua cggcgugagc 1140
cccaccaagc ugaacgaccu gugcuucacc aacguguacg ccgacagcuu cgugaucagg 1200
ggcgacgagg ugaggcagau cgcccccggc cagaccggca acaucgccga cuacaacuac 1260
aagcugcccg acgacuucac cggcugcgug aucgccugga acagcaacaa gcuggacagc 1320
aaggugagcg gcaacuacaa cuaccuguac aggcuguuca ggaagagcaa ccugaagccc 1380
uucgagaggg acaucagcac cgagaucuac caggccggca acaagcccug caacggcgug 1440
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ggccaccagc ccuacagggu gguggugcug agcuucgagc ugcugcacgc ccccgccacc 1560
gugugcggcc ccaagaagag caccaaccug gugaagaaca agugcgugaa cuuc 1614

Claims (32)

1.一种载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥方法，该方法包括步骤：
a)配制含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液；
b)降温进行预冻；
c)在真空条件下升温进行干燥，使体系含水量在3％以下，制备得到载核酸脂质纳米颗粒的干燥制剂。
2.根据权利要求1所述的冷冻干燥方法，其中，所述的冷冻干燥保护剂包括以下保护剂1至保护剂3中的一种或多种：
保护剂1：蔗糖；
保护剂2：蔗糖和非离子表面活性剂；
保护剂3：蔗糖和海藻糖。
3.根据权利要求2所述的冷冻干燥方法，其中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，蔗糖的质量体积浓度为10％～20％，海藻糖的质量体积浓度为0％～20％，非离子表面活性剂的质量体积浓度为0％～2％；
优选地，所述非离子表面活性剂优选包括泊洛沙姆。
4.根据权利要求2或3所述的冷冻干燥方法，其中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，蔗糖的质量体积浓度为10％～20％，海藻糖的质量体积浓度为0.5％～5％，非离子表面活性剂的质量体积浓度为0％～1％。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，缓冲体系为Tris、柠檬酸盐、醋酸盐或磷酸盐缓冲体系。
6.根据权利要求5所述的冷冻干燥方法，其中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，Tris的浓度为10-50mM。
7.根据权利要求5或6所述的冷冻干燥方法，其中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液的pH值为6.5～8.5。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，所述的降温进行预冻的方式为：降温至﹣80℃～﹣45℃进行预冻；优选地，以每分钟0.5℃～2.0℃的速率进行降温。
9.根据权利要求8所述的冷冻干燥方法，其中，降温至2℃～6℃时维持恒温20min～60min。
10.根据权利要求8或9所述的冷冻干燥方法，其中，降温至﹣80℃～﹣45℃后维持恒温冷冻1小时～6小时；
优选地，维持在﹣55℃～﹣45℃冷冻2～4小时。
11.根据权利要求1至10中任意一项所述的冷冻干燥方法，该方法还包括抽真空的过程，其中，控制抽真空至0.5Pa～10Pa，优选抽真空至1Pa～6Pa。
12.根据权利要求11所述的冷冻干燥方法，其中，控制在真空条件下温度上升至4℃～22℃进行干燥；
优选地，干燥过程至少包括：控制在﹣60℃～﹣2℃干燥16小时～48小时，控制在2℃～8℃干燥5小时～20小时；
更优选地，控制在真空条件下干燥过程的总时间为24小时～60小时；
更优选地，升温时，控制温度以每分钟0.3℃～2.0℃的速率上升。
13.根据权利要求12所述的冷冻干燥方法，其中，控制在﹣60℃～﹣2℃干燥16小时～48小时的过程包括：
从﹣80℃～﹣45℃升温至﹣60℃～﹣22℃，并控制在﹣60℃～﹣22℃干燥12小时～40小时；
然后升温至﹣22℃～﹣2℃，并控制在﹣22℃～﹣2℃干燥2小时～20小时；
优选地，该方法还可包括：控制在2℃～8℃干燥5小时～20小时之后，进一步升温至15℃～22℃，并在15℃～22℃干燥20min～4小时。
14.根据权利要求1至13中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，抽真空及升温进行干燥的过程在玻璃容器中进行，每单元玻璃容器中的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液体积为0.1mL至5mL。
15.根据权利要求1至14中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，核酸浓度为0.01-1.0mg/mL，优选为0.05～0.5mg/mL。
16.根据权利要求1至15中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，所配制的含有载核酸脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂的缓冲液中，载核酸脂质纳米颗粒的粒径为50nm～200nm；优选地，载核酸脂质纳米颗粒的粒径为50nm～150nm。
17.根据权利要求1至16中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中的核酸包括自由小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA或长非编码RNA(IncRNA)的核糖核苷酸。
18.根据权利要求17所述的冷冻干燥方法，其中，所述的核酸其序列至少包含300个核苷酸。
19.根据权利要求18所述的冷冻干燥方法，其中，所述的核酸其序列至少包含1000个核苷酸。
20.根据权利要求1至19中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，所述的核酸为编码冠状病毒抗原、荧光素酶或癌抗原的mRNA。
21.根据权利要求20所述的冷冻干燥方法，其中，所述的编码冠状病毒抗原的mRNA为编码新型冠状病毒NTD-RBD天然结构域的mRNA。
22.根据权利要求21所述的冷冻干燥方法，其中，所述mRNA的编码序列具有如SEQ IDNO:1、或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列。
23.根据权利要求1至22中任意一项所述的冷冻干燥方法，其中，所述的载核酸脂质纳米颗粒的组分包括核酸与脂质，其中，所述脂质包括：
a)正电荷脂质和/或可离子化脂质中的至少一种；
b)中性辅助脂质；
c)胆固醇；以及
d)PEG修饰的脂质。
24.根据权利要求23所述的冷冻干燥方法，其中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，正电荷脂质和/或可离子化脂质与核酸的氮磷摩尔比为5:1～20:1。
25.根据权利要求23或24所述的冷冻干燥方法，其中，所述的载核酸脂质纳米颗粒中，以脂质的总摩尔量为100％计，各脂质成分的摩尔比为：
正电荷脂质或可离子化脂质46％～50％；
中性辅助脂质5％～10％；
胆固醇38.5％～48％；
PEG修饰的脂质0～3％。
26.根据权利要求23至25所述的冷冻干燥方法，其中，所述的正电荷脂质包括但不限于：DOTMA、DOTAP；
所述的可离子化脂质包括但不限于：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、SM-102、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)中的一种或多种；
所述的中性辅助脂质包括但不限于：DSPC、DOPE、DSPE中的一种或多种；
所述的PEG修饰的脂质包括但不限于：甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺、DMG-PEG中的一种或多种。
27.一种载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，其是载核酸脂质纳米颗粒与冷冻干燥保护剂混合后经冷冻干燥制备得到的冻干制剂，其含水量3％以下。
28.根据权利要求27所述的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，该冻干制剂复溶后的颗粒粒径50nm～220nm，优选为50nm～200nm，更优选为70nm～180nm；多分散系数0.3以下；包封率70％以上，优选85％以上。
29.根据权利要求27或28所述的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，复溶时间20秒以内，肉眼观察溶液澄清无沉淀。
30.根据权利要求27至29中任意一项所述的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂，其是根据权利要求1～26任一项所述的方法制备得到的。
31.权利要求27至30中任一项所述的载核酸脂质纳米颗粒的冻干制剂在制备核酸疫苗中的应用。
32.一种用于载核酸脂质纳米颗粒的冷冻干燥保护组合物，该组合物包括冷冻干燥保护剂与缓冲体系试剂，其中：
所述冷冻干燥保护剂包括以下保护剂1至保护剂3中的一种或多种：
保护剂1：蔗糖；
保护剂2：蔗糖和非离子表面活性剂；非离子表面活性剂优选包括泊洛沙姆；
保护剂3：蔗糖和海藻糖；
所述缓冲体系试剂包括Tris、柠檬酸盐、醋酸盐或磷酸盐。
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101332185A (zh) * 2007-06-28 2008-12-31 哈药集团生物工程有限公司 siRNA脂质体的制备
EP2773326B1 (en) * 2011-11-04 2019-02-20 Nitto Denko Corporation Method for sterilely producing lipid-nucleic acid particles
EP3034539A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
SG10201909209RA (en) * 2015-05-05 2019-11-28 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Nucleic acid-cationic polymer compositions and methods of making and using the same
CN110548007B (zh) * 2018-05-31 2023-03-28 北京泰德制药股份有限公司 阳离子脂质体、基于其的核酸类药物递送系统及其制备方法与用途
KR20220038365A (ko) * 2019-07-23 2022-03-28 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 Mrna-로딩된 지질 나노입자의 안정한 조성물 및 제조 방법
CN110974954B (zh) * 2019-12-24 2021-03-16 珠海丽凡达生物技术有限公司 一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法
CN111366728A (zh) * 2020-03-27 2020-07-03 重庆探生科技有限公司 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试剂盒

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