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CN116515904A - 红绿光切换式交通信号灯基因编辑阳性报告富集系统 - Google Patents

红绿光切换式交通信号灯基因编辑阳性报告富集系统 Download PDF

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CN116515904A
CN116515904A CN202310388217.3A CN202310388217A CN116515904A CN 116515904 A CN116515904 A CN 116515904A CN 202310388217 A CN202310388217 A CN 202310388217A CN 116515904 A CN116515904 A CN 116515904A
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fluorescent protein
vector
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徐坤
吕明
张智英
马宝霞
王旭
孟祥宇
李尚朴
杨森
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Northwest A&F University
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Abstract

本发明公开了一种红绿光切换式交通信号灯基因编辑阳性报告富集系统。构建了新型的红绿光“切换式”报告载体以及相应的验证用CRISPR/Cas系统的表达载体。通过CRISPR/Cas系统同时打靶基因组、报告载体，利用SSA修复机制对报告载体中的双荧光报告基因及抗性基因一体化表达盒进行修复。该报告富集系统可以简单、快速检测被转染细胞中的核酸酶活性，并高效富集基因编辑阳性细胞。

Description

红绿光切换式交通信号灯基因编辑阳性报告富集系统
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及可用于CRISPR/Cas系统介导基因编辑阳性细胞富集的红绿光“切换式”交通信号灯(Traffic Light Reporter，TLR)基因编辑阳性报告富集系统。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFNs(Zinc-finger nuclease)和TALENs(Transcription activator-like effector nuclease)之后的新一代基因编辑技术。自2012年首次报道利用来源于酿脓链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR/Cas9系统(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/CRISPR-associatedprotein-9nuclease,Cas9)的蛋白和导向RNA(guide RNA、gRNA)可以体外靶向剪切质粒DNA，随着对CRISPR/Cas9机制的阐明以及在哺乳动物中成功进行基因编辑，基于CRISPR/Cas这一细菌中RNA介导的获得性免疫系统的基因编辑应用不断拓展。
CRISPR/Cas9基因编辑系统主要包括：编码Cas9核酸酶的CRISPR相关基因(CRISPR-associated genes，Cas)以及简化后的tracrRNA/crRNA二元复合体构成的导向RNA(sgRNA)。CRISPR/Cas9系统可以利用导向RNA序列，引导Cas9核酸酶在基因组的特异性位点产生DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)，触发细胞自身的DNA修复机制。DNA断裂修复机制主要包括不依赖于同源序列的非同源末端连接(Non-homo-logous endjoining，NHEJ)和依赖于同源序列介导的同源重组(Homologous recombination,HR)两种方式。其中，NHEJ包括细胞内经典非同源末端连接(classical non-homologous endjoining，C-NHEJ)和选择性非同源末端连接(alternative non-homologous end joining，A-NHEJ)；HR包括同源重组修复(homology-directed repair，HDR)和单链退火修复(single-strand annealing，SSA)。
NHEJ修复机制是哺乳动物细胞中DSBs修复的主要机制，该修复方式不需要同源DNA的参与，直接依赖DNA连接酶将断裂的DNA双链末端连接起来实现修复，同时一般会引入少量核苷酸碱基的插入或缺失(Insertions and deletions,Indels)，进而可能导致移码突变并引起基因破坏甚至是基因敲除。相比NHEJ通路，HDR修复机制更加复杂，它需要大量的生化因子，并且HDR修复效率远低于NHEJ修复，这限制了其在基因工程技术中的广泛应用。然而，如果在DNA双链断裂末端附近存在重复元件，则SSA的修复方式会呈现更高的修复效率。因此，SSA可作为一种高效的双链修复机制在报告筛选系统中进行广泛应用。
基因编辑阳性克隆的筛选主要通过使用荧光标记基因(EGFP、mRFP、DsRed、mCherry等)和药物筛选基因(PuroR、ZeoR、NeoR、HygroR)等筛选标记对目标细胞进行筛选富集。用于报告筛选的载体主要包括：串联表达核酸酶与筛选基因并用于筛选转染阳性细胞的富集载体，以及基于双链断裂的不同修复原理构建并用于筛选核酸酶阳性细胞的抗性基因报告筛选一体化载体。由于在转染的细胞中核酸酶的活性比较低，所以只是筛选转染阳性的细胞对基因编辑而言不是很有效。报告筛选一体化载体根据其修复原理可进一步分为：基于NHEJ修复、SSA修复，以及基于HDR修复的报告载体。基于NHEJ修复的报告载体理论上最高只有三分之二的修复产物可以恢复报告基因的功能；而基于HDR修复的报告载体，虽然能够对基因组精准编辑，但由于细胞自身修复效率低，导致报告载体修复效率与细胞基因组编辑效率不一致；同时，目前已报道的基于HDR修复的报告载体在筛选方式较为单一，且不具有与基因编辑位点一致的特异性，这些原因都限制了该报告系统的广泛应用。
相较于基于NHEJ、HDR修复的报告载体，基于SSA修复的报告载体在有同源重复序列存在时效率可以是NHEJ的十倍以上。尽管利用SSA修复原理构建的报告载体适合用来筛选所有编辑类型的基因编辑阳性细胞，但目前已有的基于SSA修复的报告载体均为双表达框，致使载体较大、降低细胞转染效率；同时，由于双表达框中不同表达框的表达效率不一致，降低了基因编辑阳性细胞的富集效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红绿光切换式交通信号灯基因编辑阳性报告富集系统，该报告富集系统可以通过荧光分选或药物筛选核酸酶阳性细胞，并实现更加简单、高效的富集获得基因编辑阳性细胞。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，该系统包括位点特异性的报告载体；所述报告载体包括双荧光报告基因与抗性基因一体化表达盒，所述一体化表达盒包括位于其转录区域的与抗性基因编码序列同源的上游片段、与抗性基因编码序列同源的下游片段、第一荧光蛋白(用于标记转染阳性细胞；转染阳性是指质粒转染到细胞内，并且质粒能够表达相应的荧光蛋白作为筛选标签，但质粒不被编辑)的基因编码序列、第二荧光蛋白(用于标记核酸酶阳性细胞；核酸酶阳性是指质粒转染到细胞内，并且质粒被具有核酸酶剪切活性的Cas蛋白编辑后经修复能够表达相应的荧光蛋白作为筛选标签)的基因编码序列以及由导向RNA识别的第一靶序列和第二靶序列，所述第一靶序列位于所述上游片段与第一荧光蛋白的基因编码序列之间，所述第二靶序列位于所述下游片段与第一荧光蛋白的基因编码序列之间，所述上游片段和所述下游片段包括用于进行单链退火修复并在修复后使所述一体化表达盒从表达第一荧光蛋白转换为进行相应抗性基因与第二荧光蛋白的串联表达的同向重复序列。
优选的，所述上游片段、所述第一靶序列、第一荧光蛋白的基因编码序列、所述第二靶序列、所述下游片段和第二荧光蛋白的基因编码序列采用同一个开放阅读框，该开放阅读框通过设置在所述第二靶序列与所述下游片段之间的终止密码子分隔。
优选的，所述同向重复序列为200～350bp。该同向重复序列分别位于所述上游片段的后部(具体指3'端)和所述下游片段的前部(具体指5'端)；过长的同向重复序列会影响报告载体的细胞转染效率，过短的同向重复序列会影响报告载体的单链退火修复效率，从而都会直接影响基因编辑阳性细胞的富集效率。
优选的，所述第二荧光蛋白的基因编码序列位于所述下游片段后侧，所述一体化表达盒的转录区域还包括用于连接所述下游片段和第二荧光蛋白的基因编码序列的剪切肽序列。
优选的，所述第一荧光蛋白为红色荧光蛋白(例如，mCherry蛋白)，第二荧光蛋白为绿色荧光蛋白(例如，EGFP蛋白)。即报告载体为红绿光“切换式”，在修复前只表达红色荧光蛋白，修复后只表达绿色荧光蛋白。
优选的，所述上游片段和所述下游片段经过单链退火修复后形成用于使基因编辑目标细胞表达嘌呤霉素(puromycin)抗性的序列。
优选的，所述系统还包括位点特异性的CRISPR/Cas表达载体，所述CRISPR/Cas表达载体包括用于表达所述导向RNA的sgRNA表达盒以及用于表达具有剪切活性的Cas蛋白的核酸酶表达盒(简称Cas蛋白表达盒)，所述导向RNA识别的靶序列(具体指上述第一、第二靶序列)来源于基因编辑目标细胞的基因组。
优选的，所述基因编辑目标细胞为真核细胞(例如哺乳动物细胞等)。
上述基因编辑阳性细胞报告富集系统的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
1)克隆含有上述与抗性基因编码序列同源的上游片段、与抗性基因编码序列同源的下游片段、剪切肽序列以及第二荧光蛋白的基因编码序列的重组片段(例如，PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列)；将该重组片段与表达载体(例如，pcDNA3.1载体)骨架连接后与克隆获得的上述第一荧光蛋白的基因编码序列整合并使该荧光蛋白的基因编码序列接入在所述上游片段和下游片段之间，得双荧光报告基因与抗性基因一体化重组表达载体(例如，pSSA-PMG载体)；
2)将克隆获得的含有第一荧光蛋白的基因编码序列以及上述由导向RNA识别的第一靶序列和第二靶序列的重组片段(例如，sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列)替换步骤1所得双荧光报告基因与抗性基因一体化重组表达载体中的第一荧光蛋白的基因编码序列，得到位点特异性的报告载体。
优选的，所述步骤2中，克隆获得的重组片段还含有位于所述第二靶序列后侧的终止密码子。
优选的，所述制备方法还包括以下步骤：根据目的基因靶位点设计拟合引物，将拟合引物退火后得到引物退火双链，将引物退火双链与含有上述核酸酶表达盒的载体骨架连接并利用该引物退火双链在该载体骨架中形成上述sgRNA表达盒，得到位点特异性的CRISPR/Cas表达载体。
一种基因编辑阳性细胞的筛选方法，包括以下步骤：
1)将构建得到的位点特异性的报告载体和CRISPR/Cas表达载体共转染至基因编辑目标细胞；
2)转染48～72小时后利用流式细胞仪进行荧光分选，得到核酸酶阳性细胞，然后进行富集培养；或者，转染48～72小时后用药物筛选能够表达相应抗性基因的细胞，得到核酸酶阳性细胞，然后进行富集培养。
优选的，所述药物(例如嘌呤霉素)在转染细胞的培养体系中的添加终浓度为0.2～5μg/mL(根据不同细胞对药物的实际抗性而异)。
优选的，所述富集培养具体包括以下步骤：将通过荧光分选或药物筛选得到的核酸酶阳性细胞稀释后培养细胞单克隆(例如，96孔板培养皿培养7～14天)；然后对培养的单克隆进行基因编辑阳性细胞鉴定；将鉴定为基因编辑阳性细胞的单克隆进行扩大培养(例如，转至24孔板)。
上述基因编辑阳性细胞报告富集系统在真核细胞基因编辑中的应用。
优选的，所述位点特异性的CRISPR/Cas表达载体和报告载体共转染至细胞后进行表达，其中位点特异性的报告载体的双荧光报告基因与抗性基因一体化表达盒，经位点特异性的CRISPR/Cas表达载体表达的Cas蛋白剪切(剪切位置位于所述一体化表达盒的第一靶序列和第二靶序列，同时Cas蛋白对细胞基因组上序列相同的靶位点进行基因打靶)并完成单链退火修复，在关闭一种荧光报告基因(具体指第一荧光蛋白的基因编码序列)表达(由于剪切和单链退火修复而从所述一体化表达盒的转录区域删除)的同时恢复抗性基因以及另一种荧光报告基因(具体指第二荧光蛋白的基因编码序列)的表达，使转染后的细胞可以直接用于筛选核酸酶阳性细胞，并提高了对基因编辑阳性细胞的富集效率。
优选的，在所述系统的载体转染细胞后，核酸酶阳性细胞具有绿色荧光标记(例如，EGFP+)和药物(例如，嘌呤霉素)抗性；而核酸酶阴性细胞(即转染阳性细胞)具有红色荧光标记(例如，mCherry+)且不具有药物抗性，通过不同荧光报告基因的表达，实现对核酸酶阳性细胞筛选的“红灯停绿灯行”筛选策略(即Traffic Light Reporter)。同时，具有红色荧光标记(例如，mCherry+)的细胞数目占细胞总数的比值可表征细胞转染的效率，具有绿色荧光标记(例如，EGFP+)的细胞数目占细胞总数的比值可表征核酸酶发挥剪切活性的效率(即载体修复效率)。
本发明的有益效果体现在：
本发明的报告载体中用于标记转染阳性细胞的荧光蛋白的对应基因编码序列两端各存在一个供导向RNA识别的靶序列，且这一表达结构处于与抗性基因编码序列同源的上、下游片段之间；将所述报告载体与细胞基因组的打靶载体(具体指CRISPR/Cas表达载体)共转染目标细胞，便可形成具有与细胞基因组编辑位点相同靶序列的报告富集系统；所述报告富集系统不仅为位点特异性的，而且与目标细胞中的基因组编辑效率具有更高的一致性，可以通过荧光分选或药物筛选快速、简便的检测目标细胞中的核酸酶活性，并筛选出核酸酶阳性细胞，以及提高基因编辑阳性细胞的富集效率；并且所述报告富集系统采用具有高灵敏性的SSA修复方式，可广泛应用于动物的多种细胞。
附图说明
图1为SSA-PMG报告富集系统工作示意图；图中：PuroL(1-305)代表PuroL1-305；PuroR(105-597)代表PuroR105-597。
图2为pX330-U6-Chimeric_dBsaI-CBh-hSpCas9载体酶切鉴定图，其中，泳道M：Trans2K plus II DNA Marker；泳道1、2：用Bsa I酶切载体。
图3为phCCR5-sgRNA/Cas9载体sanger测序结果图。
图4为扩增PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列的PCR产物鉴定图，其中，泳道M：Trans2K DNAMarker；泳道1、2：PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列的扩增结果。
图5为pcDNA3.1-CMV-PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP-polyA载体(质粒)酶切鉴定图，其中，泳道M：Trans2K plus II DNAMarker；泳道1、2：用Hind III和Xba I双酶切质粒。
图6为扩增mCherry序列的PCR产物鉴定图，其中，泳道M：Trans2K DNAMarker；泳道1、2：mCherry序列的扩增结果。
图7为pcDNA3.1-CMV-PuroL1-305-(BamHⅠ)mCherry(NotⅠ)-PuroR105-597-T2A-EGFP-polyA 载体(质粒)酶切鉴定图，其中，泳道M：Trans2K plus II DNAMarker；泳道1、2：用BamH I和Not I双酶切质粒。
图8a为pSSA-PMG载体图谱。
图8b为phCCR5-SSA-PMG载体酶切鉴定图，其中，泳道M：Trans2K plus II DNAMarker；泳道1、2：用BamH I和Not I双酶切质粒。
图8c为phCCR5-SSA-PMG载体图谱。
图9为扩增puromycin抗性基因编码序列的PCR产物鉴定图，其中，泳道M：Trans2KDNA Marker；泳道1、2：puromycin抗性基因编码序列的扩增结果。
图10为扩增T2A-EGFP序列的PCR产物鉴定图，其中，泳道M：Trans2K DNA Marker；泳道1、2：T2A-EGFP序列的扩增结果。
图11为Overlap Extension PCR产物鉴定图，其中，泳道M：Trans2K DNA Marker；泳道1、2：含有Puro-T2A-EGFP序列的融合结果。
图12为pcDNA3.1-CMV-Puro-T2A-EGFP-polyA载体(质粒)酶切鉴定图，其中，泳道M：Trans2K plus II DNA Marker；泳道1、2：用Hind III和Xba I双酶切质粒。
图13为利用基于报告载体的共转染系统富集基因编辑阳性细胞的操作流程。
图14为针对人源CCR5基因位点(hCCR5)SSA-PMG报告富集系统的报告效果图。
图15为利用FACS分选HEK293T中转染报告载体(阳性对照)后转染阳性细胞及报告载体(双侧靶序列剪切)后核酸酶阳性细胞的结果。
图16为利用FACS分选出的核酸酶阳性细胞中hCCR5位点的基因编辑效率的深度测序检测结果图。
图17为SSA-PMG报告富集系统表达效果和细胞状态结果图(经puromycin筛选后)。
图18为富集得到的核酸酶阳性细胞中hCCR5位点的基因编辑效率的深度测序检测结果图(经puromycin筛选后)。
图19为利用FACS分选HEK293T中转染报告载体(单侧靶序列剪切)后核酸酶阳性细胞的结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
(一)SSA-PMG报告富集系统的构建
1.构建CRISPR/Cas表达载体
1.1靶位点选择
以hCCR5基因为例，首先在基因组中寻找含有PAM(NGG/NGGNG)的靶位点。再经过CRISPR Dsign网站(http://crispr.mit.edu/)的筛选，选择出以下序列作为hCCR5基因靶位点(nuclease target site of hCCR5 gene，简称sg.T-hCCR5)： (SEQ.ID.NO.1)，该位点中位于PAM(例如黑线框内的AGG)之前的部分由Cas蛋白(例如spCas9)剪切。
1.2引物设计与合成
针对靶位点设计拟合引物，为了能够插入至pX330-U6-Chimeric_dBsaI-CBh-hSpCas9载体(将Addgene plasmid#42230，即“pX330-U6-Chimeric_dBbsI-CBh-hSpCas9载体”中的Bbs I酶切识别位点替换为Bsa I酶切识别位点)，拟合引物序列如下(以sg.T-hCCR5为例)：
hCCR5-F(Bsa I)：5'-caccCACACTTGTCACCACCCCAA-3'(SEQ.ID.NO.2)
hCCR5-R(Bsa I)：5'-aaacTTGGGGTGGTGACAAGTGTG-3'(SEQ.ID.NO.3)
1.3引物退火拟合
引物hCCR5-F(BsaI)和hCCR5-R(Bsa I)工作浓度均为10pmol/μL，参照表1成分进行混匀，置于PCR仪进行退火拟合(参见表2)，获得带有与Bsa I切割后粘性末端互补配对的引物退火双链。
表1.引物退火体系
表2.引物退火程序
1.4酶切
pX330-U6-Chimeric_dBsaI-CBh-hSpCas9载体用Bsa I进行酶切，其中混匀后的酶切体系(参见表3)置于37℃恒温水浴锅反应3～4h；采用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，并使用DNA回收试剂盒回收载体骨架对应的目的条带(参见图2)。
表3.酶切体系
1.5连接
将引物退火双链与回收的载体骨架用T4连接酶连接，其中混匀后的连接体系(参见表4)置于PCR仪中25℃反应30min。然后转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞，涂LB/AMP+平板，挑取单克隆并在LB/AMP+液体培养基中于37℃培养8～10h。
表4.连接体系
1.6鉴定阳性克隆
挑取不同单克隆的菌液提质粒，使用U6通用测序引物，进行sanger测序。测序正确的质粒(参见图3)即针对hCCR5基因上的靶位点构建的CRISPR/Cas表达载体phCCR5-sgRNA/Cas9，该载体用于表达具有核酸酶(nuclease)剪切活性的Cas蛋白(具体为spCas9)及识别靶位点的sgRNA。
U6通用测序引物序列：5'-ATGGACTATCATATGCTTACCGTA-3'(SEQ.ID.NO.4)。
2.报告载体pSSA-PMG的构建
2.1扩增PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列
以pSSA-RPG载体(Addgene#85932)为模板，设计引物并合成，进行PCR扩增(参见表5)。其中引物序列如下：
PMG-F(Hind III)：5'-cccAAGCTTACCATGACCGAGTACAAG-3'(SEQ.ID.NO.5)
PMG-R(Xba I)：5'-cagttaTCTAGATTACTTGTACAGCTC-3'(SEQ.ID.NO.6)
以上序列中，小写字母为保护碱基，大写加粗斜体字母为限制性内切酶识别位点，设计的引物送上海生工生物工程有限公司进行合成(下同)。
表5.PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列克隆扩增体系
PCR反应条件为：(98℃、10s；55℃、10s；72℃、30s)×33循环。
PCR反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用DNA回收试剂盒对目的条带进行回收(参见图4)，即完成对PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列的克隆并在序列两端加上了限制性内切酶(即Hind III、Xba I)识别位点，所述序列包括以下依次排列的元件：puromycin(嘌呤霉素)抗性基因PuroR编码区左同源臂(具体为PuroR编码序列中1至305位碱基所在的上游序列片段，简称PuroL1-305)、puromycin抗性基因PuroR编码区右同源臂(具体为PuroR编码序列中105至597位碱基所在的下游序列片段，简称PuroR105-597；PuroR105 -597中不包含终止密码子)、剪切肽序列(以采用的具体种类的剪切肽，例如T2A进行命名)、绿色荧光蛋白EGFP基因编码序列(简称EGFP)，其中PuroR编码区左同源臂与PuroR编码区右同源臂具有约200bp的同向重复序列。
2.2构建pcDNA3.1-CMV-PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP-polyA载体
通过限制性内切酶将pcDNA3.1载体(Invitrogen V79520)和扩增得到的含有PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列的目的片段分别进行双酶切，其中酶切体系(参见表6)混匀后置于37℃恒温水浴锅反应2～4h。
表6.双酶切体系
采用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，并使用DNA回收试剂盒分别对酶切后的目的条带进行回收，将回收的含有PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列的目的片段与载体骨架进行连接，其中混匀后的连接体系(参见表7)置于PCR仪中25℃反应30min。
表7.连接体系
反应后转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞，涂LB/AMP+平板，挑取单克隆并在LB/AMP+液体培养基中于37℃培养8～10h。不同单克隆的菌液提质粒，使用双酶切鉴定(参见图5)、测序，测序正确的质粒即pcDNA3.1-CMV-PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGF P-polyA载体，该载体中CMV启动子(promoter)、PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP序列及polyA(简称pA)组成一个表达盒。
2.3扩增mCherry序列
以pAAV-minCMV-mCherry载体(Addgene#27970)为模板，设计引物并合成，进行PCR扩增。其中引物序列如下：
mCherry-F(BamHⅠ)：5'-cgcGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG-3'(SEQ.ID.NO.7)
mCherry-R(NotⅠ)：5'-tatGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCG-3'(SEQ.ID.NO.8)
PCR反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用DNA回收试剂盒对目的条带进行回收(参见图6)，从而完成对红色荧光蛋白mCherry基因编码序列(简称mCherry序列或mCherry)的克隆并在序列两端加上了限制性内切酶(即BamHⅠ、NotⅠ)识别位点。
2.4构建pcDNA3.1-CMV-PuroL1-305-(BamHⅠ)mCherry(NotⅠ)-PuroR105-597-T2A-EGFP-polyA载体(简称pSSA-PMG载体)
以2.2构建的pcDNA3.1-CMV-PuroL1-305-PuroR105-597-T2A-EGFP-polyA载体为骨架，将骨架载体和扩增得到的含有mCherry序列的目的片段通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切之后连接，从而将mCherry序列插入在上述表达盒中的PuroL1-305和PuroR105-597之间，同时保留mCherry序列两端相应的限制性内切酶识别位点，得到pcDNA3.1-CMV-PuroL1-305-(BamHⅠ)mCherry(NotⅠ)-PuroR105-597-T2A-EGFP-polyA载体，使用双酶切鉴定(参见图7)、测序验证。
构建好的pSSA-PMG载体如图8a所示(7678bp)，包括以下依次排列的元件：CMVpromoter、抗性基因编码区同源序列PuroL1-305、mCherry、抗性基因编码区同源序列PuroR105-597、T2A剪切肽、EGFP、polyA。
3.特异性SSA-PMG报告载体的构建
3.1扩增sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列
以hCCR5为例，将构建CRISPR/Cas表达载体时选择的靶位点(即sg.T-hCCR5)，作为特异性SSA-PMG报告载体的靶序列，主要通过在该靶序列5'端添加BamHⅠ识别位点以及在3'端添加mCherry序列的部分互补序列(具体参照mCherry序列5'端的一部分)获得正向引物，通过在该靶序列的5'端添加mCherry序列的部分反向互补序列(具体参照mCherry序列3'端的一部分)以及在3'端添加终止密码子、NotⅠ识别位点获得反向引物。在完成引物设计并合成后，以pSSA-PMG载体为模板进行PCR扩增。上述正、反向引物序列如下：
以上反向引物序列中，下划线部分为额外增加的终止密码子(记为stop codon)的反向互补碱基。
PCR反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用DNA回收试剂盒对目的条带(778bp)进行回收，从而完成对sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列的克隆并在序列两端引入了限制性内切酶(即BamHⅠ、NotⅠ)识别位点，其中sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列包括以下依次排列的元件：sg.T-hCCR5、mCherry、sg.T-hCCR5、stop codon。
3.2构建phCCR5-SSA-PMG载体
以pSSA-PMG载体为骨架，分别将骨架载体和扩增得到的含有sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列的目的片段通过BamHⅠ/NotⅠ双酶切之后连接，使sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列替换骨架载体中的mCherry，得到phCCR5-SSA-PMG载体，使用双酶切鉴定(参见图8b)、测序验证。
构建好的phCCR5-SSA-PMG载体参见图8c所示(7725bp)，包括以下依次排列的元件：CMV promoter、抗性基因编码区同源序列PuroL1-305、sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列、抗性基因编码区同源序列PuroR105-597、T2A剪切肽、EGFP、polyA。sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列中的stop codon(具体采用TAA)位于PuroR105-597之前，从而：
1)阻止载体中的T2A-EGFP在未打靶时起作用；
2)当打靶载体时，PuroL1-305与PuroR105-597的约200bp的同向重复序列会发生重组，因此，在PuroL1-305与PuroR105-597中间的元件，例如mcherry在载体未被打靶时，能够正常表达。
4.构建转染阳性报告载体
4.1扩增puromycin抗性基因编码序列
以pSpCas9(BB)-2A-Puro载体(Addgene 48139)为模板，设计引物并合成，进行PCR扩增。其中引物序列如下：
iPuro-F(Hind III)：5'-cttAAGCTTACCATGACCGAGTACAAGC-3'(SEQ.ID.NO.11)
iPuro-R：5'-CCTCTCCACTGCCGGCACCGGGCTTGC-3'(SEQ.ID.NO.12)
PCR反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用DNA回收试剂盒对目的条带进行回收(参见图9)，从而完成对puromycin抗性基因编码序列(简称Puro)的克隆并在序列一端加上了限制性内切酶(即Hind III)识别位点。
4.2构建Puro-T2A-EGFP序列
以pSSA-RPG载体(Addgene#85932)为模板，设计引物并合成，进行PCR扩增。引物序列如下：
T2A-EGFP-F：5'-GCAAGCCCGGTGCCGGCAGTGGAGAGG-3'(SEQ.ID.NO.13)
T2A-EGFP-R(Xba I)：5'-ttaTCTAGATTACTTGTACAGCTC-3'(SEQ.ID.NO.14)
PCR反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用DNA回收试剂盒对目的条带进行回收(参见图10)，从而完成对T2A-EGFP序列的克隆并在序列一端加上了限制性内切酶(即Xba I)识别位点，其中T2A-EGFP序列由以下依次连接的元件组成：T2A剪切肽、EGFP。然后通过Overlap Extension PCR将扩增所得含有Puro的目的片段和含有T2A-EGFP序列的目的片段融合成一个DNA片段，该片段中位于限制性内切酶(即Hind III、Xba I)识别位点之间的部分命名为Puro-T2A-EGFP序列(参见图11)，该序列由以下依次连接的元件组成：Puro、T2A剪切肽、EGFP。
4.3构建pcDNA3.1-CMV-Puro-T2A-EGFP-polyA载体
以pcDNA3.1载体(Invitrogen V79520)为骨架，将骨架载体和含有Puro-T2A-EGFP序列的融合产物通过Hind III/Xba I双酶切之后连接，使Puro-T2A-EGFP序列整合在该载体中，得到pcDNA3.1-CMV-Puro-T2A-EGFP-polyA载体(简称pPuro-T2A-EGFP载体)，使用双酶切鉴定(参见图12)、测序验证(与phCCR5-SSA-PMG经打靶修复后的载体相同)。
(二)SSA-PMG报告富集系统的工作原理及流程
1.工作原理
以上构建的SSA-PMG报告富集系统是红绿光“切换式”交通信号灯(Traffic LightReporter)基因编辑报告系统。
所述SSA-PMG报告富集系统主要由两部分组成，分别是：CRISPR/Cas表达载体(例如phCCR5-sgRNA/Cas9载体)和特异性SSA-PMG报告载体(例如phCCR5-SSA-PMG载体)。CRISPR/Cas表达载体包括sgRNA表达盒和Cas蛋白表达盒；特异性SSA-PMG报告载体主要包括一个双荧光报告系统(例如基于mCherry/EGFP的红/绿荧光报告系统)和药物抗性(例如基于Puro的嘌呤霉素抗性)一体化表达盒。所述SSA-PMG报告富集系统转染细胞后，CRISPR/Cas表达载体可以表达出gRNA复合体(sgRNA)和Cas蛋白。之后，通过利用sgRNA 5'端20bp左右的序列进行RNA-DNA碱基配对，将Cas蛋白/sgRNA复合物招募到PAM上游特定的DNA序列处，在剪切细胞基因组靶位点的同时，剪切特异性SSA-PMG报告载体上的靶序列。
参见图1，所述特异性SSA-PMG报告载体转染进入细胞后，随着其一体化表达盒中位于PuroL1-305和PuroR105-597之间的两个靶序列区被同时剪切，可以利用PuroL1-305和PuroR105-597的同向重复序列发生SSA修复，使mCherry序列被敲除，并且能够正常翻译puromycin抗性基因编码序列和绿色荧光蛋白EGFP基因编码序列，从而在CMV的启动下实现puromycin抗性和绿色荧光的表达。而如果未发生上述剪切，则仅能够正常翻译PuroR105-597之前的核苷酸序列，此时，红色荧光蛋白mCherry能够正常表达，从而在CMV的启动下实现红色荧光的表达(代表转染阳性)。因此通过共转染CRISPR/Cas表达载体，特异性SSA-PMG报告载体自身可以通过单链退火修复，实现双荧光报告系统工作(两种荧光转换)，同时产生嘌呤霉素抗性，从而可以用于流式细胞仪分选或者通过嘌呤霉素药物筛选，富集基因编辑阳性细胞。
2.具体的富集试验过程(参见图13)
(1)设计针对细胞(例如HEK293T细胞)基因组中目标编辑基因(GOI)靶位点的CRISPR/Cas表达载体和特异性SSA-PMG报告载体；
(2)将构建好的CRISPR/Cas表达载体、特异性SSA-PMG报告载体共转染(Co-transfection)细胞(例如HEK293T细胞)；
(3)转染48～72小时后，使用流式细胞仪检测核酸酶发挥剪切活性的效率(转染报告载体后核酸酶阳性细胞占转染阳性细胞的比值＝报告载体修复效率/质粒载体的细胞转染效率)，或者利用流式细胞仪分选得到核酸酶阳性细胞；
(4)转染48～72小时后，也可以通过在细胞培养基中添加嘌呤霉素(puromycin)，经嘌呤霉素筛选3～5天后，撤药，换为正常细胞培养基，得到经过筛选后的细胞(指核酸酶阳性细胞)；
(5)将核酸酶阳性细胞用有限稀释法稀释后铺到96孔板培养皿；
(6)7天后，随机筛选细胞单克隆，用PCR鉴定基因组靶位点发生基因编辑(knockout,KO)的细胞单克隆(即基因编辑阳性细胞)；
(7)将经过鉴定的阳性细胞单克隆转至24孔板，对细胞进行扩大培养，例如对HEK293T细胞，采用含有10％胎牛血清及100μg/mL青/链霉素的DMEM培养基为细胞培养基，并于37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养。
(三)SSA-PMG报告富集系统在富集CRISPR/Cas9基因编辑阳性细胞中的具体应用以上述hCCR5基因为例，将共转染phCCR5-sgRNA/Cas9载体和phCCR5-SSA-PMG
载体的HEK293T细胞，作为利用SSA-PMG报告富集系统富集基因编辑阳性细胞的试验组；将phCCR5-sgRNA/Cas9载体和pPuro-T2A-EGFP载体共转染的HEK293T细胞作为阳性对照组。
各组细胞转染后48小时，用荧光倒置显微镜观察细胞红/绿荧光(参见图14)。设置pNC-sgRNA/Cas9载体和phCCR5-SSA-PMG载体共转染的HEK293T细胞为阴性对照组(pNC-sgRNA/Cas9载体具体指pX330-U6-Chimeric_dBsaI-CBh-hSpCas9载体)。然后将试验组和阳性对照组的细胞消化至1.5mL EP管内，800转/分钟离心2分钟。将细胞沉淀用PBS重悬，将标记好分组的离心管插入冰盒内。流式细胞计数仪上样前再将细胞悬液经200目细胞筛网过滤至流式管内，以防止细胞聚团、堵塞流式细胞仪管道。FACS：细胞在流式细胞仪内，经红色荧光(mCherry+)/绿色荧光(EGFP+)通道分选计数，计算试验组共转染报告载体后核酸酶阳性细胞占转染阳性细胞的比值为：88.67％＝报告载体修复效率(36.39％)/质粒载体的细胞转染效率(41.04％)，之后将两组中只发绿色荧光的细胞(EGFP+)收集(参见图15)，对收集的两组细胞提取基因组DNA，进行基因组编辑效率检测。
各组细胞转染后48小时，在试验组和阳性对照组的细胞培养基中添加嘌呤霉素(3μg/mL)对细胞进行药物筛选。药物筛选3天后，撤药，对富集的阳性细胞用荧光倒置显微镜观察(参见图17)。之后提取两组细胞的基因组DNA，进行基因组编辑效率检测。
对经过荧光分选、药物筛选两种不同方式富集得到的细胞，提取基因组DNA作为模板，使用带有不同序列的barcode的检测引物(参见表8)扩增靶位点附近区域(280bp)，胶回收后送至西安擎科生物科技公司进行扩增子深度测序检测。
表8.检测引物
测序结果经CRISPResso(http://www.crispresso.rocks)在线软件分析后，统计SSA-PMG报告富集系统及阳性对照组的报告富集系统各自富集基因编辑阳性细胞的效率；使用GraphPadPrism 8.0统计结果。如果未发生基因编辑，由细胞基因组DNA扩增出的目的基因与野生型基因序列(WT)一致；如果发生基因编辑，由细胞基因组DNA扩增出的目的基因不应是280bp的片段，且测序结果显示基因序列存在缺失或突变(参见图16和图18)。
对通过FACS获得的阳性细胞分析结果显示，使用阳性对照组的报告富集系统(与phCCR5-sgRNA/Cas9载体共转染的为pPuro-T2A-EGFP载体)获得的阳性细胞基因编辑效率为23.57％(100％-WT％，WT％为未发生基因编辑的细胞的数量占比)，使用SSA-PMG报告富集系统获得的阳性细胞基因编辑效率为41.36％(100％-WT％)；即通过核酸酶阳性细胞富集基因编辑阳性细胞的效率为通过转染阳性细胞富集基因编辑阳性细胞的效率的1.63倍(图16)。
对通过嘌呤霉素处理获得的阳性细胞分析结果显示：使用阳性对照组的报告富集系统(与phCCR5-sgRNA/Cas9载体共转染的为pPuro-T2A-EGFP载体)获得的阳性细胞基因编辑效率为45.33％(100％-WT％)，使用SSA-PMG报告富集系统获得的阳性细胞基因编辑效率为66.93％(100％-WT％)；即通过核酸酶阳性细胞富集基因编辑阳性细胞的效率为通过转染阳性细胞富集基因编辑阳性细胞的效率的1.48倍(图18)。
以上结果表明，上述SSA-PMG报告富集系统可以更加高效的富集获得基因编辑阳性细胞。
另外，将sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列变为sg.T-hCCR5-mCherry序列或mCherry-sg.T-hCCR5序列，其他与上述特异性SSA-PMG报告载体的构建相同。将由此获得的报告载体与phCCR5-sgRNA/Cas9载体分别共转染HEK293T细胞，并采用FACS检测载体修复效率，结果显示：该报告载体在只能进行单侧靶序列剪切的情况下，载体修复效率明显低于存在两侧靶序列的特异性SSA-PMG报告载体(利用sg.T-hCCR5-mCherry-sg.T-hCCR5序列构建的载体phCCR5-SSA-PMG的修复效率为：36.39％，图15；利用sg.T-hCCR5-mCherry序列构建的报告载体的修复效率为21.20％，图19；利用mCherry-sg.T-hCCR5序列构建的报告载体的修复效率为：17.28％，图19)。这些结果表明，报告载体主要反映转染细胞中核酸酶的活性，其中特异性SSA-PMG报告载体更容易被核酸酶识别并发生剪切，并且特异性SSA-PMG报告载体自身打靶后更容易被修复，从而进一步依靠自身修复能力提高了富集基因编辑阳性细胞的效率。
总之，本发明构建的SSA-PMG报告富集系统，可以通过特异性SSA-PMG报告载体上由导向RNA识别的靶序列在核酸酶打靶基因组(基因编辑)同时引导其完成对载体自身的剪切，并且通过SSA修复可以使得隔断的药物抗性基因恢复完整的表达序列，使所转染细胞产生抗性，同时对双荧光报告系统中的两种表达序列分别进行剪接删除、修复表达，从而既可以通过对TLR型双荧光报告系统中的两种报告基因的表达分别进行量化，确定核酸酶在转染细胞中发挥剪切活性的效率，同时通过荧光分选或药物筛选快速、简便的获得核酸酶阳性细胞。更为关键的是，本发明的SSA-PMG报告富集系统能够提高基因编辑阳性细胞的富集效率。本发明为推动基因编辑技术在基因功能研究及动物遗传育种方面的应用提供了有效途径。

Claims (10)

1.一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：该系统包括位点特异性的报告载体；所述报告载体包括双荧光报告基因与抗性基因一体化表达盒，所述一体化表达盒包括位于该表达盒的转录区域的与抗性基因编码序列同源的上游片段、与抗性基因编码序列同源的下游片段、第一荧光蛋白的基因编码序列、第二荧光蛋白的基因编码序列以及由导向RNA识别的第一靶序列和第二靶序列，所述第一靶序列位于所述上游片段与第一荧光蛋白的基因编码序列之间，所述第二靶序列位于所述下游片段与第一荧光蛋白的基因编码序列之间，所述上游片段和所述下游片段包括用于进行单链退火修复并在修复后使所述一体化表达盒从表达第一荧光蛋白转换为进行相应抗性基因与第二荧光蛋白的串联表达的同向重复序列。
2.根据权利要求1所述一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：所述上游片段、所述第一靶序列、第一荧光蛋白的基因编码序列、所述第二靶序列、所述下游片段和第二荧光蛋白的基因编码序列采用同一个开放阅读框，该开放阅读框通过设置在所述第二靶序列与所述下游片段之间的终止密码子分隔。
3.根据权利要求1所述一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：所述同向重复序列为200～350bp。
4.根据权利要求1所述一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：所述第二荧光蛋白的基因编码序列位于所述下游片段后侧，所述一体化表达盒的转录区域还包括用于连接所述下游片段和第二荧光蛋白的基因编码序列的剪切肽序列。
5.根据权利要求1所述一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：所述第一荧光蛋白为红色荧光蛋白，第二荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
6.根据权利要求1所述一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：所述上游片段和所述下游片段经过单链退火修复后用于表达嘌呤霉素抗性。
7.根据权利要求1所述一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：所述系统还包括位点特异性的CRISPR/Cas表达载体，所述CRISPR/Cas表达载体包括用于表达所述导向RNA的sgRNA表达盒以及用于表达Cas蛋白的核酸酶表达盒，所述导向RNA识别的靶序列来源于基因编辑目标细胞的基因组。
8.根据权利要求7所述一种基因编辑阳性细胞报告富集系统，其特征在于：所述基因编辑目标细胞为真核细胞。
9.一种如权利要求1所述的基因编辑阳性细胞报告富集系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)克隆含有与抗性基因编码序列同源的上游片段、与抗性基因编码序列同源的下游片段、剪切肽序列以及第二荧光蛋白的基因编码序列的重组片段；将该重组片段与表达载体骨架连接后与克隆获得的第一荧光蛋白的基因编码序列整合并使该荧光蛋白的基因编码序列接入在所述上游片段和下游片段之间，得双荧光报告基因与抗性基因一体化重组表达载体；
2)将克隆获得的含有第一荧光蛋白的基因编码序列以及由导向RNA识别的第一靶序列和第二靶序列的重组片段替换步骤1所得双荧光报告基因与抗性基因一体化重组表达载体中的第一荧光蛋白的基因编码序列，得到位点特异性的报告载体。
10.一种基因编辑阳性细胞的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将如权利要求7所述的基因编辑阳性细胞报告富集系统转染至基因编辑目标细胞；
2)转染48～72小时后利用流式细胞仪进行荧光分选，得到核酸酶阳性细胞，然后进行富集培养；或者，转染48～72小时后用药物筛选表达相应抗性基因的细胞，得到核酸酶阳性细胞，然后进行富集培养。
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