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CN116515710A - 异养硝化细菌及其菌剂与制法和用途 - Google Patents

异养硝化细菌及其菌剂与制法和用途 Download PDF

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CN116515710A CN202310609010.4A CN202310609010A CN116515710A CN 116515710 A CN116515710 A CN 116515710A CN 202310609010 A CN202310609010 A CN 202310609010A CN 116515710 A CN116515710 A CN 116515710A
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Abstract

本发明公开了异养硝化细菌枯草芽孢杆菌JHD‑Z1，其生物保藏号为CCTCC NO：M 20221913。还公开了异养硝化细菌地衣芽孢杆菌JHD‑Z2，其生物保藏号为CCTCC NO：M 20221914。本发明还公开了水产用异养硝化细菌制剂，制剂由枯草芽孢杆菌JHD‑Z1与/或地衣芽孢杆菌JHD‑Z2制成。本发明还公开了复合异养硝化细菌制剂的制备方法。本发明菌和菌剂不仅可以高效净化养殖水质，降低养殖用水的氨氮与/或亚硝酸盐含量，并且能够显著提高养殖动物的生长性能，为水产养殖动物提供良好的生长环境。

Description

异养硝化细菌及其菌剂与制法和用途
技术领域
本发明涉及水产动物养殖领域及微生物应用技术领域，特别涉及一种水产用复合异养硝化细菌制剂的制备及其培养方法和应用。
背景技术
水产品作为人类获取蛋白质的重要来源之一，其需求量的提升也促进着集约化养殖模式的发展。但随着养殖密度的不断提高，环境污染问题也愈发严重，因此寻找到能够维持水产行业可持续发展的方式成为了当务之急。传统的养殖模式一般通过大批量换水的方式来保持水质的优良，但成本过高、环境污染过大以及生物安全性过低等弊端也随之显现而来。养殖过程中产生的氨氮主要通过藻类的光合作用和自养微生物的硝化作用来分解吸收，但藻类容易受到光照天气等因素的影响，作用过程很不稳定，且自养微生物的硝化作用速率较慢，随着养殖过程的进行，投饲率的提高会导致氨氮的迅速积累，较低的转化能力不能达到净水的效果。
异养硝化细菌通过吸收、利用、转化等方式清除水体中的氮，这不仅能够有效改善水质，同时能定向的高效可靠地利用无机氮。在添加碳源的情况下，异养微生物通过异养转化将氨氮转变成菌体蛋白，在适宜的C/N条件下能够快速高效地改善水体环境。同时碳源的添加也能够促进水中藻类、细菌、原生动物的生长，以异养细菌为主要力量，三条途径共同作用，从而去除水体中的氨氮。益生菌同时还富含丰富的蛋白质、维生素、矿物质等营养元素，可以作为额外的营养源提供给养殖动物，从而减少饲料的投喂量及饲料中的蛋白质含量，节约成本，同时还可以降低对水环境的破坏。同时益生菌具有多种促生长功能的活性物质，不仅能提高养殖动物的营养水平，还可以增加动物在应激胁迫条件下的免疫能力。且微生物的代谢产物和细菌细胞壁成分都可以作为免疫刺激剂来提高养殖动物的免疫功能。益生菌还可以通过在机体肠道中定殖，从而提高消化酶活性，并改善肠道微生物结构，降低潜在致病菌的丰度，保证机体健康。
随着水产养殖业的快速发展，市面上相应的微生态制剂的种类也越来越多，但各个种类的脱氮性能却强弱不一，其原因就在于异养微生物种类的不同。所以，找到适宜的、功能性强的异养硝化细菌显得尤为重要。目前水产用微生态制剂一般分为单一菌种制剂和复合菌种制剂两种类型，而复合菌种制剂可以通过菌株间的共生或协作关系更高效地降解水体中的有害物质，并且相较于单一菌种具有更好的环境抗逆性。同时，不同的菌株组成，不同的菌株比例都会对复合菌液的脱氮效率产生影响。而适宜的发酵条件作为菌株生长良好的先决条件，对复合菌液的脱氮性能也具有很大影响。因此，找到一种对水质有更好净化作用的复合异养硝化细菌及其最佳脱氮条件显得极为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了两种更高效的、对水质净化能力更强的水产用异养硝化细菌。
本发明所要解决的另一个技术问题提供了上述异养硝化细菌制剂。
本发明所要解决的再一个技术问题提供了上述异养硝化细菌制剂的制备方法和应用。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种异养硝化细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD-Z1，其生物保藏号为CCTCC NO：M 20221913。
本发明还提供了一种异养硝化细菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD-Z2，其生物保藏号为CCTCC NO：M 20221914。
本发明提供了一种水产用异养硝化细菌制剂，该菌剂中含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD-Z1与/或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD-Z2。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来实现的。以上所述的水产用异养硝化细菌制剂，其特点是，水产用异养硝化细菌制剂中，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JHD-Z1的活菌总数为x，且1×108≤x≤1×109；地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)JHD-Z2的活菌总数为y，且1×108≤y≤1×109。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来实现的。以上所述的水产用异养硝化细菌制剂，其特点是，所述水产用异养硝化细菌制剂中，当同时含有枯草芽孢杆菌JHD-Z1、地衣芽孢杆菌JHD-Z2时，二者的重量比为1∶1-3。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来实现的。以上所述的水产用异养硝化细菌制剂，其特点是，所述水产用异养硝化细菌制剂中还包括可接受的营养性稀释载体，所述营养型稀释载体优选自蔗糖、NaCl、MgSO4·7H2O、K2HPO4中的一种或者多种。
本发明还提供了一种如以上技术方案所述水产用异养硝化细菌制剂的制备方法，其特点是，其步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌JHD-Z1、地衣芽孢杆菌JHD-Z2采用牛津杯的方式进行菌株间的相互拮抗测试，产生拮抗作用的菌株不进行混合培养；将菌株按照同比例的方式进行混合培养12h，用比浊仪测定菌液浓度并将菌液浓度调整至4.5×107-4.8×107CFU/mL的水平内；按1％的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养96h；每48h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化；
硝化细菌液体培养基：NaNO2 0.0375g，CH3COONa 5g，NaCl 1.0g，MgSO4·7H2O1.0g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水1000mL；
亚硝化细菌液体培养基：NH4Cl 4g，CH3COONa 5g，维氏盐溶液50mL，蒸馏水1000mL，pH 7.5-8.0；
维氏盐溶液：K2HPO4 5g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·4H2O 0.05g，蒸馏水1000mL；
氨氮的测定方法采用水杨酸分光光度法，亚硝酸盐氮的测定方法采用N-(1-萘基)二乙胺光度法；
(2)将107、108、109CFU/mL作为不同的菌液浓度，按1％的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养96h；在0、12、24、48、96h各取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳菌液浓度；
(3)将乙酸钠、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠作为唯一碳源，根据步骤(2)数据确定最佳的菌液添加浓度，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳碳源；
(4)将C/N设置为10、15、20、25，根据步骤(2)、步骤(3)数据确定最佳菌液浓度和碳源，温度30℃、转速180r/min、pH8振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳C/N；
(5)将1％、2％、5％、10％作为菌液接种量，按步骤(2)至步骤(4)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源和最佳C/N按不同的接种量接种至液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳菌液接种量；
(6)将培养基初始pH通过向培养基中添加HCl和NaOH溶液调节后设置为7、8、9、10，按步骤(2)至步骤(5)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源、最佳C/N和最佳接种量接种至液体培养基中，温度30℃、转速180r/min，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳初始pH；
(7)将25℃、30℃、35℃、40℃设置为培养温度，按步骤(2)至步骤(6)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源、最佳C/N、最佳接种量及最佳pH接种至液体培养基中，180r/min，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳培养温度；
(8)将步骤(2)至(7)得到的最终发酵液分别经8000rpm，10min离心收集菌体，向菌体中分别按照菌体与保护剂溶液重量比为菌体重量：保护剂重量＝1∶(5-10)的比例向菌体中添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液冷冻干燥，得到复合异养硝化细菌菌剂；
所述保护剂溶液包括以下组分：脱脂乳粉25-35g/L，脱盐乳清粉15-30g/L，工业海藻糖10-20g/L，维生素C3-4g/L，卵磷脂0.04-0.08g/L，余量为蒸馏水；
本发明还公开了以上技术方案所述的异养硝化细菌或者所述水产用复合异养硝化细菌制剂或者所述方法制得的水产用异养硝化细菌制剂的用途，其特点是，所述的用途为降低养殖用水的氨氮与/或亚硝酸盐含量，改善水质。同时，还可以提高养殖动物生长性能。
本发明所涉及的异养硝化细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD-Z1，已于2022年12月09日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其生物保藏号为CCTCC NO：M20221913。地址：武汉，武汉大学。
本发明所涉及的异养硝化细菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD-Z2，已于2022年12月09日保藏在中国典型培养物保藏中心其生物保藏号为CCTCC NO：M20221914。地址：武汉，武汉大学。
与现的技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选得到的2株异养硝化细菌均为降解能力较强的菌株，保证了水质净化的能力。
本发明的异养硝化细菌大量富集后可以迅速占据水体中生态位，同时通过抢占病原微生物的生长空间和营养物质来抑制其生长，从而降低系统中致病菌丰度。细菌的代谢产物和细胞壁成分都可以作为免疫刺激剂来提高养殖动物的免疫功能。益生菌还可以通过在机体肠道中定植，从而提高消化酶活性，并改善肠道微生物结构，降低潜在致病菌的丰度，保证机体健康，提高养殖动物生长性能。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1，一种水产用复合异养硝化细菌制剂，具体操作步骤如下：
S1.将枯草芽孢杆菌JHD-Z1、地衣芽孢杆菌JHD-Z2采用牛津杯的方式进行菌株间的相互拮抗测试，产生拮抗作用的菌株不进行混合培养。将纯化得到的菌株分别作为指示菌，取200μL涂布于2216E固体培养基上，在平板四周放置牛津杯，在牛津杯中加入其他菌液100μL，菌液浓度均为107CFU/mL，30℃培养24h。结果观察到牛津杯附近无透明圈产生，可以进行混合发酵。
S2.经拮抗作用测试后，将2株菌按照同比例的方式进行混合培养12h，用比浊仪测定菌液浓度并将菌液浓度调整至4.5-4.8×107CFU/mL的水平内。按1％的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养96h。每48h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化。硝化细菌液体培养基：NaNO20.0375g(NO2 --N 10mg/L)，CH3COONa 5g，NaCl 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水1000mL。亚硝化细菌液体培养基：NH4Cl 4g(NH4 +-N 50mg/L)，CH3COONa 5g，维氏盐溶液50mL，蒸馏水1000mL，pH 7.5-8.0。维氏盐溶液：K2HPO4 5g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·4H2O 0.05g，蒸馏水1000mL。氨氮的测定方法采用水杨酸分光光度法，亚硝酸盐氮的测定方法采用N-(1-萘基)二乙胺光度法。
表1各组异养硝化细菌制剂对氨氮、亚硝酸盐的降解率
结果如表1所示，复合异养硝化细菌制剂对氨氮的降解能力在48和96h要显著高于各单一异养硝化细菌制剂。各组对亚硝酸盐的降解能力无显著差异，并且在96h降解率均达到100％。由此得出各异养硝化细菌间具有协同作用，混合培养后其脱氮性能更好。
研究在不同菌液浓度、不同碳源、不同C/N、不同接种量、不同pH和不同温度这6种条件下复合异养硝化细菌的脱氮性能。
S3.分别以107、108、109CFU/mL作为不同的菌液浓度，按1％的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养96h。在0、12、24、48、96h各取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化。
表2不同菌液浓度对氨氮、亚硝酸盐的降解率的影响
结果如表2所示，在0-12h，107处理组对氨氮、亚硝酸盐的降解率最低，仅有51.3％和28％左右。其次为108处理组，两种降解率均达到80％左右。109处理组降解能力最强，12h降解率均达到100％。各组在24h对氨氮、亚硝酸盐的降解率均达到100％。而在96h，109处理组氨氮、亚硝酸盐的的降解能力均有所下降。综合判断，菌液浓度为108时脱氮性能最佳。
S4.在菌液添加浓度为108CFU/mL时，选取乙酸钠、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠作为唯一碳源，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化。
表3不同碳源对氨氮、亚硝酸盐的降解率的影响
结果如表3所示，蔗糖组无论是对氨氮还是亚硝酸盐的降解能力上都表现最好，12h时降解效率分别达到84.93％和97.67％左右，丁二酸钠组在6-12h对氨氮的降解率几乎保持平稳，处于20％左右的较低水平。由此得出碳源为蔗糖时脱氮性能最佳。
S5.在菌液添加浓度为108CFU/mL、碳源为蔗糖时，改变碳源的添加量使得C/N分别为10、15、20、25，温度30℃、转速180r/min、pH8振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化。
表4不同碳氮比对氨氮、亚硝酸盐的降解率的影响
结果如表4所示，C/N为20时降解率最高，分别为82.3％和91.8％。而当C/N为10时氨氮、亚硝酸盐的降解能力均低于其他各组。虽然C/N为15时在12h亚硝酸盐的降解能力仅略低于C/N为20组，但在对氨氮的降解能力上与C/N为20组差异显著。因此，C/N为20时脱氮性能最佳。
S6.在菌液添加浓度为108CFU/mL、碳源为蔗糖、C/N为20时，选取1％、2％、5％、10％作为菌液接种量，温度30℃、转速180r/min、pH8，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化。
表5不同接种量对氨氮、亚硝酸盐的降解率的影响
结果如表5所示，当接种量为2％时，氨氮的降解能力在各时间点均优于其他各组，而对亚硝酸盐的降解率在0-9h表现为较低水平，显著低于5％和10％处理组，但在9-12h降解率迅速升高，在12h与10％处理组无显著差异。因此当接种量为2％时脱氮性能最佳。
S7.在菌液添加浓度为108CFU/mL、碳源为蔗糖、C/N为20、接种量为2％时，通过向培养基中添加HCl和NaOH溶液调节初始pH为7、8、9、10，温度30℃、转速180r/min，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化。
表6不同pH对氨氮、亚硝酸盐的降解率的影响
结果如表6所示，当pH为9时降解能力最优，并在9h时对氨氮、亚硝酸盐的降解能力能够达到100％左右，因此当pH为9时脱氮性能最佳。
S8.在菌液添加浓度为108CFU/mL、碳源为蔗糖、C/N为20、接种量为2％、pH为9时，设置25℃、30℃、35℃、40℃四种培养温度，180r/min，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化。
表7不同温度对氨氮、亚硝酸盐的降解率的影响
结果如表7所示，当温度为30℃时，降解率在9h均达到100％，远高于温度为25℃组。温度为35和40℃组在12h氨氮的降解率也均达到100％，但对亚硝酸盐的降解能力远低于温度30℃组。温度在25℃时对氨氮、亚硝酸盐的降解能力均为最低。因此选取30℃为菌液发酵最佳温度；
以得出，当菌液添加浓度为108CFU/mL、碳源为蔗糖、C/N为20、接种量为2％、pH为9、温度为30℃时复合异养硝化细菌的脱氮性能最佳。
S9.将复合异养硝化细菌在最适发酵条件下发酵12h后经8000rpm，10min离心收集菌体，向经离心后菌体中分别按照菌体与保护剂溶液重量比为菌体重量∶保护剂重量＝1∶(5-10)的比例向菌体中添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液冷冻干燥，得到复合异养硝化细菌菌剂，其中，所述保护剂溶液包括以下组分：脱脂乳粉25-35g/L，脱盐乳清粉15-30g/L，工业海藻糖10-20g/L，维生素C3-4g/L，卵磷脂0.04-0.08g/L，余量为蒸馏水。
实施例2，水产用复合异养硝化细菌制剂的应用效果评价实验，步骤如下：
S1.日本囊对虾取自江苏省连云港赣榆佳信水产开发有限公司，平均体质量为(2.55±0.18)g，平均体长为(6.4±0.09)cm。日本囊对虾配合饲料粗蛋白含量为49.01％，粗脂肪含量为7.24％，饲料中C/N约为11；
S2.养殖对象取回后放入1000L的养殖桶中暂养7d，温度为30±0.5℃，盐度28±0.3，pH 9.1±0.1，溶解氧为7±0.2mg/L。暂养期间每天投喂两次(8:00和19:00)颗粒饲料，投喂量为虾体重的3％，投喂后1h进行吸污处理。暂养期间每天换水1/3。暂养结束后，取300尾规格相近、活力好的日本囊对虾平均分配到10个养殖箱中(60L，50cm×40cm×30cm)进行实验。实验设置对照组和实验组，每组设置5个平行。对照组养殖条件同暂养条件一致，实验组则采用零换水养殖模式，仅补充蒸发损耗水分。采用上述实验组合得到的复合异养硝化细菌按照最适培养条件发酵12h后投入水体中，使水体细菌的初始浓度保持在4.0-4.5×108CFU/mL的水平内。实验组每天添加蔗糖作为有机碳源来维持水体中C/N(质量浓度)为20∶1。实验周期为32d；
S3.实验期间每4d测定一次水质指标，养殖水质的影响如表8所示。实验组氨氮、硝酸盐含量在第4d显著高于对照组(P＜0.05)，随后显著下降，从第8d开始氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐含量显著降低并低于对照组(P＜0.05)，且随着实验的进行一直保持在较低的水平。对照组氨氮、硝酸盐含量随着时间的推移呈现波动式增长，亚硝酸盐含量则一直呈上升趋势。对照组和实验组pH均随着养殖的进行呈下降趋势，实验组下降趋势更为明显；
表8复合异养硝化细菌对养殖水质的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)
S4.实验结束后统计日本囊对虾的生长性能，结果如表9所示。实验组日本囊对虾成活率达到79％，显著高于对照组(P＜0.05)。同时实验组增重率、特定增长率相较于对照组分别提高了58.9％和50.7％(P＜0.05)。对照组和实验组肥满度无显著差异(P＞0.05)；
表9复合异养硝化细菌对日本囊对虾生长性能的影响
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)
S5.实验结束后每个处理组随机选取9尾虾，采集肝胰腺、肌肉、胃、肠道组织，每3尾虾的相同组织做成一个混样，准确称重后放入1.5mL离心管中转投液氮速冻，随后转移至-80℃冰箱保存待用。根据各组织样品的质量，按照质量体积比1∶9加入0.9％的生理盐水制成10％的组织匀浆液，4℃、2500r/min离心10min后取上清液进行酶活力的测定。测定肝胰腺和肌肉组织中的非特异性免疫酶活性，包括超氧化物歧化酶(WST-1法)、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶；测定胃和肠道组织中的消化酶活性，包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶。酶活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
表10复合异养硝化细菌对日本囊对虾非特异性免疫酶活力的影响
注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)
表11复合异养硝化细菌对日本囊对虾消化酶活力的影响
注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)
结果如表10-11所示，实验组肌肉、肝胰腺组织中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性均高于对照组，且存在显著差异(P＜0.05)；实验组胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶活性在胃和肠道组织中均显著高于对照组(P＜0.05)，表明复合异养硝化细菌能够提高日本囊对虾的免疫和消化功能；
综上所述，通过本方法得到的复合异养硝化细菌制剂相较于原来的成品微生态制剂具有更好的水质净化能力。综合各项指标得到，当菌液添加浓度为108CFU/mL、碳源为蔗糖、C/N为20、接种量为2％、pH为9、温度为30℃时该方法得到的复合异养硝化细菌能够更加快速、高效地脱氮。同时结合养殖实验可以看出该种复合异养硝化细菌制剂能够促进日本囊对虾的生长，提高其生长性能，提高消化和免疫功能。

Claims (10)

1.一种异养硝化细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD-Z1，其特征在于：其生物保藏号为CCTCC NO：M 20221913。
2.一种异养硝化细菌地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD-Z2，其特征在于：其生物保藏号为CCTCC NO：M 20221914。
3.一种水产用异养硝化细菌制剂，其特征在于，该菌剂中含有如权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD-Z1与/或如权利要求2所述的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD-Z2。
4.根据权利要求3所述的水产用异养硝化细菌制剂，其特征在于，水产用异养硝化细菌制剂中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JHD-Z1的活菌总数为x，且1×108≤x≤1×109；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)JHD-Z2的活菌总数为y，且1×108≤y≤1×109。
5.根据权利要求3所述的水产用异养硝化细菌制剂，其特征在于，所述水产用异养硝化细菌制剂中，当同时含有枯草芽孢杆菌JHD-Z1、地衣芽孢杆菌JHD-Z2时，二者的重量比为1∶1-3。
6.根据权利要求3所述的水产用异养硝化细菌制剂，其特征在于，所述水产用异养硝化细菌制剂中还包括可接受的营养性稀释载体。
7.根据权利要求6所述的水产用异养硝化细菌制剂，其特征在于，所述营养型稀释载体选自蔗糖、NaCl、MgSO4·7H2O、K2HPO4中的一种或者多种。
8.一种如权利要求3所述水产用异养硝化细菌制剂的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)将枯草芽孢杆菌JHD-Z1、地衣芽孢杆菌JHD-Z2采用牛津杯的方式进行菌株间的相互拮抗测试，产生拮抗作用的菌株不进行混合培养；将菌株按照同比例的方式进行混合培养12h，用比浊仪测定菌液浓度并将菌液浓度调整至4.5×107-4.8×107CFU/mL的水平内；按1％的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养96h；每48h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化；
硝化细菌液体培养基：NaNO2 0.0375g，CH3COONa 5g，NaCl 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO4 1.0g，蒸馏水1000mL；
亚硝化细菌液体培养基：NH4Cl 4g，CH3COONa 5g，维氏盐溶液50mL，蒸馏水1000mL，pH7.5-8.0；
维氏盐溶液：K2HPO4 5g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·4H2O 0.05g，蒸馏水1000mL；
氨氮的测定方法采用水杨酸分光光度法，亚硝酸盐氮的测定方法采用N-(1-萘基)二乙胺光度法；
(2)将107、108、109CFU/mL作为不同的菌液浓度，按1％的添加量接种于硝化细菌、亚硝化细菌液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养96h；在0、12、24、48、96h各取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳菌液浓度；
(3)将乙酸钠、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠作为唯一碳源，根据步骤(2)数据确定最佳的菌液添加浓度，温度30℃、转速180r/min、pH8、C/N15振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳碳源；
(4)将C/N设置为10、15、20、25，根据步骤(2)、步骤(3)数据确定最佳菌液浓度和碳源，温度30℃、转速180r/min、pH8振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳C/N；
(5)将1％、2％、5％、10％作为菌液接种量，按步骤(2)至步骤(4)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源和最佳C/N按不同的接种量接种至液体培养基中，温度30℃、转速180r/min、pH8，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳菌液接种量；
(6)将培养基初始pH通过向培养基中添加HCl和NaOH溶液调节后设置为7、8、9、10，按步骤(2)至步骤(5)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源、最佳C/N和最佳接种量接种至液体培养基中，温度30℃、转速180r/min，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳初始pH；
(7)将25℃、30℃、35℃、40℃设置为培养温度，按步骤(2)至步骤(6)得到的最佳菌液添加浓度、最佳碳源、最佳C/N、最佳接种量及最佳pH接种至液体培养基中，180r/min，振荡培养12h，每3h取样一次，测定培养基中氨氮、亚硝酸盐浓度的变化，确定最佳培养温度；
(8)将步骤(2)至(7)得到的最终发酵液分别经8000rpm，10min离心收集菌体，向菌体中分别按照菌体与保护剂溶液重量比为菌体重量：保护剂重量＝1∶(5-10)的比例向菌体中添加保护剂溶液，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液冷冻干燥，得到复合异养硝化细菌菌剂；
所述保护剂溶液包括以下组分：脱脂乳粉25-35g/L，脱盐乳清粉15-30g/L，工业海藻糖10-20g/L，维生素C3-4g/L，卵磷脂0.04-0.08g/L，余量为蒸馏水。
9.权利要求1或2所述的异养硝化细菌或者权利要求3-7中任何一项所述水产用复合异养硝化细菌制剂或者权利要求8所述方法制得的水产用异养硝化细菌制剂的用途，其特征在于，所述的用途为降低养殖用水的氨氮与/或亚硝酸盐含量，改善水质。
10.权利要求1或2所述的异养硝化细菌或者权利要求3-7中任何一项所述水产用复合异养硝化细菌制剂或者权利要求8所述方法制得的水产用异养硝化细菌制剂的用途，其特征在于，所述的用途为提高养殖动物生长性能。
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