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CN116514984A - Gpc3特异性纳米抗体探针的制备方法及应用 - Google Patents

Gpc3特异性纳米抗体探针的制备方法及应用 Download PDF

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CN116514984A
CN116514984A CN202310400423.1A CN202310400423A CN116514984A CN 116514984 A CN116514984 A CN 116514984A CN 202310400423 A CN202310400423 A CN 202310400423A CN 116514984 A CN116514984 A CN 116514984A
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nanobody
probe
gpc
nano antibody
fusion protein
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CN202310400423.1A
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魏伟军
安淑娴
刘建军
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Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
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Abstract

本发明提供了一种GPC3特异性纳米抗体探针的制备方法及应用，所述GPC3特异性纳米抗体探针采用纳米抗体RG2或纳米抗体融合蛋白ABDRG2制备，所述纳米抗体RG2具有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同源性为70‑100％的序列，纳米抗体融合蛋白ABDRG2具有与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列同源性为70‑100％的序列。本发明构建的GPC3特异性纳米抗体探针，可免疫PET显像，实现了对肝细胞肝癌GPC3表达的无创可视化，进一步实现了肝细胞肝癌的无创诊断，所述及探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点。

Description

GPC3特异性纳米抗体探针的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及纳米抗体探针技术领域，具体涉及一种GPC3特异性纳米抗体探针的制备方法及应用。
背景技术
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。因其发病隐匿,早期诊断困难，晚期治疗方法局限，导致患者预后极差，5年生存率低于10％。传统影像手段如多时相计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)技术对一些影像学表现非典型病灶及小病灶无法进行定性诊断(Gut.2010；59(5):638–44.)。[18F]-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层摄影/计算机断层扫描([18F]-FDG PET/CT)成像技术对HCC，尤其是高分化HCC患者诊断准确度低，严重降低了其对HCC的早期诊断价值(J Hepatol.2000；32(5):792–7.)。因此，临床迫切需要寻找一种可以早期、精准进行HCC诊断的分子影像学方法，以期协助治疗计划制定及最大程度改善患者预后。
IHC属于有创检查，需通过手术切除或穿刺活检取得在体组织与标本，因此，难以实现多点、多次取样，无法精准、全面、动态评估在体GPC3表达情况。
免疫PET(immuno-positron emission tomography，immunoPET)显像是将PET的优越灵敏度、分辨率与抗体的高亲和力、靶向特异性有机融合的一种分子显像新策略。可以无创、定量、动态检测感兴趣靶点的在体表达情况。免疫PET相较于IHC，可以实现无创、在体、全身、动态可视化诊断。1993年由比利时科学家Hamers-Casterman等在《Nature》杂志上报道了在羊驼血清中大量存在的一种天然缺失轻链的抗体(Nature.1993；363(6428):446-8.)，即重链抗体Heavy-chain antibodies,HCAbs)。通过分子生物学技术克隆HCAbs的可变区可得到只有HCAbs可变区的最小抗原结合片段，即VHH抗体或纳米抗体(Nb)。相较于传统单克隆抗体，纳米抗体具有分子量小、亲和力高、特异性强、免疫原性弱、制备成本低廉，易于临床转化和推广应用等优势。因此，成为近年来构筑分子影像探针的热门靶向载体(Theranostics.2014；4(4):386-98.)。目前，由镓-68(68Ga；T1/2＝1.1h)标记靶向人类表皮生长因子受体(HER2)的纳米抗体探针及由锝-99m(99mTc；T1/2＝6.02h)标记靶向程序性死亡配体1(PD-L1)的纳米抗体探针已成功转化至临床(J Nucl Med.2016；57(1):27-33.；JNucl Med.2019；60(9):1213-1220.)。以上实例说明放射性核素标记纳米抗体探针极具临床转化应用前景。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3,GPC3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族成员之一，由核心蛋白、位于C端的两条硫酸乙酰肝素链及与细胞膜连接的磷脂酰肌醇锚组成，分子量大小约70kDa(Gastroenterology.2003；125(1):89-97.)。包括Wnt及Hippo/YAP等在内的多条致癌信号通路及生长因子介导GPC3的信号转导，促进肿瘤的发生、发展及侵袭与转移。GPC3在HCC细胞中显著高表达，而在正常肝组织、肝脏良性疾病及胆管细胞癌中几乎不表达，是HCC最具特异性的肿瘤标志物(Genome Biol.2008；9(5):224.)。利用显像用放射性核素标记GPC3用于HCC靶向成像，对实现HCC患者早期诊断，精准患者筛选及靶向治疗监测具有重要作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于，提供一种GPC3特异性纳米抗体探针的制备方法及应用。本发明通过构建GPC3特异性纳米抗体及衍生物分子影像探针，以实现肝细胞肝癌患者的早期诊断、精准患者筛选、及对靶向治疗疗效的评估及预后判断。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种GPC3特异性纳米抗体，所述纳米抗体为RG2，具有与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同源性为70-100％的序列。
优选地，所述RG2具有与SEQ ID No.2所示的基因序列同源性为70-100％的序列。
优选地，所述RG2具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示的基因序列。
第二方面，本发明提供了一种根据前述的纳米抗体在制备GPC3特异性纳米抗体融合蛋白中的应用。
所述纳米抗体融合蛋白通过含有不同氨基酸长度的GGGGS连接子，桥接血清蛋白结合域(ABD)及纳米抗体(RG2)而组成，所述连接子“GGGGS”为1～10组，具体可为1组、2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组或10组。
优选地，所述连接子为3组，具有GGGGSGGGGSGGGGS所示的氨基酸序列。
第三方面，本发明提供了一种GPC3特异性纳米抗体融合蛋白，所述GPC3特异性纳米抗体融合蛋白为ABDRG2；
所述ABDRG2具有与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列同源性为70-100％的序列。
优选地，所述ABDRG2具有与SEQ ID NO.4所示的基因序列同源性为70-100％的序列。
优选地，所述ABDRG2具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，如SEQ ID No.4所示的基因序列。
本发明所述的GPC3特异性纳米抗体或GPC3特异性纳米抗体融合蛋白的制备方法为：将GPC3特异性纳米抗体或GPC3特异性纳米抗体融合蛋白的基因序列(如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示)克隆到表达载体上；再将所述基因序列转化到表达宿主的菌株里，将转化后的菌株扩大培养、诱导表达，纯化后即得到所述GPC3特异性纳米抗体或GPC3特异性纳米抗体融合蛋白。
第四方面，本发明提供了一种根据前述纳米抗体或纳米抗体融合蛋白在制备GPC3特异性分子影像探针中的应用。
第五方面，本发明提供了一种GPC3特异性分子影像探针，所述探针包括肿瘤靶向基团、螯合剂和放射性核素；
所述肿瘤靶向基团选自前述GPC3特异性纳米抗体或GPC3特异性纳米抗体融合蛋白。
优选地，所述螯合剂选自DOTA、NOTA、DFO、DBCO、DTPA、TETA、NOTP、EDTA中的一种或几种；
所述放射性核素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、I-124、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、Y-86、Mn-52、Sc-44、Y-90、Ac-225、At-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra-223、Ru-106、Na-24、Sr-89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177中的至少一种。
优选地，所述放射性核素选自F-18、Ga-68、Cu-64、Zr-89、Lu-177、Ac-225、At-211、I-131或Y-90中的至少一种。
优选地，所述探针为68Ga标记单价纳米抗体探针[68Ga]Ga-NOTA-RG2、68Ga标记纳米抗体融合蛋白探针[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2、18F标记单价纳米抗体探针[18F]F-RG2、89Zr标记纳米抗体融合蛋白探针[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2中的任一种。
本发明构建的GPC3特异性分子影像探针，即[68Ga]Ga-NOTA-RG2、[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2、[18F]F-RG2或[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2，具有亲和力强、稳定性高、特异性高、制备工艺简单、易于临床转化等优点。加以临床转化应用，有望实现肝细胞肝癌GPC3异质性表达的无创可视化。
优选地，所述探针包含肿瘤靶向基因、螯合剂和放射性核素68Ga、64Cu或89Zr时，其制备方法包括以下步骤：
将采用螯合剂对肿瘤靶向基因进行修饰，形成修饰后的纳米抗体；然后采用放射性核素68Ga、64Cu或89Zr对修饰后的纳米抗体进行标记，即得探针；
所述探针包含肿瘤靶向基因和放射性核素18F时，其制备方法包括以下步骤：
采用放射性核素18F标记小分子化合物前体,得18F标记前体；
制备DBCO随机偶连的纳米抗体；
将18F标记前体与DBCO随机偶连的纳米抗体进行点击化学反应，即得探针。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明构建的GPC3特异性纳米抗体探针，实现了对肝细胞肝癌GPC3表达的无创可视化，进一步实现了肝细胞肝癌的无创诊断，所述及探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为SDS-PAGE及蛋白印迹测定纳米抗体RG2及纳米抗体融合蛋白ABDRG2的表达情况；
图2为高效液相色谱测定的纳米抗体融合蛋白ABDRG2表达情况；
图3为流式细胞学检测Hep3B及Huh7细胞系的GPC3表达情况；
图4为Hep3B及Huh7细胞系的免疫组化染色的结果(HE染色和GPC3免疫组化)；
图5为纳米抗体RG2与重组人GPC3的亲和力测定结果；
图6为用放射性薄层色谱仪测定探针[68Ga]Ga-NOTA-RG2在0分钟和3小时的放射化学纯度结果；
图7为用放射性薄层色谱仪测定探针[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2在0分钟和3小时的放射化学纯度结果；
图8为用放射性薄层色谱仪测定探针[18F]F-RG2在0分钟的放射化学纯度结果；
图9为[68Ga]Ga-NOTA-RG2对Hep3B肿瘤模型的显像结果，其中图9A为PET/CT显像图，图9B为ROI图，图9C为体外生物分布数据图；
图10为[68Ga]Ga-NOTA-RG2对Huh7肿瘤模型的显像结果，其中图10A为PET/CT显像图，图10B为ROI图，图10C为体外生物分布数据图；
图11为[18F]F-RG2对Hep3B肿瘤模型的显像结果，其中图11A为PET/CT显像图，图11B为ROI图；
图12为[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2对Hep3B肿瘤模型的PET/CT多时间点显像结果；
图13为[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2对Hep3B肿瘤模型的多时间点的ROI图；
图14为[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2对Hep3B肿瘤模型的PET/CT多时间点显像结果；
图15为[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2对Hep3B肿瘤模型的多时间点的ROI图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样可改变。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
早在2014年，Sham等人便成功构建了由89Zr标记的抗GPC3单抗探针(89Zr-αGPC3)，其对原位HCC模型显示出较好的诊断效能(J Nucl Med.2014；55(5):799-804.)。然而，放射性核素标记单克隆抗体的应用受到生产过程复杂、成本高，需要匹配长半衰期放射性核素的限制，并且，一周内繁琐的成像过程以及相关的辐射暴露等问题，均严重的限制了其临床转化应用。
抗体小型化策略是近年来核医学分子影像探针开发的研究热点。分子量小、亲和力高和易于工程设计使纳米抗体成为构筑分子成像探针的的绝佳载体。近年来，本申请的发明人专注于纳米抗体衍生示踪剂的开发和临床转化应用，由此制备了本申请的基于纳米抗体RG2的GPC3特异性分子影像探针，其可用于免疫PET显像。但该探针体内半衰期短，肾脏富集高，使其仍存在进一步改进的空间。
进一步地，本申请再通过将同时靶向人/鼠白蛋白的白蛋白结合域(ABD)与纳米抗体RG2结合构建纳米抗体融合蛋白衍生物，采用其制备的GPC3特异性分子影像探针可以明显延长纳米抗体的体内半衰期，并大幅降低肾脏富集。
实施例1
本实施例提供了一种GPC3特异性纳米抗体RG2的制备方法，所述GPC3特异性纳米抗体RG2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、基因序列如SEQ ID NO.2所示。
纳米抗体RG2的具体制备步骤如下：
1)获得纳米抗体基因序列
a.使用GPC3蛋白免疫羊驼。用600μg蛋白免疫羊驼共6次，每次间隔14天。抽取免疫前后羊驼血液，离心取上清-20℃保存。
b.采用来自经免疫的羊驼的外周淋巴细胞提取总RNA，经反转录得到cDNA作为基因扩增的模板；使用两对引物通过PCR扩增获得羊驼重链抗体IgG2和重链抗体IgG3的
可变区基因；通过双酶切将可变区基因连接到载体上；
c.构建纳米抗体噬菌体展示文库。采用偶联链霉亲和素的磁珠和生物素化GPC3蛋白对
纳米抗体基因库进行亲和淘选；
d.通过夹心phage ELISA进行阳性克隆鉴定。
2)运用常规分子生物学方法，将SEQ ID NO.2所示的基因序列分别克隆到
pET-30a(+)表达载体上，得含目标抗体(RG2)的质粒DNA。
3)在大肠杆菌(E.coli)中表达上述目标抗体
3.1大肠杆菌转化：首先将BL21(DE3)感受态细胞从-80℃取出，置于冰上解冻；加100ng含目标抗体的质粒DNA至BL21(DE3)感受态细胞，轻柔混匀；将感受态细胞至于冰上孵育30分钟；静止状态下，在42℃热冲击处理感受态细胞90秒；至于感受态细胞冰上3分钟；加100μL常温LB培养基至感受态细胞；以200rpm、37℃的条件孵育60分钟；在含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂板上铺板；反转琼脂板，在37℃孵育过夜。
3.2小试表达：从琼脂板随机挑选分散较好的单克隆，接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基分别进行培养；在200rpm、37℃的条件下孵育；当OD600测量值达到0.6–0.8时，在培养管中加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其浓度达到0.5mM，然后在15℃、16小时或37℃、4小时的孵育条件(这两个孵育条件均可)进行孵育。
3.3SDS-PAGE及蛋白印迹测定纳米抗体RG2表达情况，具体步骤如下：
吸取450μl孵育后的培养液，离心收集细胞沉淀，加300μL裂解液(50mM Tris,150mM NaCl，5％glycerol，pH＝8.0)，用超声粉碎、裂解细胞1分钟，取100μL细胞裂解液作为全细胞溶解产物,加50μL 15×上样缓冲液，在100℃加热样品10分钟，加样检测。
如图1所示，条带1为还原条件下的表达情况，条带2为非还原条件下的表达情况。由结果可见：RG2抗体分子量约为15千道尔顿。
3.4纳米抗体RG2与重组人GPC3的亲和力测定。具体步骤如下：将重组人GPC3胞外域固定于Biacore芯片，将不同浓度单价纳米抗体RG2作为流动相上样，并进行洗脱。测试结果如图5所示，KD值为1.297nM，结合常数ka为5.376×1061/Ms，解离常数kd为6.97×10-31/s。
实施例2
本实施例提供了一种GPC3特异性纳米抗体融合蛋白ABDRG2的制备方法，该纳米抗体融合蛋白通过含有不同氨基酸长度的GGGGS连接子，桥接血清蛋白结合域(ABD)及纳米抗体(B3或B6)而组成，所述连接子“GGGGS”可为1组、2组、3组、4组、5组、6组、7组、8组、9组或10组。本实施例中制备的GPC3特异性纳米抗体融合蛋白ABDRG2采用的连接子为3组，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
1)运用常规分子生物学方法，将SEQ ID NO.4所示的碱基序列克隆到pET-30a(+)表达载体上，得含目标融合蛋白(ABDRG2)的质粒DNA。
2)在大肠杆菌(E.coli)中表达上述目标融合蛋白
步骤2)的具体操作方法与实施例1中的步骤3)方法相同。
采用SDS-PAGE及蛋白印迹测定纳米抗体融合蛋白ABDRG2表达情况，具体步骤与实施例1相同。如图1所示，条带3为还原条件下的表达情况，条带4为非还原条件下的表达情况。由结果可见：融合蛋白ABDRG2分子量约为20千道尔顿。
采用高效液相色谱(HPLC，Agilent)测定纳米抗体融合蛋白ABDRG2表达情况如图2所示。结果显示：ABDRG2产率为48.45mg/L，纯化率>95％。
实施例3
本实施例提供了一种GPC3特异性68Ga标记单价纳米抗体探针[68Ga]Ga-NOTA-RG2、GPC3特异性68Ga标记纳米抗体融合蛋白探针[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2的制备方法，具体步骤如下：
1)NOTA修饰RG2及ABDRG2制备中间体NOTA-RG2及NOTA-ABDRG2:取1mg RG2及ABDRG2溶于1mL磷酸盐缓冲液(PBS)中得纳米抗体溶液，使用0.1mL 0.1M碳酸钠(Na2CO3，PH＝11.4)缓冲液调节纳米抗体溶液pH至9.0–10，反应体系体积1.1mL。以p-SCN-Bn-NOTA/RG2或p-SCN-Bn-NOTA/ABDRG2摩尔比为10:1的比例，将新鲜溶于二甲基亚砜(DMSO)的p-SCN-Bn-NOTA(CAS Number：147597-66-8；Macrocyclics)加至上述纳米抗体溶液中。室温反应2小时，然后以PBS作为流动相，用预平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化经NOTA偶联的纳米抗体，收集NOTA-RG2或NOTA-ABDRG2；再用截断值为10KDa的超滤管(Merck Millipore)浓缩，使用NanoDrop测定浓度，分装并置于-20℃备用。
2)68Ga标记NOTA-RG2或NOTA-ABDRG2制备[68Ga]Ga-NOTA-RG2及[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2探针：用4mL 0.1M盐酸溶液(HCl)淋洗锗镓发生器(Eckert&Ziegler RadiopharmaInc)，收集同等体积活度约370–555MBq的68Ga淋洗液；取中间段活度最高68Ga淋洗液2mL，使用0.1mL 1M乙酸钠溶液(NaoAc)调节68Ga淋洗液的pH至4.0–4.5；取上述备用的NOTA-RG2或NOTA-ABDRG2 100–200μg(具体以加入200μg为例)加至68Ga淋洗液(反应体系体积<2.5mL)中；所得反应体系于室温下在恒温振荡器上反应5分钟；以PBS作为流动相，再次使用PBS预平衡的PD-10脱盐柱分离游离68Ga、纯化得终产物[68Ga]Ga-NOTA-RG2及[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2。
3)[68Ga]Ga-NOTA-RG2及[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2质量控制：吸取10μL[68Ga]Ga-NOTA-RG2及[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2在硅胶板上分别点样，用0.1M柠檬酸钠溶液(pH＝5)作为流动相，用放射性薄层色谱仪(Radio-TLC，Eckert&Ziegler Radiopharma Inc)测定探针的放射化学纯度(Radiochemical purity，RCP)。如图6和图7所示，新鲜制备的[68Ga]Ga-NOTA-RG2和[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2在0分钟及3小时RCP均大于99％。
实施例4
本实施例提供了一种GPC3特异性18F标记单价纳米抗体探针[18F]F-RG2的制备方法，参考发明人前期公布的方法(发明名称：一种18F标记纳米抗体探针及其制备方法和应用；申请号：CN202110771591.2；公开号：CN113476619A)制备，具体步骤如下：
1)DBCO修饰RG2制备中间体DBCO-RG2：将1mg RG2溶于磷酸盐缓冲液(PBS)，体积约1mL，加80–100μL、0.1M碳酸钠(Na2CO3)缓冲液将纳米抗体溶液pH调至9.0–10。以DBCO-NHSester(CAS#:1353016-71-3,MeloPEG)和RG2摩尔比为10:1的比例，将新鲜溶于二甲基亚砜(DMSO)的DBCO-NHS ester加至纳米抗体溶液中。将所得反应体系置于室温反应2小时，然后以PBS作为流动相，用预平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化经DBCO随机偶连的纳米抗体，收集DBCO-RG2；再用截断值为10KDa的超滤管(Merck Millipore)浓缩纳米抗体样本，最后用NanoDrop测定DBCO-RG2浓度，将DBCO-RG2置于4℃冰箱备用。
2)18F[F]-RJDJ01的制备：采用已公开专利文献CN113476619A中实施例2记载的方法进行制备得到。
3)经点击化学反应制备[18F]F-RG2：加20mL 18F[F]-RJDJ01至332μL(320μg)步骤1)制备的DBCO-RG2中得反应体系；将上述反应体系置于恒温振荡器，45℃反应45分钟；结束后以PBS作为流动相，再次用预平衡的PD-10脱盐柱分离未反应18F-RJDJ01，纯化收集终产物[18F]F-RG2。
4)[18F]F-RG2质量控制：采用与实施例3相同的方法进行。结果如图8所示，新鲜制备的[18F]F-RG2在0分钟的RCP大于75％。
实施例5
本实施例提供了一种GPC3特异性89Zr标记单价纳米抗体探针[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2的制备方法，具体步骤如下：
1)DFO偶联ABDRG2制备中间体DFO-ABDRG2：将3mg ABDRG2溶于1mL PBS溶液中得纳米抗体溶液，使用0.1mL 0.1M Na2CO3(PH＝11.4)缓冲液将纳米抗体溶液pH调至8.9-9.1，反应体系体积1.1mL。以摩尔比DFO/ABDC2＝5:1的比例，将新鲜溶于DMSO的DFO(CAS Number：147597-66-8；Macrocyclics)加至上述纳米抗体溶液。于室温下反应30分钟，然后以PBS作为流动相，用预平衡的PD-10脱盐柱纯化经DFO偶联的纳米抗体，收集DFO-ABDRG2；再用截断值为10KDa的超滤管浓缩，用NanoDrop测定DFO-ABDC2浓度，分装并置于-20℃备用。
2)89Zr标记DFO-ABDRG2制备[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2：制备450μL，100MBq 89Zr草酸溶液，使用1M Na2CO3缓冲溶液调节PH＝7。然后分别加入500μL 0.5M HEPES溶液(pH 7.1–7.3)和200μL DFO-ABDRG2(360μg)至反应溶液中。将反应体系置于恒温振荡器在室温反应1小时。标记反应结束后以PBS作为流动相，再次使用预平衡的PD-10脱盐柱分离游离89Zr、纯化得终产物[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2。
验证实施例
1)构建GPC3表达阳性荷瘤小鼠模型
以抗人GPC3单克隆抗体(Abcam,Cambridge,UK,Cat.No.Ab95363)作为一抗，通过流式细胞学实验发现Hep3B及Huh7细胞系为GPC3阳性表达细胞系，如图3所示；通过免疫组化染色实验发现Hep3B为细胞膜GPC3明显高表达，而Huh7为胞质及胞膜GPC3弥漫轻度表达，如图4所示。将Hep3B及Huh7细胞分别悬浮于PBS和基质胶(Corning)，二者比例为1:1，各注射于4–5周龄Balb/c裸鼠右侧肩部建立皮下型肝细胞肝癌模型小鼠(Hep3B肿瘤模型和Huh7肿瘤模型)。
2)[68Ga]Ga-NOTA-RG2在皮下型肝细胞肝癌模型小鼠中的显像
本实验所涉及的小动物PET/CT显像采集均使用IRIS小动物PET/CT扫描仪(Inviscan Imaging Systems)完成。每只皮下型肝细胞肝癌模型小鼠经尾静脉注射3.7-7.4MBq实施例3制备的[68Ga]Ga-NOTA-RG2，45分钟后采集图像,结果如图9和图10所示。GPC3特异性纳米抗体探针[68Ga]Ga-NOTA-RG2在Hep3B(图9A)及Huh7(图10A)肿瘤组织有较高的摄取，在主要排泄(肾脏)器官有较高的非特异性摄取。通过勾画ROI分析[68Ga]Ga-NOTA-RG2在体内的分布情况(图9B和图10B)，此外，体外生物分布实验结果进一步揭示了探针在体内主要组织和器官的分布情况(图9C和图10C)。通过分析两种肿瘤模型显像的ROI数据及生物分布数据，可以看出，Hep3B移植瘤探针摄取较Huh7肿瘤更高，这与两种细胞GPC3表达模式相一致，表明该探针具有在体可视化GPC3异质性表达的能力。
3)[18F]F-RG2免疫PET显像诊断肝细胞肝癌的实验
每只Hep3B皮下移植瘤小鼠经尾静脉注射0.37MBq[18F]F-RG2(n＝2)。1小时后采集图像，结果如图11所示，[18F]F-RG2在皮下移植肿瘤组织有较高的摄取(图11A)，与[68Ga]Ga-NOTA-RG2主要经由肾脏排泄不同，18F标记RG2主要经由肝脏代谢。通过勾画ROI分析[18F]F-RG2在体内的分布情况(图11B)。
4)[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2免疫PET显像诊断肝细胞肝癌的实验
Hep3B移植瘤小鼠经尾静脉注射GPC3特异性纳米抗体融合蛋白探针
[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2(n＝3)。在注射后的45分钟用混有氧气的异氟烷(浓度为2％)麻醉荷瘤裸鼠，并将进入深度麻醉状态的裸鼠以仰卧位姿势置于小动物PET/CT扫描床上，续惯采集PET和CT图像，用IRIS系统自带软件完成图像重建，结果如图12及图13所示，肿瘤部位的探针摄取在6小时内随时间延长逐渐增加，而心脏等部位的摄取逐渐减低。通过进一步比较[68Ga]Ga-NOTA-RG2和[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2两种探针在肝细胞肝癌模型PET/CT显像中的ROI及体外生物分布数据，表明融合蛋白探针可以在降低纳米抗体肾脏富集的同时延长其血液循环时间。
5)[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2免疫PET显像诊断肝细胞肝癌的实验
Hep3B移植瘤小鼠经尾静脉注射GPC3特异性纳米抗体融合蛋白探针[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2。分别于注射探针0.5、6、12、24、48、72、96、120、144小时后采集PET/CT图像。实验结果如图14和图15所示。在探针在肿瘤部位的摄取随时间逐渐增加(图14)，在48小时达到峰值，然后逐渐下降。通过ROI分析绘制主要组织器官摄取值随时间变化曲线(图15)。该结果进一步证实了GPC3特异性纳米抗体融合蛋白ABDRG2在肿瘤部位的富集能力。
在本专利技术的一些具体实施方案中，还可通过DOTA、NOTA、NODAGA、DTPA、DFO或其他文献报道的双功能螯合剂修饰所述纳米抗体RG2或纳米抗体融合蛋白ABDRG2；并通过Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、I-124、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、Y-86、Mn-52、Sc-44、Y-90、Ac-225、At-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra-223、Ru-106、Na-24、Sr-89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177中的至少一种标记所述纳米抗体RG2或纳米抗体融合蛋白RG2，制备免疫PET显像、放射免疫治疗或诊疗一体化探针。
需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种GPC3特异性纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为RG2，具有与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列同源性为70-100％的序列。
2.根据权利要求1所述的GPC3特异性纳米抗体，其特征在于，所述RG2具有与SEQ IDNo.2所示的基因序列同源性为70-100％的序列。
3.一种根据权利要求1或2所述的纳米抗体在制备GPC3特异性纳米抗体融合蛋白中的应用。
4.一种GPC3特异性纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述GPC3特异性纳米抗体融合蛋白为ABDRG2；
所述ABDRG2具有与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列同源性为70-100％的序列。
5.根据权利要求4所述的GPC3特异性纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述ABDRG2具有与SEQ ID NO.4所示的基因序列同源性为70-100％的序列。
6.一种根据权利要求1-2任一项所述的纳米抗体或根据权利要求4-5任一项所述的纳米抗体融合蛋白在制备GPC3特异性分子影像探针中的应用。
7.一种GPC3特异性纳米抗体探针，其特征在于，所述探针包括肿瘤靶向基团、螯合剂和放射性核素；
所述肿瘤靶向基团选自权利要求1-2任一项所述的GPC3特异性纳米抗体或权利要求4-5任一项所述的GPC3特异性纳米抗体融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的GPC3特异性纳米抗体探针，其特征在于，
所述螯合剂选自DOTA、NOTA、DFO、DBCO、DTPA、TETA、NOTP、EDTA中的一种或几种；
所述放射性核素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、I-124、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、Y-86、Mn-52、Sc-44、Y-90、Ac-225、At-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra-223、Ru-106、Na-24、Sr-89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的GPC3特异性纳米抗体探针，其特征在于，所述探针为68Ga标记单价纳米抗体探针[68Ga]Ga-NOTA-RG2、68Ga标记纳米抗体融合蛋白探针[68Ga]Ga-NOTA-ABDRG2、18F标记单价纳米抗体探针[18F]F-RG2、89Zr标记纳米抗体融合蛋白探针[89Zr]Zr-DFO-ABDRG2中的任一种。
10.根据权利要求8或9所述的GPC3特异性纳米抗体探针，其特征在于，所述探针包含肿瘤靶向基因、螯合剂和放射性核素68Ga、64Cu或89Zr时，其制备方法包括以下步骤：
将采用螯合剂对肿瘤靶向基因进行修饰，形成修饰后的纳米抗体；然后采用放射性核素68Ga、64Cu或89Zr对修饰后的纳米抗体进行标记，即得探针；
所述探针包含肿瘤靶向基因和放射性核素18F时，其制备方法包括以下步骤：
采用放射性核素18F标记小分子化合物前体,得18F标记前体；
制备DBCO随机偶连的纳米抗体；
将18F标记前体与DBCO随机偶连的纳米抗体进行点击化学反应，即得探针。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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