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CN116510001B - 一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN116510001B CN202310757360.5A CN202310757360A CN116510001B CN 116510001 B CN116510001 B CN 116510001B CN 202310757360 A CN202310757360 A CN 202310757360A CN 116510001 B CN116510001 B CN 116510001B
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法，所述mRNA疫苗包括mRNA链，以及包裹所述mRNA链的纳米脂质体；所述mRNA链的组成为：5’帽子结构、5’UTR序列、MCP编码基因序列、3’UTR序列和poly（A）核酸序列。所述MCP编码基因序列为LARGEMOUTH BASS VIRUS ISOLATE LMBV‑FS001型毒株的主要衣壳蛋白编码基因序列，其开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述mRNA疫苗能够实现同时诱导细胞免疫和体液免疫，迅速高效地应对病毒变异，研发和生产周期短，为防控LMBV提供了良好的技术途径。

Description

一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法。
背景技术
大口黑鲈虹彩病毒，又称大口黑鲈病毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV），分类地位为虹彩病毒科（Iridoviridae）蛙病毒属（Ranacirus），是养殖大口黑鲈和野生大口黑鲈致死性疾病大口黑鲈溃疡性综合征（Largemouth bassμLcerative syndrome virus，LBUSV）的病原。LMBV通过水平和垂直传播，主要感染幼年和老龄大口黑鲈，在大口黑鲈鱼群中广泛流行。该病毒也能在裂唇鱼、孔雀鱼、石斑鱼、美国红鱼、军曹鱼、真鲷、太阳鱼等中传播。鱼类感染LMBV常见体征包括：肝脏和脾脏肿大，肾脏肿大，个别病鱼鳃挂脏、发白。大口黑鲈LMBV感染率几乎高达100%，病鱼死亡率可高达60%，给大口黑鲈养殖造成严重的经济损失。
目前鱼类疫苗以传统疫苗和DNA疫苗为主，鉴于病毒独特的感染机制，常规疫苗和重组疫苗免疫保护并未达到预期的效果。mRNA疫苗是一种鱼类生产养殖中的免疫保护制剂，具有生化性能稳定、用量少、安全性能好、免疫效果明显以及抗突变能力强等优点。但mRNA疫苗在国内外大都还处于研究阶段，尚未得到大范围的推广应用，目前用于LMBV防控的有效mRNA疫苗未见上市。LMBV感染大口黑鲈潜伏期长，发病迅速，治疗困难，易造成重大的经济损失。因此，研发一种对LMBV防控安全有效的mRNA疫苗具有重要意义。
发明内容
为有效防控大口黑鲈虹彩病毒，提高大口黑鲈对大口黑鲈虹彩病毒的免疫保护效果，降低或避免大口黑鲈虹彩病毒造成的经济损失，本发明提供一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法，用于防控大口黑鲈病毒。经试验获知，本发明提供的mRNA疫苗能够引起鱼体产生更强、更持久的体液和细胞免疫反应，增强鱼体抗大口黑鲈虹彩病毒的感染能力、降低感染病毒后的死亡率，以此达到更好的免疫保护效果。
具体地，所述mRNA疫苗包括mRNA链以及包裹所述mRNA链的纳米脂质体；所述mRNA链的组成为5’帽子结构、5’UTR序列、MCP编码基因序列、3’UTR序列和poly（A）核酸序列。其中，所述MCP编码基因序列为LARGEMOUTH BASS VIRUS ISOLATE LMBV-FS001型毒株的主要衣壳蛋白编码基因序列，其开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明所述mRNA疫苗的优选实施方式之一，所述5’UTR序列为大口黑鲈免疫球蛋白超家族9（igsf9b）的非翻译区，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为本发明所述mRNA疫苗的优选实施方式之一，所述3’UTR序列为大口黑鲈免疫球蛋白超家族9（igsf9b）的非翻译区，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述mRNA链在转录时进行核苷酸修饰，即将所述mRNA链中的尿嘧啶在转录时替换为N1-甲基-假尿苷。转录起始密码子为AUG。转录终止密码子为TAA、TAG、TGA的自由组合，个数为2~8个。
作为本发明所述mRNA疫苗的优选实施方式之一，5’帽子结构的组成为一个7-甲基鸟苷通过一个5’–5’三磷酸酯桥连接到mRNA链的5’核苷上。
作为本发明所述mRNA疫苗的优选实施方式之一，所述poly（A）核酸序列中的碱基A的个数为100~250个，连接在所述3’UTR的核苷酸序列上。
本发明进一步给出了纳米脂质体（颗粒）的制备方法，其是以DOTMA、Span-80、TPGS为原料，利用涡旋振荡的方法制备，并包裹于所述mRNA链。具体地，DOTMA、Span-80、TPGS使用之前分别溶于分析纯级无水乙醇溶液中，按物质的量计，所述DOTMA、Span-80和TPGS的配比为50:49:1。以某一具体的实施例，将24.37 μL DOTMA（50 mg/mL）、14.10 μL Span-80（50mg/mL）、0.44 μL TPGS（50 mg/mL）的混合物快速注入至961.09 μL醋酸钙缓冲液（18.75mM，pH=6.8）中，并涡旋40 s，得到水相-油相-水相的复乳液，将复乳液中的醋酸钙透析去除，浓缩，即得到纳米脂质体（颗粒）。
采用所述纳米脂质体（颗粒）包裹mRNA链的操作方法为：将1 μL mRNA核酸溶液（20μg/μL）与24.37 μL DOTMA（50 mg/mL）、14.10 μL Span-80（50 mg/mL）、0.44 μL TPGS（50mg/mL）混合，快速注入至960.09 μL醋酸钙缓冲液（18.75 mM，pH=6.8）中，并涡旋40 s，得到水相-油相-水相的复乳液，将复乳液中的醋酸钙透析去除，浓缩，即得到纳米脂质体（颗粒）包裹的mRNA疫苗。经纳米脂质体（颗粒）包裹的mRNA疫苗，有利于疫苗被鱼体免疫细胞摄取和识别，避免引起鱼体过激的免疫反应。
本发明还提供了所述mRNA疫苗的制备方法。方法涉及的步骤至少包括：
构建含有T7启动子、5’UTR序列、MCP编码基因序列、3’UTR序列的质粒，并转化至工程菌中；
利用T7转录酶将尿嘧啶替换为N1-甲基-假尿苷，并进行目的基因的体外转录；
利用加帽酶将5’帽子结构7-甲基鸟苷帽连接至mRNA链的5’核苷上；
利用Poly（A）聚合酶催化ATP，将AMP连接至mRNA链的3’核苷上；
纳米脂质体包裹mRNA链。
作为本发明所述mRNA疫苗制备方法的优选实施方式之一，将5’UTR序列、MCP编码基因序列、3’UTR序列构建于pCDNA3.1（+）载体上，分别在5’端、3’端添加EcoRⅠ和Hind Ⅲ，并转染至DH5α菌株中得到重组菌，提取重组菌的质粒得到重组质粒。在体外利用Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切，胶回收得到目的基因片段。利用T7转录酶，全部替换尿嘧啶为N1-甲基-假尿苷，进行目的基因的体外转录，酚/氯仿法纯化。并将5’帽子结构7-甲基鸟苷帽利用重组牛痘病毒加帽酶将其连接至mRNA链的5’核苷上，酚/氯仿法纯化。再利用Poly（A）聚合酶催化ATP，将AMP连接至mRNA链的3’核苷上。酚/氯仿法纯化得到mRNA疫苗。
作为本发明所述mRNA疫苗制备方法的优选实施方式之一，5’非翻译区酶切位点的添加应当以切割后的小片段端点为5'端突出的黏状末端或为5’平末端，保证体外转录时核酸序列准确。
作为本发明所述mRNA疫苗制备方法的优选实施方式之一，在制备所述mRNA疫苗的每个步骤间应当进行酚/氯仿纯化，并测定mRNA浓度，保证目的mRNA的纯度以及浓度。
还有，本发明提供了所述mRNA疫苗在水产养殖中的应用，具体用于防治大口黑鲈虹彩病毒。经验证，向鱼体中注射所述mRNA疫苗，大口黑鲈在免疫后产生了高水平抗体。至于所述mRNA疫苗的剂型，本发明不做特定的限定，本领域技术人员结合现有技术，可以将所述mRNA疫苗制备成适合水产养殖的制剂类型。
还有，基于本发明公开的所述mRNA疫苗以及所述mRNA疫苗中的mRNA链，本发明还请求保护所述mRNA疫苗或所述mRNA疫苗转录后的蛋白，在制备抗大口黑鲈虹彩病毒药物中的应用。
与现有技术相比，本发明“一种水产养殖用mRNA疫苗及其制备方法”具有以下有益效果或技术优点：
本发明提供了一种抗大口黑鲈虹彩病毒的mRNA疫苗，其选取的特定5’UTR序列、3’UTR序列、MCP编码基因序列、poly（A）核酸序列以及5’帽子结构，经转录过程中的核苷酸修饰所构建得到。这一对LMBV具有特异性的mRNA疫苗，在免疫大口黑鲈后产生了高水平抗体，该抗体具有较高的中和效价和滴度。
本发明所述mRNA疫苗可同时诱导体液免疫与细胞免疫，无需细胞生产，不存在毒物导入的风险，能够迅速高效地应对病毒变异。与传统疫苗相比，本发明所述mRNA疫苗研发与生产周期较短，为防控LMBV爆发提供了一种有效方法。
本发明所述mRNA疫苗成本适中，生产效率高，制造环境几乎不受微生物影响，并且不存在整合基因的风险，降解快速，安全性相对较高。选用纳米脂质体（颗粒）作为mRNA链的运送载体，核酸包埋率可达99%以上，能够有效抑制mRNA链降解，延长疫苗保存时间并降低疫苗保存成本。同时，纳米脂质体（颗粒）的细胞相容性好，使得转染效率较高且利于转染细胞后mRNA高效表达，组织透过性高、易被免疫器官富集，细胞毒性和免疫原性较低。
附图说明
图1为含有5’UTR序列，3’UTR序列和MCP编码基因序列的pCDNA3.1（+）质粒图谱。其中，LMBV-UTR-MCP为LARGEMOUTH BASS VIRUS ISOLATE LMBV-FS001型毒株MCP编码基因序列；promoter为启动子序列（包括SV40 promoter、lac promoter、AmpR promoter、CMVpromoter和T7 promoter）；EcoRⅠ和NheⅠ为显著性酶切位点酶；质粒带有氨苄西林抗性基因；ori为质粒复制起点；CAP binding site 为CAP结合位点；lac operator为乳糖操纵基因。
图2为双酶切琼脂糖凝胶电泳图，图2中1为质粒双酶切的目的基因。
图3为体外转录修饰后的mRNA凝胶电泳图，图3中1为修饰Ploy（A）尾的mRNA，2为未修饰Ploy（A）尾的mRNA。
图4为MCP蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图，图4中1为MCP蛋白，M为蛋白Marker。
图5为包裹纳米脂质体的mRNA疫苗的包载率和粒径分布。图5中a为纳米脂质体包裹mRNA链的包载率图，图5中b为mRNA疫苗的粒径分布图。
图6为BBC细胞中转染LMU-A、LM-B、LMU和LM后的细胞存活率。
图7为BBC细胞中转染LMU-A、LM-B、LMU和LM后检测IFN-Ⅰ的RT-PCR图。
图8为BBC细胞中转染LMU-A、LM-B、LMU和LM后检测CD4的RT-PCR图。
图9为BBC细胞转染LMU-A、LM-B、LMU和LM后，进行攻毒的MBV病毒滴度变化图。
图10为大口黑鲈对mRNA疫苗的酶联免疫吸附结果。
图11为石斑鱼对mRNA疫苗的酶联免疫吸附结果。
图12为裂唇鱼对mRNA疫苗的酶联免疫吸附结果。
图13为美国红鱼对mRNA疫苗的酶联免疫吸附结果。
图14为太阳鱼对mRNA疫苗的酶联免疫吸附结果。
图15为真鲷对mRNA疫苗的酶联免疫吸附结果。
图16为用LMBV攻毒大口黑鲈，mRNA疫苗对大口黑鲈的相对保护率。
图17为用LMBV攻毒石斑鱼，mRNA疫苗对石斑鱼的相对保护率。
图18为用LMBV攻毒裂唇鱼，mRNA疫苗对裂唇鱼的相对保护率。
图19为用LMBV攻毒美国红鱼，mRNA疫苗对美国红鱼的相对保护率。
图20为用LMBV攻毒太阳鱼，mRNA疫苗对太阳鱼的相对保护率。
图21为用LMBV攻毒真鲷，mRNA疫苗对真鲷的相对保护率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行说明，但本发明并不限于下述的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
本实施例提供了一种用于大口黑鲈虹彩病毒的mRNA疫苗的制备过程，具体包括以下步骤。
构建重组菌：将含有5’UTR序列，3’UTR序列和MCP编码基因序列构建于pCDNA3.1（+）载体上，克隆pCDNA3.1（+）的EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，并转化载体至大肠杆菌DH5α，获得LMBV-MCP-pCDNA3.1(+)-DH5α，见图1。
本实施例所述MCP编码蛋白基因选用LARGEMOUTH BASS VIRUS ISOLATE LMBV-FS001型毒株MCP蛋白的编码基因。在其他优选的实施例中，为达到相同的技术目的，所述MCP编码蛋白基因也可以是所选MCP蛋白基因中的一段氨基酸基因序列，或具有50-100%同源性的氨基酸序列，如Largemouth bass virus strain Pine 14-204、Largemouth bassvirus strain Alleghany 12-343等。
本实施例所述5’UTR序列、3’UTR序列均为大口黑鲈免疫球蛋白超家族9（igsf9b）的非翻译区。在其他优选的实施例中，所述的非翻译区也可选自大口黑鲈免疫球蛋白家族中的其他蛋白，如igdcc4、igsf10等所拥有的非翻译区。
质粒的提取：将获得的重组菌进行摇菌，按照常规方法提取质粒。作为一种优选的实施方式，可以参照艾科瑞公司SteadyPure质粒DNA提取试剂盒说明书进行操作。对此，本实施例不作重复赘述。
酶切线性化与纯化：对重组质粒进行Quick Cut EcoRⅠ酶切，酶切反应体系如表1所示。将表1成分加入200 μL的EP管中，混匀，37℃酶切45 min。将双酶切完的混合物利用核酸凝胶电泳进行电泳分离，电泳结果如图2所示。
表1，Quick Cut EcoRⅠ酶切反应体系
纯化回收线性化重组质粒：采用TIANGEN公司的Universal DNA PurificationKit试剂盒从琼脂糖凝胶中回收线性化质粒。具体操作参见试剂盒说明书，本实施例不作重复赘述。
体外转录、修饰和纯化：采用体外转录试剂盒（T7 High Yield mRNA SynthesisKit 10623ES50 50 T）对线性化的质粒进行体外转录，并在添加试剂时将UTP替换为相同浓度的N1-甲基-假尿苷，进行转录时的核苷酸修饰。
本实施例采用酚/氯仿对转录的产物进行纯化，纯化后的mRNA进行1%琼脂凝胶电泳鉴定，结果见图3。如图3所示，mRNA体外转录成功。含有非翻译区的记录为LMBV-MCP-UTR（LMU），不含非翻译区的记录为LMBV-MCP（LM）。
本实施例采用牛痘病毒加帽酶Vaccinia Capping Enzyme对转录成功的mRNA进行体外修饰。
本实施例采用Poly（A）聚合酶E.coli Poly(A) Polymerase对加帽修饰成功的mRNA进行体外修饰。含有UTR、加帽、加Ploy（A）尾的记录为LMBV-MCP-UTR-修饰（LMU-A）；不含UTR、加帽、加Ploy（A）尾的记录为LMBV-MCP-修饰（LM-B）。
包裹纳米脂质体的mRNA疫苗的制备：将-20℃冰箱保存的DOTMA、Span-80、和TPGS取出，平衡到室温后在干燥环境下开封，均以50 mg/mL的浓度溶于分析纯级无水乙醇溶液中；配置18.75 mM醋酸钙缓冲液，pH值6.8；将-80℃冰箱保存的mRNA（LMU，LM，LMU-A和LM-B）溶液在冰上融化，使用无核酸酶水（RNA free Water）调整其浓度为20 μg/μL，在200 μL无RNA酶离心管中，依次加入24.37 μL DOTMA（1218.5 μg）、14.10 μL Span-80（705 μg）、0.44μL TPGS（22 μg）和1 μL mRNA（20 μg）；将离心管内液体充分混合，并将其快速注入到960.09 μL的醋酸钙缓冲液（18.75 mM，pH值6.8）中涡旋振荡40 s。包裹纳米脂质体的mRNA链的LMU、LM、LMU-A和LM-B分别记录为L-LMU、L-LM、L-LMU-A和L-LM-B。将制备好的mRNA核酸疫苗保存于4℃冰箱中待用，长期保存于-80℃。
mRNA疫苗的纳米脂质体包载率以及粒径分布如图5所示。图5中a为纳米脂质体包裹mRNA链的包载率图，图5中b为mRNA疫苗的粒径分布图。
实施例2
本实施例提供了一种用于大口黑鲈虹彩病毒的mRNA疫苗的细胞毒性检测。
采用标准的MTT法对mRNA疫苗进行细胞毒性检测：将大口黑鲈脑细胞（BBC）以4×104的密度分别接种于96孔板中，分别和不同浓度（1、5、10、20和40 μg/mL）的L-LMU、L-LM、L-LMU-A和L-LM-B于37°C下共孵育24 h，接着以1200 rpm离心3 min，弃上清，加入MTT溶液后，再离心，弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO），再利用酶标仪进行测定，测定结果如图6所示，LMU-A、LM-B、LMU和LM分别代表了转染BBC细胞后细胞存活率，表明疫苗不具有细胞毒性，能保证细胞的正常生存。
实施例3
本实施例提供了一种用于大口黑鲈虹彩病毒的mRNA疫苗在大口黑鲈脑细胞（BBC）中的表达分析。
将包裹纳米脂质体的mRNA疫苗0.2 μg用lip 6000转染试剂（mRNA:转染试剂=1:3）转染至大口黑鲈脑细胞，在转染24 h后，通过qRT-PCR分别检测IFN-Ⅰ和CD4的表达量。检测引物的序列如表2所示，检测结果分别如图7、图8所示。结果表明L-LMU-A、L-LMU、L-LM-B、L-LM与LNP相比分别提高了9.1、4.3、2.5、1.2倍，其中L-LMU-A、L-LMU、L-LM-B显著提升IFN-Ⅰ和CD4的表达水平。
表2，所用引物信息表
实施例4
细胞攻毒：将大口黑鲈脑细胞以4×104的密度分别接种于96孔板中，于12 h分别转染20 μg/mL的L-LMU、L-LM、L-LMU-A、L-LM-B、LNP和醋酸钙，于37°C下转染24 h，20μLLMBV（1×104TCID50）病毒感染大口黑鲈脑细胞，感染2天后，收集样品，用大口黑鲈脑细胞检测每个样品的病毒滴度。结果如图9所示。转染L-LMU-A的大口黑鲈脑细胞能显著抑制LMBV病毒的扩增，相较于L-LMU、L-LM、L-LM-B、LNP和醋酸钙，分别下降了3.8倍、9倍、6.9倍、9.3倍和9.2倍。
实施例5
本实施例采用所述mRNA疫苗免疫多种鱼类，并对其特异性抗体进行测定。
将同批次的大口黑鲈（3±0.1克）随机分为6组：L-LMU-A组、L-LMU组、L-LM-B组、LNP组、LM组及醋酸钙缓冲液组。每组1500尾，每组3个重复。
采用背鳍肌肉注射的方式免疫，各组每次免疫剂量相同，mRNA疫苗均为0.6 μg，体积30 μL，空白注射组注射等体积的醋酸钙缓冲液（pH值6.8，18.75 mM）以及相同浓度的纳米脂质体。分别在免疫第0、7、14、21天时进行断脊采血，收集血清，每组取样300只大口黑鲈，用间接ELISA法测定抗体水平，检测所用抗原来源于BL21菌株所表达的大口黑鲈MCP，蛋白表达结果如图4所示，其中Marker为蛋白质电泳分子量标准，1为所表达的目的蛋白大口黑鲈MCP蛋白。测定结果见图10。如图10所示，OD450测定结果显示L-LMU-A组、L-LM-A组、L-LMU组、LM组、LMU组、Lime Acetate的抗体水平。其中L-LMU-A组抗体水平最高，其他组抗体水平无显著差异。可以看出本发明mRNA疫苗可以快速刺激鱼体产生抗大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白的特异性抗体，在免疫后第一周达到峰值，并持续3周仍有一定的抗体效价，抗体效果能够持续4周。
采用所述mRNA疫苗免疫石斑鱼，并对其特异性抗体进行测定。石斑鱼规格为6±0.1 g，体长6-7 cm。随机分为6组，注射剂量为1.2 μg/尾，采用背部肌肉注射。每组1500尾，每组5个重复。其余操作同上。测定结果见图11。如图11所示，OD450测定结果显示L-LMU-A组、L-LM-A组、L-LMU组、LM组、LMU组、Lime Acetate的抗体水平。其中L-LMU-A组抗体水平最高，其他组抗体水平无显著差异。可以看出本发明mRNA疫苗可以快速刺激鱼体产生抗大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白的特异性抗体，在免疫后第一周开始产生抗体，并在第三周达到最高，抗体效果能够持续4周。
采用所述mRNA疫苗免疫裂唇鱼，并对其特异性抗体进行测定。裂唇鱼规格为1±0.1 g，体长4-5 cm。随机分为6组，注射剂量为0.2 μg/尾，采用背部肌肉注射。每组1500尾，每组5个重复。其余操作同上。测定结果见图12。如图12所示，OD450测定结果显示L-LMU-A组、L-LM-A组、L-LMU组、LM组、LMU组、Lime Acetate的抗体水平。其中L-LMU-A组抗体水平最高，其他组抗体水平无显著差异。可以看出本发明mRNA疫苗可以快速刺激鱼体产生抗大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白的特异性抗体，在免疫后第一周开始产生抗体，并在第二周达到最高，抗体效果能够持续4周。
采用所述mRNA疫苗免疫美国红鱼，并对其特异性抗体进行测定。美国红鱼规格为3±0.1 g，体长6-7 cm。随机分为6组，注射剂量为0.6 μg/尾，采用背部肌肉注射。每组1500尾，每组5个重复。其余操作同上。测定结果见图13。如图13所示，OD450测定结果显示L-LMU-A组、L-LM-A组、L-LMU组、LM组、LMU组、Lime Acetate的抗体水平。其中L-LMU-A组抗体水平最高，其他组抗体水平差异不显著。可以看出本发明mRNA疫苗可以快速刺激鱼体产生抗大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白的特异性抗体，在免疫后第一周开始产生抗体，并在第二周达到最高，抗体效果能够持续4周。
采用所述mRNA疫苗免疫太阳鱼，并对其特异性抗体进行测定。太阳鱼规格为13±0.5 g，体长12-15 cm。随机分为6组，注射剂量为2.6 μg/尾，采用背部肌肉注射。每组1500尾，每组5个重复。其余操作同上。测定结果见图14。如图14所示，OD450测定结果显示L-LMU-A组、L-LM-A组、L-LMU组、LM组、LMU组、Lime Acetate的抗体水平。其中L-LMU-A组抗体水平最高，其他组抗体水平无显著差异。可以看出本发明mRNA疫苗可以快速刺激鱼体产生抗大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白的特异性抗体，在免疫后第一周开始产生抗体，并在第二周达到最高，抗体效果能够持续4周。
采用所述mRNA疫苗免疫真鲷，并对其特异性抗体进行测定。真鲷规格为6±0.1 g，体长6-7 cm。随机分为6组，注射剂量为1.2 μg/尾，采用背部肌肉注射。每组1500尾，每组5个重复。其余操作同上。测定结果见图15。如图15所示，OD450测定结果显示L-LMU-A组、L-LM-A组、L-LMU组、LM组、LMU组、Lime Acetate的抗体水平。其中L-LMU-A组抗体水平最高，其他组抗体水平无显著差异。可以看出本发明mRNA疫苗可以快速刺激鱼体产生抗大口黑鲈虹彩病毒衣壳蛋白的特异性抗体，在免疫后第一周开始产生抗体，并在第二周达到最高，抗体效果能够持续4周。
实施例6
在实施例5的基础上，进行多种鱼类的个体攻毒实验。
大口黑鲈分为L-LMU-A组、L-LMU组、L-LM-B组、LNP组、LM组及醋酸钙缓冲液组，每组300尾，组内设置3个重复。免疫14天后对大口黑鲈进行攻毒，攻毒用LMBV的浓度为1×103TICD50，攻毒剂量为30 μL/尾。每日记录大口黑鲈死亡情况，连续记录14天。计算攻毒后疫苗相对保护率，结果如图16所示。结果表明，L-LMU-A组相对保护率达到99%，L-LMU和L-LM-B组的免疫保护率分别为70%和69%，都远高于L-LM组、LNP组和Lime Acetate组的9%、0、0的相对保护率。L-LMU-A组效果最好，几乎没有出现死亡。说明对mRNA的修饰以及非翻译区的选择都有利于疫苗在鱼体内发挥免疫作用。
石斑鱼分为L-LMU-A组、L-LMU组、L-LM-B组、LNP组、LM组及醋酸钙缓冲液组，每组300尾，组内设置3个重复。免疫14天后对石斑鱼进行攻毒，攻毒用LMBV的浓度为1×103TICD50，攻毒剂量为30 μL/尾。每日记录石斑鱼死亡情况，连续记录14天。计算攻毒后疫苗相对保护率，结果如图17所示。结果表明，L-LMU-A组相对保护率达到65%，L-LMU和L-LM-B组的免疫保护率分别为43%和27%，都远高于、L-LM组、LNP组和Lime Acetate组的5%、0和0的相对保护率。L-LMU-A组效果最好，保证了大部分石斑鱼能够存活。说明对mRNA的修饰以及非翻译区的选择都有利于疫苗在鱼体内发挥免疫作用。
裂唇鱼分为L-LMU-A组、L-LMU组、L-LM-B组、LNP组、LM组及醋酸钙缓冲液组，每组300尾，组内设置3个重复。免疫14天后对裂唇鱼进行攻毒，攻毒用LMBV的浓度为1×103TICD50，攻毒剂量为30 μL/尾。每日记录裂唇鱼死亡情况，连续记录14天。计算攻毒后疫苗相对保护率，结果如图18所示。结果表明，L-LMU-A组相对保护率达到78%，L-LMU和L-LM-B组的免疫保护率分别为60%和50%，都远高于L-LM组、LNP组和Lime Acetate组的6%、0、0的相对保护率。L-LMU-A组效果最好，出现了部分实验鱼的死亡。说明对mRNA的修饰以及非翻译区的选择都有利于疫苗在鱼体内发挥免疫作用。
美国红鱼分为L-LMU-A组、L-LMU组、L-LM-B组、LNP组、LM组及醋酸钙缓冲液组，每组300尾，组内设置3个重复。免疫14天后对美国红鱼进行攻毒，攻毒用LMBV的浓度为1×103TICD50，攻毒剂量为30 μL/尾。每日记录美国红鱼死亡情况，连续记录14天。计算攻毒后疫苗相对保护率，结果如图19所示。结果表明，L-LMU-A组相对保护率达到77%，L-LMU和L-LM-B组的免疫保护率分别为52%和50%，都远高于L-LM组、LNP组和Lime Acetate组的6%、0、0的相对保护率。L-LMU-A组效果最好，仅出现了部分死亡，而L-LMU和L-LM-B组均具有超过一半的保护率。说明对mRNA的修饰以及非翻译区的选择都有利于疫苗在鱼体内发挥免疫作用。
太阳鱼分为L-LMU-A组、L-LMU组、L-LM-B组、LNP组、LM组及醋酸钙缓冲液组，每组300尾，组内设置3个重复。免疫14天后对太阳鱼进行攻毒，攻毒用LMBV的浓度为1×103TICD50，攻毒剂量为30 μL/尾。每日记录太阳鱼死亡情况，连续记录14天。计算攻毒后疫苗相对保护率，结果如图20所示。结果表明，L-LMU-A组相对保护率达到76%，L-LMU和L-LM-B组的免疫保护率分别为59%和55%，都远高于L-LM组、LNP组和Lime Acetate组的5%、0、0的相对保护率。L-LMU-A组效果最好，能够保护大部分的太阳鱼，而L-LMU和L-LM-B组均具有超过一半的保护率。说明对mRNA的修饰以及非翻译区的选择都有利于疫苗在鱼体内发挥免疫作用。
真鲷分为L-LMU-A组、L-LMU组、L-LM-B组、LNP组、LM组及醋酸钙缓冲液组，每组300尾，组内设置3个重复。免疫14天后对真鲷进行攻毒，攻毒用LMBV的浓度为1×103TICD50，攻毒剂量为30 μL/尾。每日记录真鲷死亡情况，连续记录14天。计算攻毒后疫苗相对保护率，结果如图21所示。结果表明，L-LMU-A组相对保护率达到72%，L-LMU和L-LM-B组的免疫保护率分别为45%和44%，都远高于L-LM组、LNP组和Lime Acetate组的5%、0、0的相对保护率。L-LMU-A组效果最好，仅出现了部分死亡，而L-LMU和L-LM-B组同样能够提供一定的保护效果。说明对mRNA的修饰以及非翻译区的选择都有利于疫苗在鱼体内发挥免疫作用。
本发明提供了一种大口黑鲈虹彩病毒mRNA疫苗及其制备方法与应用。所述mRNA疫苗包含了5’帽子结构、5’UTR序列、MCP编码蛋白基因、3’UTR序列以及poly（A）核酸序列。在转录时进行N1-甲基-假尿苷替换尿嘧啶的核苷酸修饰，并用纳米脂质体包裹所述mRNA链。本发明制备出具有高效免疫性的mRNA疫苗，制备方法简单易行，可在短期内生产制备大量目的疫苗。所述mRNA疫苗在大口黑鲈中具有良好的相对保护率，且在裂唇鱼，孔雀鱼，石斑鱼，美国红鱼，太阳鱼，真鲷等鲈形目鱼类上同样具有良好的免疫效果。由于mRNA的特性，疫苗进入鱼体后被免疫细胞快速地识别，在翻译出蛋白后，被快速地降解，不存在污染鱼体遗传物质的问题。即使废弃不用，在常温下很快便被环境中存在的乳化物以及RNA酶快速降解，不存在污染环境的问题，安全性良好。
以上所述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。在依据本发明构思的条件下本领域普通技术人员进行的相关推演和替换，在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.一种水产养殖用mRNA疫苗，其特征在于，包括：mRNA链，以及包裹所述mRNA链的纳米脂质体；
所述mRNA链由以下结构组成：5’帽子结构、5’UTR序列、MCP编码基因序列、3’UTR序列和poly（A）核酸序列；
所述5’UTR序列为大口黑鲈免疫球蛋白超家族9的非翻译区，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
所述MCP编码基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述3’UTR序列为大口黑鲈免疫球蛋白超家族9的非翻译区，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
所述水产养殖用mRNA疫苗的制备方法包括：
构建含有T7启动子、5’UTR序列、MCP编码基因序列、3’UTR序列的质粒，并转化至工程菌中；
利用T7转录酶将尿嘧啶替换为N1-甲基-假尿苷，并进行目的基因的体外转录；
利用加帽酶将5’帽子结构7-甲基鸟苷帽连接至mRNA链的5’核苷上；
利用Poly(A)聚合酶催化ATP，将AMP连接至mRNA链的3’核苷上；
纳米脂质体包裹mRNA链；
所述工程菌为DH5α工程菌，所述加帽酶为重组牛痘病毒加帽酶。
2.根据权利要求1所述的水产养殖用mRNA疫苗，其特征在于，所述纳米脂质体以DOTMA、Span-80、TPGS为原料制备，按物质的量计，所述DOTMA、Span-80和TPGS的配比为50:49:1。
3.权利要求1~2中任一项所述的水产养殖用mRNA疫苗在制备抗大口黑鲈虹彩病毒药物中的应用。
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