CN116496918B - 一种拮抗烟草靶斑病的摩式假单胞菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拮抗烟草靶斑病的摩式假单胞菌(Pseudomonasmosselii)，属于微生物技术领域，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2022859。其为烟草靶斑病的生物防治提供了重要的生防资源。

Description

一种拮抗烟草靶斑病的摩式假单胞菌

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种拮抗烟草靶斑病的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。

背景技术

由于生物防治与环境的良好兼容性，给植物病虫害防治提供了新的思路与选择。利用假单胞菌防治水稻纹枯病已有报道：如张清霞报道绿针假单胞菌7-5主要通过产生吩嗪-1-羧酸、嗜铁素、氢氰酸、蛋白酶、藤黄绿脓菌素和2,4-二乙酰基间苯三酚等抗生素防治水稻纹枯病，防效可达69.0％；张亚研究表明假单胞菌SU8通过产生吩嗪类物质能够抑制水稻纹枯病菌的活性；王晓英通过紫外、红外、质谱、核磁共振等图谱分析假单胞菌发酵液，鉴定出一种新的化合物为2-庚基-5-己基呋喃-3-羧酸(HHCA)，该化合物对水稻纹枯病具有拮抗能力。但到目前为止，关于烟草靶斑病菌的生防资源仍然报道较少。

烟草靶斑病是由瓜亡革菌引起的一种真菌性病害。烟草靶斑病从苗期至烟叶成熟时均可发生，既侵染叶片，也危害茎部。侵染叶片初为圆形水渍状斑点，如温度较高、湿度大、叶片湿润时间较长，则病斑迅速扩展，形成直径2-20cm的不规则斑，有同心轮纹，形成褪绿晕圈枯斑，病斑坏死部分易碎形成穿孔，形似枪弹射击后留下在靶子上的空洞，故称靶斑病。湿度较大时在叶片下表面的病斑边缘常产生该菌的菌丝体及有性世代的子实层和担孢子。

目前，烟草靶斑病的防治措施主要是化学农药防治，但是，使用化学药剂进行防治会有农药残留，严重污染环境且对人畜也有危害，并且长期使用同种化学农药会让植株产生一定的抗药性，防治效果会大大打折扣。而生物防治不会对环境产生污染，也不会危害人畜健康，且能有效防治该病害的传播。

因此，如何提供一种可以拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

为了克服背景技术中的技术问题，本发明提供了一种拮抗烟草靶斑病病原菌的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种拮抗烟草靶斑病的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)

CZ-56，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2022859。

本发明还提供一种菌剂，所述菌剂包含所述的摩式假单胞菌(Pseudomonasmosselii)CZ-56。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包含所述的摩式假单胞菌(Pseudomonasmosselii)CZ-56。

所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与本发明的摩氏假单胞菌具有增效作用的其他物质，该其他物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述组合物进一步可以包括与本发明的摩氏假单胞菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、A1、A2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、QH凝胶、龙胶粉、F1、黄原胶等：分散剂有拉开粉、NNO、LFS、B1、碳黑等。

优选的，所述的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)CZ-56或所述的菌剂或所述的组合物中至少一种在防治靶斑病中的应用。

优选的，所述靶斑病为烟草靶斑病。

本发明的有益效果：

经过试验证明，本发明提供的所述摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)CZ-56通过平板对峙发现该菌对烟草靶斑病菌抑制率可达到83.33％，显著高于目前防治烟草靶斑病的生物农药井冈霉素，进一步对烟草靶斑病菌进行了室内离体叶片防效测定及盆栽防效测定，室内离体叶片防效测定表明发酵液均能对烟叶起到预防及治疗的效果，盆栽防效测定表明发酵原液对烟草盆栽的相对防效均为最高。进一步对CZ-56菌株处理烟草苗进行生长参数和抗性相关酶活的统计及测定，发现发酵原液灌根处理烟苗能够有效促进植株的生长及营养物质的积累，也能有效的促进PPO、SOD、POD和PAL酶活性的增强。综上所述，筛选到了一株具有较好生防潜力的生防细菌，为烟草靶斑病的生物防治提供了重要的生防资源，同时也为假单胞菌成员用于生物防治及促植株抗病性提供了参考依据，因此CZ-56的推广应用有望代替化学农药防治烟草靶斑病，可以保护环境、降低农药残留，显著提高了烟叶的安全性，具有良好的生物农药开发前景。

附图说明

图1为本发明CZ-56抑菌效果及对菌丝体的影响对比图；

图2为本发明CZ-56菌体形态及扫描电镜照片；

图3为本发明CZ-56生理生化特征对比照片；

图4为本发明CZ-56系统发育树结果图；

图5为本发明不同处理对盆栽烟草接种烟草靶斑病菌的预防与治疗效果对比照片；

图6为本发明CZ-56不同处理对烟草的促生效果对比照片；

图7为本发明CZ-56不同处理PPO酶活测定对比图；

图8为本发明CZ-56不同处理POD酶活测定对比图；

图9为本发明CZ-56不同处理SOD酶活测定对比图；

图10为本发明CZ-56不同处理PAL酶活测定对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本发明提供一种拮抗烟草靶斑病的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)CZ-56，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2022859，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2022年6月10日。

实施例中用到的材料、试剂和仪器：

1.1供试菌株

拮抗菌株从郴州罹患烟草靶斑病烟田的健康烟草根际土壤中分离并筛选得到，编号为CZ-56。供试菌株烟草靶斑病菌由课题组前期从田间烟草靶斑病病叶上分离鉴定，编号为BB-11，两者均保存于湖南农业大学植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室。

1.2供试培养基

营养液体培养基(NB)：称取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，溶于1000mL去离子水中，pH7.3±0.1；

营养琼脂培养基(NA)：在营养液体培养基的基础上加琼脂15g；

硝酸盐还原培养基：称取蛋白胨5g，牛肉膏3g，葡萄糖l0g，硝酸钾1g，溶于1000mL蒸馏水中，pH7.3±0.3；

淀粉水解培养基：称取蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂15-20g，溶于1000mL蒸馏水，pH7.1±0.1；

甲基红培养基(M.P)：称取蛋白胨5g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾5g，溶于1000mL蒸馏水；

乙酰甲基甲醇培养基(V.P)：称取蛋白胨5g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾5g，溶于1000mL蒸馏水；

明胶培养基：称取蛋白胨5g，葡萄糖3g，牛肉膏3g，明胶120g，溶于1000mL蒸馏水。在水浴锅中将上述成分溶化，pH7.3±0.1；

硫化氢培养基：称取蛋白胨20g，氯化钠5g，硫代硫酸钠0.5g，柠檬酸铁铵0.5g，琼脂15～20g，溶于1000mL蒸馏水；

以上培养基均121℃高压灭菌15分钟。

1.3主要试剂及仪器

本实施例选用烤烟品种云烟87为试验品种，其中所使用的杀菌剂为10％井冈霉素水剂(浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司)。

供试试剂：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、硝酸钾、可溶性淀粉、磷酸氢二钾、明胶、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、肌酸、山梨醇、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、D-木糖、甘露醇均购买自上海生工公司和国药集团化学试剂有限公司，结晶紫、95％乙醇、复红染液、3％H₂O₂、0.03％H₂O₂、40％NaOH、0.1mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液pH6.8、0.1mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液pH8.8、0.05mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液pH 7、0.05mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液pH 7.8、1.3×10^-2mol/L甲硫氨酸、7.5×10^-5mol/L氮蓝四唑(NBT)、2×10^-6mol/L核黄素、12×10^{- 6}mol/L EDTA、6mol/L盐酸、0.02mol/L L-苯丙氨酸、0.1mol/L邻苯二酚、0.2％愈创木酚、1％PVP，DNA纯化回收试剂盒购自OMEGA公司，琼脂糖购买于Thermo Fisher Scientific公司。

碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。

格里斯试剂A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸150mL。

格里斯试剂B液：ɑ-萘胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸150mL。

二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。甲基红指示剂：甲基红0.1g，95％乙醇300mL，蒸馏水200mL。

主要仪器：Biometra TAdvanced PCR仪(德国耶拿公司)，紫外可见分光光度计(752E RS)，-20℃冰箱、微波炉、电磁炉(Midea)，-80℃冰箱(Haier)，超净工作台(苏静集团安泰公司)，电子天平(上海光正医疗仪器有限公司)，台式高速冷冻离心机、移液器(Eppendorf)，恒温培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)，生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)，恒温摇床(Thermo)，日本TOMYSX500高压灭菌锅，超纯水机，数控超级低温恒温槽(宁波天恒仪器厂)，美国AlghaImager HP凝胶成像系统，日本SANYO制冰机，电泳仪、电泳槽(北京君意垂直电泳槽科技有限公司)，爱仕达电磁炉(浙江爱仕达电器股份有限公司)，雷磁HY-2漩涡混匀仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

实施例二

1.4拮抗菌的分离及筛选

1.4.1细菌的分离

采用稀释涂布分离法分离。将土样置于通风干燥处自然风干，称取5g土壤倒入放有灭菌玻璃珠的50mL无菌水中，置于摇床振荡培养30min后，吸取1mL混悬液，用无菌水梯度稀释，后均匀涂布在NA琼脂平板上，后置于28℃生化培养箱中培养，挑取培养性状不同的单菌落转入NA培养基上纯化培养，纯化3次后，置于4℃冰箱中保存备用。

1.4.2拮抗菌抑菌效果测定

采用平板对峙法进行拮抗菌筛选。从已活化菌株BB-11的平板上打取菌饼接种于PDA平板中央，将上述分离得到的菌株活化后，划线在距离BB-11两边2.5cm处，并将盖玻片斜插在培养基中，28℃恒温培养箱中培养3d，计算抑菌率。以不接拮抗菌仅接菌株BB-11的PDA平板作为空白对照，每个处理设置3个重复。

实施例三

1.5拮抗菌株CZ-56的鉴定

1.5.1形态学观察及生理生化鉴定

按上述纯化培养，在NA平板中长出单菌落后观察其形态。生理生化特征参照第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》方法。

革兰氏染色：用接种针挑取少许在NA培养基上培养24h的CZ-56菌苔，均匀涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，风干固定；结晶紫初染1min，水洗；碘液媒染1min，水洗，吸干；95％乙醇脱色30s，吸干；番红复染1-2min，水洗，风干；油镜观察，深紫色为革兰氏阳性细菌，红色为革兰氏阴性细菌。

生长曲线测定：将待测菌株连续活化两次，在第二次活化24h时转接入NB培养液，180rpm/min，28℃培养24h，然后测定其OD₆₀₀值。然后取1mL接种于等量的NB培养液中，180rpm/min，28℃培养，每隔2h取一次样，一直测到72h，并用涂布平板法测定样品中的活菌数量，绘制生长曲线。

生长温度范围测定：取1mL菌液接种于等量的NA培养液中，设置平行试验，分别置于4、10、15、20、25、28、30、35、37、40和45℃下黑暗培养，在培养第24h时取样，测定其OD₆₀₀值，对比分析不同温度对菌株生长的影响。

氯化钠对生长的影响：将NaCl以0.5％、1％、2％、5％和10％(w/v)的比例添加到培养基中，再将待测菌划线培养于含NaCl的培养基中，28℃培养7d后观察待测菌的生长情况，以不加NaCl的培养基作为阴性对照。

生长pH范围测定：配制pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的NA培养基，将待测菌株等量接种于不同pH的培养液中，28℃培养24h，测定其OD₆₀₀值和有效活菌数，对比分析不同pH对菌株生长的影响。

碳源利用测定：将待测菌分别划线接种于含有1.0％葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、山梨糖、甘露醇、D-木糖的NA培养基(不添加任何碳源)上，置于28℃黑暗培养，7d和14d后分别观察其生长情况，若待测菌能在该种培养基上生长则表明可以利用该种碳源，若不能生长则表示不能利用，每个碳源处理5个重复。

硝酸盐还原试验：接种待测菌于硝酸盐培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养1d，3d，5d，以不接菌的硝酸盐培养基作为空白对照。向灭菌的空试管中分别滴加0.5mL培养了1d，3d，5d的菌液，再各加1滴格里斯氏试剂A液和B液，在对照管中同样加入1滴格里斯氏试剂A液和B液，每组三次重复。若培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等则表明存在亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性反应；若无红色出现，可再滴加1滴或2滴二苯胺试剂，若为蓝色，则表示培养液中存在硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用，为阴性反应；若不为蓝色，则表明硝酸盐和形成的亚硝酸盐已变成其他物质，故仍按硝酸盐还原阳性反应处理。

接触酶试验；取生长了18-24h的待测菌于洁净载玻片上，滴加3％H₂O₂，观察是否有气泡产生，如半分钟内有气泡则为阳性，无气泡则为阴性。

淀粉水解试验：接种待测菌于淀粉水解培养基的平板上，在28℃恒温培养箱中培养2d-5d，待形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈现蓝黑色，若菌落周围出现不变色的透明圈，则为淀粉水解阳性；若菌落周围未出现透明圈则为阴性。

甲基红试验(M.R)：接种待测菌于甲基红培养液中，以不接菌的培养基为空白对照，每组三次重复。于37℃恒温箱中培养，分别在2d、6d(如为阴性可适当延长培养时间)在培养液中滴加1滴甲基红指示剂。若培养液变为红色则为阳性；变为黄色则为阴性。

明胶液化试验：接种待测菌于明胶培养基的试管中，于20℃恒温培养箱中培养，2d-7d后观察培养基是否液化。若明胶凝块部分或全部在20℃以下变为可流动的液体，则为明胶水解阳性反应；若待测菌已生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为阴性反应。如若待测菌已生长，明胶未出现液化，但明胶表明菌苔下出现凹陷小窝(须与未接种待测菌的空白对照比较，培养过久的明胶因水分丧失会出现略微凹陷)也视为轻度水解，按照明胶液化阳性反应记录。

V.P测定：接种待测菌于V.P培养液中，以不接菌的培养基为空白对照，每次三个重复。于恒温培养箱中适温培养。7d后取培养液和40％NaOH溶液等量混合，加入少量肌酸，静置于10min后观察(有时需放置更长时间)。若出现红色则为阳性，不出现红色则为阴性。3.1.5.2多基因序列测定

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取CZ-56的基因组DNA作为模板。以细菌16S rDNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)及gyrB基因引物F(5′-GACAAGCTGGTGTCTTCCGA-3′)和R(5′-CATCTCGCCCAGACCTTTGT-3′)进行PCR扩增及测序，PCR反应体系(25μL)：DNA模板1μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。16S rDNA及gyrB基因的PCR条件：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1.5min，36个循环；72℃10min。测序结果提交至NCBI数据库进行BLAST比对，最后利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建多基因系统进化树。

1.6菌株CZ-56对烟草靶斑病室内防效测定

1.6.1CZ-56对烟草离体叶片的生防活性检测

采用菌饼接种测定菌株CZ-56在离体叶片对烟草靶斑病菌的防效，以10％井冈霉素水剂为对照。将菌株CZ-56于NB培养基中，28℃恒温培养箱中培养2d后，8000rpm离心10min，上清液即为发酵原液，用无菌水悬浮沉淀使OD₆₀₀值为0.8。将直径为7mm菌丝块接种于烟叶表面，接种24h前分别把烟草叶片浸泡于清水、10％井冈霉素稀释液、6.4×10⁸cfu/m菌悬液、发酵原液、发酵液稀释10倍(10×)、发酵液稀释50倍(50×)，6个处理中浸泡5min，作为预防试验(或接种后24h处理为治疗试验)，每个处理6片烟叶，3次重复，接种4d后采用十字交叉法测量病斑长度。

1.6.2CZ-56对烟草活体生防活性检测

采用菌饼接种法测定菌株CZ-56在活体烟草植株对烟草靶斑病菌的防效，以清水为对照。根据步骤1.6.1准备6个处理，接种烟草靶斑病菌24h前将其分别喷洒于烟草叶片上，作为预防试验(接种后24h处理为治疗试验)，每个处理8盆烟草，3次重复，接种4d后利用烟草靶斑病病情分级标准计算病情指数算出防效，进行分析。

1.7CZ-56的促生能力测定

盆栽种植单株烟草，每盆装基质30g。按照步骤1.6.1准备6个处理，每个处理12盆重复，每盆灌根5mL，每周灌根一次，共计3次，最后一次灌根7d后，调查其株高、茎宽、根长、最大叶片长宽、鲜重、干重。

1.8CZ-56的抗病性相关酶活测定

根据上述进行灌根处理，取每盆最大叶片进行抗性相关酶活(多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL)测定。

酶液的提取：选取每盆最大叶片，每种处理各取1g叶组织放入提前预冷的研钵中，加入1.5mL酶提取液和适量灭菌后的石英砂，冰浴研磨后转移至无菌离心管中，用1.5mL酶提取液冲洗研钵，前后加入酶提取液共计3mL。在0℃/10000rpm条件下离心20min，取得上清则是酶液，于-20℃冰箱备用。

PPO：采用邻苯二酚法测PPO活性。向试管中加入1.5mL浓度为0.1mol/L pH值为6.8的磷酸盐缓冲液，再依次加入1.4mL浓度为0.1mol/L的邻苯二酚溶液和0.05mL酶液，对照将酶液替换为磷酸缓冲液。充分摇匀后，用紫外分光光度计在410nm处测吸光度，每隔一分钟记录一次读数，共计5次。一个酶活单位(U)的计算为每分钟每克组织在A410变化0.01时的酶量。所有样品重复3次。

POD：采用愈创木酚法测定POD的酶活。取两支试管作为试验与对照，向试管中依次加入1mL H₂O₂、1mL 0.05mol/L pH 7.0磷酸缓冲液、0.95mL 0.2％愈创木酚溶液及0.05mL酶液，对照将酶液替换为磷酸缓冲液。充分混匀后于470nm处测OD值，每分钟记录一次共5次。一个酶活单位(U)为每克植物组织在A470处每分钟变化0.01时的酶量。所有样品重复3次。

SOD：采用氮蓝四唑光化还原法测定SOD的酶活。取两支试管为试验与对照，每支试管中依次加入0.3mL浓度为1.3×10^-2mol/L甲硫氨酸、0.3mL浓度为2×10^-6mol/L核黄素、0.3mL浓度为7.5×10^-5mol/L氮蓝四唑(NBT)、0.3mL浓度为12×10^-6mol/L的EDTA、1.5mL浓度为0.05mol/L pH值为7.8的磷酸缓冲液，试验组加入0.05mL酶液，对照组加入同体积的磷酸缓冲液，加无菌水定容至3mL，将试管放在4000LX日光灯下照射30min后立即遮光并在560nm处测OD值，每分钟记录一次共5次。一个酶活单位(U)为每克植物组织在A560处每分钟变化0.01时的酶量。所有样品重复3次。

PAL：取两支试管为试验与对照，每支试管中依次加入1mL0.02mol/L的苯丙氨酸和2mL 0.1mol/L pH值为8.8磷酸缓冲液，试验组加入0.05mL酶液，对照组加入同体积的磷酸缓冲液。充分混匀后放入30℃水浴1h，向试验组试管中加入0.2mL、6mol/L的盐酸用以终止反应。立即用紫外分光光度计在290nm处测OD值，每分钟记录一次共5次。一个酶活单位(U)为每克植物组织在A290处每分钟变化0.01时的酶量。所有样品重复3次。

酶活(ΔOD_λ·g^-1·min^-1)＝(ΔOD_λ·VT)/(W·VS·0.01·t)

ΔOD：反应时间内光密度值

VT：样品提取液总体积(mL)

W：样品鲜重(g)

VS：测定时样品提取用量(mL)

t：反应时间(min)

1.9数据分析

使用IBM SPSS Staistics 26和Microsoft Excel 2010软件对试验数据进行统计分析和作图，采用Duncan’s新差复极法进行差异显著性检验。

实施例四

2.结果与分析

2.1拮抗菌的筛选及抑菌效果测定

从湖南郴州罹患烟草靶斑病烟田的健康烟草根际土壤中分离了711个菌株，以烟草靶斑病菌为指示菌通过对峙培养进行拮抗筛选，发现26个菌株对烟草靶斑病菌具有较好的拮抗效果如下表1。其中拮抗菌CZ-56处理后，烟草靶斑病菌落平均直径为1.5±0.05cm，抑制率为83.33％±0.68％，抑制效果明显，如图1，A，C：对照组；B，D：处理组，图1为拮抗菌CZ-56抑菌效果及对菌丝体的影响，且通过对峙培养观察立枯丝核菌菌丝，其外部结构、内部细胞质产生了巨大的影响分化。根据图1所示，对照处理菌丝的外部整体是细长，菌丝体与菌丝体之间连接处较远，其内部细胞质也分布均匀；利用CZ-56对峙培养的立枯丝核菌菌丝，从外部菌丝体可以观察到菌丝体与菌丝体之间连接处拉近，且部分菌丝膨大，有断裂的迹象，从内部观察可知菌丝中白色的空段明显增加，内部的细胞质出现消散裂解的特征，产生的空隙促使细胞膜向外扩张，少部分菌丝出现其内容物溢出，菌丝中空的现象。因此本研究选择防效相对稳定的菌株CZ-56为目标菌进行后续试验。

表1生防材料对烟草靶斑病抑制作用

2.2拮抗菌株CZ-56的鉴定

2.2.1形态学观察、生理生化鉴定及生物学特性分析

在NA培养基上培养24h后，CZ-56菌落呈白色，边缘光滑、整齐，稍凸起。扫描电镜观察下菌体杆状如图2所示，a：CZ-56菌落图；b：扫描电镜放大20000倍下CZ-56菌体形态。菌株CZ-56生理生化指标的测定结果表明，该菌株接触酶、甲基红试验、硝酸盐还原、硫化氢试验均呈阳性，革兰氏染色、淀粉水解、乙酰甲基甲醇、明胶液化试验皆阴性如下表2及图3所示，A：革兰氏染色；B：接触酶反应；C，D：淀粉水解测定；E：硝酸还原反应；F：M.R测定；G：V.P测定；H：硫化氢测定。这些生理生化特征初步推测该菌为摩氏假单胞菌(Pseudomonasmosselii)。

将菌株CZ-56培养56h，每2h在OD₆₀₀测吸光值和菌落。CZ-56在6h时进入对数生长期，此时菌体生长速率最快，代谢旺盛；在12h时进入稳定生长期，在28h时总菌落数最大，代谢物质积累最多，重要的次级代谢产物在此时产生较多；当生长到46h之后菌体浊度开始降低，52h时细胞出现凋亡。生长温度范围测定发现菌株CZ-56在4-45℃下均能生长，温度为28℃和37℃时，在OD₆₀₀的吸光值达到最高；氯化钠对生长的影响测定发现在NaCl浓度达到5％和10％时，菌株CZ-56能够存活，但是含量较低；菌株CZ-56生长pH范围测定表明该菌株能够在pH为2时生存，但不能在pH为11时生存。

表2菌株CZ-56的生理生化特征

2.2.2分子生物学鉴定

如图4所示，括号内为GenBank登录号；分支点上数字代表自展值；标尺0.5代表核苷酸置换率，根据测序结果可知，菌株CZ-56的16S rDNA基因的PCR产物长度为1434bp，在NCBI数据库中BLASTn比对结果显示，CZ-56菌株与P.mosselii strain yy161(MN177227.1)的16S rDNA基因具有100％的相似性，与P.mosselii strain ODW 1.5.1(MK503435.1)16SrDNA基因具有99.86％的相似性；获得菌株CZ-56的部分gyrB基因的PCR产物长度为579bp，在NCBI数据库中BLASTn比对结果显示，CZ-56菌株与P.mosselii strain PtA1(CP024159.1)的全基因组具有97.14％的相似性，与P.mosselii strain BS011(CP023299.1)全基因组具有97.50％的相似性。选取CZ-56及其他菌株序列构建系统发育树，结果显示CZ-56与摩氏假单胞菌处于同一分支上如图5所示。综合序列比对分析、形态学与生理生化鉴定结果，初步确定菌株CZ-56为摩氏假单胞菌(P.mosselii)。

2.3CZ-56的室内防效测定

2.3.1CZ-56对烟草离体叶片的生防活性检测

菌株CZ-56不同处理对离体叶片接种的烟草靶斑病菌防治试验结果如表3所示。预防试验中菌株CZ-56处理组中发酵液处理烟叶时其病斑长直径为1.600±0.255cm，虽然大于10％井冈霉素水剂处理的1.175±0.035cm病斑大小，但仍明显小于清水处理的病斑直径3.033±0.255cm。治疗试验中6.4×10⁸cfu/mL浓度的菌悬液、发酵液原液和发酵液稀释10倍液处理的病斑直径为0.324±0.231cm、0.084±0.061cm和0.145±0.201cm，显著小于清水对照处理的病斑直径2.231±0.246cm，效果比10％井冈霉素水剂更好。这说明菌株CZ-56具有生防潜能。

表3不同处理对烟草靶斑病菌的预防和治疗效果

注：表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3.2CZ-56对室内盆栽防效测定

室内盆栽防效试验结果如表4和图5所示，处理从左到右分别是对照组、10％井冈霉素水剂、6.4×10⁸cfu/mL菌悬液、发酵原液、发酵稀释10倍、发酵稀释50倍处理。预防试验中，先喷洒拮抗菌CZ-56的4个处理组和井冈霉素对照组24h后再接种烟草靶斑病，清水处理的病情指数为66.30±9.26，发酵原液处理的病情指数为17.52±2.24，相对防效达到72.58±7.21％。虽然低于井冈霉素96.36±1.36％的防效，但该处理对烟草靶斑病能够起到较好的预防效果。治疗试验中，先接种烟草靶斑病菌再进行CZ-56的4种处理，结果显示发酵原液和稀释10倍液处理的相对防效分别为83.06±3.06％和78.12±3.12％，显著高于井冈霉素62.74±2.74％的防效。此外，6.4×10⁸cfu/mL浓度的菌悬液处理也具有67.92±2.92％的防效。该试验说明CZ-56对烟草靶斑病菌具有显著的治疗和预防效果，且相较于预防作用，治疗效果更显著。

表4不同处理对活体烟草靶斑病的预防和治疗效果

注：表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.4CZ-56对烟草苗促生能力测定

CZ-56对烟草苗的促生长效果试验结果如表5所示。结果表明，菌株CZ-56对烟草苗生长有促进作用，与清水处理对照相比，发酵原液和6.4×10⁸cfu/mL菌悬液灌根处理均能促进烟草苗生长，在5％置信水平有显著性差异如图6及表5，A：清水；B：6.4×10⁸cfu/mL菌悬液；C：发酵原液；D：发酵液稀释10倍；E：发酵液稀释50倍。6.4×10⁸cfu/mL菌悬液处理后烟草茎粗、株高、最大叶长、最大叶宽和鲜重分别增加了37.78％、50.54％、26.03％、27.82％和39.25％；发酵原液处理后烟草茎粗、最大叶长、最大叶宽、鲜重和干重分别增加了28.89％、28.43％、39.39％、42.53％和15.09％；发酵液稀释10倍灌根处理对烟草的干重增加了15.09％。

表5拮抗菌CZ-56对烟草的促生作用

注：表中数据为平均数±标准误差，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.5抗病性相关酶活测定

CZ-56的不同处理后对烟草植株进行了PPO、SOD、PAL和POD的抗性酶活检测，结果如图7-10所示，分别是PPO、POD、SOD和PAL酶活测定，T1代表清水，T2代表6.4×10⁸cfu/mL菌悬液，T3代表CZ-56发酵原液，T4代表CZ-56发酵液稀释10倍，T5代表CZ-56发酵液稀释50倍，同列数据后不同小写字母表示差异显著。发酵原液处理烟草苗可使PPO、SOD和PAL酶活性达到最高，分别为1239.33、77.67和15.00(ΔOD_λ/g·min)，与清水处理相比分别高出348.91％、242.61％和400.00％。用6.4×10⁸cfu/mL菌悬液处理烟草苗能使POD酶活性达到最高为1214.00(ΔOD_λ/g·min)，与清水处理相比分别高出240.16％。

在PPO酶活性检测中，除了发酵原液处理后酶活最高，发酵液稀释10倍处理也与对照组具有显著性差异(P<0.05)。POD酶活性检测中，4个处理均与清水处理具有显著性差异(P<0.05)，6.4×10⁸cfu/mL菌悬液处理烟草苗能使POD酶活性最高，从发酵原液到发酵液稀释50倍液处理结果可知，随着发酵液稀释处理烟草苗，其处理后植株的POD酶活逐渐减弱，其中发酵液原液处理后POD酶活性达到1083(ΔOD_λ/g·min)，比清水处理高出184.25％。SOD酶活性检测中，4个处理组均比对照组酶活性高，其中发酵液原液处理烟草苗酶活性最高，其次为发酵液稀释10倍液。PAL酶活性检测中，除了发酵液原液处理外，6.4×10⁸cfu/mL菌悬液处理后的PAL酶活也比对照组高且具有显著差异(P<0.05)。综上所述，用发酵原液处理烟草苗能够引起叶片中PPO、POD、SOD和PAL抗性酶活的显著升高，其中PPO、SOD和PAL酶活性达到最高。

通过平板对峙发现该菌对烟草靶斑病菌抑制率可达到83.33％，通过对该菌的形态学特征、生理生化特征、多基因序列系统进化分析将该菌株鉴定为摩氏假单胞菌(P.mosselii)。进一步对烟草靶斑病菌进行了室内离体叶片防效测定及盆栽防效测定，室内离体叶片防效测定表明发酵液均能对烟叶起到预防及治疗的效果，盆栽防效测定表明发酵原液对烟草盆栽的相对防效均为最高。进一步对CZ-56菌株处理烟草苗进行生长参数和抗性相关酶活的统计及测定，发现发酵原液灌根处理烟苗能够有效促进植株的生长及营养物质的积累，也能有效的促进PPO、SOD、POD和PAL酶活性的增强。综上所述，该研究筛选到了一株具有较好生防潜力的生防细菌，为烟草靶斑病的生物防治提供了重要的生防资源，同时也为假单胞菌成员用于生物防治及促植株抗病性提供了参考依据。

假单胞菌是一种极具生物防治潜力的细菌。它们广泛分布在根际土壤和植物中，可产生多种抗菌物质和多种次生代谢物。该属的一些细菌还能通过水解磷和钾，分泌植物激素和铁蛋白来促进植物对营养物质的吸收和植物的生长。有研究报道，生防菌可以通过直接的拮抗作用或间接激活植物的诱导系统抗性(ISR)而起到生防作用。植物可以通过感知微生物(或病原体)分泌的激发子，也就是类似于微生物(或病原体)相关的分子模式(MAMPs或PAMPs)而激发ISR。MAMPs或PAMPs被植物与细胞膜相关的模式识别受体识别，从而引发植物先天免疫。假单胞菌可以分泌多种激发子刺激植物ISR的产生。据报道，假单胞菌可以通过产生次级代谢产物，如CLPs、Pyochelin(Pch)、前体水杨酸(SA)和吩嗪化合物绿脓菌素等激发植物的ISR来控制病原物。目前也有研究报道假单胞菌可以促进植物抗病能力的提高：紫丁香假单胞菌(Pseudomonas Syringa)编码的HrpZ蛋白能刺激非寄主植物的过敏反应，能促进烟草生长，提高烟草对烟草花叶病毒(TMV)和烟草晚疫病的抗性。以上研究背景表明，部分假单胞菌具有生防潜力、促生长功能和诱导植物抗病功能，具有重要的应用价值。本研究发现的生防菌株CZ-56对烟草靶斑病菌具有较好的拮抗效果与生防潜力，且具有促进烟苗生长，提高抗性酶活的功能。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种拮抗烟草靶斑病的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)CZ-56，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2022859。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含如权利要求1所述的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)CZ-56。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含如权利要求1所述的摩式假单胞菌(Pseudomonas mosselii)CZ-56。

4.如权利要求1所述的摩式假单胞菌、如权利要求2所述的菌剂以及如权利要求3所述的组合物中的至少一种用于防治靶斑病中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶斑病为烟草靶斑病。