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CN116479189A - 一种合胞病毒b亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒 - Google Patents

一种合胞病毒b亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒 Download PDF

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CN116479189A
CN116479189A CN202310619061.5A CN202310619061A CN116479189A CN 116479189 A CN116479189 A CN 116479189A CN 202310619061 A CN202310619061 A CN 202310619061A CN 116479189 A CN116479189 A CN 116479189A
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CN
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CN202310619061.5A
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毛凌峰
唐旖
杨狄
崔仑标
罗君红
赵康辰
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Hangzhou Boyi Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Boyi Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供一种合胞病毒B亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒，利用叠瓦式原理设计了针对合胞病毒B亚型的全基因的24对引物，且将24对引物区分为2个引物池，能够对从鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液等环境中提取的核酸样本中进行合胞病毒B亚型全基因组反转录与富集扩增，并对得到的DNA产物进行二代或三代全基因组测序实验以实现合胞病毒B亚型的全基因检测。

Description

一种合胞病毒B亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因测序领域，特别涉及一种合胞病毒B亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是一种有包膜的RNA病毒，属副粘液病毒科(Paramyxoviridae)，基因组大小为15.2Kb，该病毒经空气飞沫和密切接触传播。RSV是引起急性下呼吸道感染(ALRI)的主要病原体之一，尤其是在婴儿和5岁以下儿童中，潜伏期为3～7日。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎；成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。目前为止，RSV仍然是一个主要的公共卫生威胁，据估计它会导致5岁以下儿童感染3310万人(21.6-50.3)和59,600人死亡(48,000-74,500)。
呼吸道合胞病毒的基因分型始于1998年Peret等人发表的一篇文章。在此文章发表之前人们关于呼吸道合胞病毒种内的分类主要根据RSV的G蛋白与单克隆抗体反应的不同以及G蛋白基因的不同。随着测序技术的进步，90年代前期已有许多关于呼吸道合胞各个基因的序列及毒株间差异的报道，基本上从各个基因上都能将呼吸道合胞病毒分为A和B两个大族。而G蛋白极易发生基因突变，典型的RSV-A和RSV-B之间得G蛋白氨基酸序列的50％可以改变，不同基因型间G蛋白氨基酸的同源性可仅有53％，抗原相关性可仅为5％。G蛋白变异性集中在胞外域，它由两个高变区组成，由一个保守的13个氨基酸基序隔开。RSV-A和RSV-B各自的型内也存在主要源于G蛋白的抗原与基因的较大差异(可存在20％的氨基酸改变)，还有SH和N蛋白的有限变异，基因型内差异为进行更细基因分型提供了依据也提供了型内进化的基础。
研究发现，不同的RSV亚型感染可能导致不同程度和类型的症状。因此，临床上对RSV不同亚型的准确鉴定是后续RSV感染的疫苗研制和诊治的重要基础。另一方面，目前大部分RSV的分子流行病学研究都只研究G基因的序列，对于RSV全基因组的测序报道的较少。但RSV不同亚型之间具有高度可变性和复杂性，获得临床RSV的完整基因组序列是了解该病毒临床特征的基础，能更好地了解RSV在临床情况下的生物学特征。
综上所述，目前针对合胞病毒的鉴定可以利用分离病毒毒株后进行血清补体结合试验和中和试验进行检测，但是这种方式耗时耗力且存在大概率的病毒分离培养失败的可能性，灵敏度不够；还可以利用常规定量PCR方法以合胞病毒G基因为目标区域后根据不同分型基因核酸序列特点设计引物和探针，在特定的反应体系和反应条件下通过扩增特异性目的片段进行分型，但是定量PCR方法只能鉴定A、B亚型而无法进行更进一步的基因序列分析和分型，也无法鉴定新的分型；当然还可以设计引物对G基因进行靶向扩增和测序，对得到的序列构建进化树进行分析，而目前的技术也仅限于针对单个基因片段设计引物，且目前大部分单对引物也都设计在病毒的保守区，无法覆盖合胞病毒的全基因组。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合胞病毒B亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒，能够对从鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液等环境中提取的核酸样本中进行合胞病毒B亚型全基因组反转录与富集扩增，并对得到的DNA产物进行二代或三代全基因组测序实验以实现合胞病毒B亚型的全基因检测。
目前大部分针对合胞病毒的基因测序仅是针对位于病毒的保守区的单一基因片段进行的，而本方案提出的合胞病毒B亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒则是旨在实现合胞病毒B亚型的全基因测序。为了实现合胞病毒B亚型的全基因测序需要设计多重PCR引物，而设计多重PCR引物的难点和痛点在于：1.保证每对引物在扩增时不会相互干扰的；2.扩增效率需要保持一致；3.需要覆盖合胞病毒B亚型的全基因，且保证所有分型都可以成功扩增，本发明针对存在的研发痛点和难点按照叠瓦式原理设计了24对引物检测检测重叠的序列部分，以使得在多重PCR体系中的引物的扩增位置更加准确且不会相互干扰，表面了PCR扩增过程中产生的不特异性产物和假阳性结果；且将24对引物分成两个引物池分别进行扩增后再混合得到合胞病毒的全基因组序列，这样设计的好处在于可避免引物直接扩增比较短的重叠区域。
为实现以上目的，第一方面，本方案提供了一种合胞病毒B亚型的全基因捕获的引物组合，包括：分别对合胞病毒B亚型进行检测的第一引物池和第二引物池；
第一引物池的引物包括：
引物对RSVB_1由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.1所示的RSVB_1_LEFT-1，正向引物的序列如SEQ NO.2所示的RSVB_1_LEFT-2，反向引物的序列如SEQNO.3所示的RSVB_1_RIGHT；
引物对RSVB_3由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.7的RSVB_3_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.8的RSVB_3_RIGHT；
引物对RSVB_5由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.11的RSVB_5_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.12的RSVB_5_RIGHT；
引物对RSVB_7由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.15的RSVB_7_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.16的RSVB_7_RIGHT；
引物对RSVB_9由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.19的RSVB_9_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.20的RSVB_9_RIGHT；
引物对RSVB_11由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.23的RSVB_11_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.24的RSVB_11_RIGHT；
引物对RSVB_13由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.27的RSVB_13_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.28的RSVB_13_RIGHT；
引物对RSVB_15由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.31的RSVB_15_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.32的RSVB_15_RIGHT；
引物对RSVB_17由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.35的RSVB_17_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.36的RSVB_17_RIGHT；
引物对RSVB_19由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.39的RSVB_19_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.40的RSVB_19_RIGHT；
引物对RSVB_21由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.43的RSVB_21_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.44的RSVB_21_RIGHT；
引物对RSVB_23由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.47的RSVB_23_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.48的RSVB_23_RIGHT；
第二引物池的引物包括：
引物对RSVB_2由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.4所示的RSVB_2_LEFT-1，正向引物的序列如SEQ NO.5所示的RSVB_2_LEFT-2，反向引物的序列如SEQNO.6所示的RSVB_2_RIGHT；
引物对RSVB_4由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.9的RSVB_4_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.10的RSVB_4_RIGHT；
引物对RSVB_6由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.13的RSVB_6_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.14的RSVB_6_RIGHT；
引物对RSVB_8由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.17的RSVB_8_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.18的RSVB_8_RIGHT；
引物对RSVB_10由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.21的RSVB_10_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.22的RSVB_10_RIGHT；
引物对RSVB_12由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.25的RSVB_12_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.26的RSVB_12_RIGHT；
引物对RSVB_14由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.29的RSVB_14_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.30的RSVB_14_RIGHT；
引物对RSVB_16由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.33的RSVB_16_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.34的RSVB_16_RIGHT；
引物对RSVB_18由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.37的RSVB_18_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.38的RSVB_18_RIGHT；
引物对RSVB_20由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.41的RSVB_20_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.42的RSVB_20_RIGHT；
引物对RSVB_22由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.45的RSVB_22_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.46的RSVB_22_RIGHT；
引物对RSVB_24由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.49的RSVB_24_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.50的RSVB_24_RIGHT1，反向引物的序列如SEQNO.51的RSVB_24_RIGHT2。
在一些实施例中，第一引物池对合胞病毒B亚型进行扩增得到第一产物，第二引物池对合胞病毒B亚型进行扩增得到第二产物，合并第一产物和第二产物得到合胞病毒B亚型的全基因序列。
在一些实施例中，第一引物池和第二引物池内的24对引物中根据叠瓦式原理设计得到，相邻的引物对之间存在相互重叠的片段。关于这24对以叠瓦式原理设计得到的24对引物的重叠关系如图1所示。
第二方面，本方案提供了一种合胞病毒B亚型的全基因捕获的试剂盒，含有第一方面提及的引物组合，功能为用于鉴定合胞病毒B亚型的全基因序列。
第三方面，本方案提供了一种合胞病毒B亚型的全基因捕获方法，应用于非诊断目的，利用第一方面提及的引物组合捕获合胞病毒B亚型的全基因组序列。
在一些实施例中，待测样本选择为鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液的环境中提取的核酸样本，对待测样本利用第一方面提及的引物组合捕获合胞病毒B亚型的全基因组序列进行反转录与富集扩增。
在一些实施例中，采用二代全基因测序方法或者三代全基因测序方法。
在一些实施例中，第一引物池内的引物和第二引物池内的引物分别对待测样本进行多重PCR扩增，PCR扩增程序为低温度的退火温度扩增5个循环后再利用高温度的退火温度进行循环。
关于本方案提及的第一引物池和第二引物池内的引物序列如下表一所示：表一序列表
相较现有技术，本方案提供了一种合胞病毒B亚型的全基因捕获方法、引物组合和试剂盒，针对合胞病毒B亚型的全基因组按照叠瓦式原理设计了24对引物，这些引物被设计为相互重叠从而使得PCR产物具有重叠的序列部分，进而使得引物的扩增位置更加准确，从而提高PCR的特异性和灵敏度。且由于合胞病毒基因组长度较长，使用叠瓦式PCR可以将基因组分成多个重叠片段进行扩增，避免PCR扩增过程中产生的不特异性产物和假阳性结果。不仅如此，本方案将24对引物区分为第一引物池和第二引物池分别对合胞病毒进行扩增，使得扩增完的两管产物混合后就得到了合胞病毒B亚型的全基因组序列，通过软件把数据进行拼接成完整的一致性序列，本方案可被用于非诊断目的的从各类核酸样本中进行合胞病毒B亚型全基因组反转录和富集扩增。
另外，需要说明的是：本方案的引物组合可实现合胞病毒B亚型所有分型的全基因组扩增，且可覆盖合胞病毒B亚型99.9％的完整序列，可适用于二代或三代的所有主流测序平台。
附图说明
图1是本方案的24对引物合胞病毒B亚型引物的叠瓦设计情况；
图2是实施例1组转分析结果；
图3是实施例2组装分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
样本来源：江苏省疾控合胞病毒B亚型样品1株
1.RNA反转录
1)如表2的成分在PCR管中混合：
表2
试剂 体积
①Random hexamers 1μL
②dNTP混合物 1μL
RNA模板 11μL
总体积 13μL
。
2)轻柔吹吸混匀，瞬时离心；
3)65℃孵育5min，立即转移至冰上冷却1min。按以下表3所示的反应体系配置混合液：
表三
试剂 体积
③RT缓冲液 4μL
④二硫苏糖醇 1μL
⑤酶抑制剂 1μL
⑥RT 1μL
上一步退火产物 13μL
总体积 20μL
。
4)按以下表四所示的反应程序进行反转录生成cDNA链：
表四
PCR步骤 温度 时间 循环
1 42℃ 50min 1
2 70℃ 10min 1
3 4℃ Hold
。
2.全基因组扩增：
1)对同样本分别使用⑨第一引物池和⑩第二引物池内的引物进行扩增2)配置预混液并转移至PCR管中，反应体系如下表五所示：
表五
3)分别进行多重PCR，PCR程序如下表六所示：
表六
4)将同一样品的第一引物池和第二引物池的PCR产物合并到1.5mL离心管中即得到合胞病毒B亚型的全基因组扩增核酸。
3.三代测序
用1倍体积的磁珠对扩增产物进行纯化，纯化后qubit定量在10ng/ul以上的样本可直接进行后续的建库实验，用BK-AUX024和SQK-LSK110进行纳米孔测序建库和测序，数据通过组装软件进行组装分析。分析结果如图2所示，测序数据覆盖了基因组100％区域。
实施例二
样本来源：武汉大学分离培养RSVB一株(灭活)
核酸抽提：用凯杰的病毒RNA抽提试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit，货号(52904)进行合胞病毒RNA的抽提。逆转录扩增如实施例一，分析结果如图3所示，测序数据覆盖了基因组100％区域。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种合胞病毒B亚型的全基因捕获的引物组合，其特征在于，包括：分别对合胞病毒B亚型进行检测的第一引物池和第二引物池；
第一引物池的引物包括：
引物对RSVB_1由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.1所示的RSVB_1_LEFT-1，正向引物的序列如SEQ NO.2所示的RSVB_1_LEFT-2，反向引物的序列如SEQ NO.3所示的RSVB_1_RIGHT；
引物对RSVB_3由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.7的RSVB_3_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.8的RSVB_3_RIGHT；
引物对RSVB_5由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.11的RSVB_5_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.12的RSVB_5_RIGHT；
引物对RSVB_7由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.15的RSVB_7_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.16的RSVB_7_RIGHT；
引物对RSVB_9由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.19的RSVB_9_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.20的RSVB_9_RIGHT；
引物对RSVB_11由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.23的RSVB_11_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.24的RSVB_11_RIGHT；
引物对RSVB_13由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.27的RSVB_13_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.28的RSVB_13_RIGHT；
引物对RSVB_15由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.31的RSVB_15_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.32的RSVB_15_RIGHT；
引物对RSVB_17由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.35的RSVB_17_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.36的RSVB_17_RIGHT；
引物对RSVB_19由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.39的RSVB_19_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.40的RSVB_19_RIGHT；
引物对RSVB_21由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.43的RSVB_21_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.44的RSVB_21_RIGHT；
引物对RSVB_23由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.47的RSVB_23_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.48的RSVB_23_RIGHT；
第二引物池的引物包括：
引物对RSVB_2由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.4所示的RSVB_2_LEFT-1，正向引物的序列如SEQ NO.5所示的RSVB_2_LEFT-2，反向引物的序列如SEQ NO.6所示的RSVB_2_RIGHT；
引物对RSVB_4由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.9的RSVB_4_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.10的RSVB_4_RIGHT；
引物对RSVB_6由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.13的RSVB_6_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.14的RSVB_6_RIGHT；
引物对RSVB_8由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.17的RSVB_8_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.18的RSVB_8_RIGHT；
引物对RSVB_10由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.21的RSVB_10_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.22的RSVB_10_RIGHT；
引物对RSVB_12由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.25的RSVB_12_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.26的RSVB_12_RIGHT；
引物对RSVB_14由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.29的RSVB_14_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.30的RSVB_14_RIGHT；
引物对RSVB_16由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.33的RSVB_16_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.34的RSVB_16_RIGHT；
引物对RSVB_18由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.37的RSVB_18_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.38的RSVB_18_RIGHT；
引物对RSVB_20由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.41的RSVB_20_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.42的RSVB_20_RIGHT；
引物对RSVB_22由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.45的RSVB_22_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.46的RSVB_22_RIGHT；
引物对RSVB_24由正向引物和反向引物组成，正向引物的序列如SEQ NO.49的RSVB_24_LEFT，反向引物的序列如SEQ NO.50的RSVB_24_RIGHT1，反向引物的序列如SEQ NO.51的RSVB_24_RIGHT2。
2.根据权利要求1所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获的引物组合，其特征在于，第一引物池和第二引物池内的24对引物中根据叠瓦式原理设计得到，相邻的引物对之间存在相互重叠的片段。
3.根据权利要求1所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获的引物组合，其特征在于，第一引物池对合胞病毒B亚型进行扩增得到第一产物，第二引物池对合胞病毒B亚型进行扩增得到第二产物，合并第一产物和第二产物得到合胞病毒B亚型的全基因序列。
4.一种合胞病毒B亚型的全基因捕获的试剂盒，其特征在于，包括：根据权利要求1到3任一所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获引物组合。
5.根据权利要求4所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获的试剂盒，其特征在于，功能为鉴定合胞病毒B亚型的全基因序列。
6.根据权利要求4所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获的试剂盒，其特征在于，待测样本为鼻咽拭子、深咳痰液、肺泡灌洗液的环境中提取的核酸样本。
7.一种合胞病毒B亚型的全基因捕获方法，用于非诊断目的，其特征在于，利用权利要求1到5任一所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获引物组合捕获合胞病毒B亚型的全基因组序列。
8.根据权利要求7所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获方法，其特征在于，对待测样本中的合胞病毒B亚型的全基因组序列进行反转录与富集扩增。
9.根据权利要求7所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获方法，其特征在于，采用二代全基因测序方法或者三代全基因测序方法。
10.根据权利要求7所述的合胞病毒B亚型的全基因捕获方法，其特征在于，第一引物池内的引物和第二引物池内的引物分别对待测样本进行多重PCR扩增，PCR扩增程序为低温度的退火温度扩增5个循环后再利用高温度的退火温度进行循环。
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