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CN116474114A - 一种载分子靶向药物聚合物囊泡及其制备方法与应用 - Google Patents

一种载分子靶向药物聚合物囊泡及其制备方法与应用 Download PDF

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CN116474114A
CN116474114A CN202310375828.4A CN202310375828A CN116474114A CN 116474114 A CN116474114 A CN 116474114A CN 202310375828 A CN202310375828 A CN 202310375828A CN 116474114 A CN116474114 A CN 116474114A
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孙欢利
杜健为
岳淑静
程茹
钟志远
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Suzhou University
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Abstract

本发明公开了一种载分子靶向药物聚合物囊泡及其制备方法与应用，与全反式维甲酸联合应用以实现原位急性髓系白血病的双重级联靶向治疗。载分子靶向药物聚合物囊泡由嵌段聚合物组装交联的同时通过静电作用装载分子靶向药物，然后与靶向单抗反应制备得到。本发明的囊泡体系拥有许多独特的优点，包括尺寸小、制备简单可控、生物相容性优异、体内循环稳定性高、肿瘤细胞特异选择性强、细胞内药物释放速度快等。本发明的联合策略可为急性髓系白血病提供成熟、有效靶点，促进纳米药物对于其的高效靶向治疗，有效清除了白血病细胞，显著延长了荷瘤小鼠的生存期，且安全性高。本发明联合用药策略可为急性髓系白血病患者提供一种高全高效的靶向治疗方式。

Description

一种载分子靶向药物聚合物囊泡及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于聚合物纳米药物技术领域，具体涉及一种载分子靶向药物聚合物囊泡及与全反式维甲酸联合策略的应用。尤其涉及一种载伏拉塞替靶向聚合物囊泡及其制备方法、联合全反式维甲酸在急性髓系白血病靶向治疗中的应用。
背景技术
小分子靶向药物具有高特异性和低毒性，近年来在肿瘤治疗中发挥着关键作用，造福了许多恶性肿瘤患者。致癌基因Polo样激酶1（PLK1）对于肿瘤细胞的分裂和增殖至关重要，在急性髓系白血病（AML）及其它多种类型的肿瘤中均存在过表达，且表达水平与预后不良密切相关，大幅推动了PLK1分子靶向药物的开发。其中，伏拉塞替（Vol）是目前临床研究中最为先进的 PLK1 抑制剂，于 2013 年获得 FDA 授予的突破性疗法资格，用于AML患者的治疗。然而由于其体内清除率高、肿瘤富集少，需要大量给药，给药剂量接近于最大耐受剂量，通常伴有严重的骨髓抑制、血细胞减少等剂量限制性毒性。现有技术公开了少数几种纳米载体用于递送Vol，其虽然可以改善Vol的循环时间，降低其系统毒性，但仍面临着稳定性差、尺寸大、包封率低等问题。此外，AML靶向纳米药物的开发严重受制于缺少成熟有效的靶点。尽管人们在筛查AML靶点和靶向药物方面开展了大量的研究工作，至今尚没有发现高特异性的靶点和相关药物。CD38作为多发性骨髓瘤治疗中的成熟靶点，约在一半的AML病人细胞上表达，但表达水平高低不一，限制了其应用。
发明内容
本发明的目的是公开载分子靶向药物聚合物囊泡及其制备方法与联合全反式维甲酸的应用，具体为一种负载伏拉塞替的靶向聚合物囊泡及其制备方法、联合全反式维甲酸在治疗急性髓系白血病中的应用。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
载分子靶向药物聚合物囊泡，由两亲性嵌段聚合物、官能团化两亲性嵌段聚合物、分子靶向药物、靶向分子制备，所述两亲性嵌段聚合物为A-P(B-DTC)-KDz，官能团化两亲性嵌段聚合物为G-A-P(B-DTC)，其中A为亲水链段，B为酯单体单元，G为官能团；所述分子靶向药物为伏拉塞替或者奎扎替尼，优选伏拉塞替（Vol）；优选的，所述两亲性嵌段聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-KDz、PEG-P(LA-DTC)-KDz或者PEG-P(CL-DTC)-KDz，z为5～15。
本发明两亲性嵌段聚合物中，所述靶向分子为靶向单抗，优选单抗为靶向CD38的单抗，如达雷木单抗（Dar）、艾沙妥昔单抗（Isa）或其它靶向单抗；亲水链段为聚乙二醇链段；P(B-DTC)为疏水链段，由B单体链段（PB）、DTC单体链段（PDTC）组成；亲水链段的分子量为2000～15000 Da；疏水链段分子量为亲水链段分子量的2.0～8.0倍；PDTC的分子量为疏水链段总分子量的10%～40%。优选的，PEG的分子量为3000～8000 Da；疏水链段的分子量为PEG分子量的2.0～6.0倍；PDTC的分子量为疏水链段分子量的10%～30%。
本发明公开了上述载分子靶向药物聚合物囊泡的制备方法，包括以下步骤，以分子靶向药物、两亲性嵌段聚合物、官能团化两亲性嵌段聚合物、靶向分子为原料，通过溶剂置换法及后修饰单抗制备载分子靶向药物聚合物囊泡。具体的，将官能团化两亲性嵌段聚合物与两亲性嵌段聚合物组装自发交联，同时通过静电作用装载伏拉塞替，然后与靶向单抗反应，制备靶向载药聚合物囊泡；所述官能团化两亲性嵌段聚合物中的官能团为N3-、Mal-或者NHS-。官能团来自PEG引发剂，得到的聚合物PEG端带有可反应性官能团，比如叠氮（N3），马来酰亚胺（Mal）或N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），以两亲性嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)为例，官能团化两亲性嵌段聚合物可以为N3-PEG-P(TMC-DTC)、Mal-PEG-P(TMC-DTC)、NHS-PEG-P(TMC-DTC)。
本发明的载分子靶向药物聚合物囊泡，由两亲性嵌段聚合物组装并交联得到，其具有不对称膜结构，外壳为聚乙二醇（PEG），膜层为可逆交联的疏水聚碳酸酯，内层为聚天冬氨酸（KDz），内层的天冬氨酸残基可以与Vol通过静电作用结合，从而实现Vol的高效稳定装载。
本发明公开了上述载分子靶向药物聚合物囊泡与全反式维甲酸联合策略的应用，尤其是在治疗急性髓系白血病中的应用。本发明公开了上述载分子靶向药物聚合物囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用。上述载分子靶向药物聚合物囊泡与全反式维甲酸在制备联合抗肿瘤药物中的应用。全反式维甲酸在制备提高上述载分子靶向药物聚合物囊泡药效的试剂中的应用。所述肿瘤为血液瘤，优选的，所述肿瘤为白血病。
本发明载分子靶向药物聚合物囊泡与全反式维甲酸联合的策略在急性髓系白血病治疗中的应用效果优异，促进分子靶向药物聚合物囊泡靶向结合急性髓系白血病细胞，释放药物发挥抗白血病活性。
本发明公开了上述载分子靶向药物聚合物囊泡与全反式维甲酸联合策略在治疗急性髓系白血病中的应用。具体为，全反式维甲酸、上述载分子靶向药物聚合物囊泡贯序给药，先注射全反式维甲酸，再注射载分子靶向药物聚合物囊泡以靶向识别急性髓系白血病细胞，进而在胞内快速释放分子靶向药物，通过双重级联靶向实现高效抗白血病治疗。
本发明的载分子靶向药物聚合物囊泡的制备方法可以如下：
以Vol、PEG-P(TMC-DTC)-KDz和官能化PEG-P(TMC-DTC)为原料，通过溶剂置换法制备表面含有可反应性官能团的、负载Vol的、可逆交联、可降解聚合物囊泡，进而与靶向单抗反应制备载分子靶向药物靶向聚合物囊泡。
本发明公开了上述载分子靶向药物靶向聚合物囊泡的制备方法：将PEG-P(TMC-DTC)-KDz的DMF溶液和官能化PEG-P(TMC-DTC)如N3-PEG-P(TMC-DTC)的DMF溶液混合均匀后，再与Vol的DMSO溶液混合均匀，注入HEPES溶液中，均匀分散后透析即可得到表面含有N3的载Vol聚合物囊泡（N3-Ps-Vol）。通过二苯并环辛炔修饰的单抗，如达雷木单抗（Dar）、艾沙妥昔单抗（Isa）或其它靶向单抗与N3-Ps-Vol发生张力触动的点击化学反应，可在温和条件下制备得到单抗导向的载Vol聚合物囊泡（Ab-Ps-Vol）。采用同样的方法，通过单抗与NHS官能化的聚合物囊泡Vol聚合物囊泡发生酰胺化反应，或者巯基官能化的单抗分子与表面含有Mal的载Vol囊泡发生迈克尔加成反应，也可简单制备得到Ab-Ps-Vol。
本发明通过静电作用，在双硫交联的囊泡内腔中装载小分子抑制剂Vol，可避免在输送过程中泄漏而造成的损失和毒副作用，并在体内还原剂谷胱甘肽（GSH）的作用下，双硫键迅速断裂释放Vol，有效杀伤肿瘤细胞。
本发明中的聚合物囊泡为还原敏感可逆交联、细胞内可解交联且生物可降解的聚合物囊泡；所述聚合物为PEG-P(TMC-DTC)-KDz，其中疏水嵌段的TMC与DTC呈无规排列。囊泡膜为可逆交联的生物可降解且相容性好的PTMC，侧链的双硫戊环结构类似人体天然的抗氧化剂硫辛酸，可自发形成还原敏感的可逆交联，不但可保证药物在血液中的稳定长循环，还可实现细胞内快速解交联，快速释放药物到靶细胞内。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明设计了新的单抗导向的分子靶向药物Vol载药聚合物囊泡用于 Vol的高效稳定装载及肿瘤靶向递送，解决了Vol本身毒性大，效果差的难题；囊泡膜为可逆交联的生物可降解且生物相容性好的PTMC，侧链的双硫戊环可提供还原敏感的可逆交联，不但可保证药物在血液中的长循环，还可在细胞内快速解交联，释放药物到靶细胞内；外壳为PEG同时具有单抗分子，可特异性结合癌细胞；囊泡的小尺寸以及肿瘤特异性靶向使得囊泡可特异性输送Vol至肿瘤细胞内。
2. 本发明公开的载分子靶向药物聚合物囊泡联合全反式维甲酸策略在体内外具有显著的抗白血病效果，聚合物生物相容性好，可通过静电作用包载Vol，具有高效稳定的包载效果。
3. 本发明载分子靶向药物聚合物囊泡联合全反式维甲酸的治疗方法有效解决了急性髓系白血病病人缺少治疗靶点以及CD38表达水平高低不一的问题，有效拓宽了纳米药物的适用人群。
附图说明
图1为实施例一中N3-Ps-Vol的粒径分布图（A），实施例二中Dar与Dar-DBCO的MALDI-TOF-MS图（B）以及两亲性嵌段聚合物的结构示意图（C），NHS-OEG4-DBCO与达雷木单抗反应示意图（D）。
图2为实施例三中（A）MV4-11和MOLM-13-Luc细胞CD38表达的效果；（B）不同单抗密度的Dar-Ps-Cy5 联合ATRA在MV4-11和MOLM-13-Luc细胞中的内吞情况；（C）Dar-Ps-Cy5在未刺激的MV4-11和MOLM-13-Luc细胞中的内吞情况。
图3为实施例三中ATRA刺激前后的（A）MV4-11细胞和（B）MOLM-13-Luc细胞与Dar-Ps-Cy5和Ps-Cy5孵育4 h后的CLSM图片。
图4为实施例四中不同单抗密度的Dar-Ps-Vol、Ps-Vol和游离Vol在（A）ATRA刺激的MV4-11细胞、（B）MV4-11细胞、（C）ATRA刺激的MOLM-13-Luc细胞和（D）MOLM-13-Luc细胞中的毒性。
图5为实施例四中（A）Dar-Ps-Vol和Ps-Vol在L929细胞中的毒性；空囊泡Dar-Ps和Ps在（B）MV4-11和（C）MOLM-13-Luc细胞中的毒性；（D）ATRA在MV4-11细胞中的毒性。
图6为实施例五中（A）Dar-Ps-Vol、Ps-Vol和游离Vol在ATRA刺激与否的MV4-11细胞中抑制PLK1蛋白的能力和（B）定量分析；（C）Dar-Ps-Vol、Ps-Vol和游离Vol诱导ATRA刺激与否的MV4-11细胞周期阻滞的效果。
图7为实施例五中Dar-Ps-Vol、Ps-Vol和游离Vol在ATRA刺激与否的MV4-11细胞中的促凋亡能力。
图8为实施例六中ATRA刺激AML病人原代细胞（A）上调CD38和（B）摄取Dar-Ps-Vol的情况。
图9为实施例七中接受不同剂量Dar-Ps-Vol小鼠的（A）体重变化；（B）生存期和（C）血常规测试结果。
图10为实施例九中（A）Dar-Ps-Vol联合ATRA治疗原位MV4-11 AML模型的流程示意图；各治疗组小鼠的（B）生存期和（C）体重变化。
图11为实施例九中原位MV4-11 AML模型经不同治疗后，各组小鼠器官浸润分析的（A）流式散点图和（B）统计分析。
图12为实施例九中原位MV4-11 AML模型经不同治疗后，各组小鼠（A）心、肝、脾、肺、肾和（B）后腿骨的H&E染色图。
图13为实施例十中Dar-Ps-Vol联合ATRA治疗原位MOLM-13-Luc AML模型的（A）流程示意图；（B）小鼠的生存期；（C）小鼠的体重变化。以Ps-Vol联合ATRA及PBS组作为对照。
具体实施方式
本发明载分子靶向药物聚合物囊泡为负载伏拉塞替（Vol）的CD38靶向聚合物囊泡，由两亲性嵌段聚合物/官能化两亲性嵌段聚合物组装并自交联的同时通过静电作用包载Vol，并后修饰CD38靶向单抗得到；本发明通过负载Vol的靶向聚合物囊泡联合全反式维甲酸（ATRA）实现了急性髓系白血病的高效级联靶向治疗，部分小鼠可完全治愈。
本发明中，两亲性嵌段聚合物为A-P(B-DTC)-KDz，A为亲水链段，B为酯单体单元，z为5～15，两亲性嵌段聚合物为现有聚合物。作为示例，分别表示为PEG-P(TMC-DTC)-KDz、PEG-P(CL-DTC)-KDz和PEG-P(LA-DTC)-KDz，化学结构式参见图1C，A为聚乙二醇链段，B为TMC、CL或者LA。具体的，本发明以PEG-P(TMC-DTC)-KD15（M n= 5.0-(15.1-2.0)-1.9 kg/mol）和N3-PEG-P(TMC-DTC)（M n= 7.9-(15.1-2.0) kg/mol，M w/M n= 1.1）两亲性嵌段聚合物、伏拉塞替（Vol）药物、CD38靶向达雷木单抗为原料，制备载分子靶向药物靶向聚合物囊泡，再与ATRA联用治疗急性髓系白血病。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述，具体的制备方法以及测试方法为本领域常规技术。涉及的两亲性嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-KD15和N3-PEG-P(TMC-DTC)为现有聚合物；伏拉塞替（Vol，99.4%，Med Chem Express），达雷木单抗（Daratumumab，20 mg/mL，148 kDa，西安杨森制药有限公司）和全反式维甲酸（ATRA，Sigma-Aldrich）为现有市售原料。
实施例一 可逆交联且生物可降解的囊泡Vol纳米药物（N3-Ps-Vol）的制备
N3-Ps-Vol通过溶剂置换法制备，由N3-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-KD15共组装的同时包载Vol而得到，其中N3-PEG-P(TMC-DTC)的含量为2-10 wt.%。以N3-PEG-P(TMC-DTC)占比2 wt.%为例，具体地，称取4.0 mg的N3-PEG-P(TMC-DTC)和196.0 mg的PEG-P(TMC-DTC)-KD15分别溶解于DMF中（40 mg/mL），混合两种聚合物的溶液，得到聚合物溶液，其中N3-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-KD15的质量比为2∶98。称取20.0 mg Vol溶于1.0 mLDMSO中（20 mg/mL），取0.5 mL（10.0 mg）加入2.3 mL聚合物溶液中混合均匀，再将该溶液注入8.5 mL搅拌中（300 rpm）的HEPES缓冲液中（5 mM，pH 7.4），继续搅拌10 min后采用磷酸缓冲液（PB，10 mM，pH 7.4）透析6 h（MWCO：7 kDa），每小时更换一次透析介质，即得到载药囊泡N3-Ps-Vol。其中Vol的理论载药量设定为20 wt.%，所得N3-Ps-Vol的粒径为28 nm，粒径分布（PDI）约为0.08。通过紫外-可见分光光度计测定其在330 nm波长下的吸光值计算得到Vol的包封率为84.2%，载药量为17.4 wt.%（图1A，表1）。
N3-Ps由N3-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-KD15根据上述方法共组装得到，省略药物。
实施例二 达雷木单抗导向的囊泡Vol纳米药物（Dar-Ps-Vol）的制备
Dar-Ps-Vol通过在叠氮官能化的聚合物囊泡Vol纳米药物（N3-Ps-Vol）表面后修饰二苯并环辛炔官能化的达雷木单抗（Dar-DBCO）得到。首先，为了提高单抗的接枝效率及便于储存，先通过超滤的方法将N3-Ps-Vol由4 mg/mL浓缩至20 mg/mL，浓缩后N3-Ps-Vol的粒径仍为28 nm左右，PDI约为0.12。浓缩后在4 ºC下储存120天后其粒径及粒径分布无明显变化，且Vol泄漏量少于2.5%（表2）。
Dar-DBCO通过小分子NHS-OEG4-DBCO与达雷木单抗上的氨基发生酰胺化反应制备得到，其中DBCO的官能化度可通过改变Dar与NHS-OEG4-DBCO的摩尔比进行调节。固定Dar与NHS-OEG4-DBCO的摩尔比为1∶3。一般地，先将Dar溶液（20 mg/mL）用PB（10 mM，pH 8.5）稀释到10 mg/mL，取100 μL（1 mg）向其中加入2.6 μL NHS-OEG4-DBCO的DMSO溶液（5 mg/mL），置于27 ºC、120 rpm摇床中反应过夜。反应结束后，将上述溶液加入超滤管中（MWCO：10 kDa），再加入1 mL PBS低温离心至约200 μL（3000 rpm，4 ºC），重复上述操作两次，以除去未反应的NHS-OEG4-DBCO（M：649.7 g/mol），超滤管上部剩余溶液即为Dar-DBCO。以上反应示意参见图1D，Dar-DBCO的DBCO官能化度通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定。结果显示，此投料摩尔比下每个Dar上修饰了2.8个DBCO（图1B），表示为Dar-DBCO2.8。后续均采用Dar-DBCO2.8进行实验。
通过N3-Ps-Vol表面的N3与Dar-DBCO之间发生张力触动的点击化学反应可简单制备得到Dar-Ps-Vol，Dar的表面密度可通过改变投料比进行调节。设定Dar-DBCO与N3的摩尔比分别为0.25：1、0.5：1、1：1和2：1，得到不同靶向密度的囊泡。例如，取100 μL（2.0 mg）N3-Ps-Vol，分别加入11.2、22.3、44.7和89.3 μL Dar-DBCO溶液（5.3 mg/mL），在27 ºC、120rpm摇床中反应过夜。之后将反应混合液加入超滤管中（MWCO：300 kDa），并加入1 mL PBS稀释，低温离心（3000 rpm，4 ºC）至200 μL，重复上述操作两次以分离Dar-Ps-Vol和未键合的Dar-DBCO。通过HPLC测定下清液中未键合Dar-DBCO的浓度，从而计算出囊泡表面键合Dar的质量及平均每个囊泡表面Dar的键合个数。根据多角度激光光散射测得的聚合物囊泡的绝对重均分子量（4.11×106g/mol）和聚集数（160个）计算可知每个Dar-Ps-Vol表面分别键合有0.6、1.3、2.5和3.0个Dar（表1）。随着Dar密度的增加，Dar-Ps-Vol的粒径略有增加（28-30.5 nm），粒径分布较窄（PDI：0.11-0.12）。
a由HPLC测得；b由DLS测得。
a由DLS测得；b由紫外-可见分光光度计测得。
Dar-Ps的制备方法与Dar-Ps-Vol类似，通过Dar-DBCO与叠氮官能化的空囊泡（N3-Ps）反应得到，最终分散于PB中。
实施例三 Dar-Ps-Vol的内吞
细胞表面的CD38表达水平通过流式细胞仪测定，选取两种急性髓系白血病细胞系，即MV4-11和MOLM-13-Luc细胞。两种细胞均培养于RPMI 1640培养基中（含10% FBS、100μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素和抗支原体试剂）。取MV4-11、MOLM-13-Luc细胞悬液（1 ×106个），离心（800 rpm，5 min）并重悬于100 μL PBS中，加入5 μL APC-anti-human-CD38抗体（Biolegend）于4 ºC孵育30 min，离心并用PBS洗涤两次后，最终分散于500 μL PBS中进行测试。测定细胞的CD38表达时，首先将MV4-11、MOLM-13-Luc细胞与ATRA（1 μM）共孵育48h，随后的操作与未刺激的细胞相同。每个样品至少采集10000个细胞，数据采用Flowjo软件分析处理。结果表明（图2A），MV4-11和 MOLM-13-Luc两种细胞的CD38表达水平均较低。由于Vol本身无荧光，采用Cy5标记聚合物囊泡（Dar-Ps-Cy5）并通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜（CLSM）研究不同Dar密度的Dar-Ps-Cy5在MV4-11和MOLM-13-Luc急性髓系白血病细胞中的摄取情况。Ps-Cy5通过2 wt.% N3-PEG-P(TMC-DTC)、10 wt.% PEG-P(TMC-DTC)-Cy5和88 wt.% PEG-P(TMC-DTC)-KD15的聚合物共组装制备得到。具体如下：称取0.32 mg N3-PEG-P(TMC-DTC)、1.6 mg PEG-P(TMC-DTC)-Cy5、14.08 mg PEG-P(TMC-DTC)-KD15溶解于DMF中（40 mg/mL），将三种聚合物混合均匀后，在搅拌下注入3.6 mL PB（pH 7.4，10 mM）中。搅拌3分钟后，用PB（pH 7.4，10 mM）透析（MWCO：3 kDa）除去有机溶剂。Dar-Ps-Cy5的制备方法与Dar-Ps-Vol类似，设定Dar-DBCO与N3的摩尔比分别为0.25：1、0.5：1、1：1和2：1，以1：1为例，即在100 μL Ps-Cy5（17 mg/mL）中加入36.9 μL的Dar-DBCO溶液（5.5 mg/mL），然后在25 ºC、100 rpm摇床中反应过夜。采用超滤管离心（MWCO：300 kDa，3000 rpm）除去未键合的Dar-DBCO，并用PBS（pH 7.4，1×）洗涤两次。
流式实验中，将MV4-11、MOLM-13-Luc细胞以及ATRA刺激后的MV4-11和MOLM-13-Luc细胞悬液分别铺于6孔板中（1.8 mL，2×105个/孔），每孔加入200 μL不同靶向密度的Dar-Ps-Cy5和Ps-Cy5样品（孔内Cy5浓度为2.5 μg/mL），以PBS作为对照。孵育4 h后，离心（800 rpm，5 min）收集细胞并用PBS洗涤两次，最后分散在500 μL PBS中进行测试。测试结果显示，Dar-Ps-Cy5联合ATRA，MV4-11和MOLM-13-Luc细胞中的内吞量明显高于Ps-Cy5，其中与Dar2.5-Ps-Cy5孵育的细胞具有最高的荧光强度，分别是Ps-Cy5对照组的4.5倍（图2B）和3.9倍（图3A），单独Dar-Ps-Cy5的MV4-11和MOLM-13-Luc细胞中，Dar-Ps-Cy5的摄取量与Ps-Cy5相比无明显区别（图2C）。
随后采用CLSM进一步研究了Dar2.5-Ps-Cy5和Ps-Cy5在MV4-11和MOLM-13-Luc细胞中的内吞行为。具体实验步骤如下，将多聚赖氨酸（300 μL，0.1 mg/mL）预处理的小圆片置于24孔板中，加入MV4-11或MOLM-13-Luc细胞悬液（3×105个/孔），于培养箱中培养24小时，接着分别加入100 μL Dar2.5-Ps-Cy5和Ps-Cy5（Cy5孔内浓度为40 μg/mL）。继续孵育4小时后小心移去培养基，用PBS洗3次，接着用4%多聚甲醛溶液固定15分钟，用PBS洗3次，再用DAPI染细胞核3分钟，用PBS清洗3次，最后采用甘油封片并用CLSM（Leica，TCS SP5）进行观察和拍摄。结果表明，刺激后的MV4-11细胞和MOLM-13-Luc细胞与Dar2.5-Ps-Cy5孵育4小时后，细胞核周围呈现明显的Cy5荧光信号，而与Ps-Cy5孵育的细胞中荧光较为微弱。未刺激的细胞与Dar2.5-Ps-Cy5和Ps-Cy5孵育4 h后均未出现明显的Cy5红色荧光（图3）。这些结果表明ATRA联合Dar-Ps-Cy5，促进其高效内吞及细胞内递送。
实施例四 Dar-Ps-Vol的细胞毒性实验
研究了不同靶向密度的Dar-Ps-Vol在ATRA刺激前后的MV4-11和MOLM-13-Luc细胞中的靶向性及细胞毒性。将80 μL ATRA刺激（1 μM，48 h）的MV4-11或MOLM-13-Luc细胞悬液加入96孔培养板中（每孔1.5 × 104个细胞），然后向每孔分别加入20 μL不同Dar表面密度的Dar-Ps-Vol、Ps-Vol及游离Vol，Vol的孔内浓度设定为1、5、10、20、40、60、100和250 ng/mL。在培养箱中（37 ºC、5% CO2）孵育48 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4h，并使用酶标仪测定每孔在450 nm处的OD值。对于无ATRA刺激的细胞而言，将细胞以1.5× 104个/孔的密度铺于96孔板中，分别加入最佳靶向密度的Dar-Ps-Vol和Ps-Vol（Vol浓度同上）培养48 h，随后加入CCK-8溶液孵育4 h后用酶标仪检测450 nm处的吸光值。实验平行进行六组（mean ± SD，n = 6）。图4为不同靶向密度的Dar-Ps-Vol囊泡纳米药物的细胞毒性结果图。结果表明，联合ATRA的MV4-11细胞中，不同Dar表面密度的Dar-Ps-Vol均具有强效的抗AML活性，其中以Dar2.5-Ps-Vol的活性最强，半数抑制浓度（IC50）为10.1 ng/mL，相比非靶向的Ps-Vol（IC50：39.8 ng/mL）和游离Vol（IC50：49.8 ng/mL）分别降低了3.9倍和4.9倍。类似地，Dar-Ps-Vol在联合ATRA的MOLM-13-Luc细胞中也产生了强效的抑制效果，Dar2.5-Ps-Vol的IC50为29.1 ng/mL，相比非靶向的Ps-Vol（IC50：67.7 ng/mL）和游离Vol（IC50：87.5 ng/mL）分别降低了2.3倍和3.0倍。相反，在未联合ATRA的MV4-11和MOLM-13-Luc中，Dar2.5-Ps-Vol的毒性与Ps-Vol相当，IC50分别为39.1 ng/mL和62.3 ng/mL。对于正常的L929小鼠成纤维细胞而言，即使在Vol浓度高达300 ng/mL时，Ps-Vol和Dar-Ps-Vol 也未产生明显的细胞毒性。重要的是，空囊泡Ps和Dar2.5-Ps对MV4-11和MOLM-13-Luc细胞均无抑制作用，细胞存活率在100%左右。此外，ATRA本身在浓度高达1500 ng/mL（5 μM）时对MV4-11细胞也没有明显的毒性（图5）。
两亲性嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-KD15更换为PEG-P(TMC-DTC)-KD10、PEG-P(TMC-DTC)-KD5、PEG-P(CL-DTC)-KD15、PEG-P(LA-DTC)-KD15，N3-PEG-P(TMC-DTC)更换为N3-PEG-P(CL-DTC)、N3-PEG-P(LA-DTC)、Mal-PEG-P(TMC-DTC)、NHS-PEG-P(TMC-DTC)等，得到Dar靶向Vol囊泡纳米药物联合ATRA，对MOLM-13-Luc细胞也产生了强效的抑制效果。
以下实施例中Dar-Ps-Vol均是指Dar2.5-Ps-Vol囊泡纳米药物，Dar-Ps-Cy5均为Dar2.5-Ps-Cy5。
实施例五 Dar-Ps-Vol的PLK1蛋白抑制、细胞周期阻滞与凋亡实验
通过蛋白印迹实验评估了Ps-Vol和Dar-Ps-Vol对PLK1蛋白的抑制情况。将MV4-11细胞铺在6孔板（4 × 105个/孔）中，分别加入200 μL Ps-Vol、Dar-Ps-Vol和游离Vol，Vol的终浓度为20 ng/mL，在37 ºC下孵育48 h。之后用RIPA裂解液裂解细胞，然后在冰上孵育15 min，离心15 min（12000 rpm）后，收集上清液，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。在蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液煮沸5 min使蛋白质样品变性，然后加入SDS-PAGE凝胶（10%）上进行电泳。电泳完成后转移至PVDF膜，将膜放入含有5%脱脂奶粉的TBST溶液中于室温封闭1 h。之后根据marker剪膜，将不同位置的膜分别放入含有PLK1抗体（sc-17783，Santa Cruz Biotechnology Inc.）和GAPDH抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）的封闭液中，并在4 ºC下孵育过夜。膜用TBST洗涤三遍后放入HRP标记的山羊抗兔第二抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）孵育60 min。用TBST洗涤三遍后显影并通过Image J软件进行分析。结果显示（图6A、B），在未刺激的MV4-11细胞中，Dar-Ps-Vol、Ps-Vol以及游离Vol对PLK1蛋白的沉默效果均比较微弱，沉默效率在25%左右。联合ATRA的细胞中，Dar-Ps-Vol显示出明显的PLK1蛋白沉默效果，沉默效率达到74.5%，显著优于Ps-Vol组。
Dar-Ps-Vol诱导MV4-11细胞周期阻滞的情况采用细胞周期试剂盒，并通过流式细胞仪测试。将MV4-11细胞及ATRA刺激后的MV4-11细胞以5 × 105个/孔的密度铺在6孔板中，分别加入Ps-Vol、Dar-Ps-Vol和游离Vol（Vol的孔内浓度为20 ng/mL），只加PBS的细胞作为对照。放入培养箱孵育24 h后，离心（800 rpm，5 min）收集细胞，并用冰PBS洗涤两遍。用PBS重悬细胞，将1 mL细胞悬液逐滴加入涡旋中的3 mL冰无水乙醇中，置于4 ºC固定过夜。之后离心弃去乙醇。加入PI染液重悬细胞，在37 ºC下染色30 min后上机检测。结果显示（图6C），在未刺激的MV4-11细胞中，游离Vol、Ps-Vol和Dar-Ps-Vol组细胞G2/M期的比例分别为29.5%、35.0%和35.1%，与PBS组（10.2%）相比有一定的增加，但增加幅度较小。然而，在联合ATRA的MV4-11细胞中，Dar-Ps-Vol组细胞的G2/M期占比增加至63.4%，Ps-Vol组相比未刺激的细胞（32.4%）无明显变化。
Dar-Ps-Vol诱导MV4-11细胞的凋亡实验采用细胞凋亡试剂盒Annexin V-APC/7-AAD，并通过流式细胞仪测试。以Ps-Vol和游离Vol作为对照。将MV4-11细胞及ATRA刺激后的MV4-11细胞以4 × 105个/孔的密度铺在6孔板中，分别加入Ps-Vol、Dar-Ps-Vol和游离Vol（Vol的孔内浓度为20 ng/mL），只加PBS的细胞作为对照。放入培养箱孵育48 h后，离心（800rpm，5 min）收集细胞，并用冰PBS洗涤一遍。将其中两个PBS组的细胞分别重悬于200 μL结合缓冲液（Binding buffer）中，每组取100 μL细胞悬液，加入500 μL阳性对照液（Positivecontrol solution）室温孵育30 min，之后分别与相应未处理的100 μL细胞悬液混合均匀作为单染阳性对照。对于单染早凋，取一组的细胞悬液加入5 μL Annexin V-APC染色；对于单染晚凋，取另一组的细胞悬液加入10 μL 7-AAD染色。其余各组样品均加入200 μLBinding buffer重悬细胞（细胞密度约为106个/mL），吹打均匀后转移至流式管内。各样品组依次加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD溶液，室温避光染色15 min后，再加入400μL Binding buffer混合均匀，1 h内上机检测。结果显示，ATRA本身没有促细胞凋亡作用，在未刺激的MV4-11细胞中，Ps-Vol和Dar-Ps-Vol处理后细胞的凋亡率分别为11.6%和13.2%，二者较为接近（图7）。然而，在联合ATRA的细胞中，Dar-Ps-Vol处理导致45.4%的细胞发生凋亡，Ps-Vol对照组则仍然只有14.9%的细胞发生凋亡，与刺激前的水平相当。这些结果综合表明，联合ATRA可以增强Dar-Ps-Vol抑制细胞内PLK1蛋白的能力，从而导致G2/M期的细胞阻滞增加，促进MV4-11的细胞凋亡，凋亡率相比非靶向Ps-Vol对照组增加了3倍以上。
实施例六 Dar-Ps-Cy5的病人原代细胞内吞
病人骨髓标本由苏州大学附属第一医院提供，选取2名确诊为AML病人的骨髓样本，使用流式细胞仪分选出其中的CD34阳性细胞，然后在体外培养，培养基为IMDM（含10%FBS、1% 双抗、25 ng/mL IL-6、5 ng/mL IL-3、50 ng/mL SCF、10 ng/mL FLT3）。培养时取部分细胞在培养基中加入ATRA（终浓度1 μM），培养48 h后按前述方法测定细胞表面CD38表达情况、Ps-Cy5及Dar-Ps-Cy5的内吞情况。未给予ATRA刺激的细胞作为对照。结果参见图8。以上结果表明ATRA联合Dar-Ps-Cy5具有一定的普适性，本发明有应用于临床的可能性，这为该纳米药物进入临床前研究提供了一些参考。
实施例七 Dar-Ps-Vol的急性毒性实验
体内急性毒性实验采用6周龄昆明鼠（19-21 g，常州卡文斯实验动物有限公司）进行。将小鼠按体重平均分为4组，每组10只小鼠，雌雄各半。将Dar-Ps-Vol通过尾静脉单次注射入小鼠体内，设定Vol的剂量分别为9、27、45和54 mg/kg，注射后14天内每天观察小鼠活动状态并记录每只小鼠的体重。在注射药物后第5天，每组随机取4只小鼠（2雌2雄）采血检测血常规，另用4只未给药的健康小鼠作为对照。研究发现，当Vol的剂量为9、27和45 mg/kg时，小鼠对Dar-Ps-Vol的耐受性较好，其在14天观察期内体重保持稳定增长（图9），且表现活泼，行动敏捷，毛色、肤色正常，未出现其它不良症状。当Vol的剂量继续增大至54 mg/kg时，小鼠在给药后第3天出现了明显的体重下降，且活动较为迟缓，毛色变暗，第7天时其中一只小鼠死亡，其余小鼠体重逐渐回升，第14天时体重与其余三组相当，且行动恢复正常，与其它组小鼠无异。血常规结果显示Dar-Ps-Vol各剂量给药组的白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）、血红蛋白（HGB）、红细胞比容（HCT）和平均红细胞体积（MCV）与健康小鼠相比均未见明显异常。根据之前的研究，自由vol出现了给药过程中的急性死亡。
实施例八 荷原位AML小鼠模型的构建
所有动物实验及操作均获得苏州大学实验动物中心和苏州大学动物护理和使用委员会的批准。原位AML模型采用6周龄的B-NDG雌性小鼠（19-21 g，百奥赛图江苏基因生物技术有限公司）建立：小鼠经过适应性饲养后，将MV4-11或MOLM-13-Luc细胞的PBS悬液（均为5 × 105个/只）通过尾静脉注射到小鼠体内，完成建模。
实施例九 Dar-Ps-Cy5在荷原位MV4-11 AML模型小鼠中的抗肿瘤实验
为了研究Dar-Ps-Vol联合ATRA（+A Dar-Ps-Vol）对荷原位MV4-11 AML小鼠的抗肿瘤效果，在接种后第3天根据平均体重随机分组，开展治疗实验。给药方案为PBS、+A freeVol、+A Ps-Vol、+A Dar-Ps-Vol以及Dar-Ps-Vol，其中游离Vol用羟丙基-β-环糊精助溶。ATRA的剂量为10 mg/kg，通过腹腔注射，Vol的剂量为9 mg/kg，通过尾静脉注射。每组8只小鼠，5只用于观察生存期，3只用于浸润分析。以接种日为第0天，在第3、6、9、12天通过尾静脉注射不同剂型的Vol药物，其中ATRA刺激组在每次给药前两天通过腹腔注射ATRA（溶于玉米油中，2 mg/mL）。在治疗期间每2天记录一次小鼠体重，治疗结束后继续监测小鼠状态、观察生存期。研究发现PBS组小鼠病情进展迅速，在接种后第22天时开始出现体重下降、行动迟缓、后肢瘫痪等症状，第25天时开始有小鼠死亡，第29天时小鼠全部死亡，中位生存期为27天。游离Vol和Ps-Vol发挥了一定的肿瘤抑制效果，中位生存期分别为32和43天。在没有联合ATRA时，Dar-Ps-Vol的治疗效果与非靶向的Ps-Vol相当，中位生存期为46天。然而，在ATRA的联合作用下，Dar-Ps-Vol显著抑制了小鼠体内的AML细胞增殖，大幅延长了小鼠的生存期，其中位生存期为140天，约是PBS组的5.2倍之长，相比+A free Vol、+A Ps-Vol和Dar-Ps-Vol组也延长了3.1-4.4倍。接受+A Dar-Ps-Vol治疗的小鼠中有40%治愈并在170天后仍然存活（图10）。这些结果表明，联合ATRA可高效增加Dar-Ps-Vol在荷原位MV4-11 AML小鼠模型中的靶向性，强效抑制肿瘤增殖并大幅延长了小鼠的生存期。各组小鼠在治疗期间和结束后体重未出现明显下降，表明ATRA联合Dar-Ps-Vol策略具有较好的安全性。
在接种后第25天左右PBS组小鼠临近死亡时，每组各取3只小鼠解剖，收集外周血、肝脏、脾脏及后腿骨，研磨后加入APC-anti-human-CD45抗体标记白血病细胞并通过流式细胞仪检测小鼠各器官的白血病细胞浸润情况。结果显示，PBS组小鼠的肝脏（Liver）、脾脏（Spleen）、骨髓（Bone marrow）及外周血（Peripheral blood）中均有明显的白血病细胞浸润，白血病细胞占比分别为45.0%、19.0%、16.7%和12.4%（图11），表明MV4-11 AML模型累及多个器官。值得注意的是，+A Dar-Ps-Vol治疗后显著降低了小鼠的白血病负担，肝脏、脾脏、骨髓及外周血中没有明显的白血病浸润，浸润率为0.1%-0.9%。+A free Vol和+A Ps-Vol 治疗组虽然部分降低了肝脏、脾脏、骨髓和外周血中的白血病浸润，但仍然显著高于+ADar-Ps-Vol组。这些结果综合表明ATRA刺激大幅增加了Dar-Ps-Vol在原位AML小鼠模型中的靶向治疗效果，有效抑制了白血病细胞在小鼠体内的增殖及器官浸润，从而显著延长了小鼠的生存期。
通过H&E染色进行组织学分析，结果显示，PBS组小鼠的肝脏和脾脏中均可见明显的AML细胞浸润，游离Vol组和ATRA+Ps-Vol组小鼠的肝脏和脾脏中浸润稍少，而ATRA +Dar-Ps-Vol组的肝脏和脾脏中未见AML细胞，肝细胞形态正常、均一，排列紧密有序，脾脏红髓丰富，免疫细胞密集分布（图12）。胫骨和股骨的H&E染色结果显示，PBS和游离Vol组小鼠的骨髓中可见大量的AML细胞浸润，且出现造血干细胞减少，骨髓空腔严重，而ATRA + Dar-Ps-Vol组的骨髓中未见AML细胞，骨髓造血干细胞形态和数量正常。此外，各组小鼠的心、肺、肾均未见明显异常。
实施例十 Dar-Ps-Vol在荷原位MOLM-13-Luc AML小鼠中的抗肿瘤效果
为了进一步研究Dar-Ps-Vol联合ATRA在原位AML小鼠中的抗肿瘤效果，通过尾静脉注射MOLM-13-Luc细胞构建了荷原位MOLM-13-Luc小鼠模型并进行了抗AML研究。给药组别分别为PBS、ATRA + Ps-Vol（+A Ps-Vol）和ATRA + Dar-Ps-Vol（+A Dar-Ps-Vol），给药方案与MV4-11模型相同。研究发现（图13），PBS组小鼠肿瘤生长迅速，第17天开始出现体重下降，双腿瘫痪等症状，第18天开始有小鼠死亡，中位生存期仅有21天，Ps-Vol发挥了一定的治疗效果，将中位生存期略微延长至26天。然而在ATRA联合作用下，Dar-Ps-Vol组小鼠的状态较好，生存期得到了显著延长，中位为52天，100天后仍然有20%的小鼠存活，且体重无明显下降。
本发明载分子靶向药物聚合物囊泡与全反式维甲酸联合的策略在急性髓系白血病治疗中的应用效果优异，促进分子靶向药物聚合物囊泡靶向结合急性髓系白血病细胞，释放药物发挥抗白血病活性。

Claims (10)

1.载分子靶向药物聚合物囊泡，由两亲性嵌段聚合物、官能团化两亲性嵌段聚合物、分子靶向药物、靶向分子制备，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物为A-P(B-DTC)-KDz，官能团化两亲性嵌段聚合物为G-A-P(B-DTC)，其中A为亲水链段，B为酯单体单元，G为官能团；所述分子靶向药物为伏拉塞替或者奎扎替尼。
2.根据权利要求1所述载分子靶向药物聚合物囊泡，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物中，亲水链段的分子量为2000～15000 Da；疏水链段分子量为亲水链段分子量的2.0～8.0倍；PDTC的分子量为疏水链段总分子量的10%～40%。
3.根据权利要求1所述载分子靶向药物聚合物囊泡，其特征在于，所述靶向分子为靶向单抗；亲水链段为聚乙二醇链段。
4.权利要求1所述载分子靶向药物聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，以分子靶向药物、两亲性嵌段聚合物、官能团化两亲性嵌段聚合物、靶向分子为原料，通过溶剂置换法及后修饰单抗制备载分子靶向药物聚合物囊泡。
5.权利要求1所述载分子靶向药物聚合物囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1所述载分子靶向药物聚合物囊泡与全反式维甲酸在制备联合抗肿瘤药物中的应用。
7.全反式维甲酸在制备提高权利要求1所述载分子靶向药物聚合物囊泡药效的试剂中的应用。
8.根据权利要求5、权利要求6或者权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为血液瘤。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为白血病。
10.根据权利要求6或者权利要求7所述的应用，其特征在于，全反式维甲酸、权利要求1所述载分子靶向药物聚合物囊泡贯序给药。
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WO2024235298A1 (zh) * 2023-05-17 2024-11-21 苏州大学 一种共载药物的聚合物囊泡及其制备方法与应用

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