CN116473116B

CN116473116B - 异常威克汉姆酵母防治桃果采后褐腐病、曲霉病、软腐病及贮藏保鲜的方法

Info

Publication number: CN116473116B
Application number: CN202310495942.0A
Authority: CN
Inventors: 赵利娜; 周娅丽; 陈夕飞; 张红印; 张晓云
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2023-05-05
Filing date: 2023-05-05
Publication date: 2024-12-17
Anticipated expiration: 2043-05-05
Also published as: CN116473116A

Abstract

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及异常威克汉姆酵母防治桃果果实采后褐腐病、曲霉病、软腐病及贮藏保鲜的方法；步骤为：首先制备浓度为1×10⁸cells/mL的酵母菌悬液；选取桃果经消毒、冲洗、晾干后分为三组，在桃果表面打孔后注入酵母菌悬液，一段时间后在三组桃果的孔中分别注入与酵母菌悬液等体积的美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉、匍枝根霉孢子悬浮液，实现对桃果褐腐病、曲霉病、软腐病的有效控制；或者直接将酵母菌悬液均匀喷洒在桃果表面，自然晾干，即可实现桃果采后自然病害的防治和贮藏保鲜的目的；本发明在有效控制病害的同时对桃果采后主要品质指标无不良显著影响，操作方便且安全环保，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

异常威克汉姆酵母防治桃果采后褐腐病、曲霉病、软腐病及贮藏保鲜的方法

技术领域

本发明属于水果采后病害生物防治技术领域，具体涉及异常威克汉姆酵母对桃果采后病害防治的方法。

背景技术

桃(Prunus persica)为蔷薇科、桃属植物，其果实不仅鲜美多汁，色泽艳丽，而且营养丰富，富含多酚、可溶性糖、有机酸、维生素、矿物质和膳食纤维等多种营养物质，拥有较高的食用及药用价值，深受广大消费者喜爱。我国是世界最大的桃生产国，桃果主要用于制作罐头、果酒、果酱和蜜饯等，具有很大的经济开发价值和广阔的市场远景。桃果是典型的呼吸跃变型水果，采后代谢十分旺盛，其果实肉多皮薄，在采后易受到机械损伤，引起病原菌的侵染，加速腐烂变质的进程，降低桃果实的商品和食用价值，对桃果产业造成巨大的经济损失。桃果采后病害主要有因果实衰老、环境温度等引起的果肉褐变、软化、冷害等生理性病害，以及由果生链核盘菌(Monilinia spp.)、黑曲霉(Aspergillus nige)、青霉(Penicillium spp.)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和根霉(Rhizopus spp.)等真菌侵染引起的褐腐病、曲霉病、青霉病、灰霉病、软腐病等侵染性病害。

针对水果采后病害控制的方法主要有物理方法和化学方法。各种采后病害防治方法可以在一定程度上保持果实品质，提高果实的贮藏期和经济价值。目前，最常用的控制桃果采后病害的方法是使用化学杀菌剂，其具有价格便宜、效率高、方便等优点。然而，化学杀菌剂的持续使用可能会导致病原菌产生耐药性和农药残留，对人体和环境造成危害，使其应用受到极大的限制。物理方法主要包括冷藏、热处理(热水处理和热空气处理)、辐射等，这些方法操作简易、效果较好，但往往需要特定的设备或者存在降低水果感官品质和理化性质发生不良变化等缺点，因此实际应用受到很大限制。生物防治法是利用微生物之间的拮抗作用，选用无害的微生物抑制病原菌的生长，与物理方法、化学方法相比，其安全无害、无副作用且具有良好的防治作用。迄今为止，国内外已经筛选出了许多对水果采后病原真菌具有明显抑菌效果的细菌、霉菌和酵母菌。其中酵母菌具有可快速增殖、不产生抗生素、不产生真菌毒素、遗传稳定且安全性高等优点，受到广泛关注。

然而，大多数拮抗酵母菌有抑菌谱窄、使用效果不稳定等不足之处，而且控制病害也比较单一；因此提供一种能有效控制桃果采后多种病害，减缓果实自然腐烂，延长果实货架期，保持果实营养价值和感官品质的方法十分必要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于异常威克汉姆酵母对桃果采后病害防治及贮藏保鲜的方法，能够有效控制桃果采后褐腐病、曲霉病、软腐病，减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。

为了实现以上目的，本发明提供方案如下：

异常威克汉姆酵母可从中国典型培养物保藏中心获取，保藏信息具体如下：异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)；保藏编号为：CCTCC M2018053；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，第一附小对面。

本发明提供了防治桃果采后褐腐病、曲霉病、软腐病及贮藏保鲜的方法，具体步骤如下：

将异常威克汉姆酵母接种于NYDB培养基中进行活化培养，活化培养后经离心得到菌体沉淀，将菌体沉淀用无菌水离心洗涤，再将洗涤后的菌体沉淀用无菌生理盐水稀释得到浓度为1×10⁸cells/mL的酵母菌悬液；选取无病害、无机械损伤、大小均匀的桃果进行消毒处理，然后经冲洗、晾干，得到晾干后的桃果，将其分为三组，依次记为A组、B组和C组，然后在A组、B组和C组桃果表面用无菌打孔器进行打孔，并在每孔分别注入一定体积的酵母菌悬液，自然晾干一段时间后，再于A组、B组和C组每孔分别接种与酵母菌悬液等体积的美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉和匍枝根霉孢子悬浮液，其中美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉孢子悬浮液的浓度为1×10⁵spores/mL，匍枝根霉孢子悬浮液的浓度为1×10⁴spores/mL，由此验证异常威克汉姆酵母能够同时对由美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉、匍枝根霉引起的桃果果实褐腐病、曲霉病、软腐病进行有效防治；

或者不对桃果进行消毒处理，保持桃果的自然状况放入塑料筐中，将酵母菌悬液均匀喷洒于桃果表面，待桃果自然晾干后，用保鲜膜密封，置于恒温恒湿培养箱中保存，即可实现对桃果采后自然病害的防治及贮藏保鲜的用途。

其中，所述的NYDB培养基(以1L计)为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。

其中，所述异常威克汉姆酵母接种于NYDB培养基的接种量为1％，即接种体积比为1:100。

其中，所述活化培养的条件为：温度28℃，转速180rpm，时间20～24h。

其中，所述离心的条件为：离心力为10000g，时间5-10min。

其中，所述无菌生理盐水的质量浓度为0.85％。

其中，所述桃果消毒处理的操作为：将桃果浸入含有0.5％次氯酸钠溶液的水溶液中消毒1～5min。

其中，所述打孔的孔直径5mm，深度4mm；所述一段时间为2h。

其中，所述在孔中注入酵母菌悬液和孢子悬浮液的体积均为30μL。

其中，所述恒温培养箱的条件为：25℃，RH 95％。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的异常威克汉姆酵母为本实验室筛选，其拮抗效力强，对人体无害。经研究证明可达到水果贮藏保鲜的目的，实现了意想不到的突出效果。

(2)本发明提供的异常威克汉姆酵母对桃果采后病害防治及贮藏保鲜的方法，可以控制桃果采后褐腐病、曲霉病、软腐病，降低桃果采后的自然腐烂率的同时对桃果品质无不良影响；其对采后桃果主要品质指标，如失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸以及抗坏血酸与对照组相比，无任何不良显著影响，且有减缓品质指标降低的效果，如经过酵母处理的桃果维生素C含量显著提高。

(3)本发明使用异常威克汉姆酵母既可以代替化学杀菌剂防治桃果采后病害，避免化学杀菌剂对人体及环境的潜在危害，也可减少使用物理杀菌贮藏所产生的经济和能源负担，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为不同浓度的异常威克汉姆酵母对桃果采后由美澳型核果褐腐病菌引起的褐腐病腐烂率的影响；注：CK代表无菌水处理；Y5、Y6、Y7、Y8、Y9分别代表异常威克汉姆酵母的浓度为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹cells/mL；不同小写字母代表不同处理之间差异显著(P<0.05)。

图2为不同浓度的异常威克汉姆酵母对桃果采后由美澳型核果褐腐病菌引起的褐腐病腐烂直径的影响；注：CK代表无菌水处理；Y5、Y6、Y7、Y8、Y9分别代表异常威克汉姆酵母的浓度为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹cells/mL；不同小写字母代表不同处理之间差异显著(P<0.05)。

图3为不同浓度的异常威克汉姆酵母对桃果采后由黑曲霉引起的曲霉病腐烂率的影响；注：CK代表无菌水处理；Y5、Y6、Y7、Y8、Y9分别代表异常威克汉姆酵母的浓度为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹cells/mL；不同小写字母代表不同处理之间差异显著(P<0.05)。

图4为不同浓度的异常威克汉姆酵母对桃果采后由黑曲霉引起的曲霉病腐烂直径的影响；注：CK代表无菌水处理；Y5、Y6、Y7、Y8、Y9分别代表异常威克汉姆酵母的浓度为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹cells/mL；不同小写字母代表不同处理之间差异显著(P<0.05)。

图5为不同浓度的异常威克汉姆酵母对桃果采后由匍枝根霉引起的软腐病腐烂率的影响；注：CK代表无菌水处理；Y5、Y6、Y7、Y8、Y9分别代表异常威克汉姆酵母的浓度为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹cells/mL；不同小写字母代表不同处理之间差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明；以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

实施例1：

拮抗酵母菌说明；酵母保藏名称：异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)；保藏编号为：CCTCC M2018053；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

培养程序为：(1)液体活化培养：取保存于甘油管中的异常威克汉姆酵母接种在NYDB培养基中进行第一次活化培养，得到活化液；然后，吸取活化液转接入新的NYDB培养基中，进行第二次活化培养；两次活化培养的接种量均为1％，培养条件均为28℃、180rpm条件下培养24h；(2)活化培养后离心收集菌体，用无菌水离心清洗两遍以除去培养基，清洗后的菌体用无菌生理盐水重悬，用血球计数板调节酵母细胞浓度为1×10⁸cells/mL。

实施例2：

果实预处理

试验品种为桃(Prunus persica)，选用商业成熟度良好、表面没有破损、无病害感染、无机械损伤、大小均匀的桃果。自来水冲洗表面，然后用0.5％(v/v)次氯酸钠(NaClO)进行表面消毒5min，自来水冲洗除去残留的次氯酸钠，摆放在塑料筐中晾干备用。

实施例3：

霉菌选择为感染桃果的常规病菌，具体选择为：美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉和匍枝根霉；使用前活化步骤如下：(1)取1mL的霉菌孢子悬浮液接种到灭菌PDB培养基中，在恒温摇床(180rpm，25℃)下培养24-48h。(2)取适量的霉菌在PDA培养基上划线，于恒温恒湿箱中培养7d，取平板上的霉菌孢子于无菌生理盐水中，采用双目显微镜调整到所需浓度。

实施例4：

异常威克汉姆酵母对桃果采后由美澳型核果褐腐病菌引起的褐腐病的控制效果。

(一)试验方案

在每个桃果赤道处用无菌打孔器制得等距离的3个伤口(直径5mm×深度4mm)，分别向伤口中注入30μL(1)经NYDB培养基培养的酵母悬浮液(1×10⁸cells/mL)；(2)无菌水作为对照。室温放置2h后，分别向伤口中注入30μL的美澳型核果褐腐病菌孢子悬浮液(1×10⁵spores/mL)；室温晾干后置于恒温恒湿培养箱(25℃，RH 95％)中保存，4d后观察桃果的腐烂情况，记录腐烂率及腐烂直径；每种处理3个平行，每个平行12个桃果，试验重复三次。

发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

(二)试验结果

按照上述试验步骤，统计水果的腐烂率和病斑直径结果如下：

如图1所示，不同浓度的异常威克汉姆酵母处理均降低了桃果采后病害的发病率，其中1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理效果尤为显著。在贮藏4d后，对照组的腐烂率达到67％，而1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理组发病率仅为19％。

如图2所示，无菌水处理的对照组桃果病斑直径为41.14mm，而1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理组的桃果病斑直径仅有28.61mm。

实施例5：

异常威克汉姆酵母对桃果采后由黑曲霉引起的曲霉病的控制效果

(一)试验方案

在每个桃果赤道处用无菌打孔器制得等距离的3个伤口(直径5mm×深度4mm)，分别向伤口中注入30μL(1)经NYDB培养基培养的酵母悬浮液(1×10⁸cells/mL)；(2)无菌水作为对照。室温放置2h后，分别向伤口中注入30μL的黑曲霉孢子悬浮液(1×10⁵spores/mL)；室温晾干后置于恒温恒湿培养箱(25℃，RH 95％)中保存，5d后观察桃果的腐烂情况，记录腐烂率及腐烂直径；每种处理3个平行，每个平行12个桃果，试验重复三次。

发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

(二)试验结果

如图3所示，不同浓度的异常威克汉姆酵母处理均降低了桃果采后曲霉病的发病率，其中1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理效果尤为显著。在贮藏5d后，对照组的腐烂率达到92％，而1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理组发病率仅为41％。

如图4所示，无菌水处理的对照组桃果病斑直径为41.05mm，而1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理组的桃果病斑直径仅有17.94mm。

实施例6：

异常威克汉姆酵母对桃果采后由匍枝根霉引起的软腐病的控制效果

(一)试验方案

在每个桃果赤道处用无菌打孔器制得等距离的3个伤口(直径5mm×深度4mm)，分别向伤口中注入30μL(1)酵母悬浮液(1×10⁸cells/mL)；(2)无菌水作为对照。室温放置2h后，分别向伤口中注入20μL的匍枝根霉孢子悬浮液(1×10⁴spores/mL)；室温晾干后置于恒温恒湿培养箱(25℃，RH 95％)中保存，3d后观察桃果的腐烂情况，记录腐烂率及腐烂直径；每种处理3个平行，每个平行12个桃果，试验重复三次。

发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

(二)试验结果

如图5所示，不同浓度的异常威克汉姆酵母处理均降低了桃果采后软腐病的发病率，其中1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理效果尤为显著。在贮藏3d后，对照组的腐烂率达到100％，而1×10⁸cells/mL的异常威克汉姆酵母处理组发病率仅为8％。

实施例7：

异常威克汉姆酵母对桃果采后自然腐烂及贮藏品质的影响

(一)试验方案

选用无机械损伤，大小均一且处于正常商业成熟度的桃果进行试验，桃果采摘后保持自然状况，分为三组，置于塑料筐中，直接在其表面喷洒(1)1×10⁸cells/mL的酵母悬浮液(处理组：Y)；(2)无菌水(对照组，CK)。自然晾干后，用保鲜膜密封，置于恒温恒湿培养箱(25℃，RH 95％)中保存，6d后测定果实的自然发病率和果实自然贮藏品质相关指标。每种处理3个平行，每个平行12个桃果，试验重复三次。异常威克汉姆酵母对桃果自然腐烂的抑制效果以发病率表示。

(1)发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

(2)贮藏品质测定方法如下：

1.失重率：失重率＝(处理前质量-储藏后质量)/处理前质量×100％

2.可溶性固形物(TSS)：用手持式糖量计测定，采用手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。实验重复三次。

3.可滴定酸(TA)：取用20g果肉与30mL蒸馏水一起匀浆，置于80℃水浴浸提30min后定容至100mL，过滤得到滤液。取30mL滤液，滴入酚酞指示剂2-5滴，用标准溶液(0.1MNaOH)进行滴定，滴定至溶液初显粉色并在30s内不褪色时为滴定终点，结果以苹果酸的百分数表示。实验重复三次。

4.抗坏血酸(Vc)：取20g果肉与少量20g/L草酸溶液混合，冰浴研磨匀浆后转移到50mL容量瓶，用草酸定容至刻度，提取10min。10000g，4℃条件下离心30min，取上清液进行滴定。准确吸取10mL上清液于50mL锥形瓶中，用已标定的2，6-二氯靛酚溶液滴定至出现微红、且15s不褪色为止，记录下染料用量，以10mL草酸为空白。重复三次。结果以100g样品(鲜重)中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。

5.褐变度：取20g果肉与40mL蒸馏水一起匀浆，10000g，4℃条件下离心10min，取上清液10mL，加入95％乙醇15mL，10000g，4℃条件下离心10min，取上清液于420nm处测吸光度值，以此表示褐变度。

6.硬度(N)：采用TA-XT2 Plus质构分析仪测试，选用P5探针，参数设定为“压力测量”模式，速度为1mm/s，测试深度为5mm。选定赤道处等距离的三个点进行测试。探头插入桃果时所受的最大阻力(单位为N)就被定义为桃果的硬度。实验重复三次。

(二)试验结果

表1异常威克汉姆酵母处理对桃果自然病害发生及贮藏品质的影响

注：CK为无菌水处理的对照组，Y为1×10⁸cell/mL异常威克汉姆酵母悬浮液喷洒处理。数值为三次独立试验的平均值±标准差，不同字母代表差异显著性(P＜0.05)

如表1所示，在25℃下贮藏6d后，经异常威克汉姆酵母处理的桃果自然病害发生率显著降低，仅为27.084％，而无菌水喷洒的桃果自然病害发生率是47.917％。

在贮藏品质方面，失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸等指标与对照组相比，无任何显著不良变化，而异常威克汉姆酵母处理组的维生素C含量高于对照组。因此，可以认为经异常威克汉姆酵母处理能够降低桃果的自然病害发生率，而对桃果的贮藏品质无显著不良影响。

异常威克汉姆酵母的保存：可以选择使用NYDA培养基在4℃冰箱保藏，也可以选择将酵母于-80℃下长期保存于50％甘油管中。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims

1.异常威克汉姆酵母用于防治桃果采后褐腐病、曲霉病、软腐病及贮藏保鲜的用途，其特征在于，具体步骤如下：

将异常威克汉姆酵母接种于NYDB培养基中进行活化培养，活化培养后经离心得到菌体沉淀，将菌体沉淀用无菌水离心洗涤，再将洗涤后的菌体沉淀用无菌生理盐水稀释得到浓度为1×10⁸ cells/mL的酵母菌悬液；选取无病害、无机械损伤、大小均匀的桃果进行消毒处理，然后经冲洗、晾干，得到晾干后的桃果，将其分为三组，依次记为A组、B组和C组，然后在A组、B组和C组桃果表面用无菌打孔器进行打孔，并在每孔分别注入一定体积的酵母菌悬液，自然晾干一段时间后，再于A组、B组和C组每孔分别接种与酵母菌悬液等体积的美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉和匍枝根霉孢子悬浮液，其中美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉孢子悬浮液的浓度为1×10⁵ spores/mL，匍枝根霉孢子悬浮液的浓度为1×10⁴ spores/mL，由此验证异常威克汉姆酵母同时对由美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉、匍枝根霉引起的桃果果实褐腐病、曲霉病、软腐病进行有效防治；

或者不对桃果进行消毒处理，保持桃果的自然状况放入塑料筐中，将酵母菌悬液均匀喷洒于桃果表面，待桃果自然晾干后，用保鲜膜密封，置于恒温恒湿培养箱中保存，即实现对桃果采后自然病害的防治及贮藏保鲜的目的；

所述的异常威克汉姆酵母，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2018053。

2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NYDB培养基的组分为，以1L计：酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH自然，115 ℃灭菌20 min。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述异常威克汉姆酵母接种于NYDB培养基的接种量为1%，即接种体积比为1:100。

4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述活化培养的条件为：温度28 ℃，转速180 rpm，时间20 ~ 24 h。

5. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述离心的条件为：离心力为 10000 g，时间5~10 min。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述无菌生理盐水的质量浓度为0.85%。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述桃果消毒处理的操作为：将桃果浸入含有0.5%次氯酸钠溶液的水溶液中消毒5min。

8. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述打孔的孔直径5 mm，深度4mm；所述一段时间为2 h。

9. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述在孔中注入酵母菌悬液和美澳型核果褐腐病菌、黑曲霉、匍枝根霉孢子悬浮液的体积均为30 μL。

10. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述恒温恒湿培养箱的条件为：25 ℃，RH 95 %。