CN116463453A - 基于菘蓝全基因组开发的ssr引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于菘蓝全基因组开发的SSR引物组及其应用。本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于菘蓝全基因组开发的SSR引物组及其应用。本发明提供的菘蓝的SSR分子标记引物组合物，包括8对引物中的至少1对，8对引物名称为SSRSL01、SSRSL02、SSRSL03、SSRSL04、SSRSL05、SSRSL06、SSRSL07和SSRSL08，8对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1‑SEQ ID No.16所示。本研究利用SSR标记检测了不同菘蓝品种的遗传多样性，可以有效区分菘蓝不同栽培类型的差距，实验结果精确、可靠，可用于菘蓝栽培类型的鉴定、遗传多样性分析及良种选育等方面。

Description

基于菘蓝全基因组开发的SSR引物组及其应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于菘蓝全基因组开发的SSR引物组及其应用。

背景技术

简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)，其特征是一个串联重复的短(核苷酸数目为1-6)DNA序列，其广泛分布于真核生物整个基因组中。由于6种核苷酸以不同顺序及次数组成重复基序，因此其具有重复性、多态性、丰富性、共显性等特点，成为遗传分析中一种常见的分子标记技术，在植物的品种鉴定、遗传图谱构建等方面有广泛应用。

菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是十字花科菘蓝属，二年生草本植物。《中国药典》规定菘蓝为药材板蓝根和大青叶的基原植物。板蓝根性苦寒，具有清热解毒，凉血利咽等功效。药理研究表明，其具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫增强、抗肿瘤等多种药理活性。特别是抗病毒方面，其对于对于临床病毒性流感、腮腺炎、病毒性肝炎等多种疾病，运用十分广泛。《中国植物志》记载菘蓝原产我国，目前全国各地均有栽培。

开发一套高效的SSR分子标记引物组，可用于菘蓝栽培类型的鉴定、遗传多样性分析及良种选育等方面。

发明内容

本发明所要解决的主要问题是如何鉴定菘蓝栽培类型及进行遗传多样性分析及良种选育。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于菘蓝全基因组序列开发的SSR分子标记引物组。

本发明提供的基于菘蓝全基因组序列开发的SSR分子标记引物组包括8对引物中的至少1对，所述8对引物名称为SSRSL01、SSRSL02、SSRSL03、SSRSL04、SSRSL05、SSRSL06、SSRSL07和SSRSL08，所述8对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.16所示。

所述组合物为基于菘蓝全基因组序列开发的SSR分子标记组合物。

本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上文所述的SSR分子标记引物合物。

本发明还提供了一种DNA芯片，所述DNA芯片包含上文所述的SSR分子标记引物合物。

本发明还提供了上文所述SSR分子标记引物合物，和/或，所述试剂盒，和/或，所述DNA芯片在下述任一种中的应用：

A1)在菘蓝遗传多样性分析中的应用；

A2)在菘蓝品种多样性分析中的应用；

A3)在菘蓝亲缘关系分析中的应用；

A4)在菘蓝品种鉴定中的应用；

A5)在构建菘蓝遗传图谱或DNA指纹图谱中的应用；

A6)在菘蓝种质资源改良中的应用；

A7)在菘蓝基因定位或功能基因挖掘中的应用；

A8)在菘蓝分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种上文所述SSR分子标记引物组的筛选方法，所述方法包括如下步骤：

B1)对菘蓝种质资源材料进行基因组测序；

B2)以菘蓝基因组序列为参考基因组，对参考基因组SSR位点进行全基因组扫描，获得SSR标记；

B3)对所述SSR标记进行种质资源材料间多样性的筛选；

B4)对B3)筛选出的SSR标记进行引物设计，得到所述SSR分子标记引物组。

上述方法中，B4)中所述引物设计的参数包括：引物长度18-22bp，最优为20bp；退火温度(Tm)为55-65℃，最优为60℃；GC含量为40％～60％，最优为50％；预期PCR扩增产物大小为100-280bp。

本发明还提供了一种利用上文所述SSR核心引物组进行菘蓝遗传多样性分析或亲缘关系分析的方法，所述方法包括：以待测菘蓝基因组DNA为模板，利用上文所述的SSR引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果进行菘蓝遗传多样性分析或亲缘关系分析。

上述方法中，所述PCR扩增的反应体系为15μL，包含20ng的DNA模板、浓度为10mmol/L的正向引物0.5μL、浓度为10mmol/L的反向引物0.5μL、12.5μLPrimer STAR HS(Premix)PCR预混液、7.5μL ddH₂O；PCR扩增程序为：：96℃预变性5min；96℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃末端延伸10min。

本研究利用SSR标记检测了不同菘蓝品种的遗传多样性，可以有效区分菘蓝不同栽培类型的差距，实验结果精确、可靠。本研究采用毛细管电泳检测技术，使用QIAxcel DNAHigh Resolution Kit(1200)，使得检测误差在3-5bp之内，相比于传统电泳技术，该方法极大地提高了检测效率和精确性。实验证实，这一批SSR分子标记的多态性良好，可用于菘蓝栽培类型的鉴定、遗传多样性分析及良种选育等方面。

附图说明

图1为SSRSL01扩增的毛细管电泳检测峰图，图中从上到下的3个小图分别代表SSRSL01对样品2-1、9-1、9-2的检测峰图。SSRSL01对菘蓝样本2-1、9-1、9-2分别扩增出“236bp”“234bp”“230bp”的单一条带，如表明该引物能够稳定扩增且具有较高的稳定性。

图2为SSRSL02对18个样品的扩增的毛细管检测凝胶图，第一列为marker的检测凝胶图。2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7是2号种质6个样品的检测图，其在“183bp”“189bp”有特异性条带；6-2、6-3、6-4、6-5、6-6、6-7是6号种质6个样品的检测图，其在“187bp”“193bp”有特异性条带；9-3、9-4、9-5、9-6、9-7、9-8是9号种质6个样品的检测图，其在“190bp”有单一的条带，可见引物SSRSL02故可用于2、6、9号菘蓝种质的鉴别。

图3为引物SSRSL05对9号和2号10个样品的扩增的毛细管检测凝胶图，其中9-3、9-4、9-5、9-6、9-7是9号种质6个样品中5个的检测图，其均在“197bp”有条带；2-3、2-4、2-5、2-6、2-7号是2号种质6个样品中5个的检测图，其均在“192bp”有条带，检测效率可达80％以上，故其可用于2、9号菘蓝种质的鉴别。

图4为SSRSL02对部分样品扩增的毛细管检测峰图，图中从上到下为2号两个样本的峰图，峰图显示其产物大小为“183bp”“189bp”；6号两个样本的峰图，峰图显示其产物大小为“187bp”“193bp”；9号两个样本的峰图，峰图显示其产物大小为“190bp”。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。

下述实施例中2号、6号、9号栽培品种已记载于：韩文静.板蓝根与柴胡栽培种质产量与品质评价[D].北京协和医学院,2022.DOI:10.27648/d.cnki.gzxhu.2022.000589中。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、菘蓝基因组SSR引物的开发

本发明中使用的生物材料：4个菘蓝样品资源及相关信息见表1。

表1 4个菘蓝样品信息

样品编号	种质	产地
			6-1	6号	陕西省
2-1	2号	山西省晋中市榆次区
			9-1	9号	甘肃省张掖市民乐县
9-2	9号	甘肃省张掖市民乐县

1、提取菘蓝基因组DNA

选取上述表1中4个菘蓝材料的嫩叶，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取菘蓝样本DNA。DNA的浓度用BIO-RAD XRS+化学发光凝胶成像分析仪测定、完整性用2％琼脂糖凝胶电泳检测。将合格的DNA样品放置于-20℃条件下保存备用。

2.菘蓝基因组SSR引物的开发

(1)SSR位点筛选

菘蓝全基因组数据从NCBI/SRA数据库下载，网址(https://figshare.com/projects/Isatis_indigotica_Genome_assembly_and_annot ation/66242)，染色体规模基因组组装数据来源于NCBI，登录号为VHIU00000000。利用MISA(MIcro SAtelliteidentification tool；https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa)软件在全基因组范围内搜索不同重复单元的SSR位点，SSR位点的查找标准为：单、二、三、四、五、六核苷酸重复单元重复次数分别不小于10、6、5、5、5、5次，而且两个SSR之间允许的最大间隔碱基对为100bp。

(2)SSR引物设计

运用Primer 3软件(primer3-2.3.6)对所查找的菘蓝基因组SSR位点进行引物设计，参数设置为：引物长度18-22bp，最优为20bp；退火温度(Tm)为55-65℃，最优为60℃；GC含量为40％～60％，最优为50％；预期PCR扩增产物大小为100-280bp。利用该方法设计引物，并随机筛选出350对引物，由北京新时代众和科技有限公司合成。

3.SSR引物筛选

第一轮筛选：筛选可稳定扩增出目的条带，且产物条带清晰的引物。

(1)选择表1中所述的编号为6-1菘蓝作为实验材料，以其DNA作为模板。

(2)得到相应PCR反应体系(25μL):Premix STAR HS(Premix)PCR预混液

12.5μL，引物(10mmol/L)1μL，模板20ng DNA，ddH₂O 7.5μL。

(3)扩增反应程序为：96℃预变性5min；96℃变性10s，65℃退火30s，72℃延长45s，共35个循环；最后72℃延长10min。

(4)2％琼脂糖电泳检测：电压为125V，时间为0.5h。扩增产物和50bp DNALadder在1×TAE缓冲体系中用2％琼脂糖凝电泳，电压125V，时间为0.5h后用M5-Gelred plus核酸染料溶液染色。

(5)结果：筛选出可稳定扩增出目的条带，且目的条带清晰的引物135对。

第二轮筛选：筛选多态性丰富的引物

(1)选择表1中所述中的编号为2-1、9-1、9-2的菘蓝作为实验材料，以其DNA作为模板。以第一轮筛选获得的135条有目的条带且扩增稳定的引物，使用第一轮筛选步骤中的PCR程序进行扩增；

(2)将上述步骤a得到的PCR扩增产物使用毛细管电泳仪QIAxcel Advanced进行检测，利用QIAxcel ScreenGel软件读取样本片段大小，并根据预期产物大小及引物重复单元数目规律进行产物大小数据综合整理及基因分型。

(3)结果：通过两轮筛选，根据标准扩增效率高于80％，等位基因≥3，PCR产物峰图基线稳定，峰型尖锐，获得可稳定扩增目的基因、且多态性丰富的引物8对。具体引物序列见表2。

表2 8对引物序列信息

表2中，F为正向引物，R为反向引物。

实施例2、菘蓝基因组SSR引物的应用

利用实施例1中基于菘蓝全基因组序列开发设计的8对引物，对18个菘蓝样品进行遗传多样性分析，并利用其中的2对引物进行菘蓝种质鉴别。具体步骤如下：

1.以下述3份种质(种质2、种质6和种质9)的18个菘蓝(每个种质选取样本数为6个，具体样品信息见表3)嫩叶为样本，采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司；货号：DP350-03)提取菘蓝样本DNA。DNA的浓度用BIO-RAD XRS+化学发光凝胶成像分析仪测定、完整性用2％琼脂糖凝胶电泳检测。将合格的DNA样品放置于-20℃条件下保存备用。

表3 18个菘蓝样本信息

2.选择表3中所述18个菘蓝作为实验材料，以其基因DNA作为模板，以实施例1中获得的8对可稳定扩增目的基因、且多态性丰富的引物，分别进行PCR扩增。8对引物的PCR反应体系(25μL)均如下:Premix STAR HS(Premix)PCR预混液12.5μL，引物(10mmol/L)1μL，模板20ng DNA，ddH₂O 7.5μL。8对引物的扩增反应程序均为：96℃预变性5min；96℃变性10s，65℃退火30s，72℃延长45s，共35个循环；最后72℃延长10min。

3.将上述步骤得到的PCR扩增产物使用毛细管电泳仪QIAxcel Advanced进行检测，利用QIAxcel ScreenGel软件读取样本片段大小，并根据预期产物大小及引物重复单元数目规律，对产物大小数据进行综合整理及基因分型，利用GenAlex6.5软件计算各引物对的以下遗传多样性参数，如等位基因数量(Na)、有效等位基因数量(Ne)、观察杂合度(Ho)、预期杂合度(He)、香农信息指数(I)和不同引物等位基因频率等，用powermarker软件计算多态信息含量(PIC)。

4.实验结果

(1)所筛选和设计的SSR分子标记引物能对菘蓝样品进行稳定扩增且多态性良好。图1所示为分子标记SSRSL01对3个菘蓝样本扩增后的毛细管电泳检测峰图。从图1中可以看出，该SSR分子标记引物扩增效果稳定，多态性良好。

(2)引物SSRSL02在2号种质、6号种质、9号种质均存在特异性条带，其中2号在“183bp”“189bp”有条带，条带形态见图2中“2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7”凝胶图，条带大小见图4中“2-2、2-4”峰图；6号在“187bp”“193bp”有条带，条带形态见图2中“6-2、6-3、6-4、6-5、6-6、6-7”，条带大小见图4中“6-2、6-3”峰图；9号在“190bp”有单一的条带，条带形态见图2“9-3、9-4、9-5、9-6、9-7、9-8”，条带大小见图4中“9-3、9-4”峰图，可见引物SSRSL02可用于2、6、9号菘蓝种质的鉴别；引物SSRSL05在2号6个样本中有5个样本有“192bp”条带，在9号6个样本中有5个样本有“197bp”条带，可以鉴别2号和9号品种中80％的样本。

(3)8对引物扩增条带的多态性及18个样本进行遗传多样性分析结果如下表4所示。

表4 8对引物扩增条带的多态性及18个样本的遗传多样性分析数据

由表中可知，8个引物对18个样品进行扩增，其平均等位基因数为5.625，有效等位基因数范围为1.730-5.838。其中8对引物的期望杂合度(He)和Shannon′s信息指数(I)的平均值分别为0.65和1.34，表明菘蓝样本具有较高的遗传多样性。多态信息含量(PIC)作为衡量基因片段多态性的指标，多态信息含量越大，提供的遗传信息就越高，根据PIC＞0.50为高度多态位点的标准，该8个样品多态性信息含量的平均值为0.614，该结果表明菘蓝样本遗传多态性高，且本发明所述的引物能够进行菘蓝的遗传多样性分析及种质鉴别。其中引物SSRSL08及SSRSL02具有较高的期望杂合度(He)和Shannon′s信息指数(I)以及多态信息含量，说明其扩增效果好，鉴别效率高。

本研究利用SSR标记检测了不同菘蓝品种的遗传多样性，可以有效区分菘蓝不同栽培类型的差距，实验结果精确、可靠。本研究采用毛细管电泳检测技术，使用QIAxcel DNAHigh Resolution Kit(1200)，使得检测误差在3-5bp之内，相比于传统电泳技术，该方法极大地提高了检测效率和精确性。实验证实，这一批SSR分子标记的多态性良好，可用于菘蓝栽培类型的鉴定、遗传多样性分析及良种选育等方面。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (8)

1.菘蓝的SSR分子标记引物组合物，其特征在于，所述组合物包括8对引物中的至少1对，所述8对引物名称为SSRSL01、SSRSL02、SSRSL03、SSRSL04、SSRSL05、SSRSL06、SSRSL07和SSRSL08，所述8对引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ IDNo.16所示。

2.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的SSR分子标记引物组合物。

3.DNA芯片，其特征在于，所述DNA芯片包含权利要求1所述的SSR分子标记引物组合物。

4.权利要求1所述SSR分子标记引物组合物在下述任一种应用：

A1)在菘蓝遗传多样性分析中的应用；

A2)在菘蓝品种多样性分析中的应用；

A3)在菘蓝亲缘关系分析中的应用；

A4)在菘蓝品种鉴定中的应用；

A5)在构建菘蓝遗传图谱或DNA指纹图谱中的应用；

A6)在菘蓝种质资源改良中的应用；

A7)在菘蓝基因定位或功能基因挖掘中的应用；

A8)在菘蓝分子标记辅助育种中的应用。

5.权利要求2所述试剂盒在下述任一种应用：

A1)在菘蓝遗传多样性分析中的应用；

A2)在菘蓝品种多样性分析中的应用；

A3)在菘蓝亲缘关系分析中的应用；

A4)在菘蓝品种鉴定中的应用；

A5)在构建菘蓝遗传图谱或DNA指纹图谱中的应用；

A6)在菘蓝种质资源改良中的应用；

A7)在菘蓝基因定位或功能基因挖掘中的应用；

A8)在菘蓝分子标记辅助育种中的应用。

6.权利要求3所述DNA芯片在下述任一种应用：

A1)在菘蓝遗传多样性分析中的应用；

A2)在菘蓝品种多样性分析中的应用；

A3)在菘蓝亲缘关系分析中的应用；

A4)在菘蓝品种鉴定中的应用；

A5)在构建菘蓝遗传图谱或DNA指纹图谱中的应用；

A6)在菘蓝种质资源改良中的应用；

A7)在菘蓝基因定位或功能基因挖掘中的应用；

A8)在菘蓝分子标记辅助育种中的应用。

7.一种利用权利要求1所述SSR分子标记引物组合物进行菘蓝遗传多样性分析或亲缘关系分析的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测菘蓝基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的SSR分子标记引物组合物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果进行菘蓝遗传多样性分析或亲缘关系分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增的程序为：96℃预变性5min；96℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃末端延伸10min。