CN116457471A - 信号放大方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了能够放大可检测信号的基于核酸纳米结构的组合物以及能够可调谐、控制良好且定量地放大来自标记的靶分子的可检测信号的方法。

Description

信号放大方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年12月10日提交的美国临时申请号63/123,770、2021年8月27日提交的美国临时申请号63/237,922和2021年8月27日提交的美国临时申请号63/237,929的权益。前述申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

背景技术

基于荧光的检测是在整个生命科学中用来观察、鉴定和区分各种感兴趣的分子靶标的普遍工具，这些分子靶标包括但不限于细胞表面上或细胞内的抗原、蛋白质、抗体、外泌体和寡核苷酸。在某些情况下，靶分子或粒子可能以非常低的浓度或密度存在，使得它们特别难以检测。为了避免这一点，研究人员通常使用非常明亮的荧光团来观察弱表达的靶标；然而，即使摩尔消光系数超过150万的现有最亮荧光团通常仍然不能提供足够的信号来检测与单分子一样稀少的物质。在此类情况下，用于检测靶标的荧光信号必须通过增加与靶标结合的荧光团的数量(例如，通过使用二抗)而不是通过简单地选择更明亮的荧光团来放大。荧光放大可将发光提高到检测阈值以上，从而允许研究人员观察到非常罕见的事件。

然而，目前的荧光放大方法受到重大的限制。例如，它们在其多重检测程度，即在单个样品内可同时观察到的靶标的数量方面受到严重限制。目前的方法通常仅向研究人员提供少量供使用的不同荧光标记，这限制了实验的深度或复杂性。此外，许多常规放大方法缺乏特异性，导致放大多个靶标而不是单个明确定义的靶标。这迫使研究人员要么选择进行低重实验并放大单个靶标，要么选择进行低分辨率实验并放大所有靶标。此外，目前的放大方法缺乏对放大系数的明确的可调谐控制，而是会在各种靶标中产生放大系数的分布，导致高度的可变性并且限制它们在进行定量测量中的效用。

检测细胞标记物的最常见方法是通过使用荧光标记的一抗。一抗结合于特定细胞标记物，从而一旦连接到靶分子，就提供直接的检测方法。另一方面，基于一抗的宿主物种和同种型，二抗靶向并结合于一抗(“二抗介绍(Introduction to SecondaryAntibodies)”，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，2020年9月9日，参见万维网www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/antibodies/antibodies-learning-center/antibodies-resource-library/antibody-methods/introduction-secondary-antibodies.html)。通过用荧光标签标记二抗，可将二抗添加到已经含有一抗的细胞样品中以间接检测与一抗结合的标记物。这种间接检测的工作流程需要额外的染色步骤；然而，使用二抗的主要益处是多个二抗可结合于单个一抗，从而提供与用一抗获得的荧光信号相比放大的荧光信号。此外，二抗也可用其它分子标记，诸如生物素，其在与链霉亲和素结合使用时可产生二抗的大网络，从而进一步增加放大的荧光信号。

经由二抗放大的一个主要限制是它们不加选择地结合于共用相同宿主物种和同种型的一抗。通常在细胞标记应用中，细胞样品将用多种一抗染色，每种一抗靶向不同的标记物但共用相同的同种型和潜在宿主物种。在此类情况下，不可能选择性地选择放大哪种靶标，而是在向样品中加入相同的荧光标记的二抗时，放大相同同种型/物种的所有一抗。

为了能够用二抗放大进行多重检测，研究人员必须确保他们选择的一抗在物种和/或同种型方面不同，使得各自靶向不同物种/同种型并且各自携带不同荧光标签的二抗被添加到样品中以针对每一类别的同种型/物种产生不同颜色的放大的荧光信号。尽管这提供了一定的多重检测程度，但是研究人员想要观察的标记物的数量远远超过可供选择的同种型和宿主物种组合的数量，因此多重检测程度受到严重限制。此外，某些一抗可能仅以特定同种型/物种形式获得，使得难以设计允许特定标记物亚组的特异性靶向放大的实验。

放大荧光信号的替代方法是用靶向荧光团(诸如藻红蛋白(PE)或别藻蓝蛋白(APC))的抗体而不是一抗本身对细胞进行染色(“抗染料抗体(Anti-Dye Antibodies)”，赛默飞世尔科技公司，2020年9月9日，参见万维网www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/antibodies/primary-antibodies/epitope-tag-antibodies/anti-dye-antibodies.html)。这些抗体被称为抗染料抗体。在该工作流程中，用户用荧光标记的一抗对细胞进行染色，随后接着添加靶向并结合于与一抗连接的染料的抗染料抗体。抗染料抗体也可以是生物素酰化的，继而允许用户添加链霉亲和素和生物素酰化荧光团以将额外的荧光团结合于链霉亲和素标记的抗染料抗体。在抗染料抗体不猝灭目标染料的情况下，这些额外的荧光团放大由初级荧光团提供的初始基础信号。在抗染料抗体猝灭目标染料的情况下，新的荧光团可用于将信号转换为更明亮的替代荧光染料。

然而，抗染料抗体也具有多种缺点。首先，它们仅可用于一小部分荧光团和串联染料，这固有地限制了可实现的多重检测程度。它们的使用也限制了可利用的实验设计和/或仪器。用户被迫基于可用于放大的一小部分荧光团(例如PE或APC)来设计他们的实验，已知这些荧光团中的许多荧光团受到荧光性能限制，诸如十字激光激发或光谱溢出。这不仅使实验设计复杂化，而且使下游数据分析变得困难。

虽然上述放大方法依赖于间接抗体的使用，但分支DNA放大使用荧光标记的寡核苷酸来识别和增强与特定靶标相关的荧光信号(Player AN、Shen LP、Kenny D、Antao VP、Kolberg JA，使用分支DNA(bDNA)原位杂交的单拷贝基因检测(Single-copy genedetection using branched DNA(bDNA)in situ hybridization)，《组织化学与细胞化学杂志》(J Histochem Cytochem.)，2001；49(5):603-612。)。该一般概念开始于细胞样品的固定和透化。然后将设计成与特定mRNA和/或DNA靶标杂交的定制寡核苷酸对加入样品中。当这些初级探针对在相邻位置杂交时，它们能够结合称为前置放大分子(preamplifier)的长寡核苷酸，其表现为分支放大网络的主干。然后添加较短的放大分子(amplifier)链，使之与前置放大分子链杂交并提供用于结合许多小的荧光标记的探针寡核苷酸的分支。多个探针寡核苷酸可与每个前置放大分子结合，从而形成一个大的荧光网络，该荧光网络放大荧光信号以检测潜在的靶mRNA或DNA序列。这种放大方法已经由赛默飞世尔科技公司使用称为PRIMEFLOW RNA测定法的产品进行商业化(“通过流式细胞术检测RNA(RNA Detectionby Flow Cytometry)”，赛默飞世尔科技公司，2020年9月9日，参见万维网www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/rna-detection-flow-cytometry.html)。也存在以类似方式操作的多种其它原位杂交(ISH)放大方法，例如RNASCOPE(可购自例如美国明尼苏达州明尼阿波利斯的Bio-Techne公司(Bio-Techne,Minneapolis,MN,USA))。

分支DNA放大提供了具有高特异性的非常明亮的信号；然而，多重检测程度受到极大限制。首先，分支DNA放大仅可用于靶向mRNA或DNA序列而不是多种分子种类。通常用单个荧光团标记探针寡核苷酸，这实际上仅允许每个激光线检测到单种颜色(除非利用具有异常大的斯托克斯位移的荧光团)。大多数其它多重荧光应用利用串联染料(即，福斯特共振能量转移对)来观察每个激光线的多于一种颜色，但可用于该应用中的小的、结构化的、非基于蛋白质的串联染料的缺乏对其多重检测能力设置了上限。

发明内容

本文提供了核酸纳米结构复合物(本文中也称为“纳米结构复合物”)，该核酸纳米结构复合物包含连接到一个或多个次级核酸纳米结构(本文中也称为“次级纳米结构”)的初级核酸纳米结构(本文中也称为“初级纳米结构”)。在某些实施方案中，初级纳米结构连接到特异性决定分子。在某些实施方案中，初级纳米结构经由核酸接头连接到特异性决定分子和/或次级纳米结构，诸如其中核酸接头是被杂交的至少部分双链的接头。在某些实施方案中，初级纳米结构经由生物素/生物素结合蛋白复合物连接到特异性决定分子并且经由核酸接头连接到次级纳米结构。在某些实施方案中，纳米结构复合物包含通用结构：P(-L-S)_n，其中P是初级纳米结构，L是被杂交的至少部分双链的核酸接头，S是一个或多个相邻连接的次级纳米结构，并且n为大于零的整数，并且其中：(i)初级纳米结构包含n数量的部分单链的核酸接头延伸部，(ii)存在n数量的包含至少部分单链的核酸接头延伸部的次级纳米结构，并且(iii)n数量的初级纳米结构核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分与次级核酸接头延伸部中的一个次级核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在初级纳米结构与次级纳米结构中的每一个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将初级纳米结构连接到n数量的次级纳米结构。

在某些实施方案中，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合并且连接到n数量的具有相同光谱曲线的次级纳米结构，其中与单独初级纳米结构的荧光信号相比，具有相同光谱曲线的次级纳米结构放大了纳米结构复合物的荧光信号。在某些实施方案中，具有与初级纳米结构相同的光谱曲线的次级纳米结构各自也包含与初级纳米结构相同数量的荧光团部分并且将纳米结构复合物的荧光信号放大到单独初级纳米结构的荧光信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。

在某些实施方案中，初级纳米结构包含独特鉴定序列并且连接到n数量的包含相同独特鉴定序列的次级纳米结构，其中与单独初级纳米结构的测序信号相比，具有相同独特鉴定序列的次级纳米结构放大了纳米结构复合物的测序信号。在某些实施方案中，次级纳米结构各自也包含与初级纳米结构相同数量的独特鉴定序列并且将纳米结构复合物的测序信号放大到单独初级纳米结构的测序信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。

在某些实施方案中，初级纳米结构包含x数量的荧光团部分或荧光团部分的组合并且连接到y数量的次级纳米结构，每个次级纳米结构包含z数量的与初级纳米结构相同的荧光团部分或荧光团部分的组合，其中可独立地为每个次级纳米结构确定z并且来自次级纳米结构的z的总和为z_总数并且与单独初级纳米结构的荧光信号相比纳米结构复合物的荧光信号放大到约(x+z_总数)/x倍。在某些实施方案中，z对于每个次级纳米结构是相同的并且z_总数＝y*z。

在某些实施方案中，纳米结构复合物包含与一个或多个近侧次级核酸纳米结构相邻连接的初级核酸纳米结构，其中近侧次级纳米结构中的至少一个近侧次级纳米结构进一步连接到另一个次级纳米结构，任选地，其中初级纳米结构和一个或多个近侧次级纳米结构和/或一个或多个近侧次级纳米结构和连接到近侧次级纳米结构的另一个次级纳米结构经由被杂交的至少部分双链的核酸接头连接。在某些实施方案中，纳米结构复合物包含通式：P-L₁-S_P-L₂-(S_x-L_y)_n-Z，其中P是初级纳米结构，L₁是将初级纳米结构连接到次级纳米结构的接头，S_P(近侧次级纳米结构)是与初级纳米结构相邻连接的次级纳米结构，L₂是将S_P连接到另一个次级纳米结构的接头，n为零或正整数，(S_x-L_y)包含次级纳米结构S_x和将S_x连接到额外的次级纳米结构的接头L_y；并且Z是额外的一个或多个次级纳米结构。在某些实施方案中，Z是末端次级纳米结构S_T。

本文提供了包含核酸支架的纳米结构复合物，该核酸支架连接有至少一个初级核酸纳米结构，其中初级纳米结构包含与核酸支架的序列的至少一部分杂交的至少部分单链的核酸接头延伸部。

本文提供了包含两个或更多个不同初级纳米结构的多重组合物，该初级纳米结构中的至少一个初级纳米结构是根据本公开的纳米结构复合物的一部分。

本文提供了标记靶分子的方法，该方法包括将根据本公开的核酸纳米结构复合物结合于靶分子。本文还提供了标记一个或多个靶分子的多重方法，该多重方法包括根据本公开的方法将根据本公开的两个或更多个纳米结构复合物或根据本公开的至少一个纳米结构复合物和至少一个初级纳米结构结合于一个或多个靶分子。

本文提供了一种用于执行本公开的方法的试剂盒，该试剂盒包含本公开的纳米结构复合物或其组分；和/或包含用于根据本公开的方法标记靶分子的试剂和/或设备；任选地，其中试剂盒还包含印刷和/或在电子存储介质上的说明书、缓冲剂和/或额外试剂，和/或包装材料。

附图说明

图1示出：(左)初级核酸纳米结构结合于感兴趣的靶标，并且包括单链DNA(ssDNA)接头延伸部(a)。(右)含有互补ssDNA接头延伸部的次级纳米结构(a’)与(a)杂交，从而形成具有两倍荧光信号强度的初级-次级纳米结构复合物。

图2A和图2B示出使用次级核酸纳米结构的三向多重检测。图2A：初级核酸纳米结构1、2和3分别结合于感兴趣的靶标，并且包括ssDNA接头延伸部(a)、(b)和(c)。图2B：含有互补ssDNA接头延伸部(a’)、(b’)和(c’)的次级核酸纳米结构1、2和3分别与(a)、(b)和(c)杂交，从而形成三种不同颜色的初级-次级纳米结构复合物，每一者提供两倍的荧光。

图3示出用多聚T ssDNA延伸部或具有碱基混合物的ssDNA延伸部组装的三个不同核酸纳米结构的荧光光谱。

图4A和图4B示出具有双向多重次级核酸纳米结构放大的三向多重初级核酸纳米结构染色。图4A：初级核酸纳米结构1、2和3分别结合于感兴趣的靶标。初级核酸纳米结构1和3包括ssDNA接头延伸部(a)和(c)。图4B：含有互补ssDNA接头延伸部的次级核酸纳米结构仅与初级核酸纳米结构1和3杂交，因为初级核酸纳米结构2不具有用于放大的ssDNA接头延伸部。

图5A和图5B示出简并次级核酸纳米结构放大。图5A：初级核酸纳米结构1用于对多个靶标(1和3)进行染色，而初级核酸纳米结构2仅对靶标2进行染色。图5B：添加次级核酸纳米结构2以放大来自靶标2的荧光信号。添加次级核酸纳米结构1以同时放大来自靶标1和3的荧光信号。

图6A和图6B示出次级核酸纳米结构可如何转换所得的光谱曲线。图6A：均含有相同ssDNA接头延伸部(a)的初级核酸纳米结构1、2和3分别用于对靶标1、2和3进行染色。图6B：与任何初级核酸纳米结构不同的光谱曲线的单个次级核酸纳米结构经由其ssDNA接头延伸部(a’)与所有三个初级核酸纳米结构杂交，从而允许现在观察到具有单个、替代光谱曲线的每个靶标。

图7A和图7B是可调谐放大系数的图示。图7A：初级核酸纳米结构1和2结合于靶标1和2。初级核酸纳米结构1包含两个拷贝的相同ssDNA接头延伸部(a)，而初级核酸纳米结构2含有三个拷贝的相同ssDNA接头延伸部(b)。图7B：含有互补ssDNA接头延伸部(a’)和(b’)的次级核酸纳米结构1和2分别与所有可用的ssDNA接头延伸部(a)和(b)杂交，从而将初级核酸纳米结构1放大到3倍并将初级核酸纳米结构2放大到4倍。

图8A和图8B示出经由每个次级核酸纳米结构的可调谐数量的荧光团的可调谐放大。图8A：初级核酸纳米结构1和2结合于靶标1和2。初级核酸纳米结构1包含两个拷贝的相同ssDNA接头延伸部(a)，而初级核酸纳米结构2含有三个拷贝的相同ssDNA接头延伸部(b)。图8B：含有互补ssDNA接头延伸部(a’)和(b’)的次级核酸纳米结构1和2分别与所有可用的ssDNA接头延伸部(a)和(b)杂交。次级核酸纳米结构2携带的荧光团是次级核酸纳米结构1的两倍，从而引起更大的放大。

图9A和图9B示出次级核酸纳米结构条形码化。图9A：初级核酸纳米结构1和2结合于靶标1和2。初级核酸纳米结构1包含两个ssDNA接头延伸部(a)和(b)，而初级核酸纳米结构2含有两个ssDNA接头延伸部(a)和(c)。图9B：各自具有不同光谱曲线并含有互补ssDNA接头延伸部(a’)、(b’)和(c’)的次级核酸纳米结构1、2和3分别与初级核酸纳米结构延伸部(a)、(b)和(c)杂交，从而形成用于靶标1和2的不同的三组分条形码。

图10A和图10B示出次级纳米结构强度条形码化。图10A：初级核酸纳米结构1和2结合于靶标1和2，每个初级核酸纳米结构所含的ssDNA接头延伸部数量不同，但都具有相同的序列(a)。图10B：含有互补ssDNA接头延伸部(a’)的次级核酸纳米结构1与所有延伸部杂交，从而将靶标1放大到2倍并将靶标2放大到4倍。这些不同的强度可用作条形码来区分这两个靶标，即使它们使用相同的信号。

图11A和图11B示出了纳米结构聚合。次级核酸纳米结构1和2被设计为彼此聚合。次级核酸纳米结构1含有两个ssDNA接头延伸部，两者均具有序列(a’)。次级核酸纳米结构2含有两个ssDNA接头延伸部，两者均具有序列(a)(图11A)。通过将次级核酸纳米结构1和2与结合于靶标的初级核酸纳米结构混合，次级核酸纳米结构1和2形成了放大用于检测靶标的信号的聚合物(图11B)。

图12A和图12B示出受控的核酸纳米结构聚合。设计四个独特次级核酸纳米结构1至4，它们各自具有两个ssDNA接头延伸部，所有这些都是独特的(图12A)。当将次级核酸纳米结构1至4添加到与靶标结合的初级核酸纳米结构时，它们基于其互补序列的杂交来组装成5-纳米结构线性复合物(链)(图12B)。

图13A、图13B和图13C示出半受控的核酸纳米结构聚合。核酸纳米结构组由初级核酸纳米结构、最终可聚合的两个不同次级核酸纳米结构1和2以及终止核酸纳米结构组成(图13A)。可提前将某些核酸纳米结构以明确定义的化学计量混合在一起，因为它们彼此不反应。该化学计量对平均聚合长度有影响(图13B)。将溶液混合以形成各种长度的各种纳米结构聚合物(图13C)。

图14示出与连接到靶标的单个配位支架链连接的四个核酸纳米结构，从而引起4倍信号放大。

图15示出具有不同数量的ssDNA接头延伸部的纳米结构可形成核酸纳米结构的大的分支放大网络。

图16示出来自与抗CD 4抗体缀合并用于对外周血单核细胞(PBMC)进行染色的单体和二聚体核酸纳米结构(NOVAFLUOR Yellow610，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))的信号的柱状图。来自二聚体的较高信号提供了已形成二聚体并且它们能够相对于单体对照放大信号的证据。链-1和链-2是指将两个核酸纳米结构结合在一起并因此形成二聚体的DNA连接。链-1和链-2分别为24和32个核苷酸长。

图17示出在260nm处监测的NOVAFLUOR Yellow 610单体和二聚体核酸纳米结构的尺寸排阻色谱法(SEC)色谱图。二聚体的较短洗脱时间表明它们的结构大于单体，并提供了已形成二聚体的证据。链-1和链-2是指将两个核酸纳米结构结合在一起并因此形成二聚体的DNA连接。链-1和链-2分别为24和32个核苷酸长。

图18A、图18B和图18C示出示例性柱状图，这些柱状图示出来自PBMC上的初级和初级+次级(即，二聚体)核酸纳米结构-抗体缀合物的信号。在单独步骤中将次级核酸纳米结构添加到初级核酸纳米结构-抗体缀合物之后来自二聚体的说明性信号(图18A)、在添加次级核酸纳米结构之前来自初级核酸纳米结构-抗体缀合物的说明性信号(图18B)、在将次级核酸纳米结构阴性对照(即，无接头延伸部)添加到初级核酸纳米结构-抗体缀合物之后的说明性信号(图18C)。

图19A、图19B和图19C示出用两个光谱独特的核酸纳米结构进行两步染色的示例性数据。对于该示例，这两个核酸纳米结构是NOVAFLUOR Red 710和NOVAFLUOR Yellow590。图19A示出在添加具有不同光谱曲线的次级核酸纳米结构NOVAFLUOR Red 710之前来自初级核酸纳米结构NOVAFLUOR Yellow 590的说明性光谱曲线。图19B示出在存在NOVAFLUOR Red 710和NOVAFLUOR Yellow 590两者时(即，在单独步骤中添加次级核酸纳米结构NOVAFLUOR Red 710之后)的两个说明性独特光谱曲线。图19C示出在添加次级阴性对照NOVAFLUOR Red 710时所得的说明性光谱曲线。

图20示出使用链霉亲和素作为交联剂的三种荧光放大策略的示意图。

图21示出来自图20的策略1的展示，其中将人PBMC使用抗CD4抗体-生物素缀合物来染色，洗涤，然后用链霉亲和素缀合的核酸纳米结构来染色，在该示例中，使用链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610。使用胺反应性化学为链霉亲和素标记上NOVAFLUOR Yellow610，让所有生物素结合位点保持开放。将该染色与使用直接用NOVAFLUOR Yellow 610标记的一抗的CD4染色进行比较。

图22示出来自图20的策略2的展示，其中将人PBMC使用抗CD4抗体-生物素缀合物来染色，洗涤，然后用链霉亲和素缀合的核酸纳米结构来染色，在该示例中，使用链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610-生物素。用生物素酰化NOVAFLUOR核酸纳米结构以所指示的比率标记链霉亲和素。将该染色与使用直接用NOVAFLUOR Yellow 610标记的一抗的CD4染色进行比较。

图23示出来自图20的策略3的展示，其中将人PBMC用抗CD4抗体-生物素缀合物、链霉亲和素和生物素酰化NOVAFLUOR Yellow 610核酸纳米结构的复合物来染色。将该染色与使用直接用NOVAFLUOR Yellow610标记的一抗的CD4染色进行比较。

图24是来自图20的策略2的展示，其使用核酸纳米结构二聚体进一步放大荧光信号。将人PBMC使用抗CD4抗体-生物素缀合物来染色，洗涤，然后用链霉亲和素-NOVAFLUORYellow 610核酸纳米结构单体或二聚体来染色。用生物素酰化NOVAFLUOR单体或二聚体以2:1比率标记链霉亲和素。将该染色与使用直接用NOVAFLUOR Yellow 610标记的一抗的CD4染色进行比较。链-1和链-2是指将两个核酸纳米结构结合在一起并因此形成二聚体的DNA连接。链-1和链-2分别为24和32个核苷酸长。

图25A、图25B和图25C示出来自单体和二聚体NOVAFLUOR Ultraviolet CD4染色的PBMC的信号的柱状图。图25A、图25B和图25C分别描绘了NOVAFLUOR Ultraviolet 430、NOVAFLUOR Ultraviolet 445和NOVAFLUOR Ultraviolet 755。来自二聚体的较高信号提供了已形成二聚体并且它们能够相对于单体对照放大信号的证据。

具体实施方式

定义

应注意，术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个该实体；例如“一个接头”被理解为表示一个或多个接头。因此，术语“一个(a/an)”(或“一种(a/an)”)、“一个或多个”(“一种或多种”)以及“至少一个”(“至少一种”)在此可以互换使用。

此外，“和/或”在本文中使用时被认为是特定特征或组分中的每一个与或不与另一特定特征或组分的具体公开。因此，本文在如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

应理解，无论在何处用语言“包含(comprising或comprises)”描述的方面，还提供另外根据“由…组成(consisting of、consists of)”、“基本上由…组成(consistingessentially of和/或consists essentially of)”等描述的类似方面。

除非另外规定，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开所涉及领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。

数值范围包括限定范围的数值。即使当没有通过“和其间的任何范围”等明确标识时，在列举值的列表(例如，1、2、3或4)的情况下，除非另外说明，否则本公开特别包括这些值间的任何范围，包括端点，例如，1至3、1至4、2至4等。

本文提供的标题仅是为了便于参考，并非对本公开的各个方面或方面的限制，其可通过整体参考说明书而获得。

如本文所用，“接头”为缀合分子的组分，其目的是将分子的其它组分连接在一起，或当缀合分子的其它组分未连接在一起时，组分的部分出于与另一种成分缀合的目的存在，而且否则将不必存在。例如，抗体将不通常或必须具有连接到其的多核苷酸，但是出于本公开的目的，多核苷酸可连接到抗体以形成接头来将抗体连接到另一个分子，从而形成缀合物分子。同样，本公开的核酸纳米结构可不必具有特定的至少部分单链的延伸部，但是出于本公开的目的，核酸纳米结构可包含至少部分单链的接头延伸部以将纳米结构连接到另一个分子(诸如抗体)，从而形成缀合物分子。

如本文所用，术语“非天然存在的”物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合，或其任何语法变体为明确排除但仅排除那些被所属领域的普通技术人员充分理解为“天然存在的”，或在或可在由法官或行政或司法机构确定或解释为“天然存在”的任何时间的物质、组合物、实体和/或物质、组合物或实体的任何组合的形式的条件术语。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何链或多条链，并且不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可代替或与这些术语中的任何一个互换使用。术语“多肽”也旨在指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割或非标准氨基酸修饰。多肽可衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定由指定的核酸序列翻译而来。它可以任何方式产生，包括通过化学合成。

如本文所用，“蛋白”可指单个多肽，即如上定义的单个氨基酸链，但也可指例如通过二硫键、氢键或疏水相互作用相关联的两个或多个多肽,以产生多聚体蛋白。

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不处于天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。举例来说，分离的多肽可从其原生或天然环境去除。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是分离的，如本文所公开的，已经通过任何合适的技术分离、分级或部分或基本上纯化的重组多肽也是如此。

本文公开的其它多肽为上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，和其任何组合。当提及本文公开的多肽亚基或多聚体蛋白时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”可包括保留完整多肽或蛋白的至少一些活性的任何多肽或蛋白，但这在结构上是不同的。多肽的片段包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可自发发生或有意构建。可使用所属领域已知的诱变技术产生有意构建的变体。变体多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物为已被改变以表现出在天然多肽上未发现的额外特征的多肽。实例包括融合蛋白。衍生物多肽在本文中也可称为“多肽类似物”。如本文所用，“衍生物”可指具有一个或多个通过官能侧基反应而化学衍生的氨基酸的主题多肽。还包括作为“衍生物”的是那些含有二十种标准氨基酸的一种或多种标准或合成氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；并且鸟氨酸可取代赖氨酸。

如本文所用，术语“特异性决定分子”在其最广义上是指识别靶分子(靶标)并与之缔合的分子。特异性决定分子包括可与抗原决定簇特异性结合的结合分子，诸如抗体结合表位，以及可与受体，诸如受体配体(例如胃泌素释放肽(GRP)和胃泌素释放肽受体(GRPR))结合的分子。因此，特异性决定分子的代表性示例包括肽、重组、天然或工程化的受体/配体蛋白、适体、四聚体(具有用于检测T细胞受体的肽的折叠的MHC蛋白)、非抗体蛋白或抗体模拟物，例如人泛素(affilin)、亲和体(affimer)、亲和素(affitin)、α抗体、高亲合性多聚体(avimer)、菲诺体(fynomer)、Kunitz结构域肽、nanoCLAMPS、设计锚蛋白重复蛋白(DARPins)、单功能抗体、抗运载蛋白(anticalin)、亲和抗体(affibodies)和SOMAmers(另外的示例参考在全球生物分析联盟(GBC)和欧洲药品管理局“将关键试剂分类为分析物特异性或结合试剂，特别是抗体；肽；工程蛋白；抗体、蛋白和肽缀合物；试剂药物；适体和抗药物抗体(ADA)试剂，包括阳性和阴性对照(King,LE等人，配体结合测定法关键试剂及其稳定性：全球生物分析联盟协调团队的建议和最佳实践(Ligand Binding Assay CriticalReagents and Their Stability:Recommendations and Best Practices from theGlobal Bioanalysis Consortium Harmonization Team)，《美国药学科学家协会杂志(AAPS J.)》，2014年5月；16(3):504–515)。在某些实施方案中，特异性决定分子可靶向基因组材料(例如DNA或RNA)以例如对染色质可及性或基因表达进行荧光原位杂交(FISH)或其它生物测定法。

本文公开包含抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的某些结合分子。除非具体指全尺寸抗体，例如天然存在的抗体，否则术语“结合分子”涵盖全尺寸抗体，包括双特异性抗体(例如，包含与第一表位结合的第一结合结构域，和与第二表位结合的第二结合结构域)，以及这类抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程化的抗体分子或以类似于抗体分子的方式结合抗原的片段。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对较好理解。参见例如Harlow等人，《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988年)。抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、人类、人源化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子为本领域已知的并且描述于例如美国专利号5,892,019中。本公开所涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。

如本文所用，术语“嵌合抗体”将被认为意指任何抗体，其中免疫反应区或位点从第一物种获得或衍生，而恒定区(可为完整的、部分的或经过修饰的)从第二物种获得。在一些实施例中，靶结合区或位点将来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)并且恒定区为人类的。

如本文所用，术语“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有针对两种不同抗原的结合位点的抗体。应了解，除了标准抗体结构之外，可构建具有两种结合特异性的其它分子。还应了解，双特异性抗体的抗原结合可为同时的或顺序的。三体杂交瘤(Triomas)和杂交杂交瘤为可分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。双特异性抗体也可通过重组方式构建。(和Heiss,《未来肿瘤学(Future Oncol.)》6:1387-94(2010)；Mabry和Snavely，《研究药物杂志(IDrugs)》，13:543-9(2010))。双特异性抗体也可为双抗体。

如本文所用，术语“工程化的抗体”是指其中重链和轻链或两者中的可变结构域通过至少部分替换来自已知特异性的抗体的一个或多个CDR并且通过部分框架区替换和序列改变而改变的抗体。尽管CDR可衍生自与衍生框架区的抗体相同类别或甚至亚类的抗体，但是可设想CDR将衍生自不同类别的抗体，例如衍生自来自不同的物种的抗体。其中将来自已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链框架区中的工程化抗体在本文中称为“人源化抗体”。在一些情况下，并非所有的CDR都被替换为来自供体可变区的完整CDR以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个可变结构域；相反，转移了维持靶结合位点的活性的最少氨基酸。考虑到在例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中阐述的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验或通过反复试验测试来获得功能性工程化或人源化抗体。

术语“多核苷酸”(也称为“寡核苷酸”)旨在涵盖单数核酸以及复数核酸，其中“核酸”是指例如DNA或RNA或其类似物，诸如包含合成主链或碱基。在某些实施例中，多核苷酸或核酸为DNA。在其它实施方案中，多核苷酸或核酸可为RNA。核酸或多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，例如在肽核酸(PNA)中发现的)。“分离的”核酸或多核苷酸指已经从其天然环境中去除的核酸分子DNA或RNA，如分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。举例来说，编码包含在载体中的多肽亚基的重组多核苷酸被认为是如本文所公开的分离的。分离的多核苷酸的另外的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液中纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物。分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可为或可包括调节元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

“核酸纳米结构”是任何大小并由一条或多条寡核苷酸链构成的寡核苷酸构造，并且可具有三级和/或四级结构并由天然和/或合成的核酸碱基构成。基本上或完全由DNA构成的核酸纳米结构在本文中也称为DNA纳米结构。在某些实施方案中，核酸纳米结构可包括任何类型的荧光部分，包括但不限于小有机染料(所有种类和基础结构的小有机染料，例如罗丹明、花菁、噁嗪等)、天然存在的荧光团、磷光分子、荧光蛋白、荧光聚合物、量子点或其它荧光纳米粒子、上转换粒子、镧系元素和生物发光分子以及独特鉴定序列。如本文所用，术语“核酸纳米结构”和“纳米结构”可互换。

如本文所用，“PHITON”(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)是由北卡罗来纳州德罕(Durham,North Carolina)的PHITONEX公司(PHITONEX,Inc.)(现为赛默飞世尔科技公司的一部分)生产的核酸纳米结构(美国专利公开号2020/0124532，Lebeck,A.、Dwyer,C.、LaBoda C.，用于改善标记检测、计算、分析物感测和可调谐随机数生成的谐振器网络(Resonator Networks for Improved Label Detection,Computation,AnalyteSensing,and Tunable Random Number Generation)；该专利公开全文并入本文)。PHITON是由基于DNA的支架构成的荧光标记，该基于DNA的支架精确地布置荧光团以设计它们的相互作用和结构的总体荧光特性。底层支架为荧光放大提供了许多独特的机会。例如，如本文所公开，可利用底层支架来程序化地控制各个PHITON之间的相互作用，以便使它们一起成链来共同增强荧光信号。PHITON核酸纳米结构的示例是NOVAFLUOR核酸纳米结构(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)。

如本文所用，除非另外说明，否则“互补碱基配对”是指A/T、A/U或C/G碱基配对和相应的合成或非标准核苷酸配对，例如异胞嘧啶/异鸟嘌呤(isoC/isoG)。就胸苷(T)被指定为核酸中的碱基来说，出于简化本公开的目的，除非另外说明，否则应理解为如果核酸为RNA，那么尿嘧啶(U)为预期的。

除非在特定上下文中另外说明，否则术语“与...缀合”和“连接到”在本文中可互换使用。

如本文所用，“缀合物”是具有连接在一起的不同部分、组分部分、成分等的组合物。

如本文所用，“细胞富集”模式包括磁性或基于气泡的富集，包括经由与特异性决定分子缀合的金属粒子或微泡的阳性或阴性富集，以及基于大小或其它特征(例如荧光团缀合的特异性决定分子)的基于微流体的细胞富集；或者这些方法中的一种或多种的组合(通常该概念是基于细胞特征如同一性、大小、粒度、质量等来阳性或阴性地富集)。

“细胞分选”模式诸如荧光激活细胞分选(FACS)包括使用荧光团缀合的特异性决定分子来分选/富集感兴趣的细胞群，例如用于下游分析。

如本文所用，“免疫荧光细胞标记”模式涉及这样的过程，其中在细胞中或细胞上表达的感兴趣的抗原(诸如蛋白质抗原)可使用与荧光团共价缀合的一抗(直接检测)、先用未标记的一抗再用荧光团缀合的二抗的两步法(间接检测)或本领域技术人员已知的其它变型形式来检测。另外，此类方法可包括使用细胞膜或DNA染料。这样，来自一个或多个样品、组织、患者等的一个或大量细胞可经由免疫荧光技术(流式细胞术、免疫荧光成像等)来测量和/或诸如经由FACS来富集。

如本文所用，“基因组分析”模式涉及检查转录组(同一性、mRNA或其它RNA种类的拷贝数，包括选择性转录物同种型和单核苷酸多态性(SNP)，该检查是在每个细胞或每个组织的基础上使用全转录组分析(WTA)或使用靶向组合(例如，检查100多个选择的基因)进行的，以及结合其同一性来潜在地确定RNA的位置)；T和/或B细胞受体测序，其中进行DNA测序以检查这些免疫细胞的受体；DNA测序以检查种系DNA，例如以在单细胞水平检测拷贝数变异(CNV)；使用序列标记的抗体通过诸如与测序相结合的转录组和抗原表位细胞索引(CITE-Seq)、TOTALSEQ(加利福尼亚州圣地亚哥的百进公司(BioLegend,San Diego,CA)(“蛋白质基因组学”)或AbSeq(BD生物科学公司(BD Biosciences))之类的方法来检查蛋白质/抗原表达；例如通过单细胞ATAC-Seq来评估DNA可及性和染色质；例如通过单细胞CRISPR筛选来评估基因编辑的程度和靶标；或上列方法中的一种或多种方法的组合。除了基于悬浮细胞的方法之外，基因组分析还包括通过以下任一方式添加基于位置的数据：直接测定基因组材料，例如FISH、多重错误鲁棒荧光原位杂交(MERFISH)、空间转录组学，或利用序列标签来测定蛋白质和其它抗原的存在和位置，例如通过使用序列标记的抗体。溶液中或基于位置的测定法的测量可包括使用Sanger测序、下一代测序、长读段测序或原位测序。

如本文所用，“荧光标记”(也称为荧光团、荧光标签、荧光染料或荧光探针)是连接以帮助检测生物分子(诸如蛋白质、抗体或氨基酸)的分子。荧光标记可以是天然存在的荧光蛋白(例如藻红蛋白PE)、其衍生物(例如PE-Cy7)，包括串联染料、聚合物染料、单分子染料、荧光核酸或基于支架的荧光标记，例如核酸纳米结构，包括荧光DNA纳米结构，诸如NOVAFLUOR核酸纳米结构(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)。NOVAFLUOR核酸纳米结构的示例包括但不限于NOVAFLUOR Ultraviolet 430、NOVAFLUOR Ultraviolet 445、NOVAFLUOR Ultraviolet755、NOVAFLUOR Blue 510、NOVAFLUOR Blue 530、NOVAFLUOR Blue555、NOVAFLUOR Blue 585、NOVAFLUOR Blue 610/30S、NOVAFLUOR Blue 610/70S、NOVAFLUOR Blue 660/40S、NOVAFLUOR Blue 660/120S、NOVAFLUOR Yellow 570、NOVAFLUORYellow 590、NOVAFLUOR Yellow 610、NOVAFLUOR Yellow 660、NOVAFLUOR Yellow 690、NOVAFLUOR Yellow 700、NOVAFLUOR Yellow 730、NOVAFLUOR Red 660、NOVAFLUOR Red685、NOVAFLUOR Red 700和NOVAFLUOR Red 710。

如本文所用，“光谱曲线”意指纳米结构和/或纳米结构复合物作为一个整体的明确定义的吸收和/或发射光谱，其由与纳米结构和/或纳米结构复合物连接的荧光团部分之间的同一性、组成、数量、布置、取向和/或相互作用(例如FRET)限定。

如本文所用，“靶”分子是指可例如通过DNA互补性在基因组上靶向的表位或某物。在某些实施方案中，可使用特异性决定簇诸如抗体或其结合片段靶向表位/抗原。

除非另外说明，否则术语“条形码”、“特征条形码”和“独特鉴定序列”可互换使用，并且是指可用于区分一个或多个物种的寡核苷酸序列。

概述

当前的荧光放大方法提供有限程度的多重检测和特异性，使得难以在单次实验中研究许多不同的低密度(或低浓度)靶标。此外，目前还没有提供既可调谐又控制良好的定量放大(特别是不跨越检测单分子所需的多个数量级)的荧光放大方法。现有方法会在各靶标中产生放大系数的分布，这不可避免地在放大的信号中引入可变性。

本文提供了利用纳米结构复合物的组合物和方法，该纳米结构复合物包含次级核酸纳米结构(本文中也称为“次级纳米结构”)，该次级核酸纳米结构被设计成识别、结合、放大和/或改变纳米结构复合物的初级核酸纳米结构(本文中也称为“初级纳米结构”)的信号。在某些实施方案中，与单独的初级纳米结构的信号相比，次级纳米结构的使用放大了纳米结构复合物的信号的强度。如本文详细公开的，与当前工作流程相反，次级纳米结构的使用提供了高得多的多重检测极限、对靶分子的更大特异性以及对放大系数的非常精细的控制。

虽然贯穿本公开概述的许多示例性和说明性实施方案可涉及放大荧光信号，但应注意，可控地增加与特定靶标结合的纳米结构的数量的一般概念也使得能够放大序列信号，诸如由作为核酸纳米结构之间的核酸接头延伸部的一部分或掺入核酸纳米结构自身的序列中的独特鉴定序列提供的序列信号。出于本公开的目的，除非另外说明，否则包含含有独特鉴定序列的核酸接头延伸部的核酸纳米结构被视为包含该独特鉴定序列。应注意，可控地增加与特定靶标结合的纳米结构的数量以控制存在的独特鉴定序列的数量的一般概念也可用于控制待与纳米结构和/或纳米结构复合物缔合的DNA结合蛋白、酶、底物或其它“货物”的数量，包括在纳米结构复合物结合靶标时。

在某些实施方案中，首先用初级纳米结构对靶分子进行染色(结合)，该初级纳米结构能够识别靶分子或连接到例如抗体或其它识别并结合于靶标的生物分子(即特异性决定分子)。在某些实施方案中，初级纳米结构包括离开底层DNA纳米结构边缘的至少部分单链的DNA(ssDNA)接头延伸部(为简明起见，除非另外说明，否则“单链DNA接头延伸部”是指至少部分ssDNA接头延伸部和完整ssDNA接头延伸部两者)。该延伸部允许含有互补ssDNA序列的次级纳米结构的杂交。在某些实施方案中，次级纳米结构标记有相同的荧光团或以其它方式具有相同的光谱曲线，并且在杂交后，次级纳米结构放大初级纳米结构的荧光信号，因为现在每个靶分子存在相同光谱曲线的两个连接的纳米结构。如本文详细解释的，该概念扩展到额外次级纳米结构和/或荧光团的添加，并且还扩展到对独特鉴定序列的数量的控制和测序信号的放大。

图1示出这样的示例，其中已经用包含至少部分单链的DNA(ssDNA)接头延伸部(a)的初级纳米结构对靶标进行染色。使包含互补的至少部分ssDNA接头延伸部(a’)的次级纳米结构与初级纳米结构接触以将其连接到初级纳米结构。这两个纳米结构经由它们的接头延伸部彼此杂交，从而形成稳定的初级-次级纳米结构复合物，该复合物理论上可提供两倍的荧光信号。在某些其它实施方案中，可在对靶标进行染色之前使初级纳米结构和次级纳米结构杂交，但是为了贯穿本公开的清晰性和一致性起见，除非另外说明，否则示例将假设在连接任何次级纳米结构之前首先用初级纳米结构对靶标进行染色。然而，应当理解，可以设想到纳米结构复合物组分的连接和/或与靶标的结合的任何其它顺序。

此外，应当理解，尽管贯穿本公开概述的方法通常涉及通过使用包含具有相同光谱曲线的额外荧光团的次级纳米结构来放大荧光信号，但是在某些实施方案中，次级纳米结构还可包含改变初级纳米结构的光谱曲线的荧光团，为空白(即，不含荧光团)和/或甚至含有有意吸收初级纳米结构的荧光的猝灭剂。在某些实施方案中，空白次级纳米结构可用于放大与靶标连接的独特DNA序列的数量，诸如可用于测序应用。在某些实施方案中，次级猝灭纳米结构可用于减少来自特定靶标的荧光信号(例如在某些荧光信号太明亮的情况下)，并因此使得难以在多重应用中检测其它信号。

当使用次级纳米结构时，通过使用ssDNA接头延伸部所提供的序列空间能够实现用于荧光放大应用的较高程度的多重检测。例如，每个ssDNA接头延伸部仅使用5个碱基时，存在4^5个不同的独特序列(基于标准碱基A、T、C和G)或512个不同的互补序列组，每个互补序列组可潜在地用于不同颜色的初级-次级纳米结构对，但是在实践中，基于次级结构和/或脱靶的初级-次级纳米结构对之间的二聚体形成的可能性，应避免该序列空间中的一些。无论如何，关于ssDNA接头延伸部长度的指数级缩放意味着该方法的多重检测极限远远超过可供基于二抗的放大方法使用的同种型/物种多重检测选项。

图2A至图2B展示经由次级纳米结构的多重荧光放大。例如，首先使用各自具有不同光谱曲线的初级纳米结构1、2和3对三个单独靶分子进行染色。这些初级纳米结构分别含有ssDNA接头延伸部(a)、(b)和(c)。然后添加分别具有互补ssDNA接头延伸部(a’)、(b’)和(c’)的次级纳米结构1、2和3，这些次级纳米结构与对应的初级纳米结构杂交，并放大初始荧光信号。通过该示例，本领域普通技术人员可理解，靶向额外靶分子的许多额外初级纳米结构可各自连接到额外次级纳米结构以放大或以其它方式调节它们的信号，从而在样品中实现前所未有的程度的多重检测。在某些实施方案中，可以以这种方式标记至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个不同靶分子。在某些实施方案中，可以以这种方式标记约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800或900个中的任一者与约3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个中的任一者之间的不同靶分子。

重要的是，已经观察到在纳米结构上包含不同的ssDNA接头延伸部对纳米结构的荧光特性以及其组装具有非常小的影响。图3示出三个不同纳米结构的荧光光谱，每个纳米结构是用两个不同ssDNA接头延伸部组装的。在一种情况下，接头延伸部由多聚T序列组成，而在另一种情况下，接头延伸部是含有碱基混合物的独特序列。在该示例中，荧光光谱几乎相同。因此，可以设想到只要避免有问题的序列，例如G-四链体或I-基序，就可换出ssDNA接头延伸部而对下游应用几乎没有影响。

此外，当使用初级-次级纳米结构复合物时，研究人员可选择放大哪些信号，即该方法不仅具有较高的多重检测上限，而且是非常特异性的。图4A至图4B示出这样的示例，其中用各自具有不同光谱曲线的初级纳米结构1、2和3对三个单独靶标进行染色。但与图2A至图2B中的示例不同，仅初级纳米结构1和3分别含有ssDNA延伸部(a)和(c)。初级纳米结构2没有用作额外结合区的接头延伸部。因此，即使将通常靶向初级纳米结构1、2和3的次级纳米结构的混合物添加到样品中，也会由于次级纳米结构不能结合于初级纳米结构2，而仅放大初级纳米结构1和3。

在上述示例中，每个独特初级纳米结构(在某些实施方案中意指具有不同光谱曲线和/或在某些实施方案中包含不同独特鉴定序列)结合于不同靶标并且含有不同ssDNA接头延伸部。这允许最高程度的多重检测和特异性；然而，这可能并不总是必需的。在某些实施方案中，相同的初级纳米结构可用于检测不同的靶标，从而允许相同的ssDNA接头延伸部用于放大多个靶标的荧光信号。图5A至图5B示出这样的多重检测示例，其中初级纳米结构1用于对靶标1和3进行染色。然后可通过添加相同的次级纳米结构1来放大这两个靶标。这种简并形式的放大允许研究人员以与二抗靶向物种和同种型组合类别的方式类似的方式放大靶标类别，说明在绝对特异性不必要时平台的灵活性。

本文还提供了跨越不同初级纳米结构的简并ssDNA接头延伸部的用途，以将那些初级纳米结构的光谱曲线转换为替代光谱曲线。例如，在图6A至图6B中，初级纳米结构1、2和3全都共用相同的ssDNA接头延伸部(a)。当添加含有ssDNA接头延伸部(a’)的次级纳米结构时，现在可使用相同的次级纳米结构光谱曲线来观察每个初级纳米结构。虽然在该示例中，每个初级纳米结构被转换为相同的替代次级光谱曲线，但在其它实施方案中，通过混合和匹配不同的ssDNA接头延伸部，不同的初级纳米结构光谱曲线可被转换为不同的次级纳米结构光谱曲线。

除了增强的多重检测、特异性和灵活性之外，本公开的纳米结构组合物和方法还使得初级-次级纳米结构复合物的放大系数能够被独特地且可控地调谐。一种用于调谐这种放大的方法是通过使用每个纳米结构的多个ssDNA接头延伸部。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构可含有n数量的单独ssDNA接头延伸部(其中n可为2、3、4或更多)，它们各自可结合于单独的对应次级纳米结构。例如，当n为3时，可以设想到这可提供初级纳米结构的初始荧光信号的4倍放大，因为每个靶分子现在标记有四个纳米结构(一个初级纳米结构和三个次级纳米结构)而不是仅一个初级纳米结构。

图7A至图7B示出双向多重放大的示例，其中每个靶标被放大不同系数。首先分别用含有ssDNA接头延伸部(a)和(b)的初级纳米结构1和2对靶标1和2进行染色。初级纳米结构1含有两个ssDNA接头延伸部，并且初级纳米结构2含有三个ssDNA接头延伸部。添加次级纳米结构1和2，它们各自分别携带一个ssDNA延伸部(a’)和(b’)。这允许两个拷贝的次级纳米结构1结合于初级纳米结构1，并且三个拷贝的次级纳米结构2结合于初级纳米结构2。因此，将放大系数分别可控地设定为3倍和4倍，因为靶标1和2各自标记有三个和四个纳米结构。

除了通过控制结合于每个初级纳米结构的次级纳米结构的数量来调谐放大系数之外，每个初级纳米结构和次级纳米结构还可被设计成携带有不同数量的荧光团和/或荧光团的组合。图8A至图8B示出与图7A至图7B类似的示例，然而在这一次，每个拷贝的次级纳米结构1含有两个荧光团，并且每个拷贝的次级纳米结构2含有四个荧光团。这引起靶标1的荧光信号的3倍放大和用于检测靶标2的荧光信号的7倍放大。

虽然在利用可控放大系数的某些实施方案中，每个初级纳米结构具有多个拷贝的相同ssDNA接头延伸部，但在某些实施方案中，接头延伸部是独特的，并且不同次级纳米结构可结合于初级纳米结构的每个ssDNA延伸部，以形成连接到靶标的一组独特的次级纳米结构(以及因此荧光团的独特组合、独特光谱曲线和/或鉴定序列的独特组合)。这允许每个靶分子被独特地标记(“条形码化”)以及被放大。图9A至图9B示出这样的示例，其中用两个初级纳米结构对靶标1和2进行染色，这两个初级纳米结构具有相同的光谱曲线但含有不同的ssDNA接头延伸部。初级纳米结构1含有延伸部(a)和(b)，而初级纳米结构2含有延伸部(a)和(c)。在放大期间，分别具有ssDNA接头(a’)、(b’)和(c’)的次级纳米结构1、2和3结合于初级纳米结构，以形成每个靶标的独特编码的光谱条形码。

还可基于放大系数或最终得到的信号强度来对靶标进行条形码化，这允许跨多个靶标使用单一光谱曲线和/或独特鉴定序列。在图10A至图10B中，例如，靶标1和2标记有两个不同初级纳米结构，它们各自包含相同的荧光团但具有不同数量的ssDNA接头延伸部(全部具有序列(a))。当添加次级纳米结构并使次级纳米结构与初级纳米结构杂交时，靶标1被放大到2倍，而靶标2被放大到4倍。如果已提前知道靶标的浓度(或密度)，则这些靶标的不同信号强度可用于在单个粒子检测应用中将它们彼此区分开，即使它们共用相同的光谱曲线(和/或独特鉴定序列)。在某些实施方案中，这种放大方法可简化检测所需的仪器，因为仅需要单个激光源和滤波器组来鉴定多个靶标。此外，使用该实施方案时，例如来自多个患者的样品可被独特地鉴定并作为一个“样品”一起运行。

在某些实施方案中，可通过将ssDNA接头延伸部掺入次级纳米结构中以形成核酸纳米结构的更长延伸网络来实现甚至更高程度的信号放大。图11A和图11B提供了这种形式的纳米结构聚合的示例，其中设计了两个次级纳米结构，每个次级纳米结构具有序列(a)或序列(a’)的两个ssDNA接头延伸部。在某些实施方案中，首先用含有ssDNA接头延伸部(a)的初级纳米结构对靶标进行染色。通过添加次级纳米结构1和次级纳米结构2的混合物，交替的次级纳米结构的长网络可杂交以提供信号强度的显著增加。

在上述实施方案中，可能难以控制聚合度，因为在不添加终止物质的情况下次级纳米结构1和2将继续以交替方式聚合。为了更好地控制聚合度，次级纳米结构的ssDNA接头延伸部可被特别设计为将聚合物限制于一定链长。图12A和图12B示出这种情况的示例，其中设计了四个不同次级纳米结构，每个次级纳米结构具有独特的一对ssDNA接头延伸部。这些延伸部形成这样的规则组，其中次级纳米结构1仅结合于初级纳米结构，次级纳米结构2仅结合于次级纳米结构1和3，次级纳米结构3仅结合于次级纳米结构2和4，并且次级纳米结构4充当终止次级纳米结构，因为它仅含有专门结合于次级纳米结构3的单个ssDNA接头延伸部(参见图12B)。

图12A和图12B展示核酸纳米结构聚合的示例，其中聚合物的最终长度被绝对控制。通过仅使用每个ssDNA序列一次，保证每个聚合物最多由一个初级纳米结构和四个次级纳米结构组成。虽然这种程度的控制可能是有益的，但有时是不必要的，并且需要对每个单体单元进行独特的次级纳米结构设计。在某些放大应用中，简单地限制聚合物的平均长度就足够了。在这些实施方案中，次级纳米结构可被设计成重复使用序列但仍终止聚合过程，从而产生聚合物长度的混合物。在某些实施方案中，可基于起始条件来调节这些聚合物的平均长度。

图13A至图13C示出半受控的核酸纳米结构聚合方法的示例性实施方案。在这种情况下，存在一个初级纳米结构、两个次级纳米结构和一个终止纳米结构。初级纳米结构仅含有ssDNA接头延伸部(a)，并且终止纳米结构仅含有ssDNA接头延伸部(a’)。次级纳米结构1和2分别含有ssDNA接头延伸部(a’)和(b)以及(a)和(b’)。首先在溶液1中以特定摩尔比将初级纳米结构与次级纳米结构2混合。这两个纳米结构不会杂交，因为它们不含有任何互补的ssDNA接头延伸部。由于相同的原因，同样在溶液2中以特定摩尔比将终止次级纳米结构与次级纳米结构1混合。当随后混合这两种溶液时，将形成各种长度的聚合物。一些聚合物将含有所有四个纳米结构，如图13C所示。其它聚合物将仅由单个初级纳米结构和单个终止次级纳米结构组成。此外，一些聚合物将由初级纳米结构、之后是交替的次级纳米结构1和2的链以及终止次级纳米结构组成。该示例并不意在是限制性的，并且所得聚合物分布的平均长度可以以多种方式调谐，例如改变关于不同物质的化学计量、添加这些物质的顺序以及甚至添加不同物质的时间(例如，可在等待指定的时间量之后添加终止次级纳米结构)。

在某些实施方案中，可使用一个长配位DNA延伸部(本文中也称为“支架”)来形成聚合物样结构，多个纳米结构连接到该长配位DNA延伸部以放大信号。图14示出这种情况的示例，其中一个长ssDNA支架延伸部捕获四个拷贝的相同纳米结构。从靶标延伸的支架可由ssDNA和双链DNA(dsDNA)区域组成，这些区域可用于继续延伸其范围以捕获许多纳米结构。

在本公开的某些实施方案中，次级纳米结构可被设计成结合于初级纳米结构，并且多于一个其它次级纳米结构、多于两个其它次级纳米结构或另外纳米结构复合物可形成分支网络，从而为每个靶标提供多个放大层。图15示出这样的示例，其中仅单个纳米结构与连接到靶标的支架杂交，但该纳米结构具有两个ssDNA接头延伸部，这两个ssDNA接头延伸部随后可与其它纳米结构杂交。可基于支架的数量和这些序列的长度来调谐该纳米结构网络。最终可通过以下方式限制最终网络大小：添加仅具有单个ssDNA接头延伸部的终止纳米结构，从而终止网络的增长。本领域普通技术人员将理解，虽然图15所示的实施方案示出连接靶标的分支支架，但如本文别处所述的初级-次级纳米结构复合物的类似分支网络是本公开的一部分。相比之下，图13C和图14描绘了连接到靶标的线性支架的非限制性示例。

在上述实施方案中，待放大的初级纳米结构被描述为在它们结合于靶标之前各自含有一个或多个ssDNA接头延伸部，即，提前设计初级纳米结构，意图稍后放大信号。然而，在某些实施方案中，也可以在结合于靶标之后修饰初级纳米结构以显露用于次级纳米结构杂交的ssDNA结构域。这允许研究人员即使在已经测量了样品之后也能决定是否应放大某些信号，而不是迫使他们提前决定。例如，可使用常见的现有dsDNA改变机制(例如，CRISPR系统或限制性酶诸如锌指核酸酶)来暴露初级纳米结构上的ssDNA结构域。通过显露ssDNA结构域，可添加与这些新暴露区域杂交的次级纳米结构以实现信号的按需放大。相反，可通过使用DNA聚合酶按需停止或猝灭放大。聚合酶可延伸区域而不是暴露新的序列，从而将ssDNA转换为次级纳米结构不再可及的双螺旋结构域。

本领域普通技术人员将认识到，可混合和匹配本公开中描述的放大方法以扩展信号检测(例如，荧光和/或通过测序)的边界。例如，通过延伸的纳米结构网络(图15)、使那些延伸的网络聚合的捕获链(图14)以及增加每个纳米结构的荧光团簇的数量(图8)的组合，可将信号放大多个数量级。在需要在流式细胞术中检测弱表达的靶标、细胞外囊泡或甚至单分子的能力的应用以及多种其它应用中，可利用这种放大程度来扩展检测极限。

本公开的放大方法可用于靶向多种分子种类，包括但不限于抗原、抗体、寡核苷酸、蛋白质、小粒子、适体和细胞外囊泡。这些方法还可用于在多种不同应用中放大信号，诸如荧光和/或序列信号，这些应用包括但不限于流式细胞术、显微术、免疫荧光、免疫化学、免疫组织化学、其它形式的成像、聚合酶链式反应、测序、形态学测量、抗体和药物筛选。

可利用本公开中概述的控制良好的放大方法和底层纳米结构本身(例如，PHITON核酸纳米结构，其总是连接有明确定义的数量的荧光团)来进行放大的信号的定量分析。例如，可通过本文公开的受控次级纳米结构放大方法中的一种方法来放大与具有已知数量的靶标的参考样品结合的初级纳米结构。由于参考样品中靶标的数量是已知的，因此可确定每个靶标的信号量。这也可与每个纳米结构的信号量相关(因为放大方法是受控的并且因此纳米结构的数量是已知的)，并且最终在某些实施方案中与每个单独荧光团的信号量相关(因为每个纳米结构的荧光团数量是受控的并且是已知的)。然后该表征的纳米结构和放大策略可用于定量以未知密度表达或以未知浓度悬浮的靶标。

虽然贯穿本公开概述的许多示例性和说明性的实施方案可涉及放大荧光信号，但应注意，可控地增加与特定靶标结合的纳米结构的数量的一般概念也使得能够将“货物”(例如，蛋白质、底物、药物等)定向放大并定位到该靶标。例如，初级纳米结构和次级纳米结构可包括独特鉴定核酸序列，特定蛋白质将以转录因子样方式结合于该独特鉴定核酸序列以形成用于检测或影响蛋白质活性的分子复合物。因此，可使用所概述的定量放大策略来严格控制结合的蛋白质的数量。此外，基于放大的纳米结构网络所结合的靶标，那些结合的蛋白质可定位于细胞的特定部分。在这些情况下，纳米结构表现为用于以控制良好的定量方式携带该货物的载体。还应注意，寡核苷酸结构如tRNA也可结合于纳米结构上的特定序列，使得单独或多个纳米结构能够将生物分子集合在一起以实现组装、效应子活性和/或增强的检测。

本文公开的基于核酸纳米结构的放大组合物和方法提高了多重检测程度的上限。其还提供了高特异性(在需要时)、更大的灵活性以及通过引入额外的光谱曲线和/或可调谐的荧光强度来对放大进行条形码化(提供独特鉴定)的能力。此外，放大的各种组分和方法可彼此混合和匹配，以将荧光和/或测序信号增加多个数量级。在某些实施方案中，纳米结构和/或纳米结构复合物可诸如以缓冲剂样溶液的形式掺入产品中，该缓冲剂样溶液可同时增加多种颜色的信号。在某些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于流式细胞术中以进行高度多重放大。在某些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于在例如显微术和单分子检测中放大荧光信号，并且还可用于形成简单但超灵敏的诊断装置，包括侧流测定法。

纳米结构复合物

本文提供了核酸纳米结构复合物，该核酸纳米结构复合物包含连接到一个或多个次级核酸纳米结构(次级纳米结构)的初级核酸纳米结构(初级纳米结构)。出于本公开的目的，“初级纳米结构”是结合于靶标或与结合于靶标的特异性决定分子(诸如抗体)连接的纳米结构。“次级纳米结构”是与初级纳米结构和/或复合物中的另一个纳米结构连接的纳米结构。与初级纳米结构相邻连接的次级纳米结构是“近侧次级纳米结构”。与仅一个其它次级纳米结构相邻连接的次级纳米结构是“末端次级纳米结构”。在一些实施方案中，末端次级纳米结构仅包含一个核酸接头延伸部，或者不能连接到额外的次级纳米结构。“相邻连接”意指在初级纳米结构和近侧次级纳米结构之间存在直接连接或通过接头的连接，但没有居间的次级纳米结构。在某些实施方案中，初级纳米结构与约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或40个中的任一者至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50个中的任一者之间的次级纳米结构相邻连接。在某些实施方案中，初级纳米结构与一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个次级纳米结构相邻连接。在某些实施方案中，初级纳米结构与一个、两个、三个或四个次级纳米结构相邻连接。在某些实施方案中，初级纳米结构通过一个或多个居间次级纳米结构连接到一个或多个次级纳米结构。在某些实施方案中，次级纳米结构通过连接到与初级纳米结构相邻连接的居间近侧次级纳米结构来连接到初级纳米结构。在某些实施方案中，次级纳米结构通过连接到引回与初级纳米结构相邻连接的近侧次级纳米结构的一个或多个居间次级纳米结构来连接到初级纳米结构。

在某些实施方案中，初级纳米结构本身可特异性结合于靶分子，诸如基因组材料。在某些其它实施方案中，初级纳米结构连接到特异性决定分子。

在某些实施方案中，特异性决定分子包括蛋白质、酶、碳水化合物、核酸、受体、受体配体和/或底物，其使得能够测定不同的组(-ome)(例如，转录组、表观基因组、基因组和蛋白质组)。在某些实施方案中，特异性决定分子为结合分子诸如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在某些实施方案中，结合分子为肽、重组、天然或工程化的受体/配体蛋白、适体、四聚体(具有用于检测T细胞受体的肽的折叠的MHC蛋白)、非抗体蛋白或抗体模拟物，例如人泛素、亲和体、亲和素、α抗体、高亲合性多聚体、菲诺体、Kunitz结构域肽、nanoCLAMPS、设计锚蛋白重复蛋白(DARPins)、单功能抗体、纳米抗体、抗运载蛋白、亲和抗体和/或SOMAmers。在某些实施方案中，结合分子为受体配体。特异性决定分子可以是天然存在的或合成的。在某些实施方案中，特异性决定分子能够靶向基因组材料。例如，特异性决定分子本身可靶向基因组材料(例如DNA或RNA)以例如对染色质可及性或基因表达进行FISH或其它生物测定法。在某些实施方案中，本公开的试剂和方法提供使用基因编辑工具靶向、暴露和形成用于检测的新的放大结构的能力。例如，基因编辑和靶向的各种酶和模式，包括简并系统(例如DNA酶)和特异性靶向(例如CRISPR和锌指核酸酶)。

在某些实施方案中，初级纳米结构经由核酸接头连接到特异性决定分子。在某些实施方案中，初级纳米结构经由核酸接头连接到次级纳米结构。核酸接头可为单链的、部分单链的/双链的或双链的。在某些实施方案中，核酸接头是被杂交的至少部分双链的接头。如本文所提及，待与互补接头的单链部分杂交的至少部分单链的接头的部分是杂交区，并且当被杂交时，双链序列是被杂交区。核酸接头可包含DNA或RNA或其类似物或者由DNA或RNA或其类似物组成，诸如包含合成主链或碱基。核酸接头可为任何长度，但可考虑某些因素。例如，极短的接头可使缀合物组分接触得太近，导致空间位阻或其它干扰。另一方面，非常长的接头可能更难以产生或可能不能将组分保持在最佳距离内。在某些实施例中，核酸接头为至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、65、70或75个核苷酸长。在某些实施方案中，核酸接头为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸长中的任一者至约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60或75个核苷酸长的任一者。在某些实施方案中，核酸接头为约10、15、20、25、30、35、40或50个核苷酸长中的任一者至约15、20、25、30、35、40、50或75个核苷酸长中的任一者。在某些实施例中，核酸接头为约15、20、25、30或35个核苷酸长中的任一种至约20、25、30、35或40个核苷酸长中的任一种。核酸接头可包括单链和双链片段。在某些实施例中，核酸接头的双链片段为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、60、65、70或75个核苷酸长。在某些实施例中，核酸接头的双链片段为约10、15、20、25、30、35、40、50或60个核苷酸长中的任一种至约15、20、25、30、35、40、50、60或75个核苷酸长中的任一种。所属领域普通技术人员将认识到，虽然双链核酸通常被认为由互补碱基对的退火序列构成，但并非双链核酸片段中的所有配对都需要是互补的。对于包含互补碱基的两条核酸链退火以形成并入一些非互补碱基配对的双链核酸存在一定的耐受性。而且，还存在可与多种碱基配对的简并(通用)碱基，如脱氧肌苷。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75个互补碱基对，即使双链片段不完全由互补碱基对构成。在某些实施例中，核酸接头的双链片段包含约10、15、20、25、30、35、40、50或60个互补碱基对中中的任一种至约15、20、25、30、35、40、50、60或75个互补碱基对，即使双链片段不完全由互补碱基对构成。在某些实施例中，核酸接头的至少85％、90％、95％或98％的双链片段为互补碱基配对的。在某些实施例中，核酸接头的双链片段具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个错配碱基对。然而，在某些实施例中，100％的双链片段为互补碱基配对的。在某些实施例中，双链片段包含至少约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60或75个连续互补碱基对，或约7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50或60个连续互补碱基对中的任一个至约8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60或75个连续互补碱基对。

由于两条互补核酸链之间的杂交是非共价的，因此纳米结构复合物的组分可非共价地连接在一起。在某些实施方案中，初级纳米结构和特异性决定分子不通过共价键连接。在某些实施方案中，初级纳米结构和至少一个连接的次级纳米结构不通过共价键连接。并且，在某些实施方案中，初级纳米结构和连接的次级纳米结构中没有一个次级纳米结构通过共价键连接。

在某些实施方案中，初级纳米结构经由生物素/生物素结合蛋白复合物(例如，如图20所示)连接到特异性决定分子。在某些实施方案中，初级纳米结构经由亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素或中性亲和素-生物素复合物连接到特异性决定分子。在某些实施方案中，初级纳米结构经由链霉亲和素-生物素复合物连接到特异性决定分子。亲和素是衍生自禽类和两栖动物的蛋白质，其对生物素表现出相当大的亲和力，生物素是在多种真核生物过程中起作用的辅因子。亲和素和其它生物素结合蛋白(包括链霉亲和素和中性亲和素)具有结合多达四个生物素分子的能力(图20)。由于生物素标记稳定且较小，因此它很少干扰标记分子的功能。由于生物素结合蛋白具有结合多达四个生物素分子的能力，因此在某些实施方案中，多于一个初级纳米结构经由相同的生物素/生物素结合蛋白复合物连接到特异性决定分子(图20；“多个初级结构”)。这可针对下面描述的任何方法来进行，并且不限于图20所示的特定生物素结合蛋白/纳米结构布置。此外，在某些实施方案中，可通过成链(如本文别处所述)将额外的纳米结构添加到初级纳米结构，以提供例如纳米结构信号的放大(图20；“采用成链的多个初级结构”)。

在某些实施方案中，可使用胺反应性标记化学使生物素结合蛋白(例如，链霉亲和素)与核酸纳米结构复合。该方法让所有生物素结合位点保持开放。该生物素结合蛋白/纳米结构复合物可用于用纳米结构标记生物素酰化特异性决定分子，诸如生物素酰化抗体。例如，经由形成生物素/生物素结合蛋白复合物。

在某些实施方案中，可通过掺入用生物素修饰(诸如在3’端)的接头寡核苷酸来使纳米结构生物素酰化。然后可使该组合与生物素结合蛋白(例如，链霉亲和素)复合。该复合可以以各种比率进行。该生物素结合蛋白/纳米结构复合物可用于用纳米结构标记生物素酰化特异性决定分子，诸如生物素酰化抗体，例如经由形成生物素/生物素结合蛋白复合物。

在某些实施方案中，可通过掺入用生物素修饰(诸如在3’端)的接头寡核苷酸来使纳米结构生物素酰化。然后可使该组合与生物素结合蛋白(例如，链霉亲和素)复合。该复合可以以各种比率进行。然后可将该生物素结合蛋白/纳米结构复合物与生物素酰化特异性决定分子(例如，抗体)一起温育以形成特异性决定分子/生物素结合蛋白/生物素酰化纳米结构复合物(例如，抗体/链霉亲和素/生物素酰化核酸纳米结构复合物)。该预组装的复合物可用作流式细胞术中的初染剂。

本公开的各种纳米结构复合物的结构的说明性示例示于附图中并描述于实施例中。在某些实施方案中，纳米结构复合物包含通用结构：

P(-L-S)_n

其中P是初级纳米结构，L是被杂交的至少部分双链的核酸接头，S是一个或多个相邻连接的次级纳米结构，并且n为大于零的整数，其中(i)初级纳米结构包含n数量的部分单链的核酸接头延伸部，(ii)存在n数量的包含至少部分单链的核酸接头延伸部的次级纳米结构，以及(iii)n数量的初级纳米结构核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分与次级核酸接头延伸部中的一个次级核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在初级纳米结构与次级纳米结构中的每一个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将初级纳米结构连接到n数量的次级纳米结构。在某些实施方案中，n介于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或40至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40或50中的任一者之间。在某些实施方案中，n为一、二、三、四、五、六、七、八、九或十。在某些实施方案中，n为一、二、三或四。

在某些实施方案中，初级纳米结构与一个次级纳米结构相邻连接。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构与一个次级纳米结构相邻连接，并且(i)初级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，(ii)次级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，并且(iii)初级纳米结构核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分与次级纳米结构核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将初级纳米结构连接到次级纳米结构。

在某些实施方案中，初级纳米结构经由包含相同的杂交区/被杂交区的接头来与两个次级纳米结构相邻连接。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构与两个次级纳米结构相邻连接，并且(i)初级纳米结构包含具有相同单链杂交区序列的两个至少部分单链的核酸接头延伸部，(ii)这两个次级纳米结构包含任选地具有相同单链杂交区序列的至少部分单链的核酸接头延伸部，并且(iii)初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与次级纳米结构的核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在初级纳米结构与这两个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将初级纳米结构连接到这两个次级纳米结构。在某些实施方案中，这两个次级纳米结构包含相同的单链杂交区序列。

在某些实施方案中，初级纳米结构经由包含相同的杂交区/被杂交区的接头来与三个次级纳米结构相邻连接。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构与三个次级纳米结构相邻连接，并且(i)初级纳米结构包含具有相同单链杂交区序列的三个至少部分单链的核酸接头延伸部，(ii)所有三个次级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，并且(iii)初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与次级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在初级纳米结构与所有三个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将初级纳米结构连接到这三个次级纳米结构。在某些实施方案中，至少两个和/或所有三个次级纳米结构包含相同的单链杂交区序列。

在某些实施方案中，初级纳米结构经由包含不同的杂交区/被杂交区的接头来与两个次级纳米结构相邻连接。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构与两个次级纳米结构相邻连接，并且(i)初级纳米结构包含两个至少部分单链的核酸接头延伸部，其中至少部分单链的核酸接头延伸部中的每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，(ii)这两个次级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，其中至少部分单链的核酸接头延伸部中的每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，并且(iii)初级纳米结构核酸接头延伸部中的每一个初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与次级纳米结构核酸接头延伸部中的一个次级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在初级纳米结构与这两个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将初级纳米结构连接到这两个次级纳米结构。

在某些实施方案中，初级纳米结构经由包含不同的杂交区/被杂交区的接头来与三个次级纳米结构相邻连接。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构与三个次级纳米结构相邻连接，并且其中(i)初级纳米结构包含三个至少部分单链的核酸接头延伸部，其中至少部分单链的核酸接头延伸部中的至少一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，(ii)所有三个次级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，其中部分单链的核酸接头延伸部中的至少一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，并且(iii)初级纳米结构核酸接头延伸部中的每一个初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与次级纳米结构核酸接头延伸部中的次级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在初级纳米结构与所有三个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将初级纳米结构连接到这三个次级纳米结构。在某些实施方案中，初级纳米结构包含三个至少部分单链的核酸接头延伸部，并且至少部分单链的核酸接头延伸部中的至少两个和/或每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列。在某些实施方案中，次级纳米结构的部分单链的核酸接头延伸部中的至少两个和/或每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列。

根据前述代表性实施方案，本领域普通技术人员将理解，初级纳米结构可通过包含相同或不同的杂交区/被杂交区的核酸接头来连接到额外的相邻次级纳米结构(也称为近侧次级纳米结构)。

在某些实施方案中，初级纳米结构包含向纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。在某些实施方案中，次级纳米结构包含向纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。例如，初级纳米结构和/或次级纳米结构可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个荧光团部分中的任一者至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个荧光团部分中的任一者。在某些实施方案中，初级纳米结构以及连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构均包含向纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。在某些实施方案中，初级纳米结构以及连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构都包含向纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。在某些实施方案中，初级纳米结构以及连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构组合起来向纳米结构复合物赋予光谱曲线。在某些实施方案中，初级纳米结构和所有连接的次级纳米结构(在一些实施方案中，无论是与初级纳米结构相邻连接还是通过一个或多个居间的次级纳米结构)组合起来向纳米结构复合物赋予其光谱曲线。

在某些实施方案中，初级纳米结构包含独特鉴定序列。在某些实施方案中，次级纳米结构包含独特鉴定序列。在某些实施方案中，初级纳米结构以及连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构均包含独特鉴定序列。在某些实施方案中，初级纳米结构以及连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构都包含独特鉴定序列。在某些实施方案中，初级纳米结构和/或连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含两个或更多个独特鉴定序列。在某些实施方案中，初级纳米结构和/或次级纳米结构可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个独特鉴定序列中的任一者至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个独特鉴定序列中的任一者。在某些实施方案中，可将独特鉴定序列掺入纳米结构的核酸接头延伸部中，并且出于包含独特鉴定序列的纳米结构的目的，将其视为纳米结构的一部分。

在某些实施方案中，初级纳米结构包含独特鉴定序列以及向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。在某些实施方案中，连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含独特鉴定序列以及向次级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。在某些实施方案中，连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构包含独特鉴定序列以及向次级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。

在某些实施方案中，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到n数量的具有相同光谱曲线的次级纳米结构。与单独的初级纳米结构的荧光信号相比，具有相同光谱曲线的次级纳米结构可放大纳米结构复合物的荧光信号。如本文所公开的信号放大可使标记的分子或结构的信号处于当前可用仪器的检测极限内，即使先前不可能。这种放大具有比只有细胞时更广泛的应用，并且可以设想到用于检查目前不可检测的例如纳米晶体、超分子复合物、细胞外囊泡。另外，在某些实施方案中，这种放大能够通过荧光或基因组测量来进行单分子检测。

在某些实施方案中，放大量是可调谐的，并且可通过向纳米结构复合物添加额外的纳米结构来精确控制。在某些实施方案中，具有与初级纳米结构相同的光谱曲线的次级纳米结构各自也包含与初级纳米结构相同数量的荧光团部分并且将纳米结构复合物的荧光信号放大到单独初级纳米结构的荧光信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到包含与初级纳米结构相同的光谱曲线和相同数量的荧光团部分的一个次级纳米结构，其中次级纳米结构将纳米结构复合物的荧光信号放大到单独初级纳米结构的荧光信号的量的约2倍。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到两个次级纳米结构，每个次级纳米结构具有与初级纳米结构相同的光谱曲线和相同数量的荧光团部分；其中这两个次级纳米结构将纳米结构复合物的荧光信号放大到单独初级纳米结构的荧光信号的量的约3倍。并且，例如，在某些实施方案中，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到三个次级纳米结构，每个次级纳米结构具有与初级纳米结构相同的光谱曲线和相同数量的荧光团部分；其中这三个次级纳米结构将纳米结构复合物的荧光信号放大到单独初级纳米结构的荧光信号的量的约4倍。根据前述代表性实施方案，本领域普通技术人员将理解，通过将额外的次级纳米结构相邻地或经一个或多个居间次级纳米结构连接到初级纳米结构，可以以定量控制的方式实现额外的放大。

类似地，并且如从上文将理解的，在某些实施方案中，初级纳米结构包含独特鉴定序列并且连接到n数量的包含相同独特鉴定序列的次级纳米结构。与单独的初级纳米结构的测序信号相比，具有相同独特鉴定序列的次级纳米结构放大了纳米结构复合物的测序信号。在某些实施方案中，次级纳米结构各自也包含与初级纳米结构相同数量的独特鉴定序列并且将纳米结构复合物的测序信号放大到单独初级纳米结构的测序信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。

并非本公开的所有实施方案都必然导致信号的放大。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构包含荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且相邻地或经一个或多个居间次级纳米结构连接到包含一种或多种猝灭剂的次级纳米结构，该一种或多种猝灭剂吸收初级纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与初级纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。在某些实施方案中，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到次级纳米结构，该次级纳米结构包含向次级纳米结构和/或纳米结构复合物赋予与初级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。即，添加次级纳米结构可改变光谱曲线，使得纳米结构复合物的光谱曲线不同于初级纳米结构的光谱曲线。在某些实施方案中，次级纳米结构包含可与初级纳米结构的荧光团部分或荧光团部分的组合进行福斯特共振能量转移的荧光团部分或荧光团部分的组合。在某些实施方案中，初级纳米结构连接到至少两个次级纳米结构，每个次级纳米结构包含向每个次级纳米结构和/或纳米结构复合物赋予与初级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。在某些实施方案中，连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含向这种次级纳米结构赋予与另一连接的次级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。在某些实施方案中，连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构包含向每个次级纳米结构赋予与任何其它连接的次级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。

在某些实施方案中，通过控制纳米结构复合物的荧光团或荧光团组合的数量，放大量甚至更精确地可调谐和可控。例如，在某些实施方案中，初级纳米结构包含x数量的荧光团部分或荧光团部分的组合并且连接到y数量的次级纳米结构，每个次级纳米结构包含z数量的与初级纳米结构相同的荧光团部分或荧光团部分的组合，其中可独立地为每个次级纳米结构确定z并且来自次级纳米结构的z的总和为z_总数。在某些实施方案中，与单独的初级纳米结构的荧光信号相比，纳米结构复合物的荧光信号被放大到约(x+z_总数)/x倍。在某些实施方案中，z对于每个次级纳米结构是相同的并且z_总数＝y*z。

本公开的某些实施方案提供了纳米结构的聚合物。例如，初级核酸纳米结构可与一个或多个近侧次级核酸纳米结构相邻连接，并且近侧次级纳米结构中的至少一个近侧次级纳米结构进一步连接到另一个次级纳米结构。如本文别处更详细描述的，在某些实施方案中，初级纳米结构和一个或多个近侧次级纳米结构和/或一个或多个近侧次级纳米结构和与近侧次级纳米结构连接的另一个次级纳米结构可经由被杂交的至少部分双链的核酸接头来连接。在纳米结构聚合的某些实施方案中，复合物的至少一个纳米结构是荧光纳米结构和/或包含独特鉴定序列。在某些实施方案中，聚合可用于放大信号，例如其中初级纳米结构、近侧次级纳米结构和/或另一个次级纳米结构具有至少相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，初级纳米结构、近侧次级纳米结构和另一个次级纳米结构都具有至少相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，聚合可用于放大或修改信号，例如其中初级纳米结构、近侧次级纳米结构和/或另一个次级纳米结构具有不同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，初级纳米结构、近侧次级纳米结构和另一个次级纳米结构都具有不同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。

在某些实施方案中，纳米结构复合物包含通式：

P-L₁-S_P-L₂-(S_x-L_y)_n-Z

其中P是初级纳米结构，L₁是将初级纳米结构连接到次级纳米结构的接头，S_P(近侧次级纳米结构)是与初级纳米结构相邻连接的次级纳米结构，L₂是将S_P连接到另一个次级纳米结构的接头，n为零或正整数，(S_x-L_y)包含次级纳米结构S_x和将S_x连接到额外的次级纳米结构的接头L_y；并且Z是额外的一个或多个次级纳米结构。在某些实施方案中，Z是末端次级纳米结构S_T。

应当理解，初级纳米结构、近侧次级纳米结构、其它纳米结构和/或末端纳米结构以及连接它们的核酸接头的多种组合是可能的，提供了其代表性的但非限制性的示例以用于说明。在某些实施方案中，各种纳米结构可相同或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度，并且可通过相同接头或至少包含相同被杂交区序列的接头来连接。类似地，各种纳米结构可以是不同的或至少具有不同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度，并且可通过不同的接头来连接。例如，在某些实施方案中，P与S_p、S_T和/或S_x中的至少一者或全部相同，并且/或者具有与之相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，P与S_p、S_T和/或S_x中的一者或全部不同。例如，在某些实施方案中，S_p与P、S_T和/或S_x中的至少一者或全部相同，并且/或者具有与之相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。例如，在某些实施方案中，S_p与P、S_T和/或S_x中的一者或全部不同。例如，在某些实施方案中，S_T与P、S_p和/或S_x中的至少一者或全部相同，并且/或者具有与之相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。例如，在某些实施方案中，S_T与P、S_p和/或S_x中的一者或全部不同。

在某些实施方案中，L₁、L₂和/或L_y中的一者或多者是被杂交的至少部分双链的核酸接头。在某些实施方案中，L₁和L₂包含相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁和L₂包含不同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁和L_y包含相同的被杂交区序列。L₁和L_y包含不同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₂和L_y包含相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₂和L_y包含不同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁、L₂和L_y都包含相同的被杂交区序列。并且，在某些实施方案中，L₁、L₂和L_y各自包含不同的被杂交区序列。

在某些实施方案中，n为零并且纳米结构复合物包含通式：P-L₁-S_P-L₂-Z。在某些实施方案中，Z是S_T(例如，P-L₁-S_P-L₂-S_T)。

在某些实施方案中，n为一并且纳米结构复合物包含通式：P-L₁-S_P-L₂-S_x-L_y-Z。在某些实施方案中，Z是S_T(例如，P-L₁-S_P-L₂-S_x-L_y-S_T)。

在某些实施方案中，n为二并且纳米结构复合物包含通式：P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-Z。在某些实施方案中，Z是S_T(例如，P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-S_T)。在某些实施方案中，(S_x[a]-L_y[a])和(S_x[b]-L_y[b])相同。在某些实施方案中，S_x[a]和S_x[b]相同或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，L_y[a]和L_y[b]相同或至少包含相同的被杂交区序列。

在某些实施方案中，n为三并且纳米结构复合物包含通式：P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-S_x[c]-L_y[c]-Z。在某些实施方案中，Z是S_T(例如，P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-S_x[c]-L_y[c]-S_T)。在某些实施方案中，(S_x[a]-L_y[a])、(S_x[b]-L_y[b])和(S_x[c]-L_y[c])中的至少两者相同。在某些实施方案中，(S_x[a]-L_y[a])、(S_x[b]-L_y[b])和(S_x[c]-L_y[c])全都相同。在某些实施方案中，S_x[a]、S_x[b]和S_x[c]中的至少两者相同或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，S_x[a]、S_x[b]和S_x[c]全都相同或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，L_x[a]、L_x[b]和L_x[c]中的至少两者相同或至少包含相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L_x[a]、L_x[b]和L_x[c]全都相同或至少包含相同的被杂交区序列。

此外，在本文所公开的任何聚合纳米结构中，在某些实施方案中，P与S_p、S_x[a]、S_x[b]、S_x[c]和/或S_T相同或至少具有与之相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，P与S_p、S_x[a]、S_x[b]、S_x[c]和/或S_T不同。在某些实施方案中，S_p与P、S_T、S_x[a]、S_x[b]和/或S_x[c]相同或至少具有与之相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，S_p与P、S_T、S_x[a]、S_x[b]和/或S_x[c]不同。在某些实施方案中，S_T与P、S_p、S_x[a]、S_x[b]和/或S_x[c]相同或至少具有与之相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，S_T与P、S_p、S_x[a]、S_x[b]和/或S_x[c]不同。

此外，在本文公开的任何聚合纳米结构中，在某些实施方案中，L₁、L₂和L_y各自包含不同的被杂交区序列，并且n为二或更大，并且至少两个L_y包含相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁、L₂和L_y各自包含不同的被杂交区序列，并且n为二或更大，并且所有L_y包含相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁、L₂和L_y各自包含不同的被杂交区序列，并且n为二或更大，并且除了将S_x连接到S_T的L_y之外，所有L_y包含相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁与L₂、L_y[a]、L_y[b]和/或L_y[c]相同或至少包含与之相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁包含与L₂、L_y[a]、L_y[b]和/或L_y[c]不同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₂与L₁、L_y[a]、L_y[b]和/或L_y[c]相同或至少包含与之相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₂包含与L₁、L_y[a]、L_y[b]和/或L_y[c]不同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁包含与L₂不同的被杂交区序列，并且L₁和L₂包含与L_y[a]、L_y[b]和L_y[c]中的任一者不同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁包含与L₂不同的被杂交区序列，L₁和L₂包含与L_y[a]、L_y[b]和L_y[c]中的任一者不同的被杂交区序列，并且L_y[a]、L_y[b]和L_y[c]相同或至少包含相同的被杂交区序列。在某些实施方案中，L₁包含与L₂不同的被杂交区序列，L₁和L₂包含与L_y[a]、L_y[b]和L_y[c]中的任一者不同的被杂交区序列，并且L_y[a]、L_y[b]和L_y[c]相同或至少包含相同的被杂交区序列，例外的是如果L_y[c]将S_x连接到S_T，则L_y[c]包含与L_y[a]和L_y[b]不同的被杂交区序列。

本领域普通技术人员将理解，可以以与上述说明性示例一致的方式添加额外的L_y接头。此外，应当理解，通过控制各种纳米结构的至少部分单链的核酸接头延伸部的杂交区序列以及因此控制纳米结构复合物内的被杂交区，与初级纳米结构连接的次级纳米结构的同一性和/或顺序由次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的杂交区序列决定。

在某些实施方案中，末端次级纳米结构不能通过杂交来连接到额外的次级纳米结构。例如，在某些实施方案中，末端次级纳米结构仅包含用于与另一个次级纳米结构杂交的一个至少部分单链的接头延伸部。在某些实施方案中，至少一个次级纳米结构包含一种或多种猝灭剂，该一种或多种猝灭剂吸收另一个纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与另一个纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。在某些实施方案中，正是末端次级纳米结构包含一种或多种猝灭剂，该一种或多种猝灭剂吸收另一个纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与另一个纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。

在本公开的聚合纳米结构的某些实施方案中，可将次级纳米结构聚合成分支网络。例如，在某些实施方案中，至少一个近侧次级纳米结构与两个或更多个其它次级纳米结构相邻连接，使得近侧次级纳米结构与三个其它纳米结构相邻连接。在某些实施方案中，至少一个非近侧次级纳米结构与三个或更多个其它次级纳米结构相邻连接。

本文还提供了组装在核酸支架上的纳米结构的复合物(参见例如图13C和图15)。在某些实施方案中，纳米结构复合物包含核酸支架，该核酸支架连接有至少一个初级核酸纳米结构，其中初级纳米结构包含与核酸支架的序列的至少一部分杂交的至少部分单链的核酸接头延伸部。在某些实施方案中，核酸支架连接到特异性决定分子。在某些实施方案中，复合物经由特异性决定分子来结合于靶标。出于利用核酸支架的实施方案的目的，与支架相邻连接的任何纳米结构均被视为初级纳米结构。在某些实施方案中，经由杂交将至少两个初级纳米结构连接到核酸支架。在某些实施方案中，至少两个初级纳米结构中的至少两个初级纳米结构相同或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，所有初级纳米结构相同或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。相反，应当理解，初级纳米结构中的两个初级纳米结构或更多个可不同。在某些实施方案中，至少一个初级纳米结构连接到一个或多个次级纳米结构。在某些实施方案中，复合物的至少一个纳米结构是荧光纳米结构和/或包含独特鉴定序列。

本文提供了包含两个或更多个不同初级纳米结构的多重组合物，该初级纳米结构中的至少一个初级纳米结构是根据本文公开的任何实施方案的纳米结构复合物的一部分。在某些实施方案中，至少一个初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且不同初级纳米结构至少在荧光团部分的存在、荧光团部分的数量、荧光团部分的位置和/或荧光团部分的光谱曲线方面不同。在某些实施方案中，至少一个初级纳米结构包含独特鉴定序列，并且不同初级纳米结构至少在独特鉴定序列的存在、数量和/或序列方面不同。

在某些实施方案中，不同初级纳米结构中的至少两个不同初级纳米结构缀合到不同特异性决定分子。在某些实施方案中，不同初级纳米结构中的每一个初级纳米结构缀合到不同特异性决定分子。在某些实施方案中，不同初级纳米结构的不同之处仅在于与它们缀合的不同特异性决定分子。在某些实施方案中，不同特异性决定分子靶向不同靶标。

在某些实施方案中，多重组合物的不同初级纳米结构中的至少两个不同初级纳米结构的不同之处至少在于构成初级纳米结构的一个或多个核酸的序列，并且/或者组合物的不同初级纳米结构中的至少两个不同初级纳米结构各自包含一个或多个至少部分单链的核酸接头延伸部，并且不同之处至少在于它们的一个或多个至少部分单链的核酸接头延伸部的序列和/或组合。在某些实施方案中，至少两个不同初级纳米结构具有相同的光谱曲线、相同的序列信号和/或相同的荧光强度和/或序列信号强度。

在某些实施方案中，多重组合物包含不与次级纳米结构连接的至少一个初级纳米结构。在某些实施方案中，多重组合物包含两种或更多种不同的纳米结构复合物。在某些实施方案中，所有初级纳米结构是纳米结构复合物的一部分。

在某些实施方案中，具有不同初级纳米结构的不同纳米结构复合物中的至少两个不同纳米结构复合物包含不同次级纳米结构。在某些实施方案中，具有不同初级纳米结构的不同纳米结构复合物各自包含不同次级纳米结构。在某些实施方案中，具有不同初级纳米结构的不同纳米结构复合物中的至少两个不同纳米结构复合物包含相同的次级纳米结构或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度的次级纳米结构。在某些实施方案中，至少一个次级纳米结构包含向次级纳米结构赋予光谱曲线的一个或多个荧光团部分，并且不同次级纳米结构至少在荧光团部分的存在、荧光团部分的数量、荧光团部分的位置和/或荧光团部分的光谱曲线方面不同。在某些实施方案中，至少一个次级纳米结构包含独特鉴定序列，并且不同次级纳米结构至少在独特鉴定序列的存在、数量和/或序列方面不同。

在某些实施方案中，不同次级纳米结构中的至少两个不同次级纳米结构的不同之处至少在于构成次级纳米结构的一个或多个核酸的序列，并且/或者不同次级纳米结构中的至少两个不同次级纳米结构各自包含至少部分单链的核酸接头延伸部，并且不同之处至少在于它们的至少部分单链的核酸接头延伸部的杂交区序列。在某些实施方案中，至少两个不同次级纳米结构具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，对于每个纳米结构复合物而言，初级纳米结构以及其连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构相同或至少具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。在某些实施方案中，对于每个纳米结构复合物而言，初级纳米结构以及其连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构具有相同数量的荧光团部分和/或相同数量的独特鉴定序列。

在某些实施方案中，对于至少一个纳米结构复合物而言，初级纳米结构包含荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到包含一种或多种猝灭剂的次级纳米结构，该一种或多种猝灭剂吸收初级纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与初级纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。

在某些实施方案中，多重组合物包含至少两个纳米结构复合物，并且(i)第一纳米结构复合物的初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，其中所述第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接到次级纳米结构，该次级纳米结构包含向次级纳米结构赋予与其连接的初级纳米结构不同的光谱曲线和/或向第一纳米结构复合物赋予与其初级纳米结构不同的光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合；并且(ii)至少第二纳米结构复合物的初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予与第一纳米结构复合物的初级纳米结构的光谱曲线不同的光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，其中至少第二纳米结构复合物的初级纳米结构还连接到次级纳米结构，该次级纳米结构包含向次级纳米结构赋予与其连接的初级纳米结构不同的光谱曲线和/或向第二纳米结构复合物赋予与其初级纳米结构不同的光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。在某些实施方案中，纳米结构复合物中的至少一个纳米结构复合物的光谱曲线不同于其初级纳米结构的光谱曲线。在某些实施方案中，纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物的光谱曲线不同于其初级纳米结构的光谱曲线。在某些实施方案中，所有纳米结构复合物的光谱曲线不同于其初级纳米结构的光谱曲线。在某些实施方案中，纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物或全部具有光谱曲线。并且，在某些实施方案中，所有纳米结构复合物具有相同光谱曲线。

在某些实施方案中，多重组合物包含至少两个纳米结构复合物，其中第一复合物的初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且至少第二复合物的初级纳米结构也包含向初级纳米结构赋予与第一纳米结构复合物的初级纳米结构的光谱曲线不同的光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且其中与第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接的次级纳米结构包含向其赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且与至少第二纳米结构复合物的初级纳米结构连接的次级纳米结构包含与和第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接的次级纳米结构相同的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。在某些实施方案中，与第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接的次级纳米结构以及与第二纳米结构复合物的初级纳米结构连接的次级纳米结构是相同的。

在某些实施方案中，至少两个纳米结构复合物是荧光纳米结构复合物，并且彼此不同之处至少在于它们的荧光团部分的总数和/或它们的荧光信号强度。在某些实施方案中，纳米结构复合物彼此不同之处还在于它们的光谱曲线。在某些实施方案中，组合物中的一个纳米结构复合物的初级纳米结构的荧光团部分的数量不同于另一个初级纳米结构复合物的荧光团部分的数量。在某些实施方案中，组合物中的一个纳米结构复合物的次级纳米结构的荧光团部分的数量不同于另一个次级纳米结构复合物的荧光团部分的数量。

本公开的多重组合物的纳米结构复合物可包含如本文别处详细描述的聚合纳米结构。在某些实施方案中，至少一个纳米结构复合物包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构。在某些实施方案中，两个或更多个纳米结构复合物包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构。在某些实施方案中，包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构的至少一个纳米结构复合物具有与包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构的至少一个其它纳米结构复合物不同数量的次级纳米结构。

在某些实施方案中，至少两个纳米结构复合物包含独特鉴定序列，并且彼此不同之处至少在于它们的独特鉴定序列的总数和/或它们的测序信号的强度。在某些实施方案中，纳米结构复合物彼此不同之处还在于它们的独特鉴定序列的序列。在某些实施方案中，至少两个纳米结构复合物靶向相同靶分子，并且所述至少两个纳米结构复合物中的至少一个纳米结构复合物包含独特鉴定序列，并且所述至少两个纳米结构复合物中的至少另一个纳米结构复合物不包含具有相同序列的独特鉴定序列或不包含独特鉴定序列。在某些实施方案中，组合物中的一个纳米结构复合物的初级纳米结构的独特鉴定序列的数量不同于另一个纳米结构复合物的另一个初级纳米结构的独特鉴定序列的数量。在某些实施方案中，组合物中的一个纳米结构复合物的次级纳米结构的独特鉴定序列的数量不同于另一个纳米结构复合物的另一个次级纳米结构的独特鉴定序列的数量。

在某些实施方案中，多重组合物包含至少两个纳米结构复合物，并且纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物包含与次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合连接的初级纳米结构，并且进一步地，其中组合物中的一个纳米结构复合物的次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合不同于另一个纳米结构的次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合。在某些实施方案中，至少两个纳米结构复合物在其次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合中包含共同的至少一个次级纳米结构。在某些实施方案中，至少两个纳米结构复合物在其次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合中不包含共同的次级纳米结构。

在某些实施方案中，组合物中的一个纳米结构复合物具有与至少一个其它纳米结构复合物不同的光谱曲线和/或不同的荧光信号强度。在某些实施方案中，组合物中的一个纳米结构复合物具有与至少一个其它纳米结构复合物不同的测序信号和/或不同的测序信号强度。在某些实施方案中，组合物中的至少一个纳米结构复合物与至少一个其它纳米结构复合物和/或任何其它纳米结构复合物具有独特的荧光同一性和/或测序同一性。

在某些实施方案中，与初级纳米结构连接的次级纳米结构或次级纳米结构的组合由它们的至少部分单链的接头延伸部与初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的序列的序列互补性来确定。在某些实施方案中，出于杂交的目的，组合物中的一个初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的序列与至少一个其它初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的序列不同。

应当理解，对于本公开的多重组合物的任何纳米结构复合物或纳米结构而言，在某些实施方案中，至少一个纳米结构复合物被公开为结合于靶标。

本文提供了标记靶分子的方法。在某些实施方案中，方法包括将如本文任何地方所述的核酸纳米结构复合物结合于靶分子。在某些实施方案中，纳米结构复合物是本文所述的多重组合物的一部分。在某些实施方案中，该方法还包括测量标记的靶分子的荧光信号和/或测序信号。在某些实施方案中，该方法还包括检测标记的靶分子。

本领域普通技术人员将认识到，不同组装程度的特异性决定分子和纳米结构复合物可按许多不同的顺序结合于靶标。本文提供了若干代表性的非限制性示例。

在某些实施方案中，初级纳米结构结合于靶标。例如，在某些实施方案中，该方法包括(i)首先将初级核酸纳米结构连接到靶分子，其中初级核酸纳米结构特异性结合于靶分子，以及(ii)随后将一个或多个次级纳米结构连接到结合于靶分子的初级纳米结构以形成结合于靶分子的纳米结构复合物。在其它实施方案中，在初级纳米结构结合于靶分子之前，一个或多个次级纳米结构或纳米结构复合物的所有次级纳米结构或除一个或多个末端纳米结构之外的纳米结构复合物的所有次级纳米结构可结合于初级纳米结构。如本文别处更详细讨论的，在某些实施方案中，经由次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将一个或多个次级纳米结构连接到初级纳米结构。

某些实施方案包括(i)首先将特异性决定分子连接到靶分子，其中特异性决定分子特异性结合于靶分子；(ii)接下来将初级纳米结构连接到结合于靶分子的特异性决定分子；以及(iii)随后将一个或多个次级纳米结构连接到结合于特异性决定分子的初级纳米结构，因此形成结合于靶分子的纳米结构复合物。在某些实施方案中，经由初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与特异性决定分子的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将初级纳米结构连接到特异性决定分子。在某些实施方案中，初级纳米结构经由生物素/生物素结合蛋白复合物连接到特异性决定分子。在某些实施方案中，经由次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将一个或多个次级纳米结构连接到初级纳米结构。

某些实施方案还包括将至少一个额外的次级纳米结构连接到已与初级纳米结构相连的近侧次级纳米结构。在某些实施方案中，经由额外次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与近侧次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将至少一个额外的次级纳米结构连接到近侧次级纳米结构。此外，某些实施方案还包括将至少一个进一步额外的次级纳米结构相邻地或经居间的次级纳米结构连接到已与连接到近侧次级纳米结构的次级纳米结构相连的次级纳米结构。在某些实施方案中，经由进一步额外的次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与另一次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将至少一个进一步额外的次级纳米结构连接到另一个次级纳米结构。在某些实施方案中，添加至少一个进一步额外的次级纳米结构形成与初级纳米结构连接的次级纳米结构的线性聚合物，如本文别处更详细描述的。在某些实施方案中，添加两个或更多个进一步额外的次级纳米结构形成次级纳米结构的分支网络，如本文别处更详细描述的。

可在组装最终纳米结构之前预组装纳米结构的某些组分。例如，在某些实施方案中，两个或更多个次级纳米结构在被掺入纳米结构复合物中之前连接在一起。此外，即使当将各种组分混合在一起时，也可控制组装顺序，而不考虑它们的掺入顺序。例如，在某些实施方案中，使两个或更多个次级纳米结构同时与初级纳米结构或已被部分组装成包含初级纳米结构和至少一个近侧次级纳米结构的纳米结构复合物接触，其中两个或更多个次级纳米结构掺入纳米结构复合物中的顺序由次级纳米结构的至少部分单链的核酸接头延伸部的序列决定(而不是由它们添加的顺序决定)。

进一步的代表性方法包括其中：

(i)在将纳米结构复合物结合于靶分子之前，已将构成核酸纳米结构复合物的初级纳米结构和特异性决定分子组装在一起；

(ii)在将纳米结构复合物结合于靶分子之前，已将构成核酸纳米结构复合物的初级纳米结构和一个或多个次级纳米结构组装在一起；

(iii)在将纳米结构复合物结合于靶分子之前，将构成核酸纳米结构复合物的初级纳米结构和所有次级纳米结构组装在一起；

(iv)先将构成核酸纳米结构复合物的初级纳米结构和一个或多个次级纳米结构组装在一起，再将初级纳米结构连接到特异性决定分子，之后将纳米结构复合物结合于靶分子；并且/或者

(v)先将构成核酸纳米结构复合物的初级纳米结构和所有次级纳米结构组装在一起，再将初级纳米结构连接到特异性决定分子，之后将纳米结构复合物结合于靶分子。

末端次级纳米结构可用于特殊目的，诸如猝灭纳米结构复合物的信号。因此，在某些实施方案中，在将初级纳米结构连接到特异性决定分子之前和/或在将核酸纳米结构复合物结合于靶分子之前，除了一个或多个最终末端次级纳米结构之外，将构成纳米结构复合物的初级纳米结构和所有次级纳米结构组装在一起。在某些实施方案中，最终末端次级纳米结构在结合于靶分子之前都不组装到纳米结构复合物上。某些实施方案包括在将组装的纳米结构复合物的剩余部分结合于靶分子之后连接最终末端次级纳米结构。在某些实施方案中，在连接一个或多个末端次级纳米结构之前和之后测量荧光信号。

在某些实施方案中，与靶分子结合的纳米结构复合物的至少初级纳米结构和/或至少一个次级纳米结构是荧光纳米结构和/或包含独特鉴定序列。在某些实施方案中，该方法包括测量来自标记的靶分子的荧光信号和/或序列信号。在某些实施方案中，检测荧光信号和/或测序信号。在某些实施方案中，该方法包括在初级纳米结构和/或纳米结构复合物结合于靶分子之后但在纳米结构复合物完全组装之前测量荧光信号和/或测序信号，然后在至少一个次级纳米结构或额外的次级纳米结构组装到纳米结构复合物中之后再测量荧光信号和/或测序信号至少一次。在某些实施方案中，该方法包括在连接最终末端次级纳米结构之前测量来自标记的靶分子的荧光信号，然后在连接最终末端次级纳米结构之后测量荧光信号。在某些实施方案中，最终末端次级纳米结构包含一种或多种猝灭剂，该一种或多种猝灭剂吸收荧光团部分的荧光和/或与荧光团部分进行福斯特共振能量转移。

本文提供了标记一个或多个靶分子的多重方法。在某些实施方案中，方法包括根据上述方法将本公开的两个或更多个纳米结构复合物或本公开的至少一个纳米结构复合物和至少一个初级纳米结构结合于一个或多个靶分子。

在某些实施方案中，纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物结合于相同靶分子，但纳米结构复合物至少在光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同。在某些实施方案中，纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物结合于不同靶分子，但在其他方面，纳米结构复合物具有相同的光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度。在某些实施方案中，纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物结合于不同靶分子，并且纳米结构复合物至少在光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同。在某些实施方案中，不同纳米结构复合物至少在它们的初级纳米结构方面不同，并且/或者其中不同纳米结构复合物至少在次级纳米结构和/或次级纳米结构的数量方面不同。在某些实施方案中，至少两个不同靶分子由相同纳米结构复合物结合或结合于具有至少相同的光谱曲线、荧光信号强度、测序信号和/或测序信号强度的纳米结构复合物，并且至少一个其它靶分子结合于至少在光谱曲线、荧光信号强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同的纳米结构复合物。在某些实施方案中，每个靶分子结合于不同纳米结构复合物，该不同纳米结构复合物至少在光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同于一个或多个其它纳米结构复合物。在某些实施方案中，至少一个纳米结构复合物和至少一个初级纳米结构结合于相同靶分子。在某些其它实施方案中，至少一个纳米结构复合物和至少一个初级纳米结构结合于不同靶分子。

在某些实施方案中，对于至少一个纳米结构复合物而言，与单独的初级纳米结构相比，添加一个或多个次级纳米结构(以在结合于靶分子之前形成至少部分组装的纳米结构复合物和/或组装纳米结构复合物，其中纳米结构复合物的至少一部分已经结合于靶分子)放大了荧光信号和/或测序信号。在某些实施方案中，可按化学计量控制信号的放大。在某些实施方案中，对于至少一个纳米结构复合物而言，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合并且连接到n数量的具有相同光谱曲线的次级纳米结构，其中与单独初级纳米结构的荧光信号相比，具有相同光谱曲线的次级纳米结构放大了纳米结构复合物的荧光信号。在某些实施方案中，具有与初级纳米结构相同的光谱曲线的次级纳米结构各自也包含与初级纳米结构相同数量的荧光团部分并且将纳米结构复合物的荧光信号放大到单独初级纳米结构的荧光信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。在某些实施方案中，上述内容应用于多重方法中的至少两个纳米结构复合物。

在某些实施方案中，对于至少一个纳米结构复合物而言，初级纳米结构包含独特鉴定序列并且连接到n数量的包含相同独特鉴定序列的次级纳米结构，其中与单独初级纳米结构的测序信号相比，具有相同独特鉴定序列的次级纳米结构放大了纳米结构复合物的测序信号。在某些实施方案中，次级纳米结构各自也包含与初级纳米结构相同数量的独特鉴定序列并且将纳米结构复合物的测序信号放大到单独初级纳米结构的测序信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。在某些实施方案中，上述内容应用于多重方法中的至少两个纳米结构复合物。

在某些实施方案中，对于至少一个纳米结构复合物而言，初级纳米结构包含荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到包含一种或多种猝灭剂的次级纳米结构，该一种或多种猝灭剂吸收初级纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与初级纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。在某些实施方案中，上述内容应用于多重方法中的至少两个纳米结构复合物。

在某些实施方案中，对于至少一个纳米结构复合物而言，初级纳米结构包含向初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到次级纳米结构，该次级纳米结构包含向次级纳米结构和/或纳米结构复合物赋予与初级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。在某些实施方案中，纳米结构复合物的光谱曲线不同于初级纳米结构的光谱曲线。在某些实施方案中，次级纳米结构包含可与初级纳米结构的荧光团部分或荧光团部分的组合进行福斯特共振能量转移的荧光团部分或荧光团部分的组合。在某些实施方案中，在添加向纳米结构复合物赋予不同光谱曲线的次级纳米结构之前和之后测量标记的靶分子的荧光。在某些实施方案中，初级纳米结构连接到至少两个次级纳米结构，每个次级纳米结构包含向每个次级纳米结构和/或纳米结构复合物赋予与初级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。在某些实施方案中，连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含向这种次级纳米结构赋予与另一连接的次级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。在某些实施方案中，连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构包含向每个次级纳米结构赋予与任何其它连接的次级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。此外，在某些实施方案中，上述内容应用于多重方法中的至少两个纳米结构复合物。

在某些实施方案中，对于至少一个纳米结构复合物而言，初级纳米结构包含x数量的荧光团部分或荧光团部分的组合并且连接到y数量的次级纳米结构，每个次级纳米结构包含z数量的与初级纳米结构相同的荧光团部分或荧光团部分的组合，其中独立地为每个次级纳米结构确定z并且来自次级纳米结构的z的总和为z_总数。与单独的初级纳米结构的荧光信号相比，纳米结构复合物的荧光信号被放大到约(x+z_总数)/x倍。在某些实施方案中，z对于每个次级纳米结构是相同的并且z_总数＝y*z。在某些实施方案中，上述内容应用于多重方法中的至少两个纳米结构复合物。

此外，一旦通过本公开的方法标记，就可检测靶分子。某些实施方案包括根据本公开的方法标记靶分子以及测量来自标记的靶分子的荧光信号和/或序列信号。在某些实施方案中，该方法是多重方法，并且该方法包括标记至少两个靶分子以及测量来自标记的靶分子的荧光信号和/或序列信号。

本文还提供了用于进行本公开的任何方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含本文任何地方描述的纳米结构复合物或其组分。在某些实施方案中，试剂盒包含用于根据本文所述的任何方法标记靶分子的试剂和/或设备。在某些实施方案中，试剂盒还包含印刷和/或在电子存储介质上的说明书、缓冲剂和/或额外试剂，和/或包装材料。

核酸纳米结构荧光标记。

WO/2018/231805中已经详细描述核酸纳米结构荧光标记，该专利全文以引用的方式并入本文。可用作标记的核酸纳米结构荧光标记可经由各种技术形成。在一些实例中，DNA自组装可用于确保标记内谐振器的相对位置对应于根据所需时间衰减曲线指定的位置。例如，网络的每个谐振器可联接到各自指定的DNA链。每条DNA链可包括一个或多个部分，部分与一个或多个其它DNA链的部分互补，使得DNA链自组装成纳米结构，该纳米结构将谐振器维持在指定的相对位置。

在某些实施方案中，核酸纳米结构荧光标记包含一个或多个多核苷酸。在某些实施方案中，那些多核苷酸中的一个或多个多核苷酸的长度为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、7500或10,000个核苷酸，或其间的任何范围。在某些实施方案中，那些多核苷酸中的一个或多个多核苷酸的长度为至少约10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200、300或400个核苷酸，或其间的任何范围。在某些实施方案中，那些多核苷酸中的一个或多个多核苷酸的长度为至少约20、25、30、35、40、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、110或120个核苷酸，或其间的任何范围。在某些实施方案中，核酸纳米结构荧光标记包含两个、三个、四个、五个、六个或更多个多核苷酸。在某些实施方案中，核酸纳米结构荧光标记包含至少约50、100、200、500、1000、5000、10000、15000、20000个或其间的任何范围的核苷酸总数。

DNA自组装和其它新兴的纳米级制造技术允许以纳米级精度制造特定结构的许多实例。例如，如WO/2018/231805中所描述，核酸纳米结构是通过对化学方法生产的定制合成DNA进行退火制成。多条链在混合和退火之前与荧光团、肽、小分子等预缀合。序列被设计成使得具有最低能量的单个有限组件，并且在溶液、干燥或冷冻中稳定，并保留任何缀合材料的相对位置。这种精度可允许荧光团、量子点、染料分子、等离子体纳米棒或其它光学谐振器相对于彼此定位在精确的位置和/或方向，以创建各种光学谐振器网络。可指定这类谐振器网络以便于各种不同的应用。在一些示例中，谐振器网络可被设计成使得它们表现出光激发(例如，通过照明脉冲)与再发射之间的预先指定的时间关系；这可使得能够使用单个激发波长和单个检测波长来检测时间多重化的标记和标签剂(taggant)。另外地或替代地，可利用这些谐振器网络相对于激发的光再发射定时的概率性质来生成随机变量的样品。这些谐振器网络可包括一个或多个呈现暗态的“输入谐振器”；包括这类输入谐振器的谐振器网络可被配置为实施逻辑门或其它结构以控制激子或其它能量通过谐振器网络的流动。然后可使用这类结构，例如允许通过单个谐振器网络检测各种不同的分析物，控制使用谐振器网络生成的随机变量的分布，进一步多路复用一组用于成像的标记生物样品，或促进一些其它应用。

这些谐振器网络包括荧光团、量子点、染料、拉曼染料、导电纳米棒、发色团或其他光学谐振器结构的网络。网络还可包括抗体、适体、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)链，或被配置成允许选择性与感兴趣的分析物(例如，表面蛋白质、分子表位、特征核苷酸序列或感兴趣的分析物的其它特征)结合。标记可用于观察样品、鉴定样品的内容物(例如鉴定样品中的细胞、蛋白或其它粒子或物质)，基于它们的鉴定对这类内容物进行分类(例如，根据鉴定的细胞类型或其它特性在流式细胞仪内对细胞进行分类)，或促进一些其它应用。在本文公开的某些实施方案中，标记经由多核苷酸接头连接到底物，如抗体或珠粒。

在实例应用中，可应用这类谐振器网络(例如，通过将谐振器网络联接到抗体、适体或其它分析物特异性受体)来检测在生物或材料样品或其它感兴趣的环境中大量不同的标记的存在，它们之间的区分，或以其它方式观察。这类标记可允许检测样品中(例如，在流式细胞术设备的通道中)一种或多种感兴趣的分析物的存在、数量或位置。访问大量可区分标记的文库可允许同时检测大量不同的分析物。另外或替代地，通过使用多个标记与相同的分析物(例如，分析物的不同表位、表面蛋白或其它特征)结合，对可区分标记的大文库的访问可允许更准确地检测特定分析物(例如，感兴趣的细胞类型或亚型)。又另外，访问这类大的标记文库可允许根据相应感兴趣分析物的可能密度或数量来选择标记，例如以确保对应于样品中具有不同浓度的分析物的不同标记的有效亮度，在光学询问此类样品时大致相同。

这类标记可通过在激发光谱、发射光谱、荧光寿命、荧光强度、对光漂白的敏感性、对与分析物或一些其它环境因素的结合的荧光依赖性、再发射的光的偏振，或一些其它光学特性方面的不同而区分。

WO/2018/231805描述用于指定、制造、检测和鉴定在时间衰减曲线和/或激发和发射光谱方面不同的光学标记的方法。另外或替代地，所提供的标记可具有相对于现有标记(例如，基于荧光团的标记)的增强的亮度并且可具有可配置的亮度以促进面板设计或允许不同标记的相对亮度以促进一些其它考虑。这类标记在激发标记(例如，通过超快激光脉冲)之后由标记再发射光的时间相关概率可不同。另外或替代地，这类标记可包括谐振器网络以增加标记的激发波长和标记的发射波长之间的差(例如，通过在输入谐振器和输出谐振器之间插入多个中介谐振器以允许激子在输入谐振器和输出谐振器之间传输，在其之间直接能量转移为不利的)。又另外，这类标记可包括逻辑门或其它光学可控结构以在检测和鉴定标记时允许进一步多路复用。

如WO/2018/231805中描述的谐振器网络(例如，作为标记的一部分包括的谐振器网络)可以多种方式制造，使得一个或多个输入和/或读出谐振器、输出谐振器、暗态呈现“逻辑输入”谐振器和/或中介谐振器根据指定的谐振器网络进行布置，并且进一步使得网络的时间衰减曲线、网络的亮度、激发光谱、发射光谱、斯托克斯位移，或网络的一些其它光学性质，或网络的感兴趣的一些其它可检测特性(例如，与感兴趣的分析物结合的状态)对应于其规范(例如，对应于指定的时间衰减曲线、响应于照明而发射的概率)。这类布置可包括确保谐振器之间(例如，谐振器对之间)的相对位置、距离、取向或其它关系对应于谐振器之间的指定位置、距离、取向或其它关系。

这可包括使用DNA自组装来制造一个或多个谐振器网络的多个实例。举例来说，许多不同的DNA链可联接(例如，经由胸苷上的伯氨基修饰基团将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯修饰的染料分子连接到谐振器网络的各个谐振器(例如，输入谐振器、输出谐振器和/或介体谐振器)。DNA链对可具有至少部分互补的部分，使得当DNA链混合并暴露于指定条件(例如，指定pH或指定温度曲线)时，DNA链的互补部分对齐并结合在一起形成半刚性纳米结构，该结构维持谐振器网络的谐振器的相对位置和/或方向。

在代表性谐振器网络中，输入谐振器、输出谐振器和两个介体谐振器联接到各自的DNA链。然后联接的DNA链与额外的DNA链一起自组装成所说明的纳米结构，使得输入谐振器、介体谐振器和输出谐振器形成谐振器线。在一些实例中，可经由这类方法或其它技术形成多个单独的相同或不同的网络，作为谐振器网络的单个实例的一部分(例如，以增加谐振器网络的亮度)。

可指定这类谐振器网络的谐振器之间的距离，使得谐振器网络呈现一种或多种期望的行为(例如，被特定激发波长的光激发，并根据指定的时间衰减曲线响应性地再发射发射波长的光)。这可包括指定相邻谐振器之间的距离，使得它们能够在彼此之间(例如，双向或单向)传输能量，并且进一步使得谐振器不彼此猝灭或以其它方式干扰彼此的光学特性。在其中谐振器经由接头结合到主链(例如，经由酰胺键(例如由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯分子形成)或其它连接结构与DNA主链结合)，接头可联接到考虑到这些因素以及接头的长度指定的主链位置。例如，联接位置可相隔大于接头长度两倍的距离(例如，以防止谐振器彼此接触，并且因此彼此猝灭或以其它方式干扰彼此的光学特性)。另外或替代地，联接位置可分开的距离小于谐振器可在彼此之间传输能量的最大距离。例如，当经由福斯特共振能量转移传输能量时，谐振器可为荧光团或以福斯特半径为特征的一些其它光学谐振器，并且联接位置可分开小于福斯特半径的距离。

以下实施例是以说明的方式而非限制的方式提供的。

实施例

示例1.单链DNA(ssDNA)接头序列对核酸纳米结构荧光的影响

本研究的目的是检查核酸纳米结构的ssDNA接头延伸部的序列是否影响其荧光特性。

材料和方法：在该实验中测试三个核酸纳米结构，每个核酸纳米结构具有不同的光谱特性和潜在的荧光团组合物。对于每个纳米结构而言，组装两种不同的型式：一种含有多聚T ssDNA接头延伸部，一种含有相同长度但由碱基混合物构成的ssDNA接头。使用相同的标准程序组装每个纳米结构。组装后，使用VARIOSKAN LUX酶标仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)在96孔板中测量每个纳米结构的荧光光谱。

结果：图3显示出用多聚T接头或由碱基混合物构成的接头组装的所有三个核酸纳米结构的叠加荧光光谱。几乎相同的光谱叠加表明，接头的序列对纳米结构的荧光光谱或量子产率没有显著影响。由于光谱的形状是根据组装过程(即，通过将多个荧光团布置到相互作用的FRET网络中)而形成的，因此这些结果也提供了组装产率没有被ssDNA接头延伸部的序列显著改变的支持性证据。如果产率受到影响，预期会看到光谱的变化，这是由于未掺入的荧光团不能参与FRET过程。此外，通过测试各自具有不同光谱特性的三个纳米结构，该实验说明只要使用相同核酸支架组装这些纳米结构，这些结果就可推广到不同的潜在荧光团组合物。

实施例2.使用初级-次级NOVAFLUOR Yellow 610核酸纳米结构复合物进行荧光放 大的实验方法

进行该实施例以证明如本文所述的二聚体结构P-(L-S)₁已形成并实现了相对于单体对照放大的荧光信号。进行流式细胞术和尺寸排阻色谱法(SEC)实验以提供二聚体已形成并放大了荧光信号的证据。

通过在每个NOVAFLUOR Yellow 610核酸纳米结构中包括含有至少部分互补区的接头延伸部来形成二聚体(如图1所述)。测试了两个不同长度的接头延伸部。一个接头延伸部为24个核苷酸长(“链-1”)，另一个接头延伸部为32个核苷酸长(“链-2”)。形成有这些接头延伸部的二聚体分别称为二聚体链-1和二聚体链-2。链是指在初级和次级核酸纳米结构的部分互补区之间形成的至少部分双链的结构。

样品制备：将1:1摩尔当量的初级和次级纳米结构(NOVAFLUOR Yellow 610，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)混合以形成P-(L-S)₁的二聚体结构。一旦形成二聚体，就通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析这些二聚体或者将这些二聚体缀合到抗人CD4抗体(克隆SK3)以进行染色。通过将二聚体与单链DNA修饰的抗CD4抗体以1:1的摩尔比混合来制备CD4染色剂。以相同的方式制备单体对照染色剂。

流式细胞术分析：首先用CELLBLOX单核细胞和巨噬细胞封闭缓冲剂的溶液(赛默飞世尔科技公司)处理外周血单核细胞(PBMC)，以防止抗体或核酸纳米结构与细胞表面的非特异性结合。接下来，用单体、二聚体链-1或二聚体链-2缀合物对细胞进行染色。也制备了未染色的细胞样品。在ATTUNE NxT流式细胞仪(赛默飞世尔科技公司)上分析染色的细胞。用FLOWJO软件(BD生物科学公司)处理FCS文件。

在流式细胞术实验中，预期会观察到相对于单体对照的放大信号。从下面的图16和表1可以看出，来自二聚体链-1和链-2的信号分别比单体亮0.5倍和0.7倍。

表1.YL2检测器通道中来自单体和二聚体NOVAFLUOR Yellow 610抗CD4抗体缀合物染色的PBMC的正中位荧光强度(MFI+)。x系数表示相对于单体的信号强度增加。

尺寸排阻色谱法分析：对于SEC实验而言，将单体和二聚体NOVAFLUOR Yellow 610核酸纳米结构上样于SEC柱上。在对应于DNA吸收的260nm处监测光密度。使用Octave软件4.4.1版处理数据(John W.Eaton、David Bateman、Hauberg、Rik Wehbring(2018)，GNU Octave 4.4.1版手册：用于数值计算的高级交互语言(GNU Octaveversion4.4.1manual:a high-level interactive language for numericalcomputations)，参见万维网https://www.gnu.org/software/octave/doc/v4.4.1/)。

在SEC实验中，预期较大的二聚体结构在较小的单体结构之前洗脱。图17显示出二聚体结构(链-1和链-2)比单体更早洗脱。这些结果表明二聚体是比单体更大的结构，因此提供了二聚体形成的证据。

上述流式细胞术和SEC实验提供了二聚体形成的大量证据，并且结果是荧光信号的放大。NOVAFLUOR Yellow 610是全都具有类似分子特性的许多此类核酸纳米结构中的一种核酸纳米结构。因此，可以设想到许多核酸纳米结构将以类似于NOVAFLUOR Yellow 610的方式表现，在流式细胞术中显示出放大的信号并且在SEC中比相应单体的保留时间更短。

实施例3.使用两步初级和次级核酸纳米结构染色的荧光放大和多色条形码化的 方法

该说明性实施例用于证实如本文所述的二聚体结构P-(L-S)₁将使用两个单独的染色步骤形成。在第一步骤中，仅用初级核酸纳米结构-抗体缀合物进行细胞染色。在第二步骤中，次级核酸纳米结构结合于初级核酸纳米结构并且形成二聚体。然后可测量二聚体的荧光。

之所以形成二聚体是因为初级和次级核酸纳米结构具有彼此至少部分互补的接头延伸部。在一些实施方案中，初级和次级核酸纳米结构的染料组合物是相同的，因此二聚体将相对于初级核酸纳米结构-抗体缀合物放大荧光信号(参见实施例1)。在其它实施方案中，初级和次级核酸纳米结构将具有不同和独特的光谱曲线，例如，以实现多色条形码化。

细胞制备：首先用CELLBLOX单核细胞和巨噬细胞封闭缓冲剂的溶液(赛默飞世尔科技公司)处理外周血单核细胞(PBMC)，以防止抗体或核酸纳米结构(例如，NOVAFLUOR纳米结构)与细胞表面的非特异性结合。接下来，用初级核酸纳米结构-抗体缀合物对细胞进行染色。也制备了未染色的细胞样品。然后，洗涤细胞以从细胞中去除任何未结合的或非特异性结合的缀合物。最后，将细胞分成两个单独的样品。

向一个样品中添加具有适当接头延伸部的次级核酸纳米结构，使得其可与初级核酸纳米结构-抗体缀合物上的互补接头杂交。向另一样品中添加次级核酸纳米结构阴性对照，其没有接头延伸部，因此不应与初级核酸纳米结构-抗体缀合物杂交。该样品还充当阴性对照以显示次级核酸纳米结构基本上不与初级核酸纳米结构、抗体或细胞非特异性结合。染色后洗涤这两个细胞样品，以从细胞中去除任何未结合或非特异性结合的次级核酸纳米结构。

初级和次级核酸纳米结构具有相同染料组合物时的信号放大：当通过流式细胞术获得细胞时，预期放大样品的正中位荧光强度(MFI+)大于初级核酸纳米结构抗体-缀合物和次级核酸纳米结构阴性对照样品。图18A和表2显示了相对于图18B和图18C的预测的信号倍增。由于次级核酸纳米结构阴性对照不包含接头延伸部，因此在添加核酸纳米结构时预期不会形成二聚体。如果是这样，则将不存在信号放大。图18C和表2显示了向初级核酸纳米结构-抗体缀合物添加次级核酸纳米结构阴性对照没有引起信号放大的预测。该结果的意义在于次级核酸纳米结构不与初级核酸纳米结构或细胞非特异性结合。此外，结果将证实次级核酸纳米结构需要接头延伸部才能结合，如通过比较图18A和图18C可以看出。

表2.FL检测器通道中来自实施例2的初级、初级+次级和初级+次级阴性对照核酸纳米结构-抗体缀合物的预测的正MFI(MFI+)。x系数表示相对于初级核酸纳米结构缀合物的信号强度。

初级和次级核酸纳米结构具有不同染料组合物时的多色条形码化：图19A表示在添加次级核酸纳米结构之前初级核酸纳米结构光谱特征将如何显现。此处，NOVAFLUORYellow 590(赛默飞世尔科技公司)用作初级核酸纳米结构的示例性光谱曲线，并且NOVAFLUOR Red 710(赛默飞世尔科技公司)用作示例性次级核酸纳米结构。图19B示出在将NOVAFLUOR Red 710添加到初级核酸纳米结构中时预期将得到的数据类型。应注意，在该实施例中，各个光谱曲线发生叠加；然而，当实际测量时，将获得总计的光谱曲线，其中所得曲线将取决于来自这两个NOVAFLUOR核酸纳米结构的单独贡献曲线的相对亮度。图19C示出次级NOVAFLUOR Red 710是阴性对照(即，无接头延伸部)时预期将得到的数据类型。在这种情况下，仅观察到初始NOVAFLUOR Yellow 590特征，从而证实需要接头延伸部才能形成二聚体。图19A和图19B所示的示例性数据表明形成二聚体的成功两步方法以及相对于来自初级核酸纳米结构-抗体缀合物的信号来修改荧光特征的能力。图19C所示的示例性数据表明，接头延伸部是次级核酸纳米结构结合的先决条件，并且其对初级核酸纳米结构的光谱曲线没有可观察到的非特异性结合效应。

实施例4.使用链霉亲和素作为中间交联剂的荧光放大

本研究的目的是证实利用链霉亲和素作为中间交联剂的抗体-核酸纳米结构缀合物信号的放大。使用NOVAFLUOR Yellow 610(赛默飞世尔科技公司)和NOVAFLUOR Yellow610二聚体结构，在流式细胞术实验中证实使用该方法可能实现的潜在放大。可以设想到这些试剂和方法可推广到任何核酸纳米结构和抗体组合。

测试了利用链霉亲和素来放大荧光信号的三种策略：

1.使用胺反应性标记化学使链霉亲和素与NOVAFLUOR Yellow 610复合，让所有生物素结合位点保持开放。该链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610复合物用作流式细胞术中生物素酰化抗体的次染剂。

2.通过掺入在3’端用生物素修饰的接头寡核苷酸来使NOVAFLUORYellow 610生物素酰化，然后以各种比率与链霉亲和素复合。该链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610复合物用作流式细胞术中生物素酰化抗体的次染剂。

3.通过掺入在3’端用生物素修饰的接头寡核苷酸来使NOVAFLUORYellow 610生物素酰化，然后以各种比率与链霉亲和素复合。然后将该链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610复合物与生物素酰化抗体一起温育以形成抗体-链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610复合物，该抗体-链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610复合物用作流式细胞术中的初染剂。

在这些方法中的任一种方法中，可使用核酸纳米结构二聚体代替核酸纳米结构单体来增加信号放大。使用策略2展示了该方法的原理论证。图20中示出了每种策略的示意图。

材料和方法：

使用胺反应性化学进行链霉亲和素标记。

使用单链接头寡核苷酸通过靶向蛋白质上的反应性胺来标记纯化的链霉亲和素，然后进行纯化以去除过量的接头寡核苷酸和未标记的链霉亲和素。将链霉亲和素-接头缀合物与含有互补单链接头的NOVAFLUOR核酸纳米结构在4℃下一起温育24小时，以形成链霉亲和素-NOVAFLUOR核酸纳米结构缀合物。

使用生物素酰化核酸纳米结构进行链霉亲和素标记。

为了合成生物素酰化NOVAFLUOR核酸纳米结构，首先将NOVAFLUOR核酸纳米结构折叠，其中从该纳米结构的臂中的一个臂伸出一个短单链DNA延伸部。然后将NOVAFLUOR核酸纳米结构与1当量的含有3’生物素修饰的互补单链DNA在4℃下一起温育24小时。为了形成链霉亲和素-NOVAFLUOR核酸纳米结构复合物，将纯化的链霉亲和素与1或2当量的生物素酰化NOVAFLUOR核酸纳米结构在4℃下一起温育24小时。

流式细胞术。

使用1百万个细胞在冰上进行所有染色和封闭步骤。首先用CELLBLOX单核细胞和巨噬细胞封闭缓冲剂的溶液(赛默飞世尔科技公司)处理人外周血单核细胞(PBMC)，以防止抗体或NOVAFLUOR核酸纳米结构与细胞表面的非特异性结合。特定于所测试的每种策略的后续步骤是：

策略1：用生物素-抗人CD4抗体(克隆SK3)对细胞进行染色，然后洗涤细胞两次以去除任何过量的生物素酰化抗体。再次用CELLBLOX单核细胞和巨噬细胞封闭缓冲剂封闭细胞，然后用链霉亲和素-NOVAFLUOR Yellow 610(使用胺反应性化学来标记)对细胞进行染色。

策略2：用生物素-抗人CD4抗体(克隆SK3)对细胞进行染色，然后洗涤细胞两次以去除任何过量的生物素酰化抗体。再次用CELLBLOX单核细胞和巨噬细胞封闭缓冲剂(赛默飞世尔科技公司)封闭细胞，然后用预先形成的比率为1:0、1:1或1:2的链霉亲和素和NOVAFLUOR Yellow 610-生物素的复合物对细胞进行染色。

策略3：用预先形成的比率为1:1:2的生物素-抗人CD4抗体(克隆SK3)、链霉亲和素和NOVAFLUOR Yellow 610-生物素的复合物对细胞进行染色。

染色完成后，再洗涤细胞一次。在ATTUNE NxT流式细胞仪(赛默飞世尔科技公司)上分析细胞，并用FLOJO软件(BD生物科学公司)分析FCS文件。

结果

研究了使用链霉亲和素作为交联剂在流式细胞术中放大荧光信号的三种策略。所有这些策略都依赖于生物素酰化一抗。在该实施例中使用抗人CD4抗体(克隆SK3)，但可使用任何其它生物素酰化抗体。第一策略使链霉亲和素四聚体的所有生物素结合位点都对结合开放。按流式进行两步染色程序，首先用生物素-抗人CD4抗体(克隆SK3)，然后用NOVAFLUOR修饰的链霉亲和素。使用该策略的染色在表现上几乎与图21所示的初级抗人CD4抗体-NOVAFLUOR缀合物相同，表明单个链霉亲和素-NOVAFLUOR复合物连接到每个生物素-抗人CD4抗体。

第二策略和第三策略利用生物素结合位点来连接NOVAFLUOR核酸纳米结构。通过将3’生物素酰化链掺入该结构中，可容易且定量地使NOVAFLUOR核酸纳米结构生物素酰化。然后将生物素酰化核酸纳米结构以不同的过量与纯化的链霉亲和素一起温育以形成链霉亲和素-NOVAFLUOR核酸纳米结构缀合物。该方法形成复合物的混合物。例如，对于1:2比率的链霉亲和素:NOVAFLUOR核酸纳米结构而言，所形成的主要复合物是1:2，但其它可能的比率也在较低浓度下形成。NOVAFLUOR核酸纳米结构的比率越高，用掉的生物素结合位点越多，剩下越少的位点来与生物素酰化抗体结合。已观察到，链霉亲和素:NOVAFLUOR核酸纳米结构的比率高于1:2时，来自复合物的信号没有进一步增加，这可能是由于剩下太少的生物素结合位点来连接到抗体。

使用第二策略和1:1比率的链霉亲和素:NOVAFLUOR核酸纳米结构，观察到与初级CD4-NovaFluor缀合物相比相同的MFI(图22)。在2:1比率下，MFI增加到1.64倍，表明荧光信号的放大。

对于策略3，测试2:1比率，但将该复合物与1当量的生物素-抗人CD4抗体(克隆SK3)一起预温育。这使得整个抗体-链霉亲和素-NOVAFLUOR核酸纳米结构复合物能够用作初染剂，从而简化了流式染色程序。以这种方式形成时，与初级抗CD4抗体-NOVAFLUOR核酸纳米结构缀合物相比，在流式细胞术实验中没有观察到荧光的增加(图23)，如预计在使用策略2的两步染色时将观察到的。相反，复合物的MFI略低，并且背景染色大幅增加。进一步优化可减少背景染色并增加复合物的MFI以匹配使用两步染色形成的染色的MFI。

为了进一步增加荧光放大系数，可使核酸纳米结构(例如，NOVAFLUOR核酸纳米结构)一起成链以用于上述三种策略中的任一种策略。在一些实施方案中，这在连接到链霉亲和素之前发生。为了使核酸纳米结构成链，将次级核酸纳米结构连接到初级核酸纳米结构的相对臂，其含有用于连接到抗体或链霉亲和素的接头。这些核酸纳米结构通过互补的单链接头延伸部彼此杂交，在该实施例中，这些互补的单链接头延伸部形成24-或36-碱基对连接，分别称为链1和链2。成链接头序列相对于靶向抗体或链霉亲和素的接头序列是独特的，从而提供正交靶向能力。在连接到链霉亲和素之前形成核酸纳米结构二聚体，这使用上述策略2来展示。如图24所示，与用NOVAFLUOR Yellow 610直接标记的一抗相比，使用与链霉亲和素缀合的NOVAFLUOR Yellow 610单体的2:1复合物并对用生物素-抗人CD4抗体(克隆SK3)标记的细胞进行染色预期会使信号增加1.9倍。通过替代地使用核酸纳米结构二聚体，可在使用链-2二聚体时将该放大甚至进一步增加至与一抗相比的最大3倍。类似的方法也可用于使用策略1或3来放大荧光信号。

实施例5：使用初级-次级NOVAFLUOR Ultraviolet核酸纳米结构复合物进行荧光 放大的实验方法

概述：以下研究的目的是进一步证实如本文所述的二聚体结构P-(L-S)₁已形成并实现了相对于单体对照放大的荧光信号。进行流式细胞术实验以提供二聚体已形成并实现了荧光信号放大的证据。

通过在每个核酸纳米结构中包括含有至少部分互补区的接头延伸部来形成二聚体，如图1中可见。在本文中，针对以下核酸纳米结构测试了二聚体放大荧光信号的能力：NOVAFLUOR Ultraviolet 430、NOVAFLUOR Ultraviolet 445和NOVAFLUOR Ultraviolet755(赛默飞世尔科技公司)。这些研究中的接头延伸部为32个核苷酸长。

样品制备：将1:1摩尔当量的初级和次级NOVAFLUOR Ultraviolet纳米结构混合以形成P-(L-S)₁的二聚体结构。将单体和二聚体纳米结构缀合到抗人CD4(克隆SK3)以进行染色。通过将单体或二聚体与单链DNA修饰的CD4抗体以1:1的摩尔比混合来制备CD4染色剂。

流式细胞术分析：

实验：首先用CELLBLOX单核细胞和巨噬细胞封闭缓冲剂的溶液处理外周血单核细胞(PBMC)，以防止抗体或核酸纳米结构与细胞表面的非特异性结合。接下来，用单体或二聚体CD4染色剂对细胞进行染色。也制备了未染色的细胞样品。最后，在CYTEK Aurora流式细胞仪(加利福尼亚弗里蒙特的厦泰生物科技公司(Cytek Biosciences,Fremont,CA))上分析细胞。用FLOWJO软件处理FCS文件。

结果：在流式细胞术实验中，我们预期会观察到相对于单体对照放大的信号。从下面的图25A至C和表3可以看出，来自二聚体的信号比单体亮0.3至0.7倍。

表3.每个标记的初级检测器通道中来自单体和二聚体NOVAFLUOR UltravioletCD4染色的PBMC的正中位荧光强度(MFI+)。x系数表示相对于单体的信号强度增加。初级检测器通道是分别用于NOVAFLUOR Ultraviolet 430(NF-Ultraviolet 430)、NOVAFLUORUltraviolet 445(NF-Ultraviolet 445)和NOVAFLUOR Ultraviolet 755(NF-Ultraviolet755)的UV3、UV4和UV14。

总结陈述：流式细胞术数据提供了二聚体能够放大如本文所述的荧光信号的证据。放大对多种类型的核酸纳米结构组合物起作用的事实提供了该技术在为任何核酸纳米结构放大荧光信号方面的功效和多功能性的进一步证据。

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本公开的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同物来限定。

参考文献

1.“二抗介绍(Introduction to Secondary Antibodies)”，赛默飞世尔科技公司，2020年9月9日，https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/antibodies/antibodies-learning-center/antibodies-resource-library/antibody-methods/introduction-secondary-antibodies.html。

2.“抗染料抗体(Anti-Dye Antibodies)”，赛默飞世尔科技公司，2020年9月9日，https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/antibodies/primary-antibodies/epitope-tag-antibodies/anti-dye-antibodies.html。

3.Player AN、Shen LP、Kenny D、Antao VP、Kolberg JA，使用分支DNA(bDNA)原位杂交的单拷贝基因检测(Single-copy genedetection using branched DNA(bDNA)insitu hybridization)，《组织化学与细胞化学杂志》(J Histochem Cytochem.)，2001；49(5):603-612。

4.“通过流式细胞术检测RNA(RNA Detection by FlowCytometry)”，赛默飞世尔科技公司，2020年9月9日，https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/rna-detection-flow-cytometry.html。

5.美国专利公开号2020/0124532，Lebeck,A.、Dwyer,C.、LaBoda C.，用于改善标记检测、计算、分析物感测和可调谐随机数生成的谐振器网络(Resonator Networks forImproved Label Detection,Computation,Analyte Sensing,and Tunable RandomNumberGeneration)。

Claims (86)

1.一种核酸纳米结构复合物，所述核酸纳米结构复合物包含连接到一个或多个次级核酸纳米结构的初级核酸纳米结构。

2.根据权利要求1所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构连接到特异性决定分子。

3.根据权利要求1或2所述的纳米结构复合物，其中(i)所述初级纳米结构经由核酸接头连接到所述特异性决定分子和/或次级纳米结构，或者(ii)其中所述初级纳米结构经由生物素/生物素结合蛋白复合物连接到所述特异性决定分子并且经由核酸接头连接到所述次级纳米结构；

任选地，其中所述核酸接头是被杂交的至少部分双链的接头；

任选地，其中多于一个初级纳米结构经由所述相同的生物素/生物素结合蛋白复合物连接到所述特异性决定分子；

任选地，其中所述生物素结合蛋白是亲和素、链霉亲和素或中性亲和素。

4.根据权利要求3所述的纳米结构复合物，所述纳米结构复合物包括通用结构：

P(-L-S)_n

其中P是所述初级纳米结构，L是被杂交的至少部分双链的核酸接头，S是一个或多个相邻连接的次级纳米结构，并且n为大于零的整数，并且其中：

(i)所述初级纳米结构包含n数量的部分单链的核酸接头延伸部，

(ii)存在n数量的包含至少部分单链的核酸接头延伸部的次级纳米结构，并且

(iii)所述n数量的初级纳米结构核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分与次级核酸接头延伸部中的一个次级核酸接头延伸部的单链区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在所述初级纳米结构与所述次级纳米结构中的每一个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将所述初级纳米结构连接到n数量的次级纳米结构。

5.根据权利要求4所述的纳米结构复合物，其中：

(a)所述初级纳米结构与一个次级纳米结构相邻连接，并且其中：

(i)所述初级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，

(ii)所述次级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，并且

(iii)所述初级纳米结构核酸接头延伸部的所述单链区的所述核酸序列的至少一部分与所述次级纳米结构核酸接头延伸部的所述单链区的所述核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将所述初级纳米结构连接到所述次级纳米结构；

(b)所述初级纳米结构与两个次级纳米结构相邻连接，并且其中：

(i)所述初级纳米结构包含具有相同单链杂交区序列的两个至少部分单链的核酸接头延伸部，

(ii)这两个次级纳米结构包含具有相同单链杂交区序列的至少部分单链的核酸接头延伸部，并且

(iii)所述初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与所述次级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在所述初级纳米结构与这两个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将所述初级纳米结构连接到所述两个次级纳米结构；或者

(c)所述初级纳米结构与三个次级纳米结构相邻连接，并且其中：

(i)所述初级纳米结构包含具有相同单链杂交区序列的三个至少部分单链的核酸接头延伸部，

(ii)所有三个次级纳米结构包含任选地具有相同单链杂交区序列的至少部分单链的核酸接头延伸部，并且

(iii)所述初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与所述次级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在所述初级纳米结构与所有三个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将所述初级纳米结构连接到所述三个次级纳米结构。

6.根据权利要求4所述的纳米结构复合物，其中：

(a)所述初级纳米结构与两个次级纳米结构相邻连接，并且其中：

(i)所述初级纳米结构包含两个至少部分单链的核酸接头延伸部，其中所述至少部分单链的核酸接头延伸部中的每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，

(ii)这两个次级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，其中所述至少部分单链的核酸接头延伸部中的每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，并且

(iii)所述初级纳米结构核酸接头延伸部中的每一个初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与所述次级纳米结构核酸接头延伸部中的一个次级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在所述初级纳米结构与这两个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将所述初级纳米结构连接到所述两个次级纳米结构；或者

(b)所述初级纳米结构与三个次级纳米结构相邻连接，并且其中：

(i)所述初级纳米结构包含三个至少部分单链的核酸接头延伸部，其中所述至少部分单链的核酸接头延伸部中的至少一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，任选地，其中所述至少部分单链的核酸接头延伸部中的每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，

(ii)所有三个次级纳米结构包含至少部分单链的核酸接头延伸部，其中所述部分单链的核酸接头延伸部中的至少一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，任选地，其中所述部分单链的核酸接头延伸部中的每一个核酸接头延伸部包含不同单链杂交区序列，并且

(iii)所述初级纳米结构核酸接头延伸部中的每一个初级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分与所述次级纳米结构核酸接头延伸部中的一个次级纳米结构核酸接头延伸部的单链杂交区的核酸序列的至少一部分至少部分互补，这足以在所述初级纳米结构与所有三个次级纳米结构之间形成被杂交的至少部分双链的接头，因此将所述初级纳米结构连接到所述三个次级纳米结构。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构和/或所述次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含向所述纳米结构复合物赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。

8.根据权利要求7所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构以及所述连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构组合起来向所述纳米结构复合物赋予光谱曲线。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构和/或所述次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含独特鉴定序列。

10.根据权利要求9所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构和/或所述连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含两个或更多个独特鉴定序列。

11.根据权利要求9或10所述的纳米结构复合物，

其中所述初级纳米结构包含独特鉴定序列以及向所述初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合；并且/或者

其中所述连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含独特鉴定序列以及向所述次级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合并且连接到n数量的具有相同光谱曲线的次级纳米结构，其中与单独的所述初级纳米结构的荧光信号相比，具有相同光谱曲线的所述次级纳米结构放大到所述纳米结构复合物的荧光信号；

任选地，其中具有与所述初级纳米结构相同的光谱曲线的所述次级纳米结构各自也包含与所述初级纳米结构相同数量的荧光团部分并且将所述纳米结构复合物的荧光信号放大到单独的所述初级纳米结构的荧光信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构包含独特鉴定序列并且连接到n数量的包含相同独特鉴定序列的次级纳米结构，其中与单独初级纳米结构的测序信号相比，具有相同独特鉴定序列的所述次级纳米结构放大到所述纳米结构复合物的测序信号；

任选地，其中所述次级纳米结构各自也包含与所述初级纳米结构相同数量的独特鉴定序列并且将所述纳米结构复合物的测序信号放大到单独的所述初级纳米结构的测序信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构包含荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到包含一种或多种猝灭剂的次级纳米结构，所述一种或多种猝灭剂吸收所述初级纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与所述初级纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的纳米结构复合物，其中所述初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到次级纳米结构，所述次级纳米结构包含向所述次级纳米结构和/或所述纳米结构复合物赋予与所述初级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的纳米结构复合物，

其中所述初级纳米结构包含x数量的荧光团部分或荧光团部分的组合并且连接到y数量的次级纳米结构，每个所述次级纳米结构包含z数量的与所述初级纳米结构相同的荧光团部分或荧光团部分的组合，其中可独立地为每个次级纳米结构确定z并且来自所述次级纳米结构的z的总和为z_总数；

其中与单独的所述初级纳米结构的荧光信号相比，所述纳米结构复合物的荧光信号被放大到约(x+z_总数)/x倍；

任选地，其中z对于每个次级纳米结构是相同的并且z_总数＝y*z。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的纳米结构复合物，所述纳米结构复合物包含与一个或多个近侧次级核酸纳米结构相邻连接的初级核酸纳米结构，其中所述近侧次级纳米结构中的至少一个近侧次级纳米结构进一步连接到另一个次级纳米结构，任选地，其中所述初级纳米结构和所述一个或多个近侧次级纳米结构和/或所述一个或多个近侧次级纳米结构和连接到所述近侧次级纳米结构的所述另一个次级纳米结构经由被杂交的至少部分双链的核酸接头连接。

18.根据权利要求17所述的纳米结构复合物，所述纳米结构复合物包含通式：

P-L₁-S_P-L₂-(S_x-L_y)_n-Z

其中P是所述初级纳米结构，L₁是将所述初级纳米结构连接到次级纳米结构的接头，S_P(近侧次级纳米结构)是与所述初级纳米结构相邻连接的次级纳米结构，L₂是将S_P连接到另一个次级纳米结构的接头，n为零或正整数，(S_x-L_y)包含次级纳米结构S_x和将S_x连接到额外的次级纳米结构的接头L_y，并且Z是额外的一个或多个次级纳米结构；

任选地，其中Z是末端次级纳米结构S_T。

19.根据权利要求17或18所述的纳米结构复合物，其中L₁、L₂和/或L_y中的一者或多者是被杂交的至少部分双链的核酸接头并且其中：

L₁和L₂包含相同的被杂交区序列；

L₁和L₂包含不同的被杂交区序列；

L₁和L_y包含相同的被杂交区序列；

L₁和L_y包含不同的被杂交区序列；

L₂和L_y包含相同的被杂交区序列；

L₂和L_y包含不同的被杂交区序列；

L₁、L₂和L_y都包含相同的被杂交区序列；并且/或者

L₁、L₂和L_y各自包含不同的被杂交区序列。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的纳米结构复合物，

其中n为零并且所述纳米结构复合物包含通式：

P-L₁-S_P-L₂-Z

任选地，其中Z是S_T(P-L₁-S_P-L₂-S_T)；

其中n为一并且所述纳米结构复合物包含通式：

P-L₁-S_P-L₂-S_x-L_y-Z

任选地，其中Z是S_T(P-L₁-S_P-L₂-S_x-L_y-S_T)；

其中n为二并且所述纳米结构复合物包含通式：

P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-Z

任选地，其中Z是S_T(P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-S_T)；或者

其中n为三并且所述纳米结构复合物包含通式：

P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-S_x[c]-L_y[c]-Z

任选地，其中Z是S_T(P-L₁-S_P-L₂-S_x[a]-L_y[a]-S_x[b]-L_y[b]-S_x[c]-L_y[c]-S_T)。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的纳米结构复合物，其中L₁、L₂和L_y是各自包含不同的被杂交区序列的被杂交的至少部分双链的核酸接头，并且其中n为二或更大并且至少两个L_y包含相同的被杂交区序列。

22.根据权利要求17至20中任一项所述的纳米结构复合物，其中L₁、L₂和L_y是各自包含不同的被杂交区序列的被杂交的至少部分双链的核酸接头，并且其中n为二或更大并且所有L_y包含相同的被杂交区序列。

23.根据权利要求17至20中任一项所述的纳米结构复合物，其中L₁、L₂和L_y是各自包含不同的被杂交区序列的被杂交的至少部分双链的核酸接头，并且其中n为二或更大，并且除了将S_x连接到S_T的所述L_y之外，所有L_y包含相同的被杂交区序列。

24.根据权利要求17至23中任一项所述的纳米结构复合物，其中与初级纳米结构连接的次级纳米结构的同一性和/或顺序由所述次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的杂交区序列决定。

25.根据权利要求17至24中任一项所述的纳米结构复合物，其中末端次级纳米结构可通过杂交来连接到不多于一个初级或次级纳米结构；

任选地，其中所述末端次级纳米结构仅包含用于与另一个次级纳米结构杂交的一个至少部分单链的接头延伸部。

26.根据权利要求17至25中任一项所述的纳米结构复合物，其中至少一个次级纳米结构包含一种或多种猝灭剂，所述一种或多种猝灭剂吸收另一个纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与所述另一个纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移；

任选地，其中末端次级纳米结构包含一种或多种猝灭剂，所述一种或多种猝灭剂吸收另一个纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与所述另一个纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。

27.根据权利要求17至26中任一项所述的纳米结构复合物，其中至少一个近侧次级纳米结构与两个或更多个其它次级纳米结构相邻连接。

28.根据权利要求17至27中任一项所述的纳米结构复合物，其中至少一个非近侧次级纳米结构与三个或更多个其它次级纳米结构相邻连接。

29.一种纳米结构复合物，所述纳米结构复合物包含核酸支架，所述核酸支架连接有至少一个初级核酸纳米结构，其中所述初级纳米结构包含与所述核酸支架的序列的至少一部分杂交的至少部分单链的核酸接头延伸部。

30.根据权利要求29所述的纳米结构复合物，其中所述核酸支架连接到特异性决定分子；

任选地，其中所述复合物经由所述特异性决定分子来结合于靶标。

31.根据权利要求29或30所述的纳米结构复合物，其中经由杂交将至少两个初级纳米结构连接到所述核酸支架。

32.根据权利要求29至31中任一项所述的纳米结构复合物，其中至少一个初级纳米结构连接到一个或多个次级纳米结构。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的纳米结构复合物，其中所述复合物的至少一个纳米结构是荧光纳米结构和/或包含独特鉴定序列。

34.一种包含两个或更多个不同初级纳米结构的多重组合物，所述初级纳米结构中的至少一个初级纳米结构是根据权利要求1至33中任一项所述的纳米结构复合物的一部分。

35.根据权利要求34所述的多重组合物，

其中至少一个初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且所述不同初级纳米结构至少在荧光团部分的存在、荧光团部分的数量、所述荧光团部分的位置和/或所述荧光团部分的光谱曲线方面不同；并且/或者

其中至少一个初级纳米结构包含独特鉴定序列，并且所述不同初级纳米结构至少在所述独特鉴定序列的存在、数量和/或序列方面不同。

36.根据权利要求34或35所述的多重组合物，其中所述不同初级纳米结构中的至少两个不同初级纳米结构缀合到不同特异性决定分子。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的多重组合物，

其中所述组合物的不同初级纳米结构中的至少两个不同初级纳米结构的不同之处至少在于构成所述初级纳米结构的一个或多个核酸的序列，并且/或者所述组合物的不同初级纳米结构中的至少两个不同初级纳米结构各自包含一个或多个至少部分单链的核酸接头延伸部，并且不同之处至少在于它们的一个或多个至少部分单链的核酸接头延伸部的序列和/或组合。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的多重组合物，所述多重组合物包含不与次级纳米结构连接的至少一个初级纳米结构。

39.根据权利要求34至38中任一项所述的多重组合物，所述多重组合物包含根据权利要求1至33中任一项所述的两个或更多个不同纳米结构复合物；

任选地，其中所有所述初级纳米结构是纳米结构复合物的一部分。

40.根据权利要求39所述的多重组合物，

其中具有不同初级纳米结构的所述不同纳米结构复合物中的至少两个不同纳米结构复合物包含不同次级纳米结构；并且/或者

其中具有不同初级纳米结构的所述不同纳米结构复合物中的至少两个不同纳米结构复合物包含相同次级纳米结构。

41.根据权利要求40所述的多重组合物，

其中至少一个次级纳米结构包含向所述次级纳米结构赋予光谱曲线的一个或多个荧光团部分，并且所述不同次级纳米结构至少在荧光团部分的存在、荧光团部分的数量、所述荧光团部分的位置和/或所述荧光团部分的光谱曲线方面不同；并且/或者

其中至少一个次级纳米结构包含独特鉴定序列，并且所述不同次级纳米结构至少在所述独特鉴定序列的存在、数量和/或序列方面不同。

42.根据权利要求34至41中任一项所述的多重组合物，

其中所述不同次级纳米结构中的至少两个不同次级纳米结构的不同之处至少在于构成所述次级纳米结构的一个或多个核酸的序列，并且/或者所述不同次级纳米结构中的至少两个不同次级纳米结构各自包含至少部分单链的核酸接头延伸部，并且不同之处至少在于它们的至少部分单链的核酸接头延伸部的杂交区序列；

任选地，其中所述至少两个不同次级纳米结构具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。

43.根据权利要求34至42中任一项所述的多重组合物，其中对于每个纳米结构复合物而言，所述初级纳米结构以及其连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构具有相同的光谱曲线、测序信号和/或荧光或序列信号强度。

44.根据权利要求34至43中任一项所述的多重组合物，其中在至少一个纳米结构复合物中，所述初级纳米结构包含荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到包含一种或多种猝灭剂的次级纳米结构，所述一种或多种猝灭剂吸收所述初级纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与所述初级纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移。

45.根据权利要求34至44中任一项所述的多重组合物，所述多重组合物包含至少两个纳米结构复合物，其中：

(i)第一纳米结构复合物的初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，其中所述第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接到次级纳米结构，所述次级纳米结构包含向所述次级纳米结构赋予与其连接的初级纳米结构不同的光谱曲线和/或向所述第一纳米结构复合物赋予与其初级纳米结构不同的光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合；并且

(ii)至少第二纳米结构复合物的初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予与所述第一纳米结构复合物的初级纳米结构的光谱曲线不同的光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，其中所述至少第二纳米结构复合物的初级纳米结构还连接到次级纳米结构，所述次级纳米结构包含向所述次级纳米结构赋予与其连接的初级纳米结构不同的光谱曲线和/或向所述第二纳米结构复合物赋予与其初级纳米结构不同的光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合。

46.根据权利要求34至45中任一项所述的多重组合物，所述多重组合物包含至少两个纳米结构复合物，其中第一纳米结构复合物的初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予第一光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且至少第二纳米结构复合物的初级纳米结构还包含向所述初级纳米结构赋予第二光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，所述第二光谱曲线不同于所述第一纳米结构复合物的初级纳米结构的第一光谱曲线，并且

其中与所述第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接的所述次级纳米结构包含向其赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且与所述至少第二纳米结构复合物的初级纳米结构连接的所述次级纳米结构包含与和所述第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接的所述次级纳米结构相同的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，任选地，其中与所述第一纳米结构复合物的初级纳米结构连接的所述次级纳米结构和与所述第二纳米结构复合物的初级纳米结构连接的所述次级纳米结构相同。

47.根据权利要求34至46中任一项所述的多重组合物，其中至少两个纳米结构复合物是荧光纳米结构复合物，并且彼此不同之处至少在于它们的荧光团部分的总数和/或它们的荧光信号强度；

任选地，其中所述纳米结构复合物彼此不同之处还在于它们的光谱曲线。

48.根据权利要求47所述的多重组合物，

其中所述组合物中的一个纳米结构复合物的初级纳米结构的荧光团部分的数量不同于另一个初级纳米结构复合物的荧光团部分的数量；并且/或者

其中所述组合物中的一个纳米结构复合物的次级纳米结构的荧光团部分的数量不同于另一个次级纳米结构复合物的荧光团部分的数量。

49.根据权利要求34至48中任一项所述的多重组合物，其中至少一个纳米结构复合物包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构。

50.根据权利要求34至49中任一项所述的多重组合物，其中两个或更多个纳米结构复合物包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构；

任选地，其中包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构的至少一个纳米结构复合物具有与包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构的至少一个其它纳米结构复合物不同数量的次级纳米结构。

51.根据权利要求34至50中任一项所述的多重组合物，其中至少两个纳米结构复合物包含独特鉴定序列，并且彼此不同之处至少在于它们的独特鉴定序列的总数和/或它们的测序信号的强度；

任选地，其中所述纳米结构复合物彼此不同之处还在于它们的独特鉴定序列的序列。

52.根据权利要求34至51中任一项所述的多重组合物，其中至少两个纳米结构复合物结合于相同靶分子，并且其中所述至少两个纳米结构复合物中的至少一个纳米结构复合物包含独特鉴定序列，并且所述至少两个纳米结构复合物中的至少另一个纳米结构复合物不包含具有相同序列的独特鉴定序列或不包含独特鉴定序列。

53.根据权利要求51或52所述的多重组合物，

其中所述组合物中的一个纳米结构复合物的初级纳米结构的独特鉴定序列的数量不同于另一个纳米结构复合物的另一个初级纳米结构的独特鉴定序列的数量；并且/或者

其中所述组合物中的一个纳米结构复合物的次级纳米结构的独特鉴定序列的数量不同于另一个纳米结构复合物的另一个次级纳米结构的独特鉴定序列的数量。

54.根据权利要求51至53中任一项所述的多重组合物，其中至少一个纳米结构复合物包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构。

55.根据权利要求51至54中任一项所述的多重组合物，其中两个或更多个纳米结构复合物包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构；

任选地，其中包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构的至少一个纳米结构复合物具有与包含与两个或更多个次级纳米结构连接的初级纳米结构的至少一个其它纳米结构复合物不同数量的次级纳米结构。

56.根据权利要求34至55中任一项所述的多重组合物，所述多重组合物包含至少两个纳米结构复合物，并且其中所述纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物包含与次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合连接的初级纳米结构，并且进一步地，其中所述组合物中的一个纳米结构复合物的次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合不同于另一个纳米结构的次级纳米结构中的一个次级纳米结构或组合。

57.根据权利要求56所述的多重组合物，

其中所述组合物中的所述一个纳米结构复合物具有与至少一个其它纳米结构复合物不同的光谱曲线和/或不同的荧光信号强度；

其中所述组合物中的一个纳米结构复合物具有与至少一个其它纳米结构复合物不同的测序信号和/或不同的测序信号强度；并且/或者

其中所述组合物中的所述至少一个纳米结构复合物与至少一个其它纳米结构复合物和/或任何其它纳米结构复合物具有独特的荧光同一性和/或测序同一性。

58.根据权利要求34至57中任一项所述的多重组合物，其中与初级纳米结构连接的所述次级纳米结构或次级纳米结构的组合由它们的至少部分单链的接头延伸部与所述初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的序列的序列互补性来确定。

59.根据权利要求58所述的多重组合物，其中出于杂交的目的，所述组合物中的一个初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的序列与至少一个其它初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部的序列不同。

60.根据权利要求1至33中任一项所述的纳米结构复合物或根据权利要求34至59中任一项所述的多重组合物的纳米结构，其中至少一个纳米结构复合物结合于靶标。

61.一种标记靶分子的方法，所述方法包括将根据权利要求1至33中任一项所述的核酸纳米结构复合物结合于所述靶分子。

62.根据权利要求61所述的方法，所述方法包括：

(i)将初级核酸纳米结构连接到所述靶分子，其中所述初级核酸纳米结构特异性结合于所述靶分子；以及

(ii)将一个或多个次级纳米结构连接到结合于所述靶分子的所述初级纳米结构，

因此形成结合于所述靶分子的纳米结构复合物；

任选地，其中经由所述次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与所述初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将所述一个或多个次级纳米结构连接到所述初级纳米结构。

63.根据权利要求61所述的方法，所述方法包括：

(i)将特异性决定分子连接到所述靶分子，其中所述特异性决定分子特异性结合于所述靶分子；

(ii)将初级纳米结构连接到结合于所述靶分子的所述特异性决定分子；以及

(iii)将一个或多个次级纳米结构连接到结合于所述特异性决定分子的所述初级纳米结构，

因此形成结合于所述靶分子的纳米结构复合物；

任选地，

(a)经由所述初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与所述特异性决定分子的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将所述初级纳米结构连接到所述特异性决定分子；或者

(b)其中所述初级纳米结构经由生物素/生物素结合蛋白复合物连接到所述特异性决定分子；并且/或者

任选地，其中经由所述次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与所述初级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将所述一个或多个次级纳米结构连接到所述初级纳米结构。

64.根据权利要求62或63所述的方法，所述方法还包括将至少一个额外的次级纳米结构连接到已与初级纳米结构相连的近侧次级纳米结构；

任选地，其中经由所述额外次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与所述近侧次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将所述至少一个额外的次级纳米结构连接到所述近侧次级纳米结构。

65.根据权利要求64所述的方法，所述方法还包括将至少一个进一步额外的次级纳米结构相邻地或经居间的次级纳米结构连接到已与连接到近侧次级纳米结构的次级纳米结构相连的次级纳米结构；

任选地，其中经由所述进一步额外的次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部与所述另一次级纳米结构的至少部分单链的接头延伸部之间的杂交以形成被杂交的至少部分双链的核酸接头，来将所述至少一个进一步额外的次级纳米结构连接到另一个次级纳米结构；

任选地，其中添加所述至少一个进一步额外的次级纳米结构形成与所述初级纳米结构连接的次级纳米结构的线性聚合物；并且/或者

任选地，其中添加两个或更多个进一步额外的次级纳米结构形成次级纳米结构的分支网络。

66.根据权利要求64或65中任一项所述的方法，

其中两个或更多个次级纳米结构在被掺入所述纳米结构复合物中之前连接在一起；并且/或者

其中使两个或更多个次级纳米结构同时与初级纳米结构或已被部分组装成包含初级纳米结构和至少一个近侧次级纳米结构的纳米结构复合物接触，并且其中所述两个或更多个次级纳米结构掺入所述纳米结构复合物中的顺序由所述次级纳米结构的至少部分单链的核酸接头延伸部的序列决定。

67.根据权利要求61至66中任一项所述的方法，其中：

(i)在将所述纳米结构复合物结合于所述靶分子之前，已将构成所述核酸纳米结构复合物的所述初级纳米结构和所述特异性决定分子组装在一起；

(ii)在将所述纳米结构复合物结合于所述靶分子之前，已将构成所述核酸纳米结构复合物的所述初级纳米结构和一个或多个次级纳米结构组装在一起；

(iii)在将所述纳米结构复合物结合于所述靶分子之前，将构成所述核酸纳米结构复合物的所述初级纳米结构和所有次级纳米结构组装在一起；

(iv)先将构成所述核酸纳米结构复合物的所述初级纳米结构和一个或多个次级纳米结构组装在一起，再将所述初级纳米结构连接到所述特异性决定分子，之后将所述纳米结构复合物结合于所述靶分子；并且/或者

(v)先将构成所述核酸纳米结构复合物的所述初级纳米结构和所有次级纳米结构组装在一起，再将所述初级纳米结构连接到所述特异性决定分子，之后将所述纳米结构复合物结合于所述靶分子。

68.根据权利要求67所述的方法，其中在将所述初级纳米结构连接到所述特异性决定分子之前和/或在将所述核酸纳米结构复合物结合于所述靶分子之前，除了一个或多个最终末端次级纳米结构之外，将构成所述纳米结构复合物的所述初级纳米结构和所有次级纳米结构组装在一起，任选地，其中所述最终末端次级纳米结构在结合于所述靶分子之前都不组装到所述纳米结构复合物上；

任选地，在将所述组装的纳米结构复合物的剩余部分结合于所述靶分子之后进一步连接所述最终末端次级纳米结构。

69.根据权利要求61至68中任一项所述的方法，其中与所述靶分子结合的所述纳米结构复合物的至少初级纳米结构和/或至少一个次级纳米结构是荧光纳米结构和/或包含独特鉴定序列。

70.根据权利要求61至69中任一项所述的方法，所述方法还包括测量来自所述标记的靶分子的荧光信号和/或序列信号；

任选地，其中检测荧光信号和/或测序信号。

71.根据权利要求70所述的方法，所述方法包括在所述初级纳米结构和/或纳米结构复合物结合于所述靶分子之后但在所述纳米结构复合物完全组装之前测量荧光信号和/或测序信号，然后在至少一个次级纳米结构或额外的次级纳米结构组装到所述纳米结构复合物中之后再测量荧光信号和/或测序信号至少一次。

72.根据权利要求70或71所述的方法，所述方法包括在连接最终末端次级纳米结构之前测量来自所述标记的靶分子的荧光信号，然后在连接所述最终末端次级纳米结构之后测量荧光信号。

73.一种标记一个或多个靶分子的多重方法，所述方法包括按照根据权利要求61至72中任一项所述的方法将根据权利要求1至33中任一项所述的两个或更多个纳米结构复合物或根据权利要求1至33中任一项所述的至少一个纳米结构复合物和至少一个初级纳米结构结合于所述一个或多个靶分子。

74.根据权利要求73所述的多重方法，其中：

(i)所述纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物结合于相同靶分子，并且所述纳米结构复合物至少在光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同；

(ii)所述纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物结合于不同靶分子，并且所述纳米结构复合物中的每一个纳米结构复合物具有相同的光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度；或者

(iii)所述纳米结构复合物中的至少两个纳米结构复合物结合于不同靶分子，并且所述纳米结构复合物中的每一个纳米结构复合物至少在光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同；

任选地，其中不同纳米结构复合物至少在它们的初级纳米结构方面不同，并且/或者其中不同纳米结构复合物至少在次级纳米结构和/或次级纳米结构的数量方面不同。

75.根据权利要求73或74所述的多重方法，其中至少两个不同靶分子由相同纳米结构复合物结合或结合于具有至少相同的光谱曲线、荧光信号强度、测序信号和/或测序信号强度的纳米结构复合物，并且其中至少一个其它靶分子结合于至少在光谱曲线、荧光信号强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同的纳米结构复合物。

76.根据权利要求73或74所述的多重方法，其中每个靶分子结合于不同纳米结构复合物，所述不同纳米结构复合物至少在光谱曲线、荧光强度、测序信号和/或测序信号强度方面不同于一个或多个其它纳米结构复合物。

77.根据权利要求73所述的多重方法，其中：

(i)至少一个纳米结构复合物和至少一个初级纳米结构结合于相同靶分子；或者

(ii)至少一个纳米结构复合物和至少一个初级纳米结构结合于不同靶分子。

78.根据权利要求61至77中任一项所述的方法，其中对于至少一个纳米结构复合物而言，与单独的所述初级纳米结构相比，添加一个或多个次级纳米结构放大了所述荧光信号和/或测序信号；任选地，其中可按化学计量控制所述信号的放大。

79.根据权利要求61至78中任一项所述的方法，其中对于至少一个纳米结构复合物而言，所述初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合并且连接到n数量的具有相同光谱曲线的次级纳米结构，其中与单独的所述初级纳米结构的荧光信号相比，具有相同光谱曲线的所述次级纳米结构放大了所述纳米结构复合物的荧光信号；

任选地，其中具有与所述初级纳米结构相同的光谱曲线的所述次级纳米结构各自也包含与所述初级纳米结构相同数量的荧光团部分并且将所述纳米结构复合物的荧光信号放大到单独的所述初级纳米结构的荧光信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍；

任选地，其中在多重方法中使用至少两个纳米结构复合物。

80.根据权利要求61至79中任一项所述的方法，其中对于至少一个纳米结构复合物而言，所述初级纳米结构包含独特鉴定序列并且连接到n数量的包含相同独特鉴定序列的次级纳米结构，其中与单独初级纳米结构的测序信号相比，具有相同独特鉴定序列的所述次级纳米结构放大了所述纳米结构复合物的测序信号；

任选地，其中所述次级纳米结构各自也包含与所述初级纳米结构相同数量的独特鉴定序列并且将所述纳米结构复合物的测序信号放大到单独的所述初级纳米结构的测序信号的量的约n+0.5、n+0.6、n+0.7、n+0.8、n+0.9或n+1倍；

任选地，其中在多重方法中使用至少两个纳米结构复合物。

81.根据权利要求61至80中任一项所述的方法，其中对于至少一个纳米结构复合物而言，所述初级纳米结构包含荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到包含一种或多种猝灭剂的次级纳米结构，所述一种或多种猝灭剂吸收所述初级纳米结构的荧光团部分的荧光和/或与所述初级纳米结构的荧光团部分进行福斯特共振能量转移；

任选地，其中在多重方法中使用至少两个纳米结构复合物。

82.根据权利要求61至81中任一项所述的方法，其中对于至少一个纳米结构复合物而言，所述初级纳米结构包含向所述初级纳米结构赋予光谱曲线的荧光团部分中的一个荧光团部分或组合，并且连接到次级纳米结构，所述次级纳米结构包含向所述次级纳米结构和/或所述纳米结构复合物赋予与所述初级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合；

任选地，其中所述初级纳米结构连接到至少两个次级纳米结构，每个所述次级纳米结构包含向每个次级纳米结构和/或所述纳米结构复合物赋予与所述初级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合，

进一步任选地，其中所述连接的次级纳米结构中的至少一个次级纳米结构包含向这种次级纳米结构赋予与另一连接的次级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合，并且

进一步任选地，其中所述连接的次级纳米结构中的每一个次级纳米结构包含向每个次级纳米结构赋予与任何其它连接的次级纳米结构光谱曲线不同的光谱曲线的不同荧光团部分或荧光团部分的不同组合；

任选地，其中所述纳米结构复合物的光谱曲线不同于所述初级纳米结构的光谱曲线；

任选地，其中所述次级纳米结构包含可与所述初级纳米结构的荧光团部分或荧光团部分的组合进行福斯特共振能量转移的荧光团部分或荧光团部分的组合；

任选地，其中在所述方法中，在添加向所述纳米结构复合物赋予不同光谱曲线的次级纳米结构之前和之后测量所述标记的靶分子的荧光；并且/或者

任选地，其中在多重方法中使用至少两个纳米结构复合物。

83.根据权利要求61至83中任一项所述的方法，

其中对于至少一个纳米结构复合物而言，所述初级纳米结构包含x数量的荧光团部分或荧光团部分的组合并且连接到y数量的次级纳米结构，每个所述次级纳米结构包含z数量的与所述初级纳米结构相同的荧光团部分或荧光团部分的组合，其中独立地为每个次级纳米结构确定z并且来自所述次级纳米结构的z的总和为z_总数；

其中与单独的所述初级纳米结构的荧光信号相比，所述纳米结构复合物的荧光信号被放大到约(x+z_总数)/x倍；

任选地，其中z对于每个次级纳米结构是相同的并且z_总数＝y*z；并且/或者

任选地，其中在多重方法中使用至少两个纳米结构复合物。

84.一种检测靶分子的方法，所述方法包括按照根据权利要求61至83中任一项所述的方法标记靶分子以及测量来自所述标记的靶分子的荧光信号和/或序列信号；

任选地，其中所述方法是多重方法并且所述方法包括按照根据权利要求61至83中任一项所述的方法标记至少两个靶分子以及测量来自所述标记的靶分子的荧光信号和/或序列信号。

85.一种用于执行根据权利要求61至84中任一项所述的方法的试剂盒，

所述试剂盒包含根据权利要求1至59中任一项所述的纳米结构复合物或其组分；并且/或者

包含用于按照根据权利要求61至84中任一项所述的方法标记靶分子的试剂和/或设备；

任选地，其中所述试剂盒还包含印刷和/或在电子存储介质上的说明书、缓冲剂和/或额外试剂，和/或包装材料。

86.根据权利要求1至85中任一项所述的纳米结构复合物，其中初级纳米结构和/或次级纳米结构包含作为核酸结合蛋白的靶标的序列；

任选地，其中所述纳米结构复合物与至少一种核酸结合蛋白结合；并且进一步地，

任选地，其中定量地控制结合的核酸结合蛋白的数量。