CN116445307A - 低产杂醇油的酿酒酵母菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株新的酿酒酵母，含该菌的酿酒菌剂及其在白酒、黄酒和米酒酿造中的应用。本发明公开的酿酒酵母菌具有杂醇油含量低、出酒率高、耐高糖度和耐酒精能力强、产丁酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯等酯的风味成分含量高的特点，发酵生产的黄酒、白酒具有杂醇油含量低、口感好、香味浓郁等优点，酿酒菌剂应用于白酒、黄酒及米酒发酵可提高酒产品的质量和产量。
Description
技术领域：
本发明属于酿酒领域，具体地说，本发明涉及酿酒酵母菌、含该菌的酿酒菌剂及其在白酒和黄酒等酿造中的应用。
背景技术：
杂醇油又称高级醇，是酒精发酵过程产生的副产物，其含量高低对酒的香气和品质有很大影响，是评价酒品质量的重要指标之一(曾朝珍等，中国酿造，2015，34(5)：11-14)。白酒中杂醇油含量过高会影响白酒口感且对人体健康产生不良影响(HofiH，等.Alcoholism：Clinical andExperimental Research，2003，27(S1)：37S-41S)。在传统的酿造酒中，杂醇油含量普遍偏高的问题已经引起了业界的广泛关注。选育低产杂醇油且高产乙醇的酵母是最根本的解决手段。唐取来等(酿酒科技，2016，5：35-37)在传统小曲发酵过程中接种一定量的纯种培养的高产酯低产杂醇油酿酒酵母，能明显提高乙酸乙酯的含量，并显著降低杂醇油含量。张翠英(酿酒科技，2013，7：62-64)添加低产杂醇油酿酒酵母AYΔBAT2进行小曲酒半固态发酵，对小曲酒酒度、残糖、总酸和总酯基本无影响，但杂醇油含量得到了大幅度下降，与纯小曲发酵相比异戊醇含量降低了50.8％。杂醇油含量的降低在一定程度上能够改善小曲酒的风味，提高小曲酒品质。
杂醇油主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、苯乙醇(InternationalJournal of Food Microbiology，2021，337)。杂醇油是白酒中最重要的风味物质之一，主要由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生成。适量的杂醇油可赋予酒体醇香、柔和的口感，但当杂醇油含量超过一定限度时，不但会降低酒体的口感，还会有损饮用者的身体健康(李园子等，食品与发酵工业，2022，48(15))。因此，白酒中杂醇油种类及含量的调控对改善酒体品质有着重要意义。通过调控酿酒酵母中杂醇油的代谢途径，选育优良的酿酒酵母，可为杂醇油的有效控制提供参考方向。王鹏银等(酿酒科技，2008(2):17-21)通过低能氮离子注入诱变法获得一株具有亮氨酸营养缺陷特性的酿酒酵母AY-15突变株，利用玉米糖化醪进行模拟液态白酒发酵实验，并测定发酵液中杂醇油的最终生成量，结果表明，与亲本菌株相比，该突变株的异戊醇生成量降低39.85％，杂醇油总含量降低33.6％,且发酵性能无明显变化。王国正等(微生物学通报，2015，42(12):2407-2416)对从酒曲中筛选得到的酵母菌株CF4进行常温常压等离子体诱变，筛选得到一株低产杂醇油的酿酒酵母菌株ARTP5，通过模拟发酵测定杂醇油生成量，结果表明，诱变菌株的杂醇油产量比亲本菌株降低20.0％。张翠英等(酿酒科技，2013，(7):62-64)利用低产杂醇油酿酒酵母工程菌株AYΔbat2进行小曲半固态白酒发酵实验，工程菌株发酵得到的正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别降低20.6％、32.3％、50.8％，杂醇油总量下降37.2％。2017年，LI等(European FoodResearchand Technology，2018，244(3):555-564)以α5为出发菌株构建BAT2缺失菌株，通过模拟白酒发酵,缺失菌株的杂醇油总量降低了22.01％。陈文颖等(现代食品科技，2022,38(11))以酿酒酵母菌XF1的单倍体为原始菌，构建了BAT2单基因缺失和THI3/BAT2双基因缺失的双倍体酵母重组菌XF1-B和XF1-TB。重组菌XF1-B和XF1-TB都有效降低了黄酒中总杂醇油含量，而且XF1-TB与XF1-B相比异戊醇/异丁醇比值显著降低，这能够降低黄酒“上头”的醉度，有效提高黄酒品质。
丁酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯等组分分别具有独特的果香味和甜蜜香味，是白酒中的重特征风味物质(郭雪峰等，食品科学，2022,43(21)：43-53；范文来等，食品科学，2013,34(4):135-139；袁琦等，中国酿造，2022，41(2)：53-59)，同时它们也是黄酒等酒的重要风味组分(赵培城等，食品科学，2020，41(22)231-237；刘慧杰等，食品与发酵工业，2022，48(17)：249-255)。不同酵母菌株发酵产生的酒的风味物质组成及含量存在明显差异(郭菁菁等，食品科技，2020，45(10)：33-40；王晓丹等，食品科学，2017,38(4)：51-57)。
酵母菌对糖度和酒精度的耐受性是菌株的重要发酵特性之一。优质的酿酒酵母是保证发酵酒质量的基础，发酵液的糖浓度决定了酒液的酒精浓度，增加糖浓度是提高酒精度的有效途径，高酒精度发酵液也能避免杂菌感染，保证酒纯正的风味。因此，选育一株耐高浓度糖的优良酵母，确保在高糖浓度条件下优质发酵显得尤为重要。贾智勇等(酿酒科技，2019(11))初选出1株酿酒酵母和非酿酵母，经过酵母菌株的产气性能、耐酒精、耐糖等耐受性试验以及两株酵母之间的相互作用研究，得到了适宜红枣酒发酵的最佳菌种组合。李群等(食品与发酵工业，2022，48(9)：41-47)从清香型小曲白酒酒醅和酒曲中进行酵母分离鉴定，并挑选其中13种不同酵母进行环境耐受性实验，结果显示酿酒酵母J-52能耐250g/L糖、12％乙醇、pH2.5和45℃高温条件。相雯研等(食品与发酵工业，2020，46(22))选育到1株在300g/L葡萄糖、2.0g/L NaCl条件下的高耐糖耐盐的驯化酿酒酵母菌株。徐姿静等(酿酒科技，2021，10：95-99)选育了一株优良酿酒酵母用于俄色露酒的生产，该酵母具有耐糖、高产乙醇、低产甲醇和杂醇油的特点。
中国专利(CN201810748064.8)公布了一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用。该发明以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株,BAT2基因为靶基因,实现对野生酿酒酵母菌株基因BAT2高效的无痕敲除,通过白酒发酵实验,改造菌株的正丙醇、异丁醇和异戊醇含量亲本菌株相比分别降低了20.32％、47.85％和23.14％,达到了低产杂醇油的目的。中国专利(CN201910669531.2)公布了一种具有低产杂醇油性能的啤酒酵母菌株及其构建方法。所发明的低产杂醇油啤酒酵母菌株在以小麦为原料的发酵培养基中发酵后,较亲本菌株的杂醇油总量分别降低了16.85％和23.55％。中国专利(CN201710041517.9)报道了一株能降低杂醇油含量的啤酒酵母及其应用。所发明的酿酒酵母相比于出发菌株,其杂醇油产量降低了近60％,甲醇耐受性提高了至少3倍,具有良好的工业应用价值。中国专利(CN201910561987.7)公布了一株低产杂醇油的酿酒酵母及其在小曲米酒酿造中的应用。该菌株在米酒酿造中表现出优良的发酵性能、较好的酒化能力和较低的杂醇油产量,在酿酒过程中使用该菌株可以改善小曲米酒因杂醇油含量高引起的“上头”等症状。中国专利(CN201510416932.9)公布了一种酿酒酵母诱变菌株及其应用。该菌株可以显著增强双乙酰的还原能力、提高挥发性酯类物质含量、降低杂醇油含量、提高啤酒的风味品质。中国专利(CN201710041517.9)报道了一株能降低杂醇油含量的啤酒酵母及其应用。其特征在于能够有效的降低杂醇油含量以及具有较高的甲醇耐受性,所述杂醇油在啤酒中的含量为100mg/L以下,甲醇耐受性在2％以上。中国专利(CN201811452694.7)公布了一种酿酒酵母、提取方法及其应用。该酿酒酵母是从酒曲中分离筛选得到,该菌株可应用于红枣酒中,能够生产出低杂醇油含量的红枣酒,提高红枣酒的出酒率与整体口感品质,适用于酿制红枣酒。
中国专利(CN201010512664.8)报道了一株酿酒酵母菌株及其应用。该菌株具有生长快、酒精产量高、耐高温、耐高糖、耐高浓度乙醇和耐酸等多个优点,可应用于以木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等为原料的浓醪发酵产酒精工艺(同步糖化发酵)中,解决工业生产中酵母菌不能耐受高渗透压、高浓度乙醇和发酵后期效率低等问题,降低酒精工业生产的成本。中国专利(CN201910944041.9)报道了一株耐乙醇耐高糖的发酵菌株及构建方法。中国专利(CN202010773737.2)报道了一株耐乙醇、耐高温、耐高渗的多重耐受性发酵菌株及构建方法。该菌株具有较好的耐高温性能、乙醇耐受性、高糖耐受性和耐高渗性能,具有较好的工业应用潜力。
但是，目前报道的产杂醇油含量低的酵母菌株是人工构建的工程菌株，虽有理论意义，但由于安全性问题的限制还不能被允许应用于酿酒上。目前酿酒行业缺乏兼具耐高糖度及耐高酒精度，且杂醇油含量低的酿酒酵母菌株。白酒和黄酒等酿造基质往往具有高糖度和高酒精度的特点，只有同时具备耐高糖和高酒精度的菌种才能适应在该环境条件下能够继续发酵和发挥功能。袁华伟，等(酿酒科技2020，4：27-32)从浓香型白酒生产大曲和糟醅中筛选低产杂醇油酵母菌LJ-07，该菌株在高粱汁发酵培养基中产乙醇产量7.56％vol，杂醇油总量221.74mg/L(其中未包含苯乙醇，但增加了正丁醇8.62mg/L)。与常用的酿酒酵母菌相比，LJ-07酵母菌株的杂醇油产量降低了23.53％，而产乙醇的能力持平。但从报道的实验数据来看，该菌株在20％的葡萄糖浓度下的生长量也明显不足，其耐高糖、高酒精度的能力一般。根据已有的研究及专利检索，目前在酿酒行业中尚没有同时兼具高产酒精，低产杂醇油，并同时具有耐高糖度、耐酒精度等特性的酿酒酵母菌株及其应用的报道。
技术内容：
本发明的一个目的是提供一种新的酿酒酵母菌株，该菌株耐高糖、耐乙醇能力强，出酒率高、总杂醇油含量低的特点，并含有较高的丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等酒的风味成分物质，对改善白酒和黄酒等酒口感，提高酒品质量具有重要价值。
本发明的另一个目的是提供一种含有酿酒酵母的酿酒菌剂。
本发明的再一个目的是提供酿酒酵母在酿酒发酵中的应用。
本发明的再一个目的是提供制备酿酒菌剂的方法。
本发明的再一个目的是提供酿酒菌剂在酿酒中的应用。
本发明公开了一株新的酿酒酵母菌，其特征在于,酿酒酵母SY91株Saccharomycescerevisiae SY91,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2023450。保藏日期是2023年4月1日。酿酒酵母SY91株从湖北省某白酒厂酒醅中分离经筛选获得。该菌株有如下特征：
酿酒酵母SY91株形态特征是：在YPD固体培养基上生长2～3d，菌落乳白色，表面光滑、较湿润，边缘整齐，在YPD液体培养基中37℃下培养12～14h，细胞呈圆形或椭圆型，一端出芽。
酿酒酵母SY91株生化特征是：可同化利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖；不能利用木糖、乳糖。
酿酒酵母SY91株耐高糖度生长特征是：酿酒酵母SY91在30％葡萄糖浓度的YPD培养基中仍生长较好，而标准菌株CICC1008生长较差，明显受到抑制。
酿酒酵母SY91株耐乙醇能力特征是：28℃下，在乙醇含量为12％的YPD培养基中，SY91仍生长很好，比其标准菌株耐乙醇生长能力强。
对酿酒酵母SY91株进行26S rDNA的PCR扩增与测序实验，分析显示，菌株SY91与Saccharomyces cerevisiae strain CICC1008的26S rDNA的同源性达到了99％，确定菌株SY91为一种酿酒酵母。
本发明还公开了一种含酿酒酵母SY91株的酿酒菌剂，该酿酒菌剂主要成份是酿酒酵母SY91株及胞外产物。
优先地，本发明还公开了一种含酿酒酵母SY91株酿酒菌剂，该菌剂组合物主要成份是酿酒酵母SY91株及其胞外产物和发酵基质，其特征在于它含有下列组份(接种量)：
酿酒酵母5-200×108cfu/g
其中酿酒酵母为CCTCC NO：。
本发明公开的酿酒菌剂为液态或固态。优先的，本发明公开的酿酒菌剂为固态。
本发明还公开了制备固态酿酒菌剂的方法，该方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：接种酿酒酵母SY91株于灭菌的糖度为12巴林的麦芽汁三角瓶培养基中，28℃摇床培养24小时。
(2)液态通气培养：液体培养基配方是：葡萄糖25％、酵母膏2％，蛋白胨1％。
115℃灭菌15分钟。冷却后，按体积比5％接入活化好的酵母菌种子液，25-28℃下通气培养24h发酵完毕,取培养好的酵母菌液于4000rpm离心10min，去上清液，收集酵母菌体，加入10％牛奶保护剂与菌体混合均匀。
(3)真空冷冻干燥及粉碎：对发酵后的固体样品在-45℃进行真空冷冻干燥处理，样品含水率低于10％后，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置冰箱保鲜层中保藏。取样采用稀释平板测数法检测样品中酿酒酵母SY91的活菌数达150-300亿cfu/克。
(4)包装：将含SY91株的固体菌剂装塑料袋封口后制成含单一菌种的酿酒菌剂。
本发明还公开了新的酿酒酵母SY91株在液体和固态发酵白酒中的应用。
本发明还公开了酿酒菌剂在白酒厂降低白酒杂醇油含量和提高白酒品质量的应用。
本发明还公开了新的酿酒酵母SY91株在米酒和黄酒发酵中的应用。
本发明还公开了酿酒菌剂在黄酒厂降低黄酒杂醇油含量和提高黄酒品质量的应用。
本发明中使用的酿酒酵母SY91株进行寄存在国家知识产权局指定的保藏机构，社会第三方可依法获取再现本发明。本发明使用的试剂，普通菌种都是商品化的产品，如酿酒酵母CICC1008为常用普通微生物菌种，登载于中国工业微生物菌种保藏管理中心目录，处于公开状态，科学工作者可向中国工业微生物菌种保藏管理中心索取。
本发明的优点：
1、本发明提供的酿酒酵母SY91株是一株新的菌株，该菌株具有很强的耐高糖度、耐高酒精生长能力。该菌株在30％葡萄糖浓度的YPD培养基中仍生长较好，而标准菌株CICC1008生长明显受到抑制，且比JT-07高20.6％；SY91的耐高浓度乙醇生长能力明显强于CICC1008，菌株SY91在12％酒精度下的相对生长量是8％酒精度下的80.1％，而CICC1008菌株只有68.7％，且比JT-07高12.5％。
2、酿酒酵母SY91株总杂醇油含量低，杂醇油/乙醇比值小：在酵母菌基础发酵培养基中进行酒精发酵，SY91株比标准菌株CICC1008的杂醇油/乙醇比值降低了48.2％。SY91株发酵糯米酒的杂醇油/乙醇比值比标准菌株低43.6％。固态小曲白酒发酵中，接种SY91菌剂的实验组分别比接种传统小曲组和CICC1008组总杂醇油含量分别降低了21.7％和24.6％。黄酒发酵中，添加SY91酿酒菌剂的实验组黄酒的总杂醇油和乙酸含量分别比添加传统黄酒小曲的对照组的原酒降低了33.5％和27.0％；乙醇浓度比对照组提高了8.5％；总杂醇油/乙醇比值降低了37.1％.与比JT-07相比，总杂醇油/乙醇比值降低了37.71％.
3、酿酒酵母SY91株产酒精率高。白酒液态发酵条件下，SY91菌株乙醇产量达到8.0％(v/v)，比标准菌株CICC1008乙醇产量提高了19.4％，而总杂醇油含量降低了40.2％，总杂醇油/乙醇比值下降了49.9％。固态小曲白酒发酵中，接种SY91菌剂的实验组的酒精度分别比接种传统小曲组和CICC1008组提高了14.5％和16.2％。
4、酿酒酵母SY91株产酯率高。该菌株产丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等酒的风味成分的能力强。酿酒酵母SY91发酵液态白酒产总酯含量比标准菌株CICC1008提高了196.7％,其中丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯的含量分别比标准菌株CICC1008提高了48.2％、296.4％和693.2％。固态小曲白酒发酵中，接种SY91菌剂的实验组的丁酸乙酯和乙酸苯乙酯含量分别比标准菌株CICC1008组提高了66.7％和80.0％。
即酿酒酵母SY91株与标准菌株CICC1008相比具有较高的耐高糖和耐酒精生长能力、杂醇油含量低、出酒率高、以及高产丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等酯的风味成分能力强，发酵黄酒、米酒和白酒口感好、不易上头的特点。
附图说明
图1是酿酒酵母SY91株26S rDNAD1/D2区序列系统发育树图
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1高耐受性、低产杂醇油酿酒酵母SY91菌株的筛选及鉴定
1.1耐高糖度、高酒精度的酵母菌株分离
从湖北省某酒厂采集酒醅等发酵基质样品，称取样品10g，分别添加到装有90ml含8％(v/v)乙醇浓度的酸性豆芽汁三角瓶富集培养液中(用乳酸调至pH4.0)，30℃富集培养3-5d。各取100μl经过一定梯度稀释后的富集培养液，分别涂布到马丁孟加拉红培养基固体平板上，置于30℃培养48小时后，挑取表面光滑湿润、具有典型酵母形态的单菌落，再在相同培养基固体平板上重复划线纯化，置于30℃培养48小时后，共获30℃培养温度下单菌落生长良好的酵母菌株150株。将分离得到的具有一定的耐酒精、耐酸能力的150株酵母菌分别划线接种含12％(v/v)乙醇浓度和35％葡萄糖浓度的YPD固体选择性培养基中，28℃培养40h,观测比较各酵母菌株的生长情况。通过耐乙醇、耐高糖平板培养试验比较，并以酿酒酵母标准菌株CICC1008作对照，从150株耐高温酵母菌中进一步筛选出10具有较好的耐乙醇和耐高糖能力的菌株(表1)，对其进行4℃保存。
表1 15株酵母菌在高含量的乙醇和葡萄糖平板上的生长测定结果
注：+++表示生长很好；++表示生长较好；+表示生长微弱。
1.2出酒率高、杂醇油/乙醇比值低的酿酒酵母菌株SY91的筛选
为了获得兼具高耐受性和出酒率高、低产杂醇油的优良酵母菌株，本发明对上述分离和筛选出的10株高耐受性酵母菌株进行了酒精发酵比较试验，从中进一步优选获得出酒率高、总杂醇油含量低的菌株。具体方法为：用接种环取上述筛选到的10株高耐受性酵母菌纯种各1环，分别接入YPD液态培养基中，30℃，170rpm摇床培养24h,制备成酵母菌种子液，并用血球计数板计数各菌液中酵母菌总数。然后按接种量为2×106个/mL,分别接种各酵母菌种子液于酵母菌基础发酵培养基(配方：葡萄糖30％、酵母膏0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾0.15％、硫酸镁0.1％。分装三角瓶于115℃灭菌15分钟)，28℃下静置发酵3d。发酵完毕后，分别取各发酵液样品100ml+100ml蒸馏水进行酒精蒸馏，各接取100ml的馏出液(酒样)用于气相色谱测定酒精度，并取50ml酒样按GB/T 10345-2007测定总酸。测定结果见表2。结果表明在10株高耐受性菌株中，SY91菌株的产酒精能力最强，同时其总杂醇油的含量和杂醇油/乙醇的比值均为最低，比对照菌株CICC1008杂醇油/乙醇比值降低了48.2％。酵母菌SY91菌株具有耐受性好、高产乙醇和低产杂醇油的独特优点。
表2不同酵母菌株在基础发酵培养基中产酒精、产杂醇油能力测定结果
本发明人将分离的一株新的酿酒酵母SY91株Saccharomyces cerevisiae SY91,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2023450，保藏日为2023年4月1日。
1.3酿酒酵母SY91株的鉴定
通过形态特征观察、生理生化测定及26S rDNA D1/D2区域基因序列分析结果对SY91进行鉴定。在鉴定中，本实验选择酿酒酵母CICC1008作为对照菌株,来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，科学工作者可索取。
1.3.1酿酒酵母SY91株形态特征观察
在YPD固体培养基上生长2～3d，菌落乳白色，表面光滑、较湿润，边缘整齐，在YPD液体培养基中37℃下培养12～14h，细胞呈圆形或椭圆型，一端出芽。
1.3.2通过26S rDNA D1/D2区域序列分析进行系统发育地位鉴定
以酵母菌株的基因组DNA为模板做PCR扩增反应，扩增酵母菌株26S rDNA D1/D2区域，扩增引物采用通用引物NL1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和NL4(5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3')。
PCR反应体系(50μL)：Premix Taq(2×)25μL，引物NL1/NL4(20μmol/L)各1μL，模板DNA 1μL，无菌三蒸水22μL。
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸5min。所得PCR产物送上海生工生物工程纯化并测序，测序引物用上述NL1、NL4。
通过分子测序后，发现菌株SY91与Saccharomyces cerevisiae CICC1008的26SrDNA的同源性达到了99％，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株间差异不超过1％的标准，确定菌株SY91为一株酿酒酵母。图1是根据26S rDNA D1/D2区域序列所做的系统发育树。
1.3.3酿酒酵母SY91株的生理生化实验测定结果
(1)生化特征发酵试验
SY91菌株对糖的利用结果见表3。
表3酿酒酵母SY91不同碳源的发酵试验结果
(2)SY91菌株与标准菌株CICC1008耐酒精能力比较
将菌株SY91和标准菌株CICC1008的种子液接入含有乙醇浓度(v/v)分别为8％、10％、12％的YPD液体培养基中，置于30℃、180rpm摇瓶培养24h后，测OD600值。如表4所示，在添加了8％(v/v)乙醇的培养基中，SY91和CICC1008均能较好生长，但在添加了12％乙醇的培养基中，SY91的耐乙醇生长能力明显强于CICC1008，菌株SY91的OD600是CICC1008的126.8％。菌株SY91在12％酒精度下的相对生长量是8％酒精度下的80.3％，而对照菌株只有68.7％。
表4酿酒酵母SY91株与标准菌株CICC1008耐酒精能力比较(OD600)
(3)酿酒酵母SY91株与标准菌株CICC1008耐高糖度能力比较
将菌株SY91和标准菌株CICC1008的种子液分别转接到用葡萄糖含量分别为10％-60％的YPD液体培养基中，置于30℃、180rpm摇瓶培养24h，经适当稀释后测OD600值。从表5可以看出，SY91株在葡萄糖10-20％浓度范围内生长未受到任何影响，OD值最大，而参比菌株在20％葡萄糖浓度下，生长已受到负面影响。酿酒酵母SY91在30％葡萄糖浓度的YPD培养基中仍生长较好，其生长量达到最大值的85.0％，而标准菌株CICC1008生长较差，明显受到抑制，只有其最大生长量的60.9％。
表5酿酒酵母SY91株与标准菌株CICC1008耐高糖度能力比较(OD600)
实施例2.酿酒酵母SY91株发酵糯米酒产酒精及杂醇油能力比较
具体方法为：用接种环取各测试的酵母菌纯种各1环，分别接入YPD液态培养基中，30℃，180rpm摇床培养24h,制备成酵母菌种子液，并用血球计数板计数各菌液中酵母菌总数。然后按接种量为2×106个/mL,分别接种各酵母菌种子液于预先制备好的糯米糖化液(制备方法为：将糯米粉碎后按料：水＝1:2.5混合后，置水浴锅升温至90℃后添加液化酶液化90min，降温至65℃添加糖化酶糖化30min，冷却后离心收集糖化液，装三角瓶，115℃灭菌30min)中，28℃静置发酵5d。发酵完毕后，分别取各发酵液样品100ml+100ml蒸馏水，进行酒精蒸馏，各接取100ml的馏出液(酒样)用于气相色谱测定。酿酒酵母H和酿酒酵母B为市购的用于酿酒的商业化酵母菌株，用于酵母菌株对比测试。测定结果表明，在4株测试的菌株中，SY91菌株发酵米酒的产酒精能力最高，而其总杂醇油含量和杂醇油/乙醇比值均最低，其杂醇油/乙醇比值比标准菌株CICC1008低43.6％(表6)。
表6不同酵母菌株发酵糯米酒产酒精及杂醇油能力测定结果
实施例3.酿酒酵母SY91株液态法发酵白酒产酒精及杂醇油能力比较
采用比较不同酿酒酵母菌株在高粱糖化液中发酵产乙醇及杂醇油等的能力。结果如表7所示，酿酒酵母SY91株发酵乙醇产量最高。28℃白酒液态发酵条件下，SY91菌株乙醇产量达到8.0％(v/v)，比标准菌株CICC1008乙醇产量提高了19.4％，而总杂醇油含量降低了40.2％，总杂醇油/乙醇比值下降了49.9％。酿酒酵母SY91的乙醇产率比2株商业酿酒酵母均高，而总杂醇油含量及总杂醇油/乙醇比值比2株商业酿酒酵母均有显著下降。表明酿酒酵母SY91在白酒发酵应用中更具有提高出酒率和降低总杂醇油含量的优势。同时，酿酒酵母SY91产白酒风味物质丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯的含量分别比标准菌株CICC1008高48.2％、296.4％和693.2％，酿酒酵母SY91总酯含量比标准菌株CICC1008提高了196.7％。
表7不同酵母菌株液态法发酵白酒气相色谱分析结果
实施例4酿酒酵母SY91酿酒菌剂的制备方法
按照如下步骤进行：
4.1菌种活化：接种酿酒酵母SY91株于灭菌的糖度为12巴林的麦芽汁三角瓶培养基中，28℃摇床培养24小时。
4.2液态通气培养：液体培养基配方是：葡萄糖25％、酵母膏2％，蛋白胨1％。115℃
灭菌15分钟。冷却后，按体积比5％接入活化好的酵母菌种子液，25-28℃下通气培养24h发酵完毕,取培养好的酵母菌液于4000rpm离心10min，去上清液，收集酵母菌体，加入10％牛奶保护剂与菌体混合均匀。
4.3真空冷冻干燥及粉碎：对发酵后的固体样品在-45℃进行真空冷冻干燥处理，样品含水率低于10％后，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置冰箱保鲜层中保藏。取样采用稀释平板测数法检测样品中酿酒酵母SY91的活菌数达150-300亿cfu/克。
4.4包装：将含SY91株的固体菌剂装塑料袋封口后制成含单一菌种的酿酒菌剂。
实施例5SY91菌剂在固态小曲白酒发酵中的应用
采用小曲白酒固态发酵方法，对高粱经过闷粱、蒸粱处理后，摊凉冷却至25℃左右，水分控制在55％左右，按照高粱净重将摊凉后的高粱进行分组2500g/组，酿酒酵母菌剂按照2×106cfu/g高粱的接种量进行接种，接种后控制温度39-41℃进行堆积30h左右，堆积结束后装瓶28℃发酵15天后取样蒸馏。2个对照组分别接种传统小曲和根霉曲+酿酒酵母CICC1008，实验组接种根霉曲+酿酒酵母SY91，其中根霉曲为市购用于酿酒的糖化剂。发酵结束后取50g酒醅，加入150mL蒸馏水，蒸出100mL蒸馏液，对蒸馏的样品中的醇类、酯类等成分含量进行气相色谱分析。实验结果表明(表8)，接种SY91的实验组的酒精度分别比接种传统小曲组和CICC1008组提高了14.5％和16.2％，而总杂醇油含量分别降低了21.7％和24.6％；接种SY91实验组的丁酸乙酯和乙酸苯乙酯含量分别比对照菌株CICC1008组提高了66.7％和80.0％。表明接种SY91菌剂可明显提高固态法白酒的出酒率和丁酸乙酯等风味物质含量，同时可显著降低白酒中的杂醇油含量。
表8固态小曲白酒发酵酒醅蒸馏酒样中主要成分气相色谱分析结果
实施例6SY91酿酒菌剂在黄酒发酵中的应用
6.1试验方法
某黄酒企业以糯米为原料，按照250kg/组规模，糯米经浸泡、蒸煮、摊凉至30-32℃后加酒曲接种、混合均匀。对照组接种传统黄酒小曲比例为投料量的0.5％，实验组接种SY91酿酒菌剂(同时添加市售根霉曲)比例为投料量的0.2％。25℃左右入缸发酵30d后，经压榨、澄清、过滤、灭菌而制备成黄酒产品。取样黄酒产品进行蒸馏。每个处理三个平行样。对蒸馏的原酒样品中的醇类、酸类、酯类等成分含量进行气相色谱分析。主要仪器：气相色谱分析仪。
6.2酒质色谱分析结果及感官品评
由表9可以看出：添加SY91酿酒菌剂的实验组黄酒的总杂醇油和乙酸含量分别比添加100％传统黄酒小曲的对照组的原酒降低了33.5％和27.0％；乙醇浓度比对照组提高了8.5％；总杂醇油/乙醇比值降低了37.1％。实验组的β-苯乙醇含量为102.8mg/L，比对照组提高了114.2％；乙酸苯乙酯含量比对照提高了48.4％；而实验组的正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别比对照组降低了85.3％、10.2％和78.3％。结果表明：添加含SY91酿酒菌剂的酒曲对于提高黄酒出酒率和酒品质量有明显的促进作用。
表9SY91酿酒酵母发酵黄酒分析结果
感官品评对比为：对照组酒样分数在90-95，评语是香味较谐调、风味较纯厚；添加SY91酿酒曲的实验组酒样分数在95-100，评语为蜜香浓郁、香味谐调、绵甜纯厚、味美细腻。由于β-苯乙醇、乙酸苯乙酯等为黄酒的主要香味成分含量的增加，总杂醇油、乙酸含量的降低，表明使用SY91酿酒菌剂可以明显黄酒改善酒质，使酒中的香气更加协调，口感更佳，饮酒后不易上头。
Claims (7)
1.一株低产杂醇油，且耐高糖和乙醇的酿酒酵母，能用于白酒和黄酒等酿造，其特征在于,该菌株为酿酒酵母SY91株，SaccharomycescerevisiaeSY91,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2023450。
2.一种含权利要求1中所述的酿酒酵母SY91株的酿酒菌剂，其特征在于其活性成分为酿酒酵母SY91株菌体及其代谢产物。
3.根据权利要求2中所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为固态菌剂。
4.制备权利要求2中所述的菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：接种酿酒酵母SY91株于灭菌的糖度为12巴林的麦芽汁三角瓶培养基中，28℃摇床培养24小时；
(2)液态通气培养：液体培养基配方是：葡萄糖25％、酵母膏2％，蛋白胨1％，115℃灭菌15分钟，冷却后，按体积比5％接入活化好的酵母菌种子液，25-28℃下通气培养24h发酵完毕,取培养好的酵母菌液于4000rpm离心10min，去上清液，收集酵母菌体，加入10％牛奶保护剂与菌体混合均匀；
(3)真空冷冻干燥及粉碎：对发酵后的固体样品在-45℃进行真空冷冻干燥处理，样品含水率低于10％后，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置冰箱保鲜层中保藏，取样采用稀释平板测数法检测样品中酿酒酵母SY91的活菌数达150-300亿cfu/克；
(4)包装：将含SY91株的固体菌剂装塑料袋封口后制成含单一菌种的酿酒菌剂。
5.权利要求1中所述的酿酒酵母SY91株在米酒酿造中的应用。
6.权利要求2中所述的酿酒菌剂在白酒酿造中的应用。
7.权利要求2中所述的酿酒菌剂在黄酒酿造中的应用。
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