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CN116425856A - 一种人sf3b1乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人sf3b1乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116425856A
CN116425856A CN202310469647.8A CN202310469647A CN116425856A CN 116425856 A CN116425856 A CN 116425856A CN 202310469647 A CN202310469647 A CN 202310469647A CN 116425856 A CN116425856 A CN 116425856A
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antibody
sf3b1
human
polypeptide
acetylated
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CN202310469647.8A
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黄国良
汪婧
李文凯
曹慧媛
王芳芳
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Guangdong Medical University
Original Assignee
Guangdong Medical University
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Abstract

本发明提供了一种人SF3B1乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用，所述人SF3B1乙酰化多肽的序列为EQYRK(acetyl)MVMETIEKC，所述抗原为所述人SF3B1乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。所述抗体可特异性结合所述的人SF3B1乙酰化多肽。本发明还提供一种检测试剂盒，可用于检测发生K866位点乙酰化修饰的人SF3B1蛋白。本发明的乙酰化多克隆抗体可特异性识别SF3B1蛋白K866乙酰化位点，可用于检测肿瘤细胞该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。

Description

一种人SF3B1乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及一种人SF3B1乙酰化多肽、抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
新近发布的全球癌症统计数据显示，在所有癌症中，食管癌发病率位于第7位，而死亡率位于第6位，每18名癌症死亡病人中就有1人为食管癌。美国癌症统计数据显示，在所有癌症中食管癌五年生存率已经排在最后5位。由于食管癌早期症状不明显，患者出现症状时一般已处于中、晚期，且中、晚期患者预后较差，严重危害人类健康。食管癌发病率存在明显的地区分布差异，我国是食管癌高发区，各省份中我国的河南省、山西省及河北省为食管癌发病率较高的省份。广东省尤其潮汕地区，也是我国食管癌高发区。食管癌发病因素包括遗传因素、吸烟、酒精、饮食、肥胖等，但发病机制仍不明确，而且早期诊断指标不足，对其进行深入研究有着重要意义。
前体mRNA剪接是基因表达转录后调节中的一个重要步骤，是一个从前体RNA中去除非编码序列(内含子)并连接编码序列(外显子)形成mRNA的过程，蛋白质多样性的产生主要是由于前体mRNA剪接过程。前体mRNA剪接是由剪接体催化，目前发现的剪接体有两种：U2型剪接体和U12型剪接体，他们所识别和作用的内含子不同，但是他们的组成有许多共同的蛋白质。例如，蛋白质复合物SF3B的所有亚单位，即SF3B155/SF3B1、SF3B145、SF3B130、SF3B49、SF3B14a/p14、SF3B14b和SF3B10。SF3B1基因位于染色体2q33.1上，是剪接体因子3b(SF3B)复合体的最大亚单位，是剪接体的核心成分，对于识别和结合靠近3′剪接位点的分支点序列至关重要，并且在准确切除前体mRNA的内含子形成成熟mRNA中起着重要作用。因此，SF3B1突变会引起多个基因的表达失调，可能是肿瘤发生的驱动因素。
临床和实验数据表明，SF3B1突变与肿瘤的发生、发展及转移有关联。在乳腺癌中，SF3B1基因突变会导致细胞丝氨酸合成酶(PHGDH)表达下降，影响细胞中丝氨酸的合成代谢，说明SF3B1突变会影响细胞的能量代谢过程。在骨髓增生异常综合征患者中，SF3B1突变的体细胞由于3'剪接位点的错误识别导致移码，产生的异常mRNA一部分被降解，未降解的mRNA被翻译成了异常功能的蛋白质，导致两个参与线粒体铁代谢的基因PPOX和ABCB7基因的表达量显著下调。在慢性淋巴细胞白血病中，SF3B1突变会导致多个基因发生3'端异常剪接，包括SLC23A2、TC1RG1、FOXP等，这些突变剪接因子破坏了B细胞的生长和功能，改变了细胞的发育，引起细胞衰老。还有研究表明，在SF3B1基因突变体中ABCC5基因发生内含子保留，ABCC5基因的突变与肿瘤的耐药性密切相关。
蛋白质乙酰化修饰是指在乙酰基转移酶的作用下将乙酰基转接到蛋白质分子链上的一种蛋白质修饰过程。它属于蛋白质翻译后修饰的一种，包括组蛋白乙酰化和非组蛋白乙酰化，主要发生位点在赖氨酸上。蛋白质乙酰化修饰会影响蛋白质的功能作用的发挥，比如酶的活化与失活、蛋白质稳定性、亚细胞结构定位和特殊功能复合体的形成等。组蛋白中的H3、H4发生乙酰化修饰可以激活基因转录。组蛋白乙酰化除了可以激活特定基因的转录过程外，还是一个可逆的动态调节过程，维持这种可逆的乙酰化过程对于稳定染色质的结构和调控基因表达有着至关重要的作用。非组蛋白乙酰化也参与了与生理学和疾病相关的关键细胞过程，如基因转录、DNA损伤修复、细胞分裂、信号转导、蛋白质折叠、自噬和代谢。总之，对非组蛋白乙酰化修饰与肿瘤发生的研究加深了对肿瘤发生机制的认识，对肿瘤的治疗提供了新思路和新靶点。
抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，磷酸化抗体的制备和应用已成为国际上关注的热点。但是目前仍缺乏用来检测人SF3B1蛋白的氨基酸序列中Lys866位点乙酰化状态的抗体。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种针对SF3B1蛋白K866乙酰化位点的抗原多肽，可特异性识别人肿瘤细胞表达的SF3B1蛋白K866乙酰化位点的多克隆抗体以及其制备方法和应用。
本发明提供一种人SF3B1乙酰化多肽，所述人SF3B1乙酰化多肽的序列为EQYRK(acetyl)MVMETIEKC，其中K(acetyl)表示人SF3B1蛋白K866位点氨基酸乙酰化赖氨酸。所述抗原多肽为人SF3B1蛋白第866位赖氨酸位点的附近14肽作为候选多肽筛选得到，其中该K866位点的赖氨酸为乙酰化状态，且C端连接一个半胱氨酸的氨基酸序列。
本发明还提供一种抗原，所述抗原为所述人SF3B1乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。
进一步的，所述载体蛋白选自KLH、OVA、THY或BSA。
本发明还提供一种抗体，所述抗体可特异性结合所述的人SF3B1乙酰化多肽。所述抗体是针对人SF3B1蛋白K866位点氨基酸乙酰化的抗体，其中所述抗体制备中采用了由以下氨基酸序列组成的抗原多肽，其具体序列为：EQYRK(acetyl)MVMETIEKC，其中K(acetyl)表示人SF3B1蛋白K866位点氨基酸乙酰化赖氨酸。
进一步的，所述抗体选自多克隆抗体或其经过化学手段或酶消化处理后可仍然保持结合所述人SF3B1乙酰化多肽的性质的抗体片段。
进一步的，所述多克隆抗体为利用EQYRK(acetyl)MVMETIEKC和载体蛋白的偶联物免疫非人动物接着纯化提取所述非人动物的血清后获得的。
进一步的，所述抗体可用于人SF3B1蛋白K866乙酰化位点的乙酰化水平检测。
本发明还提供所述的抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)对SF3B1蛋白第866位点附近赖氨酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段多肽序列；人工合成所述的人SF3B1乙酰化多肽；
(2)将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫非人动物；
(3)经过五次免疫的非人动物血清用ELISA法对抗体效价进行检测，收集免疫非人动物血清，并用多肽包被的溴化氰活化的琼脂糖亲和纯化柱纯化抗体；
(4)对纯化后抗体进行ELISA、免疫组化鉴定。
本发明还提供所述的人乙酰化SF3B1多肽或所述的抗原或所述的抗体在制备用于肿瘤的诊断、治疗及预后判定的试剂或试剂盒中的应用。所述的癌细胞优选为人食管癌细胞。
本发明还提供一种检测试剂盒，包括所述的抗体、抗原修复液、PBS缓冲溶液、内源性过氧化物酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。所述抗原修复液为EDTA(1X)抗原修复液；所述PBS缓冲溶液pH为7.4；所述阻断剂为内源性过氧化物酶阻断剂，如3％H2O2；所述环保透明剂为Van-Clear环保透明剂。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)本发明采用人工设计和合成含有该乙酰化位点的一段SF3B1蛋白K866位点的抗原多肽，并制备对应的多克隆抗体。该多克隆抗体经过ELISA等鉴定可特异性识别SF3B1蛋白K866乙酰化位点，并且相对于癌旁组织其在多种癌组织细胞中高表达，其差异具有统计学意义。
(2)本发明是针对人SF3B1蛋白K866位点乙酰化多克隆抗体，有助于研究介导其发生乙酰化的激酶作用，探讨人SF3B1蛋白多种生物学功能。
(3)本发明的乙酰化多克隆抗体可特异性识别SF3B1蛋白K866乙酰化位点，可用于检测肿瘤细胞该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1中DNAstar软件分析人SF3B1蛋白特性结果。
图2是本发明实施例4中乙酰化SF3B1-K866抗体与SF3B1-K866抗体的OD值，ELISA检测乙酰化SF3B1-K866抗体为特异性乙酰化位点抗体。
图3是本发明的制备流程。
图4是本发明实施例5中抗SF3B1(acK866)多克隆抗体的免疫组化鉴定结果。所使用的标本为食管癌细胞病理切片。
图5为本发明实施例5中Kaplan-Meier生存分析结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
根据前期工作结果，预测SF3B1蛋白第866位赖氨酸(K866)是一个潜在的乙酰化位点，可能与该蛋白的稳定及激活功能相关。本发明采用人工设计和合成含有该乙酰化位点的一段SF3B1蛋白多肽(acK866)，与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白(KLH)偶联，经脱盐纯化后免疫新西兰兔，通过五次免疫及ELISA效价检测后，采集兔血清并经多肽包被的溴化氰活化的琼脂糖凝胶纯化柱纯化。该多克隆抗体经过ELISA等鉴定，可特异性识别人食管癌细胞表达的SF3B1蛋白acK866位点。
实施例1SF3B1蛋白acK866多肽的设计及合成
(1)SF3B1氨基酸序列
根据GenBank获得人SF3B1蛋白氨基酸序列(NP_036565.2)：
Figure BDA0004203614800000061
Figure BDA0004203614800000071
结果表明，人SF3B1蛋白含有1304个氨基酸。
(2)用ProtParam软件分析人SF3B1蛋白特性(表1)：
表1
Number of amino acids 1306
Molecular weight 145830.36
Theoretical pI 6.65
结果表明，人SF3B1蛋白分子量为145830.36道尔顿，等电点为6.65，为中性蛋白。
(3)用DNAstar软件分析人SF3B1蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果如图1所示。框中标注的序列为选定的多肽序列，结果表明，人SF3B1蛋白第862位至第875位共14个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强，且866位氨基酸包含其中。
(4)SF3B1合成多肽序列：
SF3B1氨基酸序列中K866位点位于SF3B1的胞内段序列区，是SF3B1蛋白乙酰化修饰的一个位点，在SF3B1蛋白降解失活的动态调控中可能具有重要的作用。经过上述分析，选用的多肽序列为EQYRK(AC)MVMETIEKC。
实施例2多肽合成及与载体蛋白偶联
为便于与载体蛋白偶联，合成多肽在C端加入一个半胱氨酸，而且第866位赖氨酸为乙酰化状态：EQYRK(AC)MVMETIEKC。同时合成一段含有非乙酰化的第866位赖氨酸多肽序列：EQYRKMVMETIEKC作为对照。多肽由苏州百远生物科技有限公司合成。
一、多肽合成流程：
A：多肽合成：采用固相合成法合成，即先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以该结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链，重复操作，直到达到所要合成的肽链长度为止，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。
B：纯化：RP-HPLC纯化
①HPLC条件：
流动相：A)0.1％TFA水溶液；
0.1％TFA乙腈溶液；
梯度：A/B(90/40)到A/B(40/90)30min；
流速：1ml/min；
温度：室温(23℃)检测：214nm的紫外光；
样品：冻干的粗品；
②步骤：
a.将粗品溶解在流动相中；
b.注入20-30mg(2-2.5ml)样品；
c.将主峰收集到50mL管中；
d.冻干；
③鉴定：LC/MS
条件：
流动相：A)0.05％TFA水溶液B)0.1％TFA乙腈溶液；
梯度：A/B(90/10)到A/B(40/60)15min；
流速：1ml/min；温度：室温(23℃)；
检测：214nm的紫外光；
MS API：ESI。
表2多肽合成结果
Figure BDA0004203614800000091
二、多肽与载体蛋白偶联
化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)，卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽交联载体。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。
多肽偶联流程：
a.溶液准备：偶联缓冲液包括Na2HPO4，NaH2PO4，NaCl，EDTA，调pH至7.2；
b.实验步骤：
1)柱床准备：纯水及偶联缓冲液洗涤柱床；
2)多肽准备：少量DMF溶解多肽，静置半小时，待溶液中无颗粒状不溶物，加适量AH液配制成6mg/ml的多肽溶液，从多肽溶液中分出需要偶联的量；
3)KLH、Sulfo-SMCC准备：根据质量比，偶联多肽总量：纯KLH＝1：1，计算出纯KLH的量，按照质量比，纯KLH：Sulfo-SMCC＝10：1，计算出Sulfo-SMCC的量；
4)KLH和Sulfo-SMCC反应与反应物收集：将称取的KLH溶于适量的AH液配置成终浓度10mg/ml，Sulfo-SMCC用DMSO溶解成100mg/ml的溶液，将二者混合摇匀，室温反应4h并间断混摇使其充分反应，用层析柱分离样品；
5)KLH与Sulfo-SMCC的反应物与多肽偶联：向每一管需偶联多肽中加入相应量KLH与Sulfo-SMCC反应物，室温反应2h或室温过夜，并用垂直混合仪混匀，将偶联好的多肽至于-20℃保存。
注：使用KLH载体蛋白偶联合成多肽，所得偶联肽作免疫抗原用。
实施例3抗SF3B1多肽兔多克隆抗体制备
(1)免疫与采血：
Figure BDA0004203614800000101
(2)抗体效价ELISA检测方法
①血清ELISA检测：
a.溶液准备：
包被液：50mM Na2CO3(pH9.6)，20mM Tris-HCl(pH8.5)或10mM PBS(pH7.4)；
封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等；
洗涤液：PBST或纯水；
b.实验步骤：
1)将抗原按适当浓度溶解于包被液中；
2)在对应的孔中加入100μl抗原，4℃过夜；
3)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
4)每孔加200μl封闭液，37℃孵育1小时；
5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
6)每孔加100μl一抗，37℃孵育1小时；
7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
8)每孔加100μl二抗，37℃孵育1小时；
9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；
10)拍干孔中残留液体，每孔加100μl显色液，37℃避光显色10min；
11)每孔加50μl 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm的OD值。
c.血清ELISA检测结果：
Figure BDA0004203614800000111
注：R01885和R01886混合血清ELISA检测均转阳(1∶27000，OD值＞1)，将安排两步亲和纯化并进行ELISA抗体鉴定。
②抗体亲和纯化结果：
兔号 抗原号 抗体(批号) 浓度(mg/ml) 体积(m1) 总量(mg)
R01885P 20072408 SA210105X06 0.12 3 0.36
R01886P 20072408 SA210106X03 0.28 14.5 4.06
R01885NP 20072418 SA201230X04 0.4 22 8.8
R01886NP 20072418 SA210105X07 0.49 8.5 4.165
③抗体ELISA结果
Figure BDA0004203614800000121
结论：该项目免疫的R01885P和R01886P血清ELISA检测为阳性；两步亲和法纯化抗体，共获得乙酰化化抗体4.42mg。以上结果表明本实施例制备的抗体效果良好，制备成功。
实施例4抗SF3B1(pK866)多克隆抗体的鉴定
一、抗SF3B1(acK866)多克隆抗体的ELISA鉴定
ELISA实验步骤
(1)将多肽SF3B1-Lys866(Lys866未乙酰化的对照组)和acSF3B1-Lys866(Lys866乙酰化处理的实验组)，用1×CBS包被液溶解成0.2μg/100μl，铺至每个酶标板的孔中100μl，4℃过夜包被。
(2)第二天取出包被好的酶标板，甩干包被液，拍板。
(3)加封闭液(3％BSA)，每个孔加200μl，37℃孵育2h。
(4)封闭完毕后，取出酶标板，洗板三次，每个孔中加入300μl的PBST静置2min后甩干(避免孔与孔之间的污染)，将板拍在干净的纱布上，将孔内的液体拍干为佳。
(5)可直接进行下一步实验，也可用自封袋包装好，4℃保存备用。
(6)将SF3B1一抗以1:4000的稀释浓度，加入每孔100μl，37℃孵育1h。
(7)1h后将酶标板取出，洗板三次后加入HRP二抗，37℃孵育30min。
(8)30min后将酶标板取出，洗板三次后加入TMB显色剂37℃避光孵育15min。
(9)15min后将酶标板取出(变蓝)，立即加入终止液，酶标仪震荡30s，450nm读数，分析结果。
二、ELISA实验检测acSF3B1-K866抗体为特异性乙酰化位点抗体
鉴于SF3B1-K866位点的乙酰化尚未见相关报道，因此发明人委托公司定制了acSF3B1-K866抗体，经ELISA实验检测acSF3B1-K866抗体是否为特异性乙酰化位点抗体。结果显示acSF3B1-K866抗体与acSF3B1-K866抗原结合的OD值是明显大于acSF3B1-K866抗体与非乙酰化SF3B1-K866抗原结合的OD值(见图2)，并且acSF3B1-K866抗体与acSF3B1-K866抗原结合的OD值是随着抗体浓度的稀释而减小的，结果提示该acSF3B1-K866抗体为特异性的acSF3B1-K866位点的抗体。
实施例5抗SF3B1(acK866)多克隆抗体的组织免疫组化鉴定
一、实验步骤：选用食管癌组织芯片进行免疫组化，验证ac-SF3B1(K866)抗体在癌、癌旁组织中的表达差异。
1、放入60℃烤箱烤片2小时。
2、切片脱蜡水化程序
(1)环保透明剂摇床脱蜡10分钟3次；
(2)100％—95％—85％—75％—50％乙醇各浸泡5分钟。
3、超纯水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。
4、抗原热修复：将EDTA(1X)抗原修复液与微波盒中将热至沸腾，将石蜡切片放入放入沸腾的抗原修复液中，中档微波处理20～30分钟。
5、停止加热，室温冷却20～30分钟。
6、将抗原修复后切片置超纯水，浸泡2次各3分钟，之后用PBS摇洗3次各3分钟。
7、将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3％H2O2，避光室温孵育15分钟。PBS缓冲液摇洗3次各5分钟。
8、取出切片，滴加一抗60μl，滴加一抗后放入专用孵育盒内，4℃冰箱过夜。
9、第二天，取出切片复温30分钟，随后放入PBS缓冲液中清洗3次各5分钟，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色。(前两次的PBS倒掉)。
10、擦干组织周围液体后滴加60μl辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物(根据实际情况要求覆盖样本)，室温孵育20分钟，PBS缓冲液洗涤3分钟×3次。
11、显色，滴加现配适量DAB显色剂，室温显色，5～20分钟。自来水终止显色。
12、复染，苏木素染液中染色5～10分钟，水洗，将切片置于盐酸乙醇快速分化液浸泡15秒左右，继续水洗，将切片至于0.5％氨水中10秒，水洗。
13、将切片依次置于75％乙醇—85％乙醇—95％乙醇—100％乙醇中各3分钟。
14、取出后将切片依次置于透明剂浸泡5分钟3次。
15、中性树胶封片，光学显微镜下观察。
二、抗SF3B1(pK866)多克隆抗体的组织免疫组化鉴定结果
将免疫组化实验过后的食管癌切片与镜下观察(如图4所示)，比较抗SF3B1(acK866)多克隆抗体癌、癌旁组织中的表达，可见癌组织于胞浆或胞核中可见棕黄色，呈强阳性。癌旁组织于胞浆或胞核中可见淡黄色，呈弱阳性。对于食管癌芯片180个点的癌与癌旁做统计分析，使用日本滨松数字病理扫描仪进行芯片扫描，使用image Pro plus软件进行染色强度评分。我们对于癌组织的SF3B1-K866乙酰化蛋白表达量进行了ROC分析，选取了特异性和敏感性程度最高的点作为划分标准，对于高低表达分组进行了划分。Kaplan-Meier生存分析结果如图5所示，在癌组织中，SF3B1-K866乙酰化蛋白表达量低时，患者生存时间明显延长，P＝0.0365。进一步对乙酰化蛋白表达和各种病理特征进行卡方检验，结果显示，在浸润深度等级更高的病例中，乙酰化SF3B1-K866表达量更高，P＝0.013。可以认为SF3B1(acK866)蛋白在癌组织中对患者生存不利。
表2食管癌中Ac-SF3B1(K866)与临床特征的关系
Figure BDA0004203614800000151
标准卡方检验，*P<0.05
上述试验结果证明本发明的乙酰化多克隆抗体可特异性识别SF3B1蛋白acK866乙酰化位点，可用于检测肿瘤细胞例如食管癌等该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
实施例6一种检测试剂盒
所述试剂盒包括如下组分：实施例3制备得到的抗体、抗原修复液、PBS缓冲溶液、酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。
所述抗原修复液可为EDTA(1X)抗原修复液；所述PBS缓冲溶液pH为7.4；所述阻断剂为内源性过氧化物酶阻断剂，如3％H2O2；所述环保透明剂为Van-Clear环保透明剂。
本实施例还提供上述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)将待检测组织常规石蜡切片，经过环保透明剂，乙醇分别摇床脱蜡，超纯水漂洗；
(2)将抗原修复液加热至沸腾，将石蜡切片放入放入沸腾的抗原修复液中，中高档微波处理，室温冷却后置于超纯水中浸泡，之后用PBS摇洗3次；
(3)将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3％H2O2，避光室温孵育，PBS缓冲液摇洗；
(4)取出切片，滴加经过稀释的针对人SF3B1蛋白K866位点的乙酰化抗体(实施例3制备的)，放入孵育盒内，4℃冰箱过夜，放入PBS缓冲液中充分洗涤；
(5)擦干组织周围液体后滴加辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室温孵育，PBS缓冲液洗涤，滴加现配适量DAB显色剂，室温显色，自来水终止显色，苏木素染液中染色，水洗后将切片置于0.5％氨水中浸泡，继续水洗；
(6)将切片依次置于乙醇中，取出后将切片置于透明剂，用中性树胶封片，光学显微镜下观察。
本发明选择了SF3B1蛋白包含第866位苏氨酸位点(K866)的附近14肽作为候选多肽，并用人工方法进行包含acK866的多肽合成及完全抗原制备。对SF3B1蛋白第866位点附近氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过五次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用多肽包被的溴化氰活化的琼脂糖(CNBr activatedsepharose)亲和纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别SF3B1蛋白acK866位点，可用于检测肿瘤细胞该位点的乙酰化水平，为探索肿瘤细胞增殖及转移机制研究提供一种工具，也为肿瘤诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人SF3B1乙酰化多肽，其特征在于，所述人SF3B1乙酰化多肽的序列为EQYRK(acetyl)MVMETIEKC，其中acetyl表示乙酰化。
2.一种抗原，其特征在于，所述抗原为权利要求1的人SF3B1乙酰化多肽和载体蛋白的偶联物。
3.根据权利要求2所述的抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自KLH、OVA、THY或BSA。
4.一种抗体，其特征在于，所述抗体可特异性结合权利要求1所述的人SF3B1乙酰化多肽。
5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述抗体选自多克隆抗体或其经过化学手段或酶消化处理后可仍然保持结合所述人SF3B1乙酰化多肽的性质的抗体片段。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述多克隆抗体为利用EQYRK(acetyl)MVMETIEKC和载体蛋白的偶联物免疫非人动物接着纯化提取所述非人动物的血清后获得的。
7.根据权利要求4-6任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体可用于人SF3B1蛋白K866乙酰化位点的乙酰化水平检测。
8.权利要求4-7任一项所述的抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)人工合成权利要求1所述的人SF3B1乙酰化多肽；
(2)将合成的多肽与载体蛋白偶联，将偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫非人动物；
(3)经过四次免疫的非人动物血清对抗体效价进行检测，收集免疫非人动物血清，并纯化抗体；
(4)对纯化后抗体进行检测。
9.权利要求1所述的人乙酰化SF3B1多肽或权利要求2-3任一项所述的抗原或权利要求4-7任一项所述的抗体在制备用于肿瘤的诊断、治疗及预后判定的试剂或试剂盒中的应用。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求4-7任一项所述的抗体、抗原修复液、PBS缓冲溶液、酶阻断剂、辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB显色剂、苏木素染液、乙醇、环保透明剂、0.5％氨水和超纯水。
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