CN116411139A - 用于多亚型hiv-1检测的通用型引物组、探针及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于扩增HIV‑1核酸的引物组、用于检测HIV‑1核酸的荧光探针，以及使用它们进行HIV‑1检测的方法及试剂盒。本发明的检测方法具有亚型通用性广、灵敏度高、特异性高等特点，适用于HIV‑1的多种常见和非常见亚型的检测。特别是本发明能够在10‑25分钟内完成检测，因此可成为HIV‑1的现场快速检测方法。

Description

用于多亚型HIV-1检测的通用型引物组、探针及检测方法

技术领域

本发明涉及艾滋病病毒的检测领域。更具体地，本发明涉及一种用于扩增HIV-1核酸的引物组、用于检测HIV-1核酸的荧光探针，以及使用它们进行HIV-1病毒的快速检测的方法及试剂盒。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的慢性传染性疾病。终结艾滋病流行的一个关键环节在于检测发现HIV感染者，既往研究发现，未被诊断发现的HIV感染者，特别是急性期感染者是导致HIV感染传播的重要原因。及早发现感染者并在感染早期进行抗病毒治疗可以有效提高抗病毒治疗效果，并通过抑制病毒在体内复制有效降低传播风险。因此，尽早诊断HIV感染对于预防HIV传播具有重要的公共卫生意义。

迄今为止，全球流行的HIV可以分为两种基因型，HIV-1和HIV-2。HIV-1广泛分布于世界各地，是引起全世界艾滋病流行的主要病原体。HIV-1型可进一步分为M、N、O、P组，其中M组毒株是导致全球艾滋病流行的主要病毒株，至少包括A、B、C、D、F、G、H、J、K和L 10个不同的亚型以及多种流行重组型(circulating recombinant form，CRF)和独特重组型(uniquerecombinant form，URF)。我国以HIV-1为主要流行株，主要亚型包括CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B等，近年来也不断发现新的流行重组型(例如CRF55_01B、CRF85_BC等)和独特重组型(例如0107、01B、01BC、01C等)，不同HIV-1亚型间的基因序列多样性可能导致检测试剂出现漏检的情况发生。

现基于不同的技术已经有多种商品化HIV-1核酸检测试剂盒，例如逆转录PCR技术(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)、核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)技术、分枝DNA(branched DNAsignal amplification,bDNA)技术、实时荧光PCR定量技术(Quantitative real-timePCR,qPCR)等，但这些检测试剂通常实验操作流程较复杂、依赖于变温设备、成本较高，并且检测时间通常需要3个小时以上，这些因素使得HIV-1核酸检测通常在大型医院或实验室中开展，限制了HIV-1核酸检测在资源有限的基层医疗机构推广应用。

因此，本领域需要一种具有多亚型通用性、并且灵敏度高、特异性高的HIV-1快速检测方法。

发明内容

为了解决现有检测方法所存在的缺陷，本发明人基于Los Alamos HIV SequenceDatabase里中国地区610条HIV-1全基因序列进行了深度研究，这610条HIV-1全基因序列涉及34种亚型，不仅涵盖我国常见HIV-1亚型，如CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC、B、CRF55_01B、CRF85_BC亚型，还包含多种URF(包括0107、BC、01BC、01C等)。针对中国地区流行HIV-1的序列保守区进行序列分析，设计了亚型覆盖广的引物和探针序列，并基于实时荧光反转录-重组酶介导扩增(Reverse transcription recombinase aided amplification，RT-RAA)技术提出了一种针对中国地区HIV-1亚型的通用型核酸检测方法。该检测方法耗时短，同时兼具了灵敏度高、特异性高且无需复杂变温设备等特点。由此，得到本发明。

因此，在第一方面，本发明提供一种用于扩增HIV-1核酸的引物组，所述引物组包括：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)或AARACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCAC(SEQ ID NO.4)、以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)。

在第二方面，提供了一种用于检测HIV-1核酸的荧光探针，所述荧光探针的核酸序列为：5’-GGATTGGGGRRTACAGTGCAGGRGAAAGAATATAGAYATAAT AGCAAC-3’(SEQ ID NO.11)。

在第三方面，提供了第一方面所述的用于扩增HIV-1核酸的引物组与第二方面所述的用于检测HIV-1核酸的荧光探针在制备HIV-1诊断试剂中的用途。

在第四方面，提供了一种检测HIV-1的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：

(1)提供HIV-1核酸样本；

(2)配制实时荧光RT-RAA反应体系，所述实时荧光RT-RAA反应体系包括：作为模板的HIV-1核酸、第一方面所述的引物组、以及第二方面所述的荧光探针；

(3)对所述实时荧光RT-RAA反应体系进行RT-RAA扩增反应，并根据扩增曲线的斜率来确定是否存在HIV-1。

在第五方面，提供了一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)第一方面所述的引物组；

b)第二方面所述的荧光探针；以及

c)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种基于实时荧光重组酶介导扩增技术(RT-RAA)进行HIV-1的快速检测方法，并使用HIV-1重组质粒和临床样本对本发明的检测方法的检测性能进行初步评价。与现有技术相比，本发明得到的HIV-1快速检测新方法具有亚型通用性广、灵敏度高、特异性高、无需复杂变温设备等优势，并且能够在10-25分钟内完成检测，因此可作为现有HIV-1检测方法的有益补充。该方法有助于快速确认HIV-1感染者，与现有核酸检测技术相比更适于在资源有限的基层医疗机构推广使用，为促进HIV-1感染者早检测、早发现提供了有力的检测工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示出了HIV-1序列集的亚型构成情况。

图2示出了RAA引物和探针位置及长度的示意图。

图3示出了筛选RAA上游引物的检测结果。

图4示出了筛选RAA下游引物的检测结果。

图5示出了应用4种HIV-1亚型(CRF01_AE(标示为“01AE”)、CRF07_BC(标示为“07BC”)、CRF08_BC(标示为“08BC”)、B)的重组质粒筛选引物组合的检测结果。

图6示出了不同反应条件下的RT-RAA检测结果。

图7示出了本发明的方法针对10种HIV-1亚型(CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC、B、CRF55_01B、CRF85_BC、0107、BC、01BC和01C)的检测结果。

具体实施方式

在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。

在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。

在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。

为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。

在第一方面，本发明提供一种用于扩增HIV-1核酸的引物组，所述引物组包括：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)或AARACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCAC(SEQ ID NO.4)、以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)。

在上述引物序列中，A代表腺嘌呤，G代表鸟嘌呤，C代表胞嘧啶，T代表胸腺嘧啶，R代表A/G，Y代表C/T，M代表A/C，K代表G/T，S代表C/G，W代表A/T，H代表A/T/C，B代表G/T/C，V代表G/A/C，D代表G/A/T，以及N代表A/T/C/G。

在本发明的上下文中，所述引物组可以用于重组酶介导扩增(Recombinase AidedAmplification,RAA)反应。重组酶介导扩增技术原理为在腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosinetriphosphate,ATP)作用下，重组酶与特异性引物形成复合物，当特异性引物在模板DNA序列中识别到与之互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白辅助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶作用下复制延伸，实现反应产物的指数级增长。HIV-1是RNA病毒，可以理解在扩增前需要逆转录过程，因此本发明采用RT-RAA技术。

同样不希望被理论束缚，本发明的引物组也可以用于其他多种扩增技术中，例如qPCR、RT-PCR、NASBA、bDNA、重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)、酶促重组等温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA)、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、解旋酶依赖性扩增技术(helicase-dependent amplification，HAD)、链替代扩增技术(StrandDisplacement Amplification，SDA)、滚环核酸扩增技术(Rolling CircleAmplification，RCA)等。本领域技术人员会知道，RAA的引物与RPA、ERA等的引物是可以通用的。通过向反应体系中加入逆转录酶和荧光探针可以实现对RNA核酸的实时荧光检测。

因此，在第二方面，提供了一种用于检测HIV-1核酸的荧光探针，所述荧光探针的核酸序列为：5’-GGATTGGGGRRTACAGTGCAGGRGAAAGAATATAGAYATAATAGCAAC-3’(SEQ IDNO.11)。

在一个优选的实施方案中，在所述荧光探针中具有四氢呋喃残基(THF残基)修饰位点，该位点距离所述荧光探针的5’端至少30个碱基，距离所述荧光探针的3’端至少15个碱基，所述四氢呋喃残基位点两侧分别标记有荧光基团和猝灭基团，且所述荧光探针的3’端由封闭基团修饰。

在一个优选的实施方案中，所述荧光探针的第31位碱基(T)由荧光报告基团修饰，第34位碱基(T)由荧光淬灭基团修饰，第33位碱基替换为四氢呋喃残基。

在一个更优选的实施方案中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1，所述封闭基团为C3-Spacer。

在一个最优选的实施方案中，所述荧光探针的序列可以表示为：5’-GGATTGGGGRRTACAGTGCAGGRGAAAGAA/FAM-dT/A/THF//BHQ-dT/AGAYATAATAGCAAC-3’-C3-Spacer。

当该荧光探针与模板结合时，核酸外切酶III切割THF残基，荧光基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。

然而，不希望被理论束缚，本发明的引物组和探针也可以用于其他多种扩增技术中，例如RPA、ERA、RT-PCR、NASBA、bDNA、qPCR、LAMP、HAD、SDA、RCA等。

当本发明的荧光探针与RT-RAA扩增反应中的扩增产物杂交时，核酸外切酶III会切割荧光探针中的THF残基，从而使得荧光基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。

本发明的上下文中使用的HIV-1可以是任何来源的，例如来自血液样本如全血、血清、血浆、干血斑等，来自体液样本如分泌物等。

在第三方面，提供了第一方面所述的用于扩增HIV-1核酸的引物组与第二方面所述的用于检测HIV-1核酸的荧光探针在制备HIV-1诊断试剂中的用途。

在本发明的上下文中，本发明的用于扩增HIV-1核酸的引物组可以与用于检测HIV-1核酸的荧光探针结合形成HIV-1诊断试剂，通过实时荧光RT-RAA检测HIV-1。

在第四方面，提供了一种检测HIV-1的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提供HIV-1核酸样本；

(2)配制实时荧光RT-RAA反应体系，所述实时荧光RT-RAA反应体系包括：作为模板的HIV-1核酸、第一方面所述的引物组、以及第二方面所述的荧光探针；

(3)对所述实时荧光RT-RAA反应体系进行RT-RAA扩增反应，并根据扩增曲线的斜率来确定是否存在HIV-1。

本发明方法可以用于诊断目的，也可以用于非诊断目的。可以理解，本发明用于检测HIV-1的方法的“非诊断目的”可以是不包括诊断目的的任何其他目的，包括但不限于检验检疫和疫情防控等。

可以理解，在步骤(1)中，所述HIV-1核酸样本可以是任何来源的，例如来自血液样本如全血、血清、血浆、干血斑等，来自体液样本如分泌物等，也可以是基于已知的核酸序列经人工合成的样本。另外，还可以理解，所述HIV-1核酸样本可以通过本领域常规的核酸提取技术来进行提取获得。

可以理解，在步骤(2)中，实时荧光RT-RAA反应体系还包括用于进行RT-RAA扩增反应的其他试剂，例如逆转录酶、RAA重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶III、dNTP、RNase抑制剂、乙酸镁、缓冲液V、阴性对照、阳性对照等。本领域技术人员能够根据实际需要选择用于RT-RAA扩增反应的上述试剂，这些试剂均可以通过商购获得。

在一个具体的实施方案中，在步骤(2)中，每种引物的工作浓度为0.2-1.0μM。

在一个优选的实施方案中，在步骤(2)中，每种引物的工作浓度为0.4-0.8μM。

在一个更优选的实施方案中，在步骤(2)中，每种引物的工作浓度为0.6μM。

在又一个具体的实施方案中，在步骤(2)中，荧光探针的工作浓度为0.07-0.33μM。

在一个优选的实施方案中，在步骤(2)中，荧光探针的工作浓度为0.13–0.27μM。

在一个更优选的实施方案中，在步骤(2)中，荧光探针的工作浓度为0.2μM。

在又一个具体的实施方案中，在步骤(3)中，所述扩增反应在37℃至41℃进行25分钟或更短的时间，例如10分钟。事实上，本领域技术人员根据后文的示例性实施例的扩增结果可以预期，对于本发明的方法，扩增反应的时间可以设置为更短，而不会影响检测结果。

在一个优选的实施方案中，所述扩增反应在41℃进行。

在第五方面，提供了一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)第一方面所述的引物组；

b)第二方面所述的荧光探针；以及

c)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书。

在本发明的上下文中，所述试剂盒可以用于将反转录-重组酶介导扩增(RT-RAA)与荧光探针结合以用于检测HIV-1。因此，可以理解，所述试剂盒还可以包括与引物组结合使用的用于进行RT-RAA扩增反应的其他试剂，例如逆转录酶、RAA重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶III、dNTPs、RNase抑制剂、乙酸镁、缓冲液、阴性对照、阳性对照等。

下面通过实施例并参考附图来对本发明进行进一步详细的描述。

实施例

在下述实施例中，示出了本发明的HIV-1核酸快速检测方法与相关性质的表征。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。

材料

1.主要仪器

表1：所用的主要仪器及相关品牌和型号

2.主要试剂

(1)QIAamp Viral RNA Mini Kit(Cat#5290)：QIANGEN；

(2)丽珠全自动核酸提取试剂盒(Cat#01070028)：珠海丽珠试剂股份有限公司；

(3)RT-RAA核酸扩增试剂盒(荧光法)(Cat#F00R01)：江苏奇天；

(4)引物、探针、和质粒均合成自生工生物工程(上海)股份有限公司；

3.实验样本

本研究中使用的HIV-1感染者血浆样本、8E5细胞、HIV-1B亚型毒株、HBV感染者血浆样本、HCV感染者血浆样本、TP感染者血浆样本均来自国家艾滋病参比实验室样本库。

实施例1：HIV-1核酸快速检测用特异性引物探针的设计和筛选

用Los Alamos数据库里中国地区的HIV-1基因序列，建立我国HIV-1基因序列集，如图1所示。序列集中共纳入610条HIV-1全基因序列，包含34种亚型，不仅涵盖我国常见HIV-1亚型，如CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC、B、CRF55_01B、CRF85_BC亚型，还包含C亚型、G亚型、CRF57_BC、CRF59_01B、CRF62_BC、CRF64_BC、CRF65_cpx、CRF67_01B、CRF68_01B等，以及多种URF(0107、BC、01BC、01B、01C等)。使用Bioedit软件对序列进行清理并分析，对比找出不同亚型序列的保守序列。

针对HIV-1的保守序列，按照以下原则进行RAA引物和荧光探针的设计：

RAA引物设计原则：

(1)靶标区域GC含量在40-60％，尽量不含有正向或反向重复序列和回文序列；

(2)引物长度为30-35个碱基；

(3)引物序列：

1)5’端(前3-5个碱基)避免出现重复G，最好为C或T；

2)3’端(后3个碱基)最好有G和C；

3)GC含量不要大于70％或小于30％；

4)引物间避免形成二级结构、引物二聚体；

(4)产物长度：扩增产物长度不超过500bp，理想长度为100-200bp。

实时荧光RAA的探针长度一般为46-52个碱基，3’端进行阻断基团修饰，阻止DNA聚合酶的复制延伸。探针内部设计可供核酸外切酶切割的四氢呋喃(THF)修饰位点，THF修饰位点距离5’端至少30个碱基，距离3’端至少15个碱基，且THF修饰点两侧标记荧光基团和猝灭基团。当探针与模板结合时，核酸外切酶III切割THF残基，荧光基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。

HIV-1序列具有高度变异性，难以在HIV-1基因组找到长度较长、适合作为RAA扩增靶序列的保守片段，并且在确定的保守序列区难以设计多组完全符合上述原则的引物和探针。本发明经过大量实验发现即使不完全符合上述原则的引物仍可得到扩增效果良好，并优于符合原则的引物组合。因此，在上述RAA设计原则的基础上，本发明进行了优化设计和筛选。经过前期大量实验验证，在HIV-1保守区(pol区)初步得到了6条候选上游引物(F1-F4)，4条候选下游引物(R1-R4)及1条荧光探针(P)，它们的位置、长度和序列信息如图2和下表2所示。

表2：RAA引物和探针位置、长度和序列信息

HIV-1序列具有高度变异性，若引物与病毒核酸序列不能完全匹配可能会影响扩增效率。为了得到与中国地区HIV-1亚型序列匹配度更高的HIV-1特异性引物，本发明进一步通过使用多种不同亚型的HIV-1模拟样本进行多轮筛选，综合考虑扩增曲线起峰时间和终荧光值选取引物。

首先使用含有HIV-1B亚型缺陷前病毒的T淋巴细胞白血病细胞株(8E5细胞)提取的核酸作为模板进行引物筛选。通过采用一个正向引物筛选所有反向引物，得到扩增效果较好的候选反向引物；再用筛选出的反向引物筛选所有正向引物，得到扩增效果较好的候选正向引物。

基于国内HIV-1序列分析结果，将中国地区HIV-1主要流行的四种亚型CRF07_BC(GenBank:KC492737.1)、CRF08_BC(GenBank:KF835534.1)、CRF01_AE(GenBank：JX112829.1)、B(GenBank:KU724103.1)的pol区片段(位于HXB2 4600-5100bp)SEQ IDNO.12-15克隆至pUC57载体上，得到四种HIV-1重组质粒，使用NanoDrop One紫外分光光度计进行定量。

随后使用这四种重组质粒作为模板(浓度为10⁷拷贝/mL)，对应用8E5细胞筛选出的候选上下游引物分别两两组合进行再次筛选，每组引物重复三次实验，优选得到用于后续检测的引物组合。

为了减少引物探针筛选过程中因反应批次不同造成的差异和保证不同反应条件下结果的可对比性，在此过程选择高通量的Bio-rad CFX96仪器进行检测，具体操作步骤如下：

(1)将RT-RAA荧光试剂盒(江苏奇天，F00R01)平衡至室温，该试剂盒中含有反应缓冲液V、包含冻干重组酶等反应组份的单人份反应单元和乙酸镁。配制如表3所示的反应混合液：

表3：反应混合液

(2)将42.5μL反应混合液加至反应单元中，轻柔混匀，使反应管中的冻干粉充分溶解均匀，将混匀后的反应液转移至PCR管中，进行后续反应。

(3)在PCR管盖上加入2.5μL的乙酸镁，最后向PCR管中加入5μL模板，盖上PCR管盖后，放入样本前处理系统(江苏奇天，B6108)中自动振荡混匀并离心至管底，随后立即放置于Bio-rad CFX96仪器中。每次实验同时设置无核酸酶水作为阴性对照。

(4)反应条件：在39℃预反应40秒，之后每30秒读取一次荧光，设定在40次荧光读取后结束反应。

使用8E5细胞提取的核酸作为模板对设计的RAA引物进行筛选。首先使用下游引物R4与上游引物F1-F6进行组合，结果如图3所示。对上游引物的初步筛选结果显示，各引物在起峰时间上差距不明显，但终荧光值相差较大。F4、F3扩增曲线的起峰时间较早，且终荧光值较高，设为候选上游引物。使用候选上游引物F4对下游引物R1-R4进行筛选，结果如图4所示。R3与R4的扩增曲线起峰时间最早，R1虽然在扩增曲线的起峰时间上略晚于R3与R4，但终荧光值最高，将R1、R3和R4设为候选下游引物。

进一步使用高浓度(10⁷拷贝/μL)的四种HIV-1亚型的重组质粒(CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B)作为模板筛选候选引物，将候选上游引物和下游引物两两组合，对每个亚型的重组质粒重复进行三次检测，结果如图5所示。F3/R4和F4/R4组合对四种亚型的重组质粒均显示出良好扩增效果。由于扩增产物片段长度通常与扩增效率相关，以尽可能缩短扩增产物长度以提高扩增效率为标准，优选扩增片段长度较短的F3/R4组合作为后续检测使用的引物组合，但不排除F4/R4引物组合同样具备良好的检测性能。

实施例2：HIV-1快速检测反应条件的优化

在本实施例中，使用

Viral RNA Mini Kit试剂盒提取HIV-1B亚型毒株RNA作为模板，优化HIV实时荧光RT-RAA检测方法的反应体系和反应温度。为了同时设置温度梯度和比对不同反应条件下检测结果，并减少因反应批次不同造成的差异和保证结果的可对比性，在此过程同样选择高通量的Bio-rad CFX96仪器进行检测，检测方法参见实施例1。

(1)优化引物和探针的浓度

分别在实时荧光RT-RAA反应体系中加入不同体积的引物和探针的混合物(引物10μM；探针3.3μM)：1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，重复三次实验，结果如图6所示。通过比较实时荧光扩增曲线的起峰时间和终荧光值，得到最佳引物探针浓度。由图6可知，当引物和探针终浓度分别为0.6μM和0.2μM时，扩增曲线的起峰时间最短，且终荧光值相对较高。

(2)优化反应温度

RT-RAA扩增反应的推荐温度为39℃，为优化得到最佳反应温度，基于39℃增加或减少2℃的温度区间(37℃-41℃)设置了5个温度梯度：37℃、38℃、39℃、40℃、41℃，重复三次实验，结果如图6所示。检测结果显示，在37℃-41℃温度区间，扩增曲线的起峰时间随反应温度升高而缩短，当反应温度设置为41℃时起峰时间最早。

通过优化反应条件，确定在后续的RT-RAA检测反应体系中引物终浓度为0.6μM和探针终浓度为0.2μM，反应温度设置为41℃。

实施例3：临床样本检测

取已知HIV-1亚型和病毒载量的25份HIV-1阳性样本(样本信息如表4所示，涉及CRF07_BC、CRF55_01B、CRF01_AE、CRF08_BC、01B五种亚型)、20份HIV-1阴性样本和9份HBV(乙型肝炎病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)和TP(梅毒螺旋体)感染样本(每种病原体各3份)来进行检测。

表4：25份HIV-1阳性样本的病毒载量和亚型信息表

注：样本亚型通过pol区进行分型；病毒载量检测使用罗氏试剂(Cobas TaqManHIV-1v2.0)。

检测具体步骤如下：

1.核酸提取：将血浆样本平衡至室温后，采用丽珠核酸提取试剂盒，搭配丽珠全自动核酸提取仪提取病毒核酸。

2.核酸检测：

(1)将RT-RAA荧光试剂盒(江苏奇天公司，F00R01)平衡至室温，该试剂盒中含有反应缓冲液V、包含冻干重组酶等反应组份的单人份反应单元和乙酸镁。引物和探针采用实施例1确定的引物和探针，配制如表5所示的反应混合液：

表5：反应混合液

(2)将42.5μL反应混合液加至反应单元中，在反应单元盖上加入2.5μL的乙酸镁，向反应单元管中加入5μL模板，盖上管盖后放入样本前处理系统(江苏奇天，B6108)中自动振荡混匀并离心至管底，然后立即放入恒温核酸扩增分析仪(江苏奇天，F1628)，设定反应温度为41℃，反应时间25分钟。每次实验同时设置无核酸酶水作为阴性对照。当出现扩增曲线且斜率>20时，判定为阳性。

检测结果如下表6所示。本发明的检测方法的阳性符合率和阴性符合率均为100％(25/25,0/20)。本发明的检测方法在检测HIV-1时与常见的血源性病原体(HBV、HCV和TP)并无交叉反应，表现出针对HIV-1的高特异性。

表6：实时荧光RT-RAA检测临床样本的结果

实施例4：模拟样本检测

尽管在上述实施例3中，已经检测了涉及CRF07_BC、CRF55_01B、CRF01_AE、CRF08_BC、01B五种HIV-1亚型的真实临床样本，但为了进一步验证本发明所提供检测方法的亚型通用性和检测灵敏度，本发明使用了10种HIV-1亚型的真实序列合成重组质粒模拟HIV-1样本，由此克服样本限制问题。这10种国内较为常见的HIV-1亚型分别为CRF07_BC(GenBank:KC492737.1)、CRF01_AE(GenBank：JX112829.1)、CRF08_BC(GenBank:KF835534.1)、CRF55_01B(GenBank:MN067522)、B(GenBank:KU724103.1)、CRF85_BC(GenBank:KU992930)、0107(GenBank:KX159285)、BC(GenBank:AY967805)、01BC(GenBank:KF250407)、01C(GenBank:KY200517)，其中前四种即为实施例1中验证的四种亚型。通过实施例1中所述的相同合成方法，将SEQ ID NO.12-21示出的pol区片段克隆至pUC57载体上，从而合成10种HIV-1重组质粒。

使用紫外分光光度计对上述10种亚型的HIV-1重组质粒样本进行定量并换算拷贝数，以十倍倍比稀释后，使用各亚型的五个梯度样本进行检测(10⁰至10⁴拷贝/μL)，检测方法参见实施例3。

检测结果如图7所示。结果表明，本发明所提供的检测方法能够在设置的25分钟的扩增反应时间内检测出但不限于以上所述10种HIV-1亚型，表现出该方法对多种HIV-1亚型的通用性。在低至10拷贝/μL浓度，上述10种亚型均能成功检出；在低至1拷贝/μL浓度，部分亚型仍可检出，表现出该方法的高灵敏度。此外，由图7的检测结果也可知，所有检出样本的扩增曲线在10分钟内均已经起峰，由此可知扩增反应时间可以进一步缩短为10分钟，并且不会影响最终检测结果，由此可实现HIV-1的快速检测。

序列表

SEQ ID NO.1：F1引物

GTACARATGGCAGTDTTCATHCACAATTTTAA

SEQ ID NO.2：F2引物

GCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAATT

SEQ ID NO.3：F3引物

ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA

SEQ ID NO.4：F4引物

AARACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCAC

SEQ ID NO.5：F5引物

TAARACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCAT

SEQ ID NO.6：F6引物

GCTGARCAYCTTAARACAGCAGTACARATGGCA

SEQ ID NO.7：R1引物

CTTCACCTTTCCARAGNAGYTTKGCTGGTCCTT

SEQ ID NO.8：R2引物

TACTGCCCCTTCACCTTTCCARAGNAGYTT

SEQ ID NO.9：R3引物

TGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCARA

SEQ ID NO.10：R4引物

CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA

SEQ ID NO.11：荧光探针

GGATTGGGGRRTACAGTGCAGGRGAAAGAATATAGAYATAATAGCAAC

SEQ ID NO.12：B.CN.2013.BJMP3116B的pol基因序列

TACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCTGCCTGTTGGTGGGCAGGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAATGAATTAAAAAAGATTATAGGACAGGTAAGAGACCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAGGAACTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCACTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAACATAACAGTGA

SEQ ID NO.13：CRF07_BC.CN.2005.pXJDC6291的pol基因序列

TTCACCAGTGCTGCAGTTAAGGCAGCCTGTTGGTGGGCAGGTATCCAACAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGGCAGGTAAGAGATCAAGCTGAGCACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGATATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTATAAAAATTCAAAATTTCCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCATTTGGAAAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGA

SEQ ID NO.14：CRF08_BC.CN.2007.07CNYN355的pol基因序列

GCAGGTGTCCACCAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGGCAGGTAAGAGATCAAGCTGAGCACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACAAGAGAATTACAAAAACAAATTATAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCATTTGGAAAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAGAACATGGAATAGTTTAGTAAAACACCATA

SEQ ID NO.15：CRF01_AE.CN.2007.GX070003的pol基因序列

ATCCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGGGTAGTAGAATCCATGAATAAGGAATTAAAGAAAATCATAGGGCAGATAAGAGAGCAAGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGCAAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGATATAAAAGTAGTACCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAGGATTAGAACATGGAACAGTTTAGTAAAACATCATATGTACATCTCAAAGAAAGCTAAAA

SEQ ID NO.16：01BC(KF250407)的pol基因序列

TGCAGCCAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAGCAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGGCAGGTAAGAGACCAAGCAGAGCACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAACTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAACAGAGATCCACTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTTCTTTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAACAGTGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAAATCATCAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGGGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAGAACA

SEQ ID NO.17：01C(KY200517)的pol基因序列

TGCAGTTAAAGCAGCCTGTTGGTGGGCCAATGTCCGACAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAGGAATTAAAGAAAATCATAGGGCAGGTAAGAGAGCAAGCTGAACACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGAGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAACTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACCCAATTTGGAAAGGACCAGCAAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGATATAAAAGTAGTACCAAGAAGAAAAGCGAAGATCATCAGAGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAGAATTAGAACA

SEQ ID NO.18：CRF85_BC(KU992930)的pol基因序列

TGCAGTTAAGGCAGCCTGCTGGTGGGCAGGTATCCATCAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAGGGGGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGGCAGGTAAGAGATCAAGCTGAGCACCTTAAAACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGATATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAGATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCAGTTGGAAAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAAAACAGATGGCAGGTGCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAGAACA

SEQ ID NO.19：0107(KX159285)的pol基因序列

TGCAGTTAAGGCAGCCTGTTGGTGGGCAGGTCTCCAACAAGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAGAGTCAGGGAGTAGTAGAATCCATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGGCAGGTAAGAGATCAAGGTGAGCACGTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATACAAAATAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATCCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGAGACAGCAGAGACCCCAGTTGGAAAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAAAACAGATGGCAGGCGCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAGAACA

SEQ ID NO.20：BC(AY967805)的pol基因序列

TTCGGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAACAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGATAAGAGATCAAGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGATACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAGAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACCCCATTTGGAAAGGACCAGCCAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAGGTAGTACCAAGGAGGAAAGCAAAAATCATTAAGGACTATGGAACACAGATGGCAGGTGCTGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAAGATTAGAACA

SEQ ID NO.21：CRF55_01B(MN067522)的pol基因序列

TGCAGTCAAAGCAGCCTGTTGGTGGGTCAATGTCCAACAGGAATTTGGGATCCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAGGAATTAAAGAAAATCATAGGACAGGTAAGAGAGCAAGCTGAACACCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGATACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATAGCAACAGACATGCAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAATTTGGAAAGGACCAGCAAAACTACTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGACAATAGTGATATAAAAGTAGTACCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATTAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAGGTAGACAGGATGAGGATTAGAACA。

Claims (10)

1.一种用于扩增HIV-1核酸的引物组，所述引物组包括：

上游引物：ACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCACAA(SEQ ID NO.3)或AARACAGCAGTACARATGGCAGTDTTCATHCAC(SEQ ID NO.4)、以及

下游引物：CYTGTATYACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO.10)。

2.一种用于检测HIV-1核酸的荧光探针，所述荧光探针的核酸序列为：5’-GGATTGGGGRRTACAGTGCAGGRGAAAGAATATAGAYA TAATAGCAAC-3’(SEQ ID NO.11)；优选地，在所述荧光探针中具有四氢呋喃残基修饰位点，该位点距离所述荧光探针的5’端至少30个碱基，距离所述荧光探针的3’端至少15个碱基，所述四氢呋喃残基位点两侧分别标记有荧光基团和猝灭基团，且所述荧光探针的3’端由封闭基团修饰。

3.根据权利要求2所述的荧光探针，其中，所述荧光探针的第31位碱基由荧光报告基团修饰，第34位碱基由荧光淬灭基团修饰，第33位碱基替换为四氢呋喃残基。

4.根据权利要求3所述的荧光探针，其中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1，所述封闭基团为C3-Spacer。

5.权利要求1所述的用于扩增HIV-1核酸的引物组与权利要求2-4中任一项所述的用于检测HIV-1核酸的荧光探针在制备HIV-1诊断试剂中的用途。

6.一种检测HIV-1的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：

(1)提供HIV-1核酸样本；

(2)配制实时荧光反转录-重组酶介导扩增(RT-RAA)反应体系，所述实时荧光RT-RAA反应体系包括：作为模板的HIV-1核酸、权利要求1所述的引物组、以及权利要求2-4中任一项所述的荧光探针；

(3)对所述实时荧光RT-RAA反应体系进行RT-RAA扩增反应，并根据扩增曲线的斜率来确定是否存在HIV-1。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述扩增反应在37℃至41℃、优选41℃进行25分钟或更短的时间，如10分钟。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，每种引物的工作浓度为0.2-1.0μM，优选0.4-0.8μM，更优选0.6μM。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，所述荧光探针的浓度为0.07-0.33μM，优选0.13–0.27μM，更优选0.2μM。

10.一种用于检测HIV-1的试剂盒，包括：

a)权利要求1所述的引物组；

b)权利要求2-4中任一项的荧光探针；以及

c)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书。

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