CN116396991A

CN116396991A - 羟基-l-哌可酸的制造方法

Info

Publication number: CN116396991A
Application number: CN202211661458.2A
Authority: CN
Inventors: 三宅良磨; 川端润
Original assignee: API Corp
Current assignee: API Corp
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2023-07-07
Also published as: US20210180097A1; US10954539B2; CN107532185B; CN107532185A; US12173330B2; US11591577B2; EP3358016A4; WO2017057730A1; US20180273993A1; JP6947634B2; JP7221350B2; JPWO2017057730A1; US20230265475A1; EP3358016A1; JP2022000037A

Abstract

本发明涉及羟基‑L‑哌可酸的制造方法。本发明的课题是提供抑制羟基‑L‑脯氨酸的生成、高效且以低成本廉价地制造高纯度的羟基‑L‑哌可酸的新方法。本发明提供羟基‑L‑哌可酸的制造方法，其为在α‑酮戊二酸和二价铁离子的存在下使L‑哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的含有该酶的培养液作用于作为底物的L‑哌可酸而生成羟基‑L‑哌可酸的方法，L‑哌可酸羟化酶具有下述(1)和(2)的特征。(1)能够在α‑酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L‑哌可酸，在L‑哌可酸的3位、4位和/或5位的碳原子上添加羟基。(2)对L‑脯氨酸的催化反应效率(kcat/Km)为对L‑哌可酸的催化反应效率(kcat/Km)的7倍以下。

Description

羟基-L-哌可酸的制造方法

本申请是申请日为2016年9月30日、申请号为201680022697.X(国际申请号为PCT/JP2016/079123)、发明名称为“羟基-L-哌可酸的制造方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及利用生物学方法制造羟基-L-哌可酸的方法，具体而言，涉及使用具有生产羟基-L-哌可酸的能力的酶由L-哌可酸制造羟基-L-哌可酸的方法。

背景技术

羟基-L-哌可酸是作为用于合成药品的中间体等有用的化合物。例如，已知(4S)-羟基-L-哌可酸可用作Rho激酶抑制剂的前体(专利文献1)、(4R)-羟基-L-哌可酸可用作HIV蛋白酶抑制剂帕利那韦(palinavir)的前体(非专利文献1)、(5S)-羟基-L-哌可酸和(5R)-羟基-L-哌可酸可用作抗菌剂的前体(专利文献2)。

已知羟基-L-哌可酸可以通过生物学方法由L-哌可酸进行制造。例如据报道，百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)MAFF303099来源的BAB52605蛋白质、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021来源的CAC47686蛋白质(以下有时称为“SmPH”)和褶皱慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rugosus)ATCC BAA-974来源的EFV12517蛋白质的注释的上游48个碱基(相当于16个氨基酸)开始表达的多核苷酸(cis基因)所编码的蛋白质(以下有时称为“SruPH”)等具有将L-哌可酸转变为(5S)-羟基-L-哌可酸的能力(专利文献3)，使用这些羟化酶能够将L-哌可酸转变为羟基-L-哌可酸。

但是，这些羟化酶也均具有将L-脯氨酸羟化而生成羟基-L-脯氨酸的能力。

在此，使用酶、菌体等利用生物学方法制造的L-哌可酸中有时会微量混入例如作为来自酶、菌体的制备时使用的培养基等的带入成分的L-脯氨酸。

另外，在以纯的L-哌可酸作为原料使用羟化酶制造羟基-L-哌可酸的情况下，有时在所使用的羟化酶中混入有L-脯氨酸。

此外，即使在作为原料的L-哌可酸、羟化酶均不含有L-脯氨酸的情况下，在一边使表达羟化酶的菌体生长一边进行反应的情况下，认为在其生长过程中菌体也会副生成L-脯氨酸。

L-脯氨酸与L-哌可酸的物理化学性质接近，因此难以将L-脯氨酸完全除去而得到纯的L-哌可酸。

另外，在以混入有L-脯氨酸的L-哌可酸作为原料、使用上述的酶将L-哌可酸转变为羟基-L-哌可酸的情况下，L-脯氨酸被转变为羟基-L-脯氨酸，因此，产物中混杂存在羟基-L-哌可酸和羟基-L-脯氨酸，难以得到高纯度的羟基-L-哌可酸。另外，羟基-L-脯氨酸与羟基-L-哌可酸的物理化学性质接近，因此难以将两者分离。

因此，为了除去羟基-L-脯氨酸而得到高纯度的羟基-L-哌可酸，需要多次重复纯化或者使用昂贵的纯化方法，因此纯化的负荷高，存在时间上成本上的负担都大的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2010-514720号公报

专利文献2：日本特表2004-505088号公报

专利文献3：WO2013/187438

非专利文献

非专利文献1：Gillard et al.,The Journal of Organic Chemistry,1996,Vol.61,pp.2226

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，利用生物学方法由L-哌可酸制造羟基-L-哌可酸的方法是已知的，但现有的方法不仅生成羟基-L-哌可酸也会生成羟基-L-脯氨酸，因此，作为用于要求高纯度的药品的中间体等的羟基-L-哌可酸的制造方法并不能令人满意，期望更高效的制造方法。

即，本发明的课题在于提供抑制羟基-L-脯氨酸的生成、高效且以低成本廉价地制造高纯度的羟基-L-哌可酸的新方法。

用于解决课题的手段

本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，特定的哌可酸羟化酶具有α-酮戊二酸依赖性地将L-哌可酸转变为羟基-L-哌可酸的能力(L-哌可酸羟化活性)，并且几乎不具有将L-脯氨酸转变为羟基-L-脯氨酸的活性(L-脯氨酸羟化活性)。而且发现，通过使这些特定的酶作用于L-哌可酸，能够高效率地得到光学纯度高的各种羟基-L-哌可酸。本发明是基于这些见解而完成的。

即，本发明的主旨如下。

[1]一种羟基-L-哌可酸的制造方法，其为在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下使L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的包含该酶的培养液作用于作为底物的L-哌可酸而生成羟基-L-哌可酸的方法，L-哌可酸羟化酶具有下述(1)和(2)的特征：

(1)能够在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L-哌可酸，在L-哌可酸的3位、4位和/或5位的碳原子上添加羟基；

(2)对L-脯氨酸的催化反应效率(kcat/Km)为对L-哌可酸的催化反应效率(kcat/Km)的7倍以下。

[2]如[1]所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，包括下述步骤：

(i-1)使选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和L-氨基酸氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶与L-赖氨酸和/或DL-赖氨酸反应，或者，(i-2)使选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶和D-氨基酸氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶和氨基酸消旋酶与L-赖氨酸和/或DL-赖氨酸反应，

生成3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸后，

使N-甲基-L-氨基酸脱氢酶作用于该3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸，由此生成作为底物的L-哌可酸。

[3]如[1]所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，包括下述步骤：

使选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶和L-赖氨酸6-氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶与L-赖氨酸反应而生成2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸后，

使吡咯啉-5-羧酸还原酶作用于该2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸，生成作为底物的L-哌可酸。

[4]如[1]所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，包括下述步骤：使赖氨酸环化脱氨酶作用于L-赖氨酸，生成作为底物的L-哌可酸。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，作为底物的L-哌可酸中含有的L-脯氨酸为10％(w/w)以下。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，L-哌可酸羟化酶进一步具有下述(3)的特征：

(3)在将具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物的羟基-L-哌可酸生成活性设为100％的情况下，具有生产该L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物的羟基-L-脯氨酸生成活性为55％以下。

[7]如[1]～[6]中任一项所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，L-哌可酸羟化酶包含下述(A)、(B)或(C)所示的蛋白质：

(A)具有序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有在序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列且具有上述(1)和(2)的特征的蛋白质；

(C)具有与序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列且具有上述(1)和(2)的特征的蛋白质。

[8]如[1]～[7]中任一项所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞是利用编码L-哌可酸羟化酶的DNA进行了转化的微生物或细胞。

[9]如[8]所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，编码L-哌可酸羟化酶的DNA包含下述(D)、(E)或(F)所示的DNA：

(D)具有序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的DNA；

(E)包含在序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加一个或几个碱基而得到的碱基序列且编码具有上述(1)和(2)的特征的蛋白质的DNA；

(F)包含在严格条件下与序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的互补链杂交的碱基序列且编码具有上述(1)和(2)的特征的蛋白质的DNA。

发明效果

根据本发明，能够高效率地制造光学纯度高的高纯度的羟基-L-哌可酸。特别是，即使在作为底物的L-哌可酸中含有L-脯氨酸的情况下，本发明也能够制造高纯度的羟基-L-哌可酸。

此外，本发明能够抑制羟基-L-脯氨酸的生成，因此能够以低成本廉价地制造可用于药品的中间体等的高纯度的羟基-L-哌可酸，因此在工业上优选。

附图说明

图1是在实施例3中将各L-哌可酸浓度(mmol/L)的倒数作为x轴、将各L-哌可酸浓度下的每1mg量的各羟化酶的羟基-L-哌可酸生成活性(U/mg)的倒数作为y轴进行作图而得到的图。

图2是在实施例4中将L-哌可酸5位羟化酶对于L-脯氨酸和L-哌可酸的反应性进行比较的图。

图3是示出实施例5中(5S)-羟基-L-哌可酸的蓄积量的经时变化的图。

图4是示出实施例5中(4S)-羟基-L-哌可酸的蓄积量的经时变化的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

本说明书中，“L-哌可酸羟化活性”是指在L-哌可酸的3位、4位和/或5位的碳原子上添加羟基的能力。

是否具有“L-哌可酸羟化活性”例如可以通过下述方法进行确认：在含有L-哌可酸作为底物、进一步含有α-酮戊二酸和二价铁离子的反应体系中，使作为测定对象的酶作用于L-哌可酸，测定所生成的羟基-L-哌可酸的量。

本说明书中的“酶”中也包括纯化酶(包括部分纯化的酶)、使用通常的固定化技术固定化于载体上的酶、例如固定化于聚丙烯酰胺、卡拉胶等载体上的酶等。

本说明书中，“表达载体”是指，用于通过整合编码具有所期望的功能的蛋白质的多核苷酸并导入到宿主生物中而使具有所期望的功能的蛋白质在上述宿主生物中进行复制和表达的遗传因子。可以列举例如质粒、病毒、噬菌体、粘粒等，但不限定于这些，优选为质粒。

本说明书中，“转化体”是指，利用上述表达载体等导入目的基因、从而能够表现出与具有所期望的功能的蛋白质相关的特性的微生物或细胞。

本发明的羟基-L-哌可酸的制造方法的特征在于，在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下，使具有下述(1)和(2)的特征的L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的含有该酶的培养液作用于作为底物的L-哌可酸。

(1)能够在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L-哌可酸而在L-哌可酸的3位、4位和/或5位的碳原子上添加羟基。

本发明中使用的L-哌可酸羟化酶(以下有时称为“本发明的L-哌可酸羟化酶”)是能够在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下作用于L-哌可酸而在L-哌可酸的3位、4位和/或5位的碳原子上添加羟基的酶。

α-酮戊二酸的量只要是不妨碍反应的量则没有特别限定，通常在反应体系中与L-哌可酸为等摩尔或等摩尔以上、优选为等摩尔～1.2倍摩尔的范围。

二价铁离子的量只要是不妨碍反应的量则没有特别限定，通常在反应体系中相对于L-哌可酸1摩尔为0.0001摩尔～0.5摩尔、优选为0.001摩尔～0.1摩尔。

二价铁离子例如可以通过向反应体系中添加硫酸铁、氯化铁、柠檬酸铁等而存在。

本发明的L-哌可酸羟化酶优选包含具有序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列的蛋白质。

另外，本发明的L-哌可酸羟化酶也可以包含作为序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列的同源物且具有上述(1)和(2)的特征的具有L-哌可酸羟化活性的蛋白质。

作为这样的序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列的同源物，可以列举具有在序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加一个或几个氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白质。在置换、插入或添加的情况下，优选保守性地置换、插入或添加了一个或几个氨基酸的经保守性突变得到的蛋白质。

在此，“一个或几个氨基酸”通常为1个～100个、优选为1个～50个、更优选为1个～20个、进一步优选为1个～10个、特别优选为1个～5个的氨基酸。

另外，作为序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列的同源物，可以列举具有与序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列全长具有70％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。优选列举具有与该氨基酸序列全长具有80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

本发明中，序列同一性是指，对于碱基序列或氨基酸序列，在将两个序列以最优的方式排列的情况下，在两个序列间共有的一致的核苷酸或氨基酸的个数的百分率。即，可以通过同一性＝(一致的位置的数量/位置的总数)×100来计算出，可以使用市售的算法进行计算。另外，这样的算法编入在Altschul et al.,J.Mol.Biol.215(1990)pp.403-410中记载的NBLAST和XBLAST程序中。更详细而言，与碱基序列或氨基酸序列的同一性相关的检索、分析可以利用本领域技术人员周知的算法或程序(例如，BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)来进行。本领域技术人员可以适当设定使用程序的情况下的参数，或者也可以使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法是本领域技术人员周知的方法。

序列号2、12、14、16或18所表示的氨基酸序列各自基于柯奈尼亚小单孢菌(Micromonospora chokoriensis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)Naraqc5株、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)Wisconsin 54-1255株、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)PH-1株和济州岛考克氏菌(Kordia jejudonensis)株的基因组信息。

本发明的L-哌可酸羟化酶之中，具有序列号2、18或20所表示的氨基酸序列的蛋白质、作为序列号2、18或20所表示的氨基酸序列的同源物且具有L-哌可酸羟化活性的蛋白质选择性地对L-哌可酸的5位的碳原子进行羟化，因此能够高效率地生成(5S)-羟基-L-哌可酸。

本发明的L-哌可酸羟化酶之中，具有序列号12、14或16所表示的氨基酸序列的蛋白质、作为序列号12、14或16所表示的氨基酸序列的同源物且具有L-哌可酸羟化活性的蛋白质选择性地对L-哌可酸的4位的碳原子进行羟化，因此能够高效率地生成(4S)-羟基-L-哌可酸。

本发明中，可以使用一种或两种以上的L-哌可酸羟化酶。

本发明的L-哌可酸羟化酶可以由柯奈尼亚小单孢菌(Micromonosporachokoriensis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)Nara qc5株、产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)Wisconsin 54-1255株、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)PH-1株或济州岛考克氏菌(Kordia jejudonensis)株等纯化得到。

另外，也可以通过利用PCR(聚合酶链式反应)、杂交等公知的方法将编码本发明的L-哌可酸羟化酶的DNA克隆化并使其在适当的宿主中进行表达而得到本发明的L-哌可酸羟化酶。

例如，作为编码包含具有序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列的蛋白质的L-哌可酸羟化酶的DNA，可以分别列举包含序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的DNA。另外，也可以是作为包含序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的DNA的同源物且编码具有上述(1)和(2)的特征的具有L-哌可酸羟化活性的蛋白质的DNA。

作为这样的包含序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的DNA的同源物，可以列举包含在序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列中缺失、置换、插入和/或添加一个或几个碱基而得到的碱基序列的DNA。在置换、插入或添加的情况下，优选保守性地置换、插入或添加了一个或几个碱基的经保守性突变得到的DNA。

在此，“一个或几个碱基”通常为1个～300个、优选为1个～150个、更优选为1个～60个、进一步优选为1个～30个、更优选为1个～15个、特别优选为1个～10个碱基。

需要说明的是，序列号1、11、13、15或17所表示的碱基序列分别是将编码序列号2、12、14、16或18所表示的氨基酸序列的柯奈尼亚小单孢菌(Micromonosporachokoriensis)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)Nara qc5株、产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)Wisconsin 54-1255株、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)PH-1株或济州岛考克氏菌(Kordia jejudonensis)株的基因按照大肠杆菌表达用途进行密码子优化而得到的碱基序列。这种根据作为转化对象的宿主进行了密码子优化的DNA当然也包含在编码本发明的L-哌可酸羟化酶的DNA中。

另外，作为包含序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的DNA的同源物，可以是包含在严格条件下与序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的互补链杂交的碱基序列的DNA。

在此，“在严格条件下杂交的碱基序列”是指，通过使用DNA作为探针，在严格条件下利用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Sounthern印记杂交法等得到的DNA的碱基序列。

作为严格条件，可以列举例如下述条件：在菌落杂交法或噬菌斑杂交法中，使用固定有菌落或噬菌斑来源的DNA或该DNA的片段的过滤器，在0.7mol/L～1mol/L的氯化钠水溶液的存在下、在65℃下进行杂交后，使用0.1×SSC溶液(1×SSC的组成为150mmol/L氯化钠水溶液、15mmol/L柠檬酸钠水溶液)，在65℃的条件下对过滤器进行清洗。该杂交可以按照Molecular Cloning:A laboratory Mannual(分子克隆实验指南)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989.等中记载的方法来进行。

本领域技术人员可以通过使用定点突变法(Nucleic Acids Res.10,pp.6487(1982)、Methods in Enzymol.100,pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR A PracticalApproach IRL Press pp.200(1991))等，对包含序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的DNA进行碱基的缺失、置换、插入和/或添加而导入所期望的突变，来得到包含序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列的DNA的突变体。

另外，也可以基于序列号2、12、14、16、18或20所表示的氨基酸序列或其部分氨基酸序列、序列号1、11、13、15、17或19所表示的碱基序列或其部分碱基序列，对例如DNADatabank of JAPAN(DDBJ)等数据库进行同源检索而获得本发明的L-哌可酸羟化酶的氨基酸信息或编码该L-哌可酸羟化酶的氨基酸的DNA的碱基序列信息。

另外，本发明的L-哌可酸羟化酶对L-脯氨酸的催化反应效率(kcat/Km)为对L-哌可酸的催化反应效率(kcat/Km)的7倍以下、优选为2倍以下、更优选为1倍以下、进一步优选为0.5倍以下、特别优选为0.1倍以下。而且，最优选羟基-L-脯氨酸生成活性实质上为0的L-哌可酸羟化酶。本发明中，“羟基-L-脯氨酸生成活性实质上为0”并不是指1分子的羟基-L-脯氨酸也没有生成，而是指羟基-L-脯氨酸无法被检测出或者即使能被检测出也为微量，是本领域技术人员基于技术常识可以忽略的程度。

本发明的催化反应效率(kcat/Km)例如可以通过使用米氏方程计算出kcat/Km的方法来求出。在此，kcat表示每1分子酶的催化效率，Km是酶对底物的亲和性的指标。

Km和kcat的具体计算方法如下所述。首先，在特定的底物浓度范围内测定各L-哌可酸浓度下的每mg量的各羟化酶的羟基-L-哌可酸生成活性(U/mg)。在此，1单位(U)表示在1分钟生成1μmol的羟基-L-哌可酸的能力。接着，将所实施的各L-哌可酸浓度(mmol/L)的倒数作为x轴、将各L-哌可酸浓度下的每mg量的各羟化酶的羟基-L-哌可酸生成活性(U/mg)的倒数作为y轴进行作图。已知这些线性图中，x轴截距的倒数乘以-1所得到的数值表示km(mmol/L)，y轴截距的倒数表示最大速度Vmax(U/mg)。每1分子酶的催化能力kcat可以由Vmax和酶的分子量计算出。根据如此得到的kcat和km，能够计算出作为酶的催化能力的指标的催化反应效率(kcat/Km)。

作为用于计算催化效率的酶，可以使用通过利用有机溶剂或表面活性剂等的处理、物理处理或酶处理将具有生产该酶的能力的微生物或细胞破坏，将酶级分以粗纯化物或纯化物的形式从所得物中取出而得到的酶。酶活性的强弱和反应时间可以在酶活性与反应时间成比例增加的范围内任意设定。

关于米氏方程的详细内容等，记载在例如“生化学实验法21酶反应速度论实验入门·学会出版中心”等中。

此外，本发明的L-哌可酸羟化酶活性也可以通过下述的方法简易地进行评价。

使具有生产本发明的L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物与L-哌可酸或L-脯氨酸反应，在特定的底物浓度下测定每单位的投入的细胞量(单位：g或浊度)或总蛋白质量(单位：g)的羟基-L-哌可酸生成活性(U/g)和羟基-L-脯氨酸生成活性(U/g)。然后将特定的底物浓度下由L-哌可酸生成羟基-L-哌可酸的活性设为100％，计算出相同底物浓度下由L-脯氨酸生成羟基-L-脯氨酸的活性(相对值)。

关于本发明的L-哌可酸羟化酶，在将具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物的生成羟基-L-哌可酸的活性设为100％的情况下，具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物的生成羟基-L-脯氨酸的活性通常为55％以下、优选为50％以下、更优选为35％以下、特别优选为20％以下、最优选为0％。

本发明中使用的L-哌可酸羟化酶(以下有时称为“本发明的L-哌可酸羟化酶”)能够以高位置选择性和高立体选择性对L-哌可酸进行羟化，因此能够高效率地得到光学纯度高的羟基-L-哌可酸。

本发明的羟基-L-哌可酸的制造方法中，可以将本发明的L-哌可酸羟化酶直接用于反应，也可以将具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的含有该酶的培养液用于反应。

具有生产本发明的L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞可以是内源性地具有上述生产能力的微生物或细胞，也可以是通过育种而赋予了上述生产能力的微生物或细胞。另外，不限于活的微生物或细胞，也包含作为生物体虽然已经死亡但具有酶能力的微生物或细胞。

另外，作为具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞的种类，可以列举作为“宿主微生物”或“宿主细胞”在下文中记述的微生物或细胞。

作为通过育种而赋予上述生产能力的方法，可以采用基因重组处理(转化)、突变处理等公知的方法。作为转化的方法，可以列举导入目的DNA的方法、在染色体上改变启动子等表达调节序列而对目的DNA的表达进行强化的方法等。

这些之中，优选使用以编码本发明的L-哌可酸羟化酶的DNA进行了转化的微生物或细胞。

例如，可以将编码本发明的L-哌可酸羟化酶的DNA以可进行表达的方式插入到公知的表达载体中，构建L-哌可酸羟化酶表达载体，利用该表达载体对宿主细胞进行转化，由此制造导入有编码本发明的L-哌可酸羟化酶的DNA的转化体。

另外，该转化体也可以通过利用同源重组等方法在宿主细胞的染色体中以可进行表达的方式整合编码本发明的L-哌可酸羟化酶的DNA来制作。

用于制作转化体的步骤、适合于宿主的重组载体的构建和宿主的培养方法可以按照分子生物学、生物工程、基因工程的领域中常用的技术(例如，上述的Molecular Cloning中记载的方法)来进行。

作为转化体的制作方法，可以列举例如下述方法：向在宿主细胞中稳定存在的质粒载体、噬菌体载体或病毒载体中导入编码本发明的L-哌可酸羟化酶的DNA，将所构建的表达载体导入到该宿主细胞中；或者直接将该DNA导入到宿主基因组中，对其遗传信息进行转录、翻译。

此时，在宿主中，优选在DNA的5’-侧上游连接适当的启动子，进一步更优选在3’-侧下游连接终止子。作为这样的启动子和终止子，只要是已知在宿主中发挥功能的启动子和终止子就可以使用，没有特别限定。可以使用例如“微生物学基础讲座8基因工程·共立出版”中记载的载体、启动子和终止子。

关于作为转化对象的宿主微生物或宿主细胞，只要宿主本身不会对L-哌可酸的反应产生不利影响则没有特别限定。

作为宿主微生物，可以列举例如大肠杆菌(埃希氏菌属细菌)、芽孢杆菌属细菌、假单胞菌属细菌、棒状杆菌、根瘤菌、乳杆菌属细菌、短芽孢杆菌属细菌、厌氧螺菌属细菌、放线杆菌属细菌、放线菌等原核生物、酵母、丝状菌等菌类、植物、动物等真核生物。其中，优选为大肠杆菌、酵母、棒状杆菌，特别优选为大肠杆菌。

作为宿主微生物，可以列举例如以下所示的微生物。

属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、根瘤菌(Rhizobium)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、短芽孢杆菌(Brevibacillus)属、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属、放线杆菌(Actinobacillus)属、沙雷氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、链球菌(Streptococcus)属等的已建立了宿主载体系统的细菌。

属于红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属等的已建立了宿主载体系统的放线菌。

属于酵母(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、耶氏酵母(Yarrowia)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、汉逊酵母(Hansenula)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属等的已建立了宿主载体系统的酵母。

属于脉孢菌(Neurospora)属、曲霉(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、木霉(Trichoderma)属等的已建立了宿主载体系统的菌类。

以下，例示出优选的宿主微生物、该微生物中的优选转化方法、载体、启动子、终止子，但本发明并不限定于这些例子。

在埃希氏菌属、特别是大肠杆菌(Escherichia coli)中，作为质粒载体，可以列举pBR、pUC系质粒等，可以列举lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体PL、PR、T7噬菌体等来源的启动子等。另外，作为终止子，可以列举trpA来源、噬菌体来源、rrnB核糖体RNA来源的终止子等。这些启动子之中，出于提高表达效率的目的，可以使用能够诱导基因表达的启动子。例如，在上述lac启动子的情况下，通过添加乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等表达诱导物质，能够诱导基因表达。

在芽孢杆菌属中，作为载体，可以列举pUB110系质粒、pC194系质粒等，另外也可以整合到染色体中。作为启动子和终止子，可以利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等酶基因的启动子、终止子等。

在假单胞菌属中，作为载体，可以列举在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等中建立的通常的宿主载体系统、与甲苯化合物的分解相关的质粒、以TOL质粒为基础的广宿主载体(包含来源于RSF1010等的自主复制所需要的基因)pKT240(Gene,26,273-82(1983))等。

在短杆菌属、特别是乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中，作为载体，可以列举pAJ43(Gene 39,281(1985))等质粒载体。作为启动子和终止子，可以利用在大肠杆菌中使用的各种启动子和终止子。

在棒状杆菌属、特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，作为载体，可以列举pCS11(日本特开昭57-183799号公报)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196,175(1984))等质粒载体。

在酵母(Saccharomyces)属、特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作为载体，可以列举YRp系、YEp系、YCp系、YIp系质粒等。另外，可以利用醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶等各种酶基因的启动子、终止子。

在裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属中，作为载体，可以列举Mol.Cell.Biol.6,80(1986)中记载的粟酒裂殖酵母来源的质粒载体等。特别是pAUR224，由宝酒造进行市售，可以容易地利用。

在曲霉(Aspergillus)属中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等在霉菌中研究得最多，可以利用能够整合到质粒或染色体中、来源于菌体外蛋白酶或淀粉酶的启动子(Trendsin Biotechnology 7,283-287(1989))。

另外，作为宿主细胞，可以列举例如昆虫(例如蚕)等动物(Nature315,592-594(1985))；菜籽、玉米、马铃薯等植物。另外，已建立了利用大肠杆菌无细胞提取液、小麦胚芽等的无细胞蛋白质合成体系的系统，可以优选使用。

另外，除了上述以外，还建立了各种各样的宿主、载体系统，可以适当使用它们。

本说明书中，“具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞的处理物”是指，对具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞进行培养，将该生物或细胞1)利用有机溶剂、表面活性剂等进行处理而得到的物质；2)进行冷冻干燥而得到的物质；3)固定在载体等上而得到的物质；4)以物理方式或酶学方式破坏而得到的物质；或5)将酶级分以粗纯化物或纯化物的形式从上述1)～4)的处理物中取出而得到的物质。

作为有机溶剂，可以列举例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

作为表面活性剂，可以列举例如作为非离子型表面活性剂的Tween 20、Triton X-100、Brij 35、十二烷基-β-D-麦芽糖苷、Nonidet P-40、辛基-β-D-葡萄糖苷、作为两性离子型表面活性剂的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸内盐(CHAPS)、作为阴离子型表面活性剂的十二烷基硫酸钠(SDS)等。

作为固定化在载体等上的具体例，可以列举将该微生物或细胞中的酶级分固定化在聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、离子交换树脂等所代表的载体上的方法等。

作为物理性的破坏方法的例子，可以列举超声波处理、利用弗氏压碎器的高压处理、使用均质器、ダイノミル(卧式砂磨机)等的机械磨碎处理等。

作为利用酶的破坏方法的例子，可以列举利用溶菌酶等具有细胞壁溶解活性的酶进行处理的方法。

作为酶纯化的取出方法，可以使用通常的酶的分离纯化方法。例如，可以通过单独使用或组合使用离心分离、超滤、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用各种树脂的层析法(阴离子交换层析法、阳离子交换层析法、疏水性层析法、凝胶过滤法、亲和层析法)、以及等电点电泳等电泳法等方法，从利用上述方法等得到的提取液中得到纯化物。

作为对具有生产本发明的L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞进行培养而得到的包含该酶的培养液，可以列举例如该微生物或细胞与液体培养基的混悬液、该微生物或细胞为分泌表达型微生物或细胞的情况下的通过离心分离等除去该微生物或细胞而得到的上清或其浓缩物等。

本说明书中，“对具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞进行培养而得到的包含该酶的培养液”是指，1)微生物或细胞的培养液、2)利用有机溶剂、表面活性剂等对微生物或细胞的培养液进行处理后的培养液、3)以物理方式或酶学方式将微生物或细胞的细胞膜破碎而得到的培养液。

作为有机溶剂、表面活性剂、物理或酶学的破碎方法，可以使用上述记载的材料和方法。

本发明的羟基-L-哌可酸的制造方法的特征在于，在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下，使上述L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的含有该酶的培养液作用于作为底物的L-哌可酸，生成羟基-L-哌可酸。

本发明中，作为底物的L-哌可酸可以使用纯的L-哌可酸，但也可以含有微量的L-脯氨酸。L-脯氨酸的含量通常为10％(w/w)以下、优选为1％(w/w)以下、特别优选为0.1％(w/w)以下。

另外，作为底物的L-哌可酸可以使用市售的L-哌可酸，但也可以使用利用酶/菌体等通过生物学方法制造的L-哌可酸。通过生物学方法制造的L-哌可酸中有时会混入例如作为来自酶/菌体的制备时使用的培养基等的带入成分的L-脯氨酸，在本发明中，L-哌可酸可以混入上述含量的L-脯氨酸。

作为通过生物学方法制造L-哌可酸的方法，可以列举例如下述的方法。

(i)(i-1)使选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和L-氨基酸氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶与L-赖氨酸和/或DL-赖氨酸反应，或者

(i-2)使选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶和D-氨基酸氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶和氨基酸消旋酶与L-赖氨酸和/或DL-赖氨酸反应，

生成3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸后，使N-甲基-L-氨基酸脱氢酶作用于该3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸，制造L-哌可酸。

(ii)使选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶和L-赖氨酸6-氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶与L-赖氨酸反应，生成2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸后，与吡咯啉-5-羧酸还原酶发生作用，制造L-哌可酸。

(iii)使赖氨酸环化脱氨酶作用于L-赖氨酸，制造L-哌可酸。

本发明中的制造L-哌可酸的第一方法如下所示。

(i)一种L-哌可酸的制造方法，其特征在于，

(i-1)使选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和L-氨基酸氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶与L-赖氨酸和/或DL-赖氨酸反应，或者

生成3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸后，使N-甲基-L-氨基酸脱氢酶作用于该3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸。

以下，例示出路线来进行说明。

路线(i-1)是使用选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和L-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶和N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)的情况。

首先，利用选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和L-氨基酸转移酶组成的组中的酶，将化合物(a)(L-赖氨酸)转变为化合物(b)。化合物(b)自发转变为化合物(c)(3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸)。然后，化合物(c)由N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH、别名DpkA)转变为化合物(d)(L-哌可酸)。

在此，作为L-氨基酸氧化酶，只要能够催化将L-赖氨酸的2位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如J.Biochem.,2015,157(4),pp.201中记载的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

作为L-氨基酸脱氢酶，只要能够催化将L-赖氨酸的2位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如Nature,1966,211,pp.854中记载的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

作为L-氨基酸转移酶(L-氨基酸氨基转移酶)，只要能够催化将L-赖氨酸的2位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如包含Eur.J.Biochem.,1998,254,pp.347中记载的氨基酸序列的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

作为N-甲基-L-氨基酸脱氢酶，只要能够催化将3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸转变为L-哌可酸的反应则没有特别限制，可以列举例如J.Biol.Chem.2005,280(49),pp.40875中记载的DpkA；或者具有与DpkA具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

路线(i-2)是使用选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶和D-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶、氨基酸消旋酶和N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)的情况。

首先，利用氨基酸消旋酶将化合物(a)(L-赖氨酸)转变为D构型的化合物(a’)(D-赖氨酸)，利用选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶和D-氨基酸转移酶组成的组中的酶将该化合物(a’)(D-赖氨酸)转变为化合物(b)。化合物(b)自发转变为化合物(c)。然后，化合物(c)由N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)转变为化合物(d)(L-哌可酸)。

作为D-氨基酸氧化酶，只要能够催化将D-赖氨酸的2位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如包含Biochemistry,2005,70,pp.40中记载的氨基酸序列的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

D-氨基酸脱氢酶只要能够催化将D-赖氨酸的2位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如Microbiology,2010,156(Pt1),pp.60和Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2009,106,pp.906中记载的DauA；或者具有与DauA具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

D-氨基酸转移酶(D-氨基酸氨基转移酶)只要能够催化将D-赖氨酸的2位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如Protein Eng,1998,11,pp.53中记载的D-AAT；或者具有与D-AAT具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

作为氨基酸消旋酶(LysR)，只要能够催化将L-赖氨酸转变为D-赖氨酸的反应则没有特别限制，可以列举例如Appl.Microbiol.Biotechnol.2015,99,pp.5045中记载的LysR；或者具有与LysR具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

路线(i-1)和(i-2)的反应可以分别进行各酶反应，但优选在同一反应体系中连续进行。

在同一反应体系中连续进行的情况下，优选在含有L-赖氨酸、以及利用编码各酶的基因群进行了转化的细胞、该转化体的制备物和/或对该转化体进行培养而得到的培养液的水性介质中或者该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。

需要说明的是，由于N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)需要NAD(P)H作为辅酶，因此，优选共存有将在NMAAH的反应中生成的NAD(P)⁺再生为NAD(P)H的体系。

作为再生方法，可以列举：1)利用宿主微生物自身的NAD(P)⁺还原能力的方法；2)向反应体系内添加具有由NAD(P)⁺生成NAD(P)H的能力的微生物或其制备物、或者葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶或有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等可用于NAD(P)H的再生的酶(再生酶类)的方法；3)将作为可用于NAD(P)H再生的酶的上述再生酶类的基因与本发明的DNA共同导入到宿主中的方法等。

其中，在上述1)的再生方法中，优选向反应体系中添加葡萄糖、乙醇、甲酸等化合物。由此，能够使这些化合物被宿主所代谢，将在该过程中生成的NAD(P)H用于反应。

在上述2)的再生方法中，作为再生酶类，可以使用包含该再生酶类的微生物、将该微生物菌体进行丙酮处理而得到的处理物、进行冷冻干燥处理而得到的处理物、以及以物理方式或酶学方式破碎而得到的处理物等菌体制备物。另外，也可以使用将该酶级分以粗纯化物或纯化物的形式从菌体制备物中取出而得到的物质、将其固定化在聚丙烯酰胺凝胶或卡拉胶等载体上而得到的物质等。此外，也可以使用市售的酶。

在上述2)和3)的再生方法中，为了发挥辅酶还原能力，优选添加成为再生酶的底物的化合物。例如，在利用葡萄糖脱氢酶的情况下，优选添加葡萄糖；在利用甲酸脱氢酶的情况下，优选添加甲酸；在利用醇脱氢酶的情况下，优选添加乙醇或异丙醇等。

包含催化各反应的酶的细胞可以使用原本就具有这些酶的微生物，但优选使用以编码各酶的DNA进行了转化的细胞。在路线(i-1)的情况下，优选使用以分别编码选自由L-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶和L-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶和N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)的DNA进行了转化的细胞。另外，在路线(i-2)的情况下，优选使用以分别编码选自由D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶和D-氨基酸转移酶组成的组中的至少一种酶、氨基酸消旋酶和N-甲基-L-氨基酸脱氢酶(NMAADH)的DNA进行了转化的细胞。

另外，这些DNA可以分别整合到染色体中，也可以将这些DNA导入到单一的载体中后对宿主进行转化，还可以将这些DNA分别单独导入到载体中后对宿主进行转化。

需要说明的是，微生物等宿主细胞的转化方法、宿主的种类等与上述的L-哌可酸羟化酶的情况同样。

本发明的由L-赖氨酸制造L-哌可酸的第二方法如下所示。

(ii)一种L-哌可酸的制造方法，其特征在于，使选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶和L-赖氨酸6-氨基转移酶组成的组中的一种以上的酶与L-赖氨酸反应，生成2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸后，与吡咯啉-5-羧酸还原酶发生作用。

以下，例示出路线来进行说明。

首先，利用选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶和L-赖氨酸6-转移酶组成的组中的至少一种酶，将化合物(a)(L-赖氨酸)转变为化合物(b’)。化合物(b’)自发转变为化合物(c’)(2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸)。然后，化合物(c’)由吡咯啉-5-羧酸(P5c)还原酶转变为化合物(d)(L-哌可酸)。

L-赖氨酸6-氧化酶只要能够催化将L-赖氨酸的6位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如Biochim.Biophys.Acta.,2006,1764pp.1577中记载的LodA；或者具有与LodA具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

L-赖氨酸6-脱氢酶只要能够催化将L-赖氨酸的6位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如包含J.Biochem.,105,pp.1002-1008(1989)中记载的氨基酸序列的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

L-赖氨酸6-转移酶(赖氨酸-6-氨基转移酶)只要能够催化将羟基-L-赖氨酸的6位的氨基转变为氧代基的反应则没有特别限制，可以列举例如包含国际公开公报WO2001/048216号中记载的氨基酸序列的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

吡咯啉-5-羧酸(P5C)还原酶只要能够催化将2,3,4,5-四氢吡啶-2-羧酸转变为L-哌可酸的反应则没有特别限制，可以列举例如包含国际公开公报WO2001/048216号中记载的氨基酸序列的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

哌可酸的制造方法(ii)的反应可以分别进行各酶反应，但优选在同一反应体系中连续进行。特别优选通过使包含催化各反应的酶的细胞与L-赖氨酸反应来进行。包含催化各反应的酶的细胞可以使用原本就具有这些酶的细胞，但优选使用以编码各酶的DNA进行了转化的细胞，具体而言，优选使用以分别编码选自由L-赖氨酸6-氧化酶、L-赖氨酸6-脱氢酶和L-赖氨酸6-转移酶组成的组中的至少一种酶和吡咯啉-5-羧酸(P5C)还原酶的DNA进行了转化的细胞。

需要说明的是，微生物等宿主细胞的转化方法、宿主的种类等与上述L-哌可酸羟化酶的情况同样。

在同一反应体系中连续进行第二方法(ii)的情况下，优选在含有L-赖氨酸、以编码各酶的基因群进行了转化的细胞、该转化体的制备物和/或对该转化体进行培养而得到的培养液的水性介质中或者该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。

本发明的由L-赖氨酸制造L-哌可酸的第三方法如下所示。

(iii)一种L-哌可酸的制造方法，其特征在于，使赖氨酸环化脱氨酶作用于L-赖氨酸。

赖氨酸环化脱氨酶只要能够催化将L-赖氨酸转变为L-哌可酸的反应则没有特别限制，可以列举例如包含Biochimie 2007,89,pp.591中记载的氨基酸序列的蛋白质；或者具有与该氨基酸序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上的同一性的氨基酸序列且保持该活性的蛋白质。

利用赖氨酸环化脱氨酶的反应优选通过使包含赖氨酸环化脱氨酶的细胞与L-赖氨酸反应来进行。包含赖氨酸环化脱氨酶的微生物可以使用原本就包含这些酶的细胞，但优选使用以包含编码赖氨酸环化脱氨酶的DNA进行了转化的细胞。

在利用赖氨酸环化脱氨酶进行将L-赖氨酸转变为L-哌可酸的反应的情况下，优选在含有L-赖氨酸、以编码赖氨酸环化脱氨酶的DNA进行了转化的细胞、该转化体的制备物和/或对该转化体进行培养而得到的培养液的水性介质中或者该水性介质与有机溶剂的混合物中进行。

本发明中，L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物或者对该微生物或细胞进行培养而得到的包含该酶的培养液可以含有L-脯氨酸。该情况下，L-脯氨酸的含量为10％(w/w)以下、优选为1％(w/w)以下、特别优选为0.1％(w/w)以下。

另外，具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞可以是具有以培养液或反应体系中的成分作为原料来生产L-脯氨酸的能力的微生物或细胞。

另外，在制造羟基-L-哌可酸时，可以使用溶剂。作为溶剂，没有特别限定，但优选在水性溶剂中或者水性溶剂与有机溶剂的混合溶剂中进行。

作为水性介质，可以列举例如水或缓冲液。作为缓冲液，可以列举例如磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等。

另外，作为在水性溶剂与有机溶剂的混合溶剂中使用的有机溶剂，可以使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等对反应底物的溶解度高的溶剂，另外，也可以使用乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等对于反应副产物的除去等有效的溶剂。

溶剂的量没有特别限定，相对于作为底物的L-哌可酸，通常为0.01％w/v～90％w/v、优选为0.1％w/v～10％w/v。

反应体系中的作为底物的L-哌可酸的浓度通常为0.01％w/v～90％w/v、优选为0.1％w/v～30％w/v的范围。L-哌可酸可以在反应开始时一次性地添加到反应体系中，但从降低存在酶的底物抑制时的影响、提高产物的蓄积浓度等观点考虑，优选连续或间歇地添加到反应体系中。

α-酮戊二酸的量在与作为底物的L-哌可酸为等摩尔或等摩尔以上、优选为等摩尔～1.2倍摩尔的范围进行添加。α-酮戊二酸可以在反应开始时一次性地添加到反应体系中，但从降低存在对酶的抑制作用时的影响、提高产物的蓄积浓度等观点考虑，优选连续或间歇地添加到反应体系中。

另外，也可以向反应体系中添加宿主可代谢的葡萄糖等廉价化合物来代替α-酮戊二酸，使宿主进行代谢，使该过程中生成的α-酮戊二酸存在于反应体系中。

反应体系中的二价铁离子的浓度相对于L-哌可酸1摩尔通常为0.0001摩尔～0.5摩尔、优选为0.001摩尔～0.1摩尔。

二价铁离子通常可以以硫酸铁、氯化铁、柠檬酸铁等的形式在反应开始时一次性添加到反应体系中，但在所添加的二价铁离子在反应中被氧化为三价、或者形成沉淀而减少的情况下，以达到所期望的浓度的方式补充添加也是有效的。

另外，在本发明的L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的包含该酶的培养液本身已经含有所期望的浓度的二价铁离子的情况下，可以未必添加铁离子。

反应在通常为4℃～60℃、优选为15℃～45℃、特别优选为20℃～40℃的反应温度下、在通常为pH3～11、优选为pH 5～8的条件下进行。反应时间通常为约1小时～约150小时。

关于L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的包含该酶的培养液的量，例如在使用微生物或细胞的情况下，反应体系中的微生物或细胞的浓度以湿菌体重计通常为0.1％w/v～50％w/v、优选为1％w/v～20％w/v。另外，在使用该处理物或培养液的情况下，求出酶的比活力，以反应体系中的微生物或细胞的浓度为上述浓度的方式使用。

生成的羟基-L-哌可酸可以在反应结束后在利用离心分离、膜处理等分离出反应体系中的菌体、蛋白质等后，通过将利用1-丁醇、叔丁醇等有机溶剂的提取；蒸馏；使用离子交换树脂、硅胶等的柱层析；等电点结晶析出；利用一盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的结晶析出等适当组合来进行纯化。

实施例

以下。利用实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限定于此。

<实施例1>L-哌可酸羟化酶基因的克隆

以按照大肠杆菌表达用途进行了密码子优化的基因序列(mcph_OE、序列号1)的形式人工合成了编码被注释为柯奈尼亚小单孢菌(Micromonospora chokoriensis)株来源的天冬氨酰β羟化酶(aspartyl beta-hydroxylase)的氨基酸羟化酶McPH(GenBank登录号WP_030487089、序列号2)的基因。将基因插入到pJExpress411(DNA2.0)中而构建质粒pJ411McPH。

同样地实施了4种显示出L-哌可酸5位羟化活性的酶基因的克隆。

人工合成了sruph_OE(序列号3)、caph_OE(序列号5)和xdph_OE(序列号7)，它们是编码褶皱慢反应脂肪酸菌(Segniliparus rugosus)ATCC BAA-974株来源的L-哌可酸顺式-5-羟化酶SruPH(GenBank登录号EFV12517、序列号4)、嗜酸细链孢菌(Catenulisporaacidiphila)NBRC102108株来源的L-脯氨酸顺式-4-羟化酶CaPH(GenBank登录号WP_012787640、序列号6)和杜氏致病杆菌(Xenorhabdus doucetiae)FRM16株来源的L-脯氨酸顺式-4-羟化酶XdPH(GenBank登录号CDG16639、序列号8)的、按照大肠杆菌表达用途进行了密码子优化的基因序列。

分别插入到pJexpress411(DNA2.0公司制造)中而得到质粒，命名为pJ411SruPH、pJ411CaPH和pJ411XdPH。

人工合成smph_OE(序列号9)，其为编码苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)1021株来源的L-脯氨酸顺式4-羟化酶SmPH(GenBank登录号CAC47686、序列号10)的、按照大肠杆菌表达用途进行了密码子优化的基因序列，插入到pJexpress401中，制作质粒pJ401SmPH。合成针对smph_OE的引物smph_f(序列号21)和smph_r(序列号22)，使用它们以质粒DNA为模板按照常规方法进行PCR反应，得到约1.0kbp的DNA片段。将所得到的DNA片段利用限制酶NdeI、HindIII进行消化，按照常规方法与利用NdeI、HindIII进行消化后的pET24a(Novagen)连接，由此得到pET24SmPH。

以按照大肠杆菌表达用途进行了密码子优化的基因序列(kjph_OE、序列号17)的形式人工合成了编码注释为济州岛考克氏菌(Kordia jejudonensis)株来源的假定蛋白质(hypothetical protein)的氨基酸羟化酶KjPH(GenBank登录号WP_046758372、序列号18)的基因。将基因插入到pJExpress411(DNA2.0)中而构建质粒pJ411KjPH。

另外，还实施了3种显示出L-哌可酸4位羟化活性的酶基因的克隆。

人工合成了cgph_OE(序列号11)、pcph_OE(序列号13)、和gzph_OE(序列号15)，它们是编码胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)Nara qc5株来源的L-哌可酸反式-4-羟化酶CgPH(GenBank登录号ELA34460、序列号12)、产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum)Wisconsin 54-1255株来源的L-哌可酸反式-4-羟化酶PcPH(GenBank登录号XP_002558179、序列号14)、和玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)PH-1株来源的L-哌可酸反式-4-羟化酶GzPH(GenBank登录号XP_383389、序列号16)的基因的、按照大肠杆菌表达用途进行了密码子优化的基因序列。

表1中示出实施了基因克隆的上述L-哌可酸羟化酶。

表1

序列号	ID	来源微生物	登录号
				2	McPH	柯奈尼亚小单孢菌	WP_030487089
4	SruPH	褶皱慢反应脂肪酸菌ATCC BAA-974	EFV12517
				6	CaPH	嗜酸细链孢菌NBRC102108	WP_012787640
8	XdPH	杜氏致病杆菌FRM16	CDG16639
				10	SmPH	苜蓿中华根瘤菌1021	CAC47686
12	CgPH	胶孢炭疽菌Nara gc5	ELA34460
				14	PcPH	产黄青霉菌Wisconsin 54-1255	XP_002558179
16	GzPH	玉蜀黎赤霉PH-1	XP_383389
				18	KjPH	济州岛考克氏菌	WP_046758372

<实施例2>L-哌可酸羟化酶基因表达菌体的获得

使用实施例1中得到的各质粒，按照常规方法对大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(Invitrogen制)进行转化，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pJ411McPH、BL21(DE3)/pJ411SruPH、BL21(DE3)/pJ411CaPH、BL21(DE3)/pJ411XdPH、BL21(DE3)/pET24SmPH、BL21(DE3)/pJ411CgPH、BL21(DE3)/pJ411PcPH、BL21(DE3)/pJ411GzPH和BL21(DE3)/pJ411KjPH。

为了得到表达所导入的基因的菌体，对于各重组大肠杆菌使用包含卡那霉素和lac启动子诱导物质的液体LB培养基，在30℃下培养约5小时，然后进一步在18℃下培养约30小时后收集菌体。

通过离心分离收集所得到的重组大肠杆菌0.6mL，混悬到pH为6的50mmol/L MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸)缓冲液0.5mL中。将装有混悬液的容器浸入冰水中进行超声波破碎处理，然后以12000rpm的转速进行离心分离。所得到的上清在实施例3中用作酶液。

<实施例3>L-哌可酸羟化酶对L-哌可酸和L-脯氨酸的催化反应效率(kcat/Km)的确认

对于几种L-哌可酸羟化酶，进行了对L-哌可酸和L-脯氨酸的催化反应效率的确认。

在塑料管内添加0.3mmol/L～50mmol/L的L-哌可酸、20mmol/Lα-酮戊二酸、1mmol/L L-抗坏血酸、0.5mmol/L硫酸铁(II)，并且以使蛋白质浓度为约2mg/mL的方式添加实施例2中得到的各酶液，将所得到的反应液0.2mL在30℃下振荡25分钟。然后，添加1mol/L盐酸0.05mL使反应停止。

对于使用L-脯氨酸作为底物的情况，也在与上述L-哌可酸的情况相同的条件下进行反应。

接着，对于反应液，使用1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(FDAA)(东京化成工业公司制造)，利用下述方法对各反应液中含有的羟基-L-哌可酸或羟基-L-脯氨酸进行FDAA衍生物化。

向停止反应后的反应液中添加1mol/L氢氧化钠0.05mL进行中和。将该溶液以12000rpm的转速进行离心分离，向所得到的上清15μL中添加15μL的0.5mol/L硼酸缓冲液(pH9)后，进一步添加20mmol/L的FDAA丙酮溶液30μL，在40℃下保温1小时。然后，添加1mol/L盐酸10μL，使衍生物化反应停止，添加甲醇80μL进行稀释，以12000rpm的转速对其进行离心分离，将所得到的上清作为FDAA衍生物化液。

利用UPLC-MS(Waters公司制造)对生成的羟基-L-哌可酸或羟基-L-脯氨酸的量进行分析。将分析条件示于表2～表4。

各酶液所显示出的(5S)-羟基-L-哌可酸生成活性或(4R)-羟基-L-哌可酸生成活性(U/mg)用每mg量各羟化酶的单位(U)来定义。在此，1单位表示在1分钟生成1μmol的羟基-L-哌可酸的能力。

表2：LC的设定

表3：洗脱条件

表4：MS的条件

羟化酶量如下进行定量。

以注入的每个泳道的总蛋白质量为5μg的方式制备实施例2中得到的各酶液，进行聚丙烯酰胺电泳。使用图像分析软件Image Lab3.0(BIO-RAD公司制造)分析所得到的电泳图，对羟化酶的含量进行定量。作为用于定量的标准样品，使用碳酸酐酶(SIGMA-Aldrich公司制造)，基于供给200ng、400ng和600ng的该酶时的各条带的信号值，由目标羟化酶的信号值计算出目标酶的含量。

酶的催化反应效率基于米氏方程进行计算。

首先，将在0.3mmol/L～50mmol/L的范围实施4个点～6个点的各L-哌可酸浓度(mmol/L)的倒数作为x轴、将各L-哌可酸浓度下的每mg量各羟化酶的羟基-L-哌可酸生成活性(U/mg)的倒数作为y轴，进行作图(图1)。图1中，已知x轴截距的倒数乘以-1而得到的数值表示km(mmol/L)，y轴截距的倒数表示最大速度Vmax(U/mg)。

每1分子酶的催化能力kcat可以由Vmax和酶的分子量计算出。将由所得到的kcat和km计算出的作为酶的催化能力的指标的催化反应效率(kcat/km)的结果示于表5。

在使用L-脯氨酸作为底物的情况下，从使用羟化酶CaPHE的反应液中检测出大量的羟基-L-脯氨酸。另外，从羟化酶SruPH、XdPH、SmPH和KjPH的反应液中检测出少量的羟基-L-脯氨酸。另一方面，未从羟化酶McPH的反应液中检测出羟基-L-脯氨酸。由此可以认为，McPH是对脯氨酸的反应性极低的具有5-羟基哌可酸生成活性的新酶。该性质是难以由公知的信息推测得到的。

另外，从羟化酶CgPH、PcPH、GzPH的反应液中也未检测到羟基-L-脯氨酸。由此可知，这些羟化酶是对脯氨酸的反应性极低的具有4-羟基哌可酸生成活性的新酶。该性质是难以由公知的信息推测得到的。

表5

<实施例4>L-哌可酸5位羟化酶的反应性的比较

对于L-哌可酸5位羟化酶，进行对L-脯氨酸和对L-哌可酸的反应性的比较。

在塑料管内添加10mmol/L的L-哌可酸或10mmol/L的L-脯氨酸、20mmol/Lα-酮戊二酸、1mmol/L L-抗坏血酸、0.5mmol/L硫酸铁，并且以使总蛋白质浓度为约2mg/mL的方式添加实施例2中得到的各酶液，将所得到的反应液0.2mL在30℃下振荡30分钟。与实施例3同样地利用FDAA衍生物化法对生成的羟基-L-哌可酸和羟基-L-脯氨酸的量进行定量。产物的检测以波长340nm的吸收作为指标。

将对反应液进行FDAA衍生物化而得到的溶液的LC分析色谱示于图2。活性值以单位质量总蛋白的产物量(U/g-蛋白)来进行评价，将以羟基-L-哌可酸生成活性为100(％)时的羟基-L-脯氨酸生成活性(相对活性)示于表6。

由图2和表6可知，从羟化酶CaPH的反应液中检测出大量的羟基-L-脯氨酸。另外，从羟化酶SruPH、XdPH和SmPH的反应液中检测出少量的羟基-L-脯氨酸。未从羟化酶McPH的反应液中检测出羟基-L-脯氨酸。

由此可以认为，McPH是对脯氨酸的反应性极低且具有高的5-羟基哌可酸生成活性的新酶。该性质是难以由公知的信息推测得到的。

另外可知，羟化酶SruPH、XdPH和SmPH是对脯氨酸的反应性低且具有高的5-羟基哌可酸生成活性的酶。该性质是难以由公知的信息推测得到的。

表6

<实施例5>羟基-L-哌可酸的制造

将实施例2中得到的8种重组大肠杆菌BL21(DE3)/pJ411McPH、BL21(DE3)/pJ411SruPH、BL21(DE3)/pJ411CaPH、BL21(DE3)/pJ411XdPH、BL21(DE3)/pET24SmPH、BL21(DE3)/pJ411CgPH、BL21(DE3)/pJ411PcPH和BL21(DE3)/pJ411GzPH接种到包含卡那霉素硫酸盐(25μg/mL)的种子培养用M9液体培养基(33.9g/L Na₂HPO₄、15g/L KH₂PO₄、2.5g/L氯化钠、5g/L氯化铵、10g/L酪蛋白氨基酸、0.1mmol/L氯化钙、0.1mmol/L硫酸铁、4g/L葡萄糖、0.001mmol/L氯化镁)中，在30℃下以200rpm的条件振荡培养24小时。

将该培养液40μL添加到包含卡那霉素硫酸盐(25μg/mL)和过夜表达自动诱导系统(Overnight Express Autoinduction Systems)(默克公司)的主培养用M9液体培养基(50.9g/L Na₂HPO₄、22.5g/L KH₂PO₄、3.8g/L氯化钠、7.5g/L氯化铵、10g/L酪蛋白氨基酸、0.1mmol/L氯化钙、0.1mmol/L硫酸铁、20mmol/L L-哌可酸、12.5g/L甘油)中，然后在30℃以200rpm的条件振荡培养120小时。

在培养开始后48小时、64小时和120小时，回收培养液的离心上清，作为分析用样品，进行LC分析和MS分析。

分析用样品使用FDAA(东京化成工业公司制造)利用下述方法进行FDAA化。

向分析用样品液的离心上清3μL中添加27μL的0.5mol/L硼酸缓冲液(pH9)后，添加20mmol/L的FDAA丙酮溶液30μL，在40℃下保温1小时。然后，添加1mol/L盐酸使反应停止，添加甲醇80μL进行稀释，以12000rpm的转速对其进行离心分离，将所得到的上清作为FDAA化液。

对于所得到的FDAA化液，在表2记载的LC/MS的条件下对羟基-L-哌可酸和羟基-L-脯氨酸的量进行分析。将所得到的结果示于图3和图4。

图3和表7是与使用(5S)-羟基-L-哌可酸生成酶时的生产率相关的结果。图3是示出(5S)-羟基-L-哌可酸的蓄积量的经时变化的图。表7是对120小时后的各成分的蓄积量进行确认的结果。可知，通过120小时的培养，羟化酶SruPH和McPH能够将大部分底物转变为(5S)-羟基-L-哌可酸。

表7:120小时后的各成分的蓄积量

在实施例3中确认了对脯氨酸的反应性的羟化酶SruPH、XdPH和SmPH确认到(4S)-羟基-L-脯氨酸的蓄积。McPH未确认到(4S)-羟基-L-脯氨酸的蓄积。对于羟化酶CaPH，虽然也未确认到(4S)-羟基-L-脯氨酸的蓄积，但(5S)-羟基-L-哌可酸的蓄积量也少，因此认为这是由于羟化酶CaPH作为羟化酶的能力低所导致的。

由此可认为，羟化酶McPH具有高的(5S)-羟基-L-哌可酸生产能力，且具有不会使纯化时难以除去的(4S)-羟基-L-脯氨酸等副产物蓄积的特性，是非常实用的羟化酶。

图4和表8是与使用(4S)-羟基-L-哌可酸生成酶时的生产率相关的结果。图4是示出(4S)-羟基-L-哌可酸的蓄积量的经时变化的图。表8是对64小时后的各成分的蓄积量进行确认的结果。可知，通过64小时的培养，羟化酶CgPH、PcPH和GzPH能够将大部分底物转变为(4S)-羟基-L-哌可酸。另外，未确认到(4R)-羟基-L-脯氨酸的蓄积。

由此可认为，羟化酶CgPH、PcPH和GzPH具有高的(4S)-羟基-L-哌可酸生产能力，且具有不会使纯化时难以除去的(4R)-羟基-L-脯氨酸等副产物蓄积的特性，是非常实用的羟化酶。

表8:64小时后的各成分的蓄积量

<实施例6>通过导入突变而进行的羟化酶McPH基因的改变

以实施例1中得到的质粒pJ411McPH作为模板，使用序列表的序列号23所示的引物(H4Q-f)和序列号24所示的引物(H4Q-r)，利用QuikChange多点突变试剂盒(Stratagene公司制造)构建编码将氨基酸编号第4位的组氨酸置换为谷氨酰胺而得到的突变体(McPHm1)的质粒。

与上述同样地构建如下设计的质粒：使用序列号25所示的引物(F5Y-f)和序列号26所示的引物(F5Y-r)，将第5位的苯丙氨酸置换为酪氨酸(McPHm2)；使用序列号27所示的引物(C23A-f)和序列号28所示的引物(C23A-r)，将第23位的半胱氨酸置换为丙氨酸(McPHm3)；使用序列号29所示的引物(C44A-f)和序列号30所示的引物(C44A-r)，将第44位的半胱氨酸置换为丙氨酸(McPHm4)；使用序列号31所示的引物(L97R-f)和序列号32所示的引物(L97R-r)，将第97位的亮氨酸置换为精氨酸(McPHm5)；使用序列号33所示的引物(V98A-f)和序列号34所示的引物(V98A-r)，将第98位的缬氨酸置换为丙氨酸(McPHm6)；使用序列号35所示的引物(D116G-f)和序列号36所示的引物(D116G-r)，将第116位的天冬氨酸置换为甘氨酸(McPHm7)；使用序列号37所示的引物(C137A-f)和序列号38所示的引物(C137A-r)，将第137位的半胱氨酸置换为丙氨酸(McPHm8)；使用序列号39所示的引物(D282E-f)和序列号40所示的引物(D282E-r)，将第282位的天冬氨酸置换为谷氨酸(McPHm9)。

使用所得到的各质粒，按照常规方法对大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(Invitrogen制)进行转化，获得表达各突变体的重组大肠杆菌。按照实施例2中记载的方法由所得到的重组大肠杆菌制备酶液，按照实施例4中记载的方法对L-哌可酸5位羟化活性进行评价。活性值以单位质量总蛋白的产物量(U/g-蛋白)来进行评价，将以未导入突变的野生型酶(McPH)的5-羟基-L-哌可酸生成活性为100(％)时的各突变体的活性值(相对活性)示于表9。

表9

突变体	突变位置	相对活性
			(野生型)	-	100
McPHm1	H4Q	82
			McPHm2	F5Y	132
McPHm3	C23A	123
			McPHm4	C44A	0
McPHm5	L99R	18
			McPHm6	V100A	2
McPHm7	D116G	27
			McPHm8	C137A	42
McPHm9	D282E	152

进而，对于对提高活性有效的McPHm2、McPHm3和McPHm9，确认了组合各突变部位而得到的效果。构建表达将5位的苯丙氨酸置换为酪氨酸、将23位的半胱氨酸置换为丙氨酸的双重突变体(McPHm10)的质粒，并构建表达进一步将282位的天冬氨酸置换为谷氨酸的三重突变体的质粒。然后，按照上述的方法制作重组大肠杆菌，使用酶液对5-羟基-L-哌可酸生成活性进行评价。将其结果示于表10。作为三重突变体的McPHm11(序列号20、将编码该氨基酸序列的基因示于序列号19)显示出与野生型相比为3倍以上的高活性。

表10

关于McPHm10和McPHm11，对依照实施例4中记载的方法使用L-脯氨酸作为底物的情况下的羟化活性进行了确认。结果确认，对脯氨酸的活性均实质上为0。

Claims

1.一种羟基-L-哌可酸的制造方法，其为在α-酮戊二酸和二价铁离子的存在下使L-哌可酸羟化酶、具有生产该酶的能力的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或对该微生物或细胞进行培养而得到的包含该酶的培养液作用于作为底物的L-哌可酸而生成羟基-L-哌可酸的方法，其中，L-哌可酸羟化酶为具有序列号2或18所表示的氨基酸序列的蛋白质。

2.如权利要求1所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，包括下述步骤：

生成3,4,5,6-四氢吡啶-2-羧酸后，

3.如权利要求1所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，包括下述步骤：

4.如权利要求1所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，包括下述步骤：使赖氨酸环化脱氨酶作用于L-赖氨酸，生成作为底物的L-哌可酸。

5.如权利要求1～4中任一项所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，作为底物的L-哌可酸中含有的L-脯氨酸为10％(w/w)以下。

6.如权利要求1～4中任一项所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，具有生产L-哌可酸羟化酶的能力的微生物或细胞是利用编码L-哌可酸羟化酶的DNA进行了转化的微生物或细胞。

7.如权利要求6所述的羟基-L-哌可酸的制造方法，其中，编码L-哌可酸羟化酶的DNA包含碱基序列由序列号1表示的DNA或碱基序列由序列号17表示的DNA。