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CN116390767A - 用于长效递送治疗剂的多功能蛋白聚糖 (vg1) 的透明质酸结合衍生物 - Google Patents

用于长效递送治疗剂的多功能蛋白聚糖 (vg1) 的透明质酸结合衍生物 Download PDF

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CN116390767A
CN116390767A CN202180070823.XA CN202180070823A CN116390767A CN 116390767 A CN116390767 A CN 116390767A CN 202180070823 A CN202180070823 A CN 202180070823A CN 116390767 A CN116390767 A CN 116390767A
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CN
China
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seq
therapeutic molecule
component
domain
hyaluronic acid
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English (en)
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R·F·小凯利
S·C·梅塔
D·B·特萨
R·汉努什
S·T·汉森
S·登格尔
H·科腾贝格
P·M·休尔斯曼
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F Hoffmann La Roche AG
Genentech Inc
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Genentech Inc
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Abstract

缀合物可包含能够结合至眼睛中的治疗靶点的第一组分，能够结合至透明质酸的一种或多种第二组分，以及包含透明质酸的一种或多种第三组分，其中每种第二组分共价地结合至所述第一组分且非共价地结合至第三组分，包含所述缀合物的组合物用作药物或用于治疗眼睛疾病，以及治疗受试者的眼睛疾病的方法。此外，靶向患者的组织的治疗分子可包含透明质酸结合部分和治疗活性剂，其中所述透明质酸结合部分包含多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域。靶向患者的组织的治疗分子可包含透明质酸结合部分和治疗活性剂，其中所述透明质酸结合部分包含结合(即，预复合)至透明质酸的多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域。递送靶向患者的组织的治疗分子的方法包括将本文所述的任何治疗分子施用于所述患者，并允许所述治疗分子向靶组织提供所述治疗活性剂的长效递送。

Description

用于长效递送治疗剂的多功能蛋白聚糖(VG1)的透明质酸结 合衍生物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月15日提交的美国临时专利申请号63/092,251，和2021年9月20日提交的美国临时专利申请第63/250,782号的优先权权益，两者均与本案共同拥有，并且两者的全部内容通过引用明确地并入本文，如同其在本文中完全阐述一样。
技术领域
采用结合至透明质酸的融合蛋白和融合蛋白-透明质酸缀合物的长效疗法和治疗方法。
背景技术
玻璃体内(IVT)注射通常用于施用药物以治疗各种眼睛疾病。IVT注射允许将药物直接施加至眼后，从而消除局部和全身施用常见的障碍。以这种方式直接施加药物允许药物在后段组织中具有更高的眼内生物利用度，从而更有效地治疗眼后疾病。Stewart,M.W.,Expert Opinion on Drug Metabolism&Toxicology,14(1):5-7(2018)。接受经由IVT注射治疗的常见疾病的实例包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜变性、视网膜静脉阻塞和眼睛感染(诸如眼内炎和视网膜炎)。美国视网膜专家学会基金会，asrs.org/patients/retinal-diseases/33/IVT-injections(2017)。
尽管在阻止疾病和改善视力方面取得了令人鼓舞的结果，但IVT注射既不舒服且昂贵，并且需要视网膜专家来执行。已知IVT注射对一些患者造成不良反应，诸如感染、炎症、玻璃体出血、眼睛中存在的飞蚊症增加、对光的敏感性增加、视力下降和视网膜脱离。美国视网膜专家学会基金会，asrs.org/patients/retinal-diseases/33/IVT-injections(2017)。IVT注射也可与感染性眼内炎、无菌性眼内炎症、孔源性视网膜脱离、眼内压升高和眼出血有关。出处同前。经眼长效递送技术可无需重复注射药物，从而改善患者依从性和临床结果。延长玻璃体液中药物半衰期的方法和组合物(例如，维持药物储存能力、眼睛中的低周转率、低保留靶所介导的清除率和/或在高龄族群中看似稳定的特性)促进药物从注射部位到靶位点的缓慢释放，从而能够使用更高的剂量并减少所需的注射次数。
治疗分子的玻璃体半衰期可通过以下方式得以延长：将治疗分子结合至透明质酸(HA)，以作为封装或用聚合物进行化学修饰的替代方案。Cromwell,S等人,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.59(9):235(2018)；Ghosh,J.G.等人,NatureCommunications,8:14837,doi:10.1038/ncomms14837(2017)；Stewart,M.W.,ExpertOpinion on Drug Metabolism&Toxicology,14(1):5-7(2018)。在一个特定实例中，长效抗VEGF抗体分别与人肿瘤坏死因子(TNF)-刺激基因6蛋白(TSG-6)的HA结合结构域(HABD)融合。Ghosh,J.G.等人,Nature Communications,8:14837,doi:10.1038/ncomms14837(2017)。与未经修饰的抗VEGF抗体相比，融合蛋白表现出以下改善：(1)半衰期增加3至4倍；(2)在新生血管性视网膜疾病动物模型中，能够在3至4倍长的时间内减弱VEGF所诱导的视网膜变化。Ghosh,J.G.等人,Nature Communications,8:14837,doi:10.1038/ncomms14837(2017)。一种包含长效抗VEGF抗体与TSG-6融合的候选药物LMG324已进入临床试验，用于评估单次递增剂量的安全性和耐受性，以确定新生血管性年龄相关性黄斑变性(nvAMD)中的最大耐受剂量(MTD)。clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02398500(2019)。但是，由于严重不良事件(包括玻璃体飞蚊症、炎症和玻璃体后脱离)，这些试验被暂停。
抗体片段与透明质酸(HA)的化学结合可降低药物从玻璃体的扩散率。但是，该方法需要对HA进行化学活化；使用非天然接头可能导致受试者中活化HA产生非天然代谢物。
本发明人发现通过提供包含以下的缀合物，可避免上述缺点：(1)能够结合至眼睛中的治疗靶点的第一组分，(2)能够结合至HA的一种或多种第二组分，以及(3)包含HA的一种或多种第三组分；其中每种第二组分(a)共价地结合至第一组分并且(b)非共价地结合至第三组分。与上述抗VEGF抗体和TSG-6融合蛋白(LMG324)不同，能够结合至HA的第二组分与HA预复合。
本申请公开了增加包含能够结合透明质酸(HA)的融合蛋白的治疗分子的眼内保留的材料与方法。在一些实施例中，融合蛋白包含：(1)能够结合至眼睛中的治疗靶点的第一组分，以及(2)能够结合至HA的一种或多种第二组分；其中每种第二组分共价地结合至第一组分。
本申请还公开了缀合物，其中该融合体进一步包含一种或多种第三组分，这些第三组分包含HA，其中每种第二组分进一步非共价地结合至第三组分。进一步地，能够结合至HA的第二组分可与HA预复合。缀合物与玻璃体兼容，并且对HA具有结合亲和力。这些材料与方法为更长的长效药物设计提供了一种平台技术。
发明内容
本申请公开了一种材料与方法，其涉及能够结合至眼睛中的治疗靶点且能够结合至透明质酸的治疗分子及其缀合物。本申请提供了以下项、方面和实施例。
项1为一种治疗分子，该治疗分子包含：(a)能够结合至眼睛中的治疗靶点的第一组分；(b)能够结合至透明质酸的一种或多种第二组分，其中这些一种或多种第二组分共价地结合至第一组分；以及(c)任选地，包含透明质酸的一种或多种第三组分，其中，如果存在这些一种或多种第三组分，则这些一种或多种第三组分非共价地结合至这些一种或多种第二组分。
项2为项1所述的治疗分子，其中该第一组分为蛋白质、肽、受体或其片段、受体的配体、darpin、核酸、RNA、DNA或适体。
项3为项1或2所述的缀合物，其中该第一组分选自抗体、抗原结合片段，特别地为抗体片段，更特别地为至少缺少Fc结构域的抗体片段，尤其地其中该片段为或包含(Fab')2片段、Fab'片段或Fab片段、VhH片段、scFv片段、scFv-Fc片段和微型抗体，更尤其为Fab片段。
项4为项1至3中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分包含透明质酸受体CD44(CD44)结构域、脑特异性连接蛋白(BRAL1)结构域、肿瘤坏死因子刺激基因6(TSG-6)结构域、淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)结构域、或透明质酸结合蛋白(HABP)结构域、聚集蛋白聚糖G1(AG1)结构域或多功能蛋白聚糖G1(VG1)结构域。
项5为项1至4中任一项所述的治疗分子，其中该缀合物包含一种第二组分或两种彼此相同的第二组分。
项6为项1至4中任一项所述的治疗分子，其中该第三组分为透明质酸，其中该透明质酸(a)具有以下分子量：(i)选自3kDa至60kDa、4kDa至30kDa、5kDa至20kDa或400Da至200kDa；(ii)是至少2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa或9kDa；或(iii)是至多60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、20kDa或15kDa；(b)向这些一种或两种第二组分提供摩尔过量的结合当量；以及(c)具有减少眼睛中透明质酸降解的修饰。
项7为项1至6中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分能够以10nM至10μM、5nM至8μM或100nM至5μM的KD结合至透明质酸。
项8为项1至7中任一项所述的治疗分子，其中(a)这些第一组分和第二组分包含在融合蛋白中，特别地其中这些第二组分中的一种或两种共价地结合至该第一组分的N末端和/或C末端，更特别地其中该第一组分为抗体或抗原结合片段，并且其中这些一种或两种第二组分共价地结合至该第一组分的C末端；和/或(b)这些一种或两种第二组分直接地结合至该第一组分或经由接头间接地结合至该第一组分，该接头特别地为至少4个氨基酸和/或至多50个或至多25个氨基酸的接头，更特别地该接头为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3)。
项9为项1至8中任一项所述的治疗分子，其中该治疗靶点为VEGF、C2、C3a、C3b、C5、C5a、Htra1、IL-33、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF或ANG2，尤其为VEGF。
项10为项1至9中任一项所述的治疗分子，其中(a)该第一组分为抗VEGF的抗体或抗原结合片段，特别地为抗VEGF Fab；和/或(b)这些一种或两种第二组分中的每一者包含CD44结构域或TSG-6结构域或VG1结构域；和/或(c)该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸。
项11为项1至10中任一项所述的治疗分子，其中(i)该第一组分为抗VEGF抗体或抗原结合片段，这些一种或两种第二组分包含CD44结构域，并且该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸；(ii)该第一组分为抗VEGF抗体或抗原结合片段，这些一种或两种第二组分包含TSG-6结构域，并且该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸；或(iii)该第一组分为抗VEGF抗体或抗原结合片段，这些一种或两种第二组分包含VG1结构域，并且该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸。
项12为项1至11中任一项所述的缀合物，其中(a)该第一组分包含(i)SEQ ID NO:97、99、105、109或144的VH结构域；以及(ii)SEQ ID NO:98、100、106、110或115的VL结构域；且(b)该第二组分包含SEQ ID NO:2。
项13为项1至11中任一项所述的缀合物，其中(a)该第一组分包含(i)SEQ ID NO:97、99、105、109或144的VH结构域；以及(ii)SEQ ID NO:98、100、106、110或115的VL结构域；且(b)该第二组分包含SEQ ID NO:4。
项14为项1至11中任一项所述的缀合物，其中(a)该第一组分包含(i)SEQ ID NO:97、99、105、109或144的VH结构域；以及(ii)SEQ ID NO:98、100、106、110或115的VL结构域；且(b)该第二组分包含SEQ ID NO:86、60、32或29。
项15为项1至11中任一项所述的治疗分子，其中这些第二组分包含多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域。
项16为项15所述的治疗分子，其中这些第二组分包含结合至透明质酸的多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域。
项17为项1至22中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸允许透明质酸与治疗分子的比例范围为自1.5:1至1:1。
项18为项14至17中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分与SEQ ID NO:86、60、32或29至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
项19为项14至18中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分与SEQ ID NO:86、60、32或29至少95％相同。
项20为项14至19中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个突变。
项21为项14至20中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分包含1个至3个突变，其中这些1个至3个突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代和截短。
项22为项14至21中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分包含1个至5个突变，其中这些1个至5个突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代和截短。
项23为项14至22中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29具有截短突变。
项24为项23所述的治疗分子，其中该截短突变包含在N末端上的1个至129个氨基酸的截短。
项25为项14至24中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分为截短序列，其中不存在野生型多功能蛋白聚糖的Ig结构域。
项26为项14至25中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含以下氨基酸中的至少一个：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。
项27为项14至26中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含以下氨基酸中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。
项28为项14至27中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的至少一个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
项29为项14至28中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
项30为项14至29中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的2个、3个、4个、5个或6个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
项31为项14至30中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少一个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
项32为项14至31中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分包含Y208A和H306A中的至少一个。
项33为项14至32中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
项34为项14至33中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少2个、3个、4个、5个或6个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
项35为项14或18中任一项所述的治疗分子，其中该第二组分为SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59。
项36为项1至35中任一项所述的治疗分子，其中该第一组分包含寡肽、蛋白质或核酸。
项37为项1至36中任一项所述的治疗分子，其中该第一组分包含治疗药物、抗体、抗原结合片段、酶、生长因子、寡肽、半胱氨酸结肽、生长因子、反义寡核苷酸、锁核酸或适体。
项38为项37所述的治疗分子，其中该半胱氨酸结肽与SEQ ID NO:92具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
项39为项37所述的治疗分子，其中该生长因子包含成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子(NGF)、VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)。
项40为项1至39中任一项所述的治疗分子，其中该第一组分结合VEGF。
项41为项40所述的治疗分子，其中结合VEGF的该第一组分包含雷珠单抗、阿柏西普、布洛赛珠单抗-dbll和贝伐珠单抗。
项42为项37所述的治疗分子，其中该适体经聚乙二醇化。
项43为项37或42所述的治疗分子，其中该适体为
Figure BDA0004179509630000081
项44为项1至43中任一项所述的治疗分子，其中该接头包含GGGGS(SEQ ID NO:27)或其多聚体，更尤其包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:28)。
项45为项1至42中任一项所述的治疗分子，其中该接头包含GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:95)。
项46为项45所述的治疗分子，其中该半胱氨酸结肽与这些一种或两种第二组分经由接头连接，该接头包含序列GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:95)。
项47为项45或46所述的治疗分子，其中该序列包含(a)抗VEGF抗原结合片段；以及(b)与SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
项48为一种用作药物的组合物，该组合物包含如项1至47中任一项所述的治疗分子和任选的药用赋形剂、稀释剂或载体。
项49为一种用于治疗眼睛疾病或脑疾病的组合物，该组合物包含如项1至47中任一项所述的缀合物和任选的药用赋形剂、稀释剂或载体。
项50为项49所使用的组合物，该组合物配制用于眼内递送，特别地用于玻璃体内注射。
项51为项48至50中任一项所使用的组合物，其中(a)该组合物至多每三个月施用一次，特别地至多每四个月施用一次，更特别地至多每六个月施用一次；和/或(b)该缀合物中该第一组分的消除半衰期相较于未结合的第一组分延长至少3倍、至少4倍或至少5倍。
项52为项48至51中任一项所使用的组合物，其中该眼睛疾病为年龄相关性黄斑变性(AMD)，特别地为湿性AMD或新生血管性AMD；糖尿病性黄斑水肿(DME)；糖尿病性视网膜变性(DR)，特别地为增殖性DR或非增殖性DR；视网膜静脉阻塞(RVO)；或地图状萎缩(GA)。
项53为一种治疗受试者的眼睛疾病的方法，该方法包括将项1至47中任一项所述的治疗分子或项48至52中任一项所定义的组合物施用于该受试者。
项54为一种递送靶向患者的组织的治疗分子的方法，该方法包括将项1至47中任一项所述的治疗分子或项48至52中任一项所述的组合物施用于该患者，并允许该治疗分子向靶组织提供该第一组分的长效递送。
项55为项54所述的方法，其进一步包括在施用步骤之前将该治疗分子与透明质酸结合。
项56为项55所述的方法，其进一步包括将包含该治疗分子的第一溶液与包含该透明质酸的第二溶液混合。
项57为项56所述的方法，其中该混合包括容器。
项58为项57所述的方法，其中该容器为两室注射器。
项59为项56至58中任一项所述的方法，其中该混合产生结合至透明质酸的治疗分子，该治疗分子准备用于施用于受试者。
项60为项54至59中任一项所述的方法，其中该施用步骤为单次注射。
项61为项54至60中任一项所述的方法，其中该靶组织包含眼睛或脑。
项62为项54至61中任一项所述的方法，其中相较于未经修饰的生物活性剂，该治疗分子提供改善的玻璃体兼容性、更长的玻璃体停留时间、更长的玻璃体半衰期和/或改善的药理作用持续时间。
方面63为一种缀合物，该缀合物包含(a)能够结合至眼睛中的治疗靶点的第一组分；(b)能够结合至透明质酸的一种或多种第二组分；以及(c)包含透明质酸的一种或多种第三组分，(d)其中每种第二组分共价地结合至第一组分并非共价地结合至第三组分。
方面64为方面63所述的缀合物，其中该第一组分为蛋白质、肽、受体或其片段、受体的配体、darpin、核酸、RNA、DNA或适体。
方面65为方面63或64所述的缀合物，其中该第一组分为抗体或抗原结合抗体片段，特别地为抗体片段，更特别地为至少缺少Fc结构域的抗体片段，尤其地其中该片段为或包含(Fab')2片段、Fab'片段或Fab片段，更尤其为Fab片段。
方面66为方面63至65中任一项所述的缀合物，其中该第二组分包含透明质酸受体CD44(CD44)结构域、脑特异性连接蛋白(BRAL1)结构域、肿瘤坏死因子刺激基因6(TSG-6)结构域、淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)结构域、或透明质酸结合蛋白(HABP)结构域、聚集蛋白聚糖G1(AG1)结构域或多功能蛋白聚糖G1(VG1)结构域。
方面67为方面63至66中任一项所述的缀合物，其中该缀合物包含一种或两种第二组分，特别地包含两种相同的第二组分。
方面68为方面63至66中任一项所述的缀合物，其中该第三组分为透明质酸，其中该透明质酸(a)具有3kDa至60kDa、特别地4kDa至30kDa、更特别地5kDa至20kDa的分子量；和/或(b)具有至少2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa或9kDa的分子量；和/或(c)具有至多60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、20kDa或15kDa的分子量；和/或(d)具有减少眼睛中透明质酸降解的修饰。
方面69为方面63至67中任一项所述的缀合物，其中(a)这些第一组分和第二组分包含在融合蛋白中，特别地其中这些第二组分中的一种或两种共价地结合至该第一组分的N末端和/或C末端，更特别地其中该第一组分为抗体或抗原结合抗体片段，并且其中这些第二组分中的一种或两种共价地结合至该第一组分的C末端；和/或(b)这些第二组分直接地结合至该第一组分或经由接头间接地结合至该第一组分，该接头特别地为至少4个氨基酸和/或至多50个或至多25个氨基酸的接头，更特别地该接头为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3)。
方面70为方面63至69中任一项所述的缀合物，其中该治疗靶点为VEGF、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNF□、FGFR2、PDGF或ANG2，尤其为VEGF。
方面71为方面63至70中任一项所述的缀合物，其中(a)该第一组分为抗VEGF的抗体或抗原结合抗体片段，特别地为抗VEGF Fab；和/或(b)这些一种或两种第二组分中的每一者包含CD44结构域或TSG-6结构域或VG1结构域；和/或(c)该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸，(d)特别地其中(e)该第一组分为抗VEGF Fab，并且其中这些一种或两种第二组分中的每一者包含CD44结构域，并且其中该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸；或(f)该第一组分为抗VEGF Fab，并且其中这些一种或两种第二组分中的每一者包含TSG-6结构域，并且其中该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸；或(g)该第一组分为抗VEGF Fab，并且其中这些一种或两种第二组分中的每一者包含VG1结构域，并且其中该第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸。
方面72为方面63至71中任一项所述的缀合物，该第一组分为抗体，该抗体具有包含于SEQ ID NO:5中的VH结构域和包含于SEQ ID NO:6中的VL结构域，并且该第二组分包含SEQ ID NO:4或由其组成。
方面73为用作药物的组合物，该组合物包含如方面63至72中任一项所述的缀合物和任选的药用赋形剂、稀释剂或载体。
方面74为用于治疗眼睛疾病的组合物，该组合物包含如方面63至73中任一项所述的缀合物和任选的药用赋形剂、稀释剂或载体。
方面75为方面73或74所使用的组合物，该组合物配制用于眼内递送，特别地用于玻璃体内注射。
方面76为方面73至75中任一项所使用的组合物，其中(a)该组合物至多每三个月施用一次，特别地至多每四个月施用一次，更特别地至多每六个月施用一次；和/或(b)该缀合物中该第一组分的消除半衰期相较于未结合的第一组分延长至少3倍、至少4倍或至少5倍。
方面77为方面73至76中任一项所使用的组合物，其中该眼睛疾病为年龄相关性黄斑变性(AMD)，特别地为湿性AMD或新生血管性AMD；糖尿病性黄斑水肿(DME)；糖尿病性视网膜变性(DR)，特别地为增殖性DR或非增殖性DR；视网膜静脉阻塞(RVO)；或地图状萎缩(GA)。
方面78为一种治疗受试者的眼睛疾病的方法，该方法包括将方面63至72中任一项所述的缀合物或方面73至77中任一项所定义的组合物施用于该受试者。
实施例79为一种靶向患者的组织的治疗分子，该治疗分子包含透明质酸结合结构域和治疗活性剂，其中该透明质酸结合结构域包含多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域。
实施例80为一种靶向患者的组织的治疗分子，该治疗分子包含透明质酸结合结构域和治疗活性剂，其中该透明质酸结合结构域包含多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域，这些多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域经由HA结合结构域结合至透明质酸。
实施例81为实施例79或80所述的治疗分子，其中该透明质酸的范围为从400Da至200kDa。
实施例82为实施例81所述的治疗分子，其中该透明质酸为至少5kDa。
实施例83为实施例81或82所述的治疗分子，其中该透明质酸为10kDa。
实施例84为实施例79至83中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸对这些多功能蛋白聚糖的连接结构域提供摩尔过量的结合当量。
实施例85为实施例79至84中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸允许透明质酸与治疗分子的比例范围为从1.5:1至1:1。
实施例83为实施例79至85中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域具有10nM至10μM的KD。
实施例87为实施例79至86中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域具有5nM至8μM的KD。
实施例88为实施例79至87中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域具有100nM至5μM的KD。
实施例89为实施例79至88中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域与SEQ ID NO:86、60、32或29至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
实施例90为实施例79至89中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域与86、60、32或29至少95％相同。
实施例91为实施例79至90中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个突变。
实施例92为实施例79至91中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域包含1个至3个突变，其中这些1个至3个突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代和截短。
实施例93为实施例79至92中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域包含1个至5个突变，其中这些1个至5个突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代和截短。
实施例94为实施例79至93中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29具有截短突变。
实施例95为实施例94所述的治疗分子，其中该截短突变包含在N末端上的1个至129个氨基酸的截短。
实施例96为实施例79至95中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域为截短序列，其中不存在野生型多功能蛋白聚糖的Ig结构域。
实施例97为实施例79至96中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含以下氨基酸中的至少一个：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。
实施例98为实施例79至97中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含以下氨基酸中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。
实施例99为实施例79至98中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的至少一个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
实施例100为实施例79至99中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
实施例101为实施例79至100中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的2个、3个、4个、5个或6个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
实施例102为实施例79至101中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少一个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
实施例103为实施例79至102中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域包含Y208A和H306A中的至少一个。
实施例104为实施例79至103中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
实施例105为实施例79至104中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少2个、3个、4个、5个或6个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
实施例106为实施例79至105中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或SEQID NO:59。
实施例107为实施例79至106中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂包含寡肽、蛋白质或核酸。
实施例108为实施例79至107中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂包含抗体、抗原结合片段、半胱氨酸结肽、生长因子或适体。
实施例109为实施例108所述的治疗分子，其中该治疗活性剂能够结合抗原。
实施例110为实施例109所述的治疗分子，其中该治疗活性剂能够结合VEGF、HtrA1、IL-33、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF或ANG2。
实施例111为实施例109或110中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂为抗体或其抗原结合片段(包括但不限于Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、VhH片段、scFv片段、scFv-Fc片段或微型抗体)。
实施例112为实施例109或110中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂为寡肽或蛋白质。
实施例113为实施例102所述的治疗分子，其中该寡肽或蛋白质为半胱氨酸结肽或酶。
实施例114为实施例103所述的治疗分子，其中该半胱氨酸结肽与SEQ ID NO:92具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
实施例115为实施例79至108中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂为生长因子，该生长因子包含成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子(NGF)、VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)。
实施例116为实施例110所述的治疗分子，其中结合VEGF的该治疗活性剂包含雷珠单抗、阿柏西普、布洛赛珠单抗-dbll和贝伐珠单抗。
实施例117为实施例79至110中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂为核酸。
实施例118为实施例117所述的治疗分子，其中该核酸为适体、反义寡核苷酸和/或锁核酸。
实施例119为实施例118所述的治疗分子，其中该适体结合VEGF。
实施例120为实施例108、118或119中任一项所述的治疗分子，其中该适体经聚乙二醇化。
实施例121为实施例108或实施例118至120中任一项所述的治疗分子，其中该适体为
Figure BDA0004179509630000171
实施例122为实施例79至121中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂与该透明质酸结合结构域经由接头共价地连接。
实施例123为实施例122所述的治疗分子，其中该接头为至少4个氨基酸。
实施例124为实施例122或123所述的治疗分子，其中该接头的长度不超过50个氨基酸。
实施例125为实施例122至124中任一项所述的治疗分子，其中该接头为4个至25个氨基酸。
实施例126为实施例122至125中任一项所述的治疗分子，其中该接头包含(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3)。
实施例127为实施例122至126中任一项所述的治疗分子，其中该接头包含GGGS(SEQ ID NO:84)或其多聚体，更尤其包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:85)。
实施例128为实施例122至125中任一项所述的治疗分子，其中该接头包含(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，并且(n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
实施例129为实施例122至实施例125或128中任一项所述的治疗分子，其中该接头包含GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:95)。
实施例130为实施例79至107中任一项所述的治疗分子，其中该治疗活性剂包含抗VEGF抗原结合部分和半胱氨酸结肽。
实施例131为实施例130所述的治疗分子，其中该半胱氨酸结肽经由接头与该透明质酸结合结构域连接，该接头包含序列GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:95)。
实施例132为实施例130或131所述的治疗分子，其中该序列包含(a)抗VEGF抗原结合部分；以及(b)与SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
实施例133为实施例79至132中任一项所述的治疗分子，其中该透明质酸结合结构域可非共价地结合至透明质酸。
实施例134为一种递送靶向患者的组织的治疗分子的方法，其包括将如实施例79至133中任一项所述的治疗分子施用该患者，并允许该治疗分子向靶组织提供该治疗活性剂的长效递送。
实施例135为实施例134所述的方法，其进一步包括在施用步骤之前将该治疗分子与透明质酸结合。
实施例136为实施例135所述的方法，其进一步包括将包含该治疗分子的第一溶液与包含该透明质酸的第二溶液混合。
实施例137为实施例136所述的方法，其中该混合包括容器。
实施例138为实施例137所述的方法，其中该容器为两室注射器。
实施例139为实施例136至138中任一项所述的方法，其中该混合产生结合至透明质酸的治疗分子，该治疗分子准备用于施用于受试者。
实施例140为实施例134至139中任一项所述的方法，其中该施用步骤为单次注射。
实施例141为实施例134至140中任一项所述的方法，其中该靶组织包含眼睛或脑。
实施例142为实施例134至141中任一项所述的方法，其中相较于未经修饰的治疗活性剂，该治疗分子提供改善的玻璃体兼容性、更长的玻璃体停留时间、更长的玻璃体半衰期和/或改善的药理作用持续时间。
附加的目的和优点将部分地如以下说明书所述，并且部分地将从该说明书中显而易见，或者可通过实践得知。这些目的和优点将通过随附权利要求书中特定指出的要素和组合来实现和获得。
应理解，前述一般描述和以下详细描述均仅为例示性和说明性的，并且不限制权利要求书。
并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图图解说明一个(若干个)实施例，并且与本说明一起用于阐释本文所述的某些原理。
附图说明
图1示出与10kDa透明质酸(HA)预复合或未预复合的Fab-透明质酸结合结构域(Fab-HABD)融合蛋白VPDF-2xCD44的尺寸排阻色谱法(SEC；TSKgel UP-SW3000，2μm，4.6×150mm；运行缓冲剂0.2MKPh，0.25M KCl，pH 6.2)分析结果。Fab-HABD如实例1所述进行制备，并如实例2所述进行测试。
图2A至2B示出在新西兰白兔中进行剂量标准化玻璃体内(IVT)注射后，兔抗c-MetFab(RabFab)和兔抗c-Met Fab-VG1 Fab-HABD(RabFab-Fab-HABD)的玻璃体药代动力学(PK)。图2A示出IVT后玻璃体内存在的RabFab或RabFab-Fab-HABD的含量随时间的变化。示出RabFab融合物的数据，即125I-RabFab-2xTSG6(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；0.5mg/眼)和RabFab-1xTSG6(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；0.3mg/眼)、RabFab(SEQ ID NO:61和SEQID NO:62；0.3mg/眼)和125I-雷珠单抗
Figure BDA0004179509630000191
对照(0.5mg/眼)。数据点经剂量标准化。图2B通过荧光光度测定法监测的RabFab(0.15mg/眼)或RabFab-2xTSG6(0.026mg/眼、0.15mg/眼或2.5mg/眼)的玻璃体药代动力学。
图3示出OS兔眼的组织病理学图像，其中示出在TSG6(SEQ ID NO:32)经由IVT给药后4天的视网膜变性。
图4A至4B示出房水和玻璃体液中的VPDF(未经修饰；图4A)和VPDF-2xCD44+10kDaHA(图4B)的IVT药代动力学(PK)形态(药物平均浓度随时间的变化)。
图5A至5C示出与猪玻璃体的不同混合物。图5A示出与未经修饰的抗VEGF/抗PDGFFab片段(VPDF)混合的猪玻璃体，其是均匀的(透明)。图5B示出与VPDF-2xCD44混合的猪玻璃体，其是不均匀的(沉淀)。图5C示出与1％(w/v)HA 10kDa的VPDF-2xCD44预复合物混合的猪玻璃体，其是均匀的(透明)。
图6A至6F示出与不同浓度的VPDF-2xCD44混合的猪玻璃体。图6A：37.5mg/mLVPDF-2xCD44。图6B：9.4mg/mL VPDF-2xCD44。图6C：2.4mg/mL VPDF-2xCD44。图6D：0.6mg/mLVPDF-2xCD44。图6E：0.15mg/mL VPDF-2xCD44。图6F：0.04mg/mL VPDF-2xCD44。+++严重沉淀；++中度沉淀；+轻度沉淀；-透明玻璃体。
图7A至7C示出注射指定VPDF-2xCD44样品后整个猪眼的玻璃体不均匀性。图7A：缓冲剂对照。图7B：未经复合的VPDF-2xCD44。图7C：与HA复合的VPDF-2xCD44。
图8A至8B示出多功能蛋白聚糖的结构域结构和连接结构域的氨基酸序列。多功能蛋白聚糖为玻璃体液内源性物质。图8A示出多功能蛋白聚糖结构域：VG1结构域、GAG附着结构域和G3结构域。VG1结构域(WT VG1；SEQ ID NO:29)包含Ig样结构域接以两个连接结构域(即Link1和Link2)，这些两个连接结构域负责HA结合。图8B示出包括TSG6 LD(SEQ ID NO:4)、VG1 Link1(SEQ ID NO:30)和VG1 Link2(SEQ ID NO:31)的连接结构域的序列比对。
图9A至9B示出猪玻璃体液中的TSG6但非WT VG1的沉淀。将TSG6(但非WT VG1)与1:4稀释(PBS)的猪玻璃体混合后，观察浊度。玻璃体中的TSG6和WT VG1的最终浓度为约1mg/mL。图9A示出TSG6vs.对照–离心后观察到沉淀物。图9B示出WT VG1 vs.对照–离心后未观察到沉淀物。
图10A至10B示出RabFab-TSG6在猪玻璃体中发生沉淀，而RabFab-VG1未发生沉淀。TSG6或VG1各自重组接附至RabFab并经由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)伯胺标记化学结合至Alexa488。图10A示出RabFab-TSG6。图10B示出RabFab-VG1。
图11A至11C示出VG1和RabFab-VG1在兔玻璃体液中未发生沉淀。图11A示出约40g/L的VG1。图11B示出约40g/L的RabFab-VG1。图11C示出约17g/L的RabFab-VG1+10kDa HA。在任何条件下均未观察到沉淀。
图12示出VG1与离体玻璃体液相互作用的荧光相关光谱(FCS)测量结果。示出缓慢扩散的测量结果表明，蛋白质与玻璃体液发生相互作用，而快速扩散则表明不发生相互作用。玻璃体液的稀释因子显示于热图的顶部–最左侧一列示出未经稀释的对照/样品；最右侧一列示出磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4；中间的列示出从左到右增加的稀释因子。未结合对照的测量结果显示于顶部两行中。以下样品的测量结果显示于第3-8行：游离VG1、PigFab-VG1、PigFab-VG1+10kDa HA(1:1)、游离VG1、RabFab-VG1和RabFab-VG1+10kDa HA(1:1)。未结合对照示出最快速的扩散(图12，第1行和第2行)。虽然所有样品相对于对照都表现出显著的延迟扩散，但游离VG1、PigFab-VG1和RabFab-VG1在玻璃体稀释超过6000倍之前都表现出延迟扩散(图12，第3、4、6和7行；从未稀释到稀释因子为6,561)。观察到与10kDaHA共同配制的样品缓慢扩散，但当稀释因子大于729倍时，该效应消失(图12，第5行：PigFab-VG1+10kDa HA(1:1)，和第8行：RabFab-VG1+10kDa HA(1:1)；从稀释因子为729到PBS)。这些结果表明VG1可与内源性HA发生相互作用。
图13示出37℃下的抗HtrA1-VG1的热应力(即蛋白质稳定性)分析结果。T0＝未孵育对照。T4wk＝孵育4周后。
图14示出猪房水中pigFab-VG1的平均浓度。在经由IVT单独注射1.8mg pigFab-VG1或与相等质量浓度的10kDa HA预复合的pigFab-VG1后，通过质谱法测量浓度。示出几只动物的平均值，误差条表示标准偏差。
图15示出VPDF VG1在大鼠激光诱导的脉络膜新血管形成(大鼠激光CNV)中对新血管形成的抑制百分比。
图16A至16C示出在处理后30天经试验品处理的兔眼的组织病理学。图16A示出WTVG1，图16B示出RabFab-VG1，并且图16C示出与HA结合的RabFab-VG1。
图17A至17B示出小鼠接受脑室内注射后的脑水平。图17A示出随时间的推移保留在脑中的蛋白质的量。图17B示出通过曲线下面积(AUC)所测量的脑中暴露水平。**表示p<0.01，并且***表示p<0.001，用于在组间比较。抗gD＝抗单纯疱疹病毒-1糖蛋白D。BRD＝抗gD Fab-VG1。
图18示出WT VG1和HA缀合物的晶体结构。VG1的Ig结构域显示于图的顶部，Link1结构显示于图的底部右侧，Link2结构域显示于图的底部左侧。HA的结合以VG1分子右下方较小的HA分子表示。
图19示出VG1变体SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33-59的比对。N末端之前20个氨基酸为多功能蛋白聚糖信号序列(示出为带有*)。框内氨基酸为保守残基。所有这些蛋白质都带有用于纯化的C末端His标签。
序列说明
表1提供了本文所引用的某些序列的列表。提供的氨基酸序列从N末端到C末端。
Figure BDA0004179509630000221
Figure BDA0004179509630000231
Figure BDA0004179509630000241
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Figure BDA0004179509630000311
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Figure BDA0004179509630000361
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Figure BDA0004179509630000401
Figure BDA0004179509630000411
Figure BDA0004179509630000421
具体实施方式
I.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践中，但是现在描述优选的方法和材料。
除非另有说明，否则本文所使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：
如本文所使用，术语“抗体(antibody)”是指全(完全或完整)抗体。抗体为糖蛋白，其包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区可进一步细分为高度可变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布更保守的区域，称为骨架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(CIq)。
如本文所使用，术语“抗原结合片段(antigen-binding fragment)”或“抗体片段(antibody fragment)”是指抗体中保留与给定抗原(例如，眼睛中的治疗靶点，诸如VEGF)特异性结合的能力并由此表现出所需的抗原结合活性的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过完整抗体的片段来执行。涵盖于术语“抗体的抗原结合片段”内的结合片段的实例包括但不限于以下抗体片段的实例，其中包括但不限于：Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；和由抗体片段形成的多特异性抗体；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段，其由VH结构域或VL结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。关于某些抗体片段的综述，参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但它们可使用重组方法通过人工肽接头连接，使其能够成为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。这些单链抗体可包括抗体的一种或多种抗原结合片段。这些抗原结合片段系使用本领域技术人员所已知的常规技术获得，并且片段的实用性按照与完整抗体相同的方式进行筛选。抗原结合片段亦可并入单结构域抗体、大抗体、微型抗体、内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv。抗原结合片段可并入包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。术语“抗体(antibodies)”包括多克隆抗体和单克隆抗体。
适体为结合至特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。适体通常通过从大型随机序列池中选择它们来创建，但天然适体也存在于核糖开关(riboswitch)中。适体可作为巨分子药物用于基础研究和临床目的。适体可与核酶结合，在靶分子存在下进行自切割。这些化合物分子具有额外的研究、工业和临床用途。更具体地，适体可分为DNA或RNA或XNA适体，它们由(通常为短的)寡核苷酸链组成，并且由一个(或多个)短的可变肽结构域组成的肽适体在其两端接附至蛋白质支架。DNA和RNA适体都表现出对各种标靶的稳定的结合亲和力。已针对同一标靶选择了DNA和RNA适体。这些标靶包括溶菌酶、凝血酶、干扰素γ、血管内皮生长因子(VEGF)、多巴胺。在例如VEGF的情况下，DNA适体为RNA适体的类似物，其中胸腺嘧啶代替了尿嘧啶。
“共价键(covalent bond)”也称为分子键，是一种涉及在原子之间共享电子对的化学键。这些电子对被称为共享电子对或键合电子对，当它们共享电子时，原子间吸引力和排斥力的稳定平衡被称为共价键。
如本文所使用，术语“DARPin”(经设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrinrepeat protein)的缩写字”)是指通常表现出高特异性和高亲和力的靶蛋白质结合的抗体模拟蛋白质。它们通常是经过基因改造，来源于天然锚蛋白，并由至少三个、通常为四个或五个这些蛋白质的重复模体组成。对于四或五重复DARPin，它们的分子量分别为约14kDa或18kDa。DARPin的实例可参见例如美国专利7,417,130。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”是指在所需的给药剂量和时间段内有效实现所需的治疗或预防效果的量。
如本文中所使用的术语“眼睛疾病”包括与病理性血管生成和/或萎缩相关的任何眼睛疾病。术语“眼睛疾病(eye disease)”与术语“眼睛病症(eye condition)”、“眼睛障碍(eye disorder)”、“眼部病症(ocular condition)”、“眼部疾病(ocular disease)”和“眼部障碍(ocular disorder)”同义。
如本文所使用，“Fab-透明质酸结合结构域(Fab-hyaluronan-binding domain)”和“Fab-HABD”是指包含Fab和透明质酸结合结构域的融合蛋白。这些术语同义并可在本公开全文中互换使用。
如本文所使用，“透明质酸(hyaluronan)”、“透明质酸(hyaluronic acid)”、“透明质酸盐(hyaluronate)”和“HA”是指具有化学式(C14H21NO11)n的非硫酸化葡糖胺聚糖及其盐类。
如本文所使用，“透明质酸结合结构域(hyaluronic acid binding domain)”、“透明质酸结合部分(hyaluronic acid binding moiety)”、“HA结合结构域(HA bindingdomain)”或“HABD”是指能够结合透明质酸的任何部分。在一些情况下，HABD可为HA-结合蛋白的结构域。
配体是与生物分子形成复合物或缀合物以达到其生物目的的物质。在蛋白质-配体结合中，配体通常为通过结合至靶蛋白上的位点以产生信号的分子。该结合通常导致靶蛋白的构象异构(conformation)发生变化。在DNA-配体结合研究中，配体可为结合至DNA双螺旋的小分子、离子或蛋白质。配体与结合配偶体之间的关系为电荷、疏水性和分子结构的函数。结合的情况发生于无限小的时间和空间范围内，因此速率常数通常是非常小的数字。配体可为天然存在的配体或非天然存在的配体。此外，它可能是激动剂、部分激动剂、拮抗剂或反向激动剂。
“非共价相互作用(non-covalent interaction)”与共价键的不同之处在于它不涉及电子的共享，而是涉及分子间或分子内的电磁相互作用的更分散的变化。非共价相互作用可分为不同的类别，诸如静电、π-效应、范德华力和疏水效应。优选地，缀合物以分离的形式提供。第一组分和第二组分可经由接头或直接彼此共价地结合。
核酸是由核苷酸组成的生物聚合物，其为三种组分所形成的单体：5-碳糖、磷酸基团和含氮碱基。术语“核酸(nucleic acid)”为DNA和RNA的总称。如果糖为复合核糖，则该聚合物为RNA(核糖核酸)；如果糖为来源于核糖的脱氧核糖，则该聚合物为DNA(脱氧核糖核酸)。
如本文所使用，术语“肽接头(peptide linker)”表示含氨基酸序列的肽，其优选地为合成来源。
蛋白质是由一个或多个氨基酸残基的长链所组成的大分子生物聚合物(多肽)。蛋白质在生物体内执行一系列功能，包括催化代谢反应、DNA复制、对刺激产生反应、为细胞和生物体提供结构以及将分子从一个位置运输到另一个位置。蛋白质之间的区别主要在于其氨基酸序列，而氨基酸序列由其基因的核苷酸序列决定，并且通常导致蛋白质折叠为特定的三维结构，该三维结构决定其活性。含有少于20-30个残基的短多肽通常称为肽。
如本文所使用，“蛋白质缀合物(protein conjugate)”或“缀合物(conjugate)”是指非共价地结合至透明质酸的蛋白质。
受体为通常由蛋白质组成的化学结构，其接收并转导可能整合至生物系统中的信号。这些信号通常为化学信使(配体)，其结合至受体，引起某种形式的细胞/组织反应，例如细胞活性的变化。受体的作用方式主要可分为三种：信号中继、放大或整合。中继将信号向前发送，放大增加单个配体的效果，整合则允许将信号并入另一条生化途径。在此意义上，受体是一种识别并响应内源性化学信号的蛋白质分子。因此，在本发明的上下文中，包含配体结合位点的受体或片段及其配体为合适的结合对应物(第一组分和治疗靶点)。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变待治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。理想的治疗效果包括预防疾病或其病状或症状的发生或复发，减轻疾病的病状或症状，减轻疾病的任何直接或间接病理后果，减慢疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，并达到缓解或改善预后的目的。在一些方面中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
数字范围包括定义范围的数字。考虑到有效数字以及与测量相关的误差，测量值和可测量值应理解为近似值。此外，“包含(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains)”和“包括(include/includes/including)”的使用并非旨在限制。应理解，前述一般描述和详细描述均仅为例示性和说明性的，并且不限制教导。
说明书和权利要求书中的所有数字都由术语“约(about)”修饰。这意味着每个数字都包括微小变化，其定义为所述数值或范围的10％。
除非说明书中特别指出，否则说明书中引用“包含各种组分”的实施例也被认为“由所引用的组分组成”或“基本上由所引用的组分组成”；说明书中引用“由各种组分组成”的实施例也被认为“包含所引用的组分”或“基本上由所引用的组分组成”；并且说明书中引用“基本上由各种组分组成”的实施例也被认为“由所引用的组分组成”或“包含所引用的组分”(该互换性不适用于权利要求书中这些术语的使用)。除非上下文另外明确指出，否则术语“或(or)”以包含的意义使用，即等同于“和/或(and/or)”。
现在将详细参考本发明的某些实施例，其实例在所附随的图式、实例和实施例中说明。应理解，图式、实例和实施例(除非另有具体指出)并非旨在将本发明的范围限制在本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。本发明旨在涵盖可包括在由所附权利要求书和所包括的实施例所限定的本发明内的所有替代、修改和等同形式。此外，本文所用的技术仅用于公开特定实施例的目的，而非试图限制本公开的范畴。除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。类似地，字词“包含”、“含有”及“涵盖”应解释为包含性而非排他性。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为以任何方式限制所需的目标。本文引用的所有出版物(科学和专利出版物)都通过引用并入。如果通过引用并入的任何材料与本说明书中定义的任何术语或本说明书的任何其他明确内容相矛盾，则以本说明书为准。虽然本教导结合各种实施例予以描述，但并非旨在将本教导限制于这些实施例。相反，如本领域技术人员所理解的，本教导涵盖各种替代、修改和等同形式。
II.包含治疗活性剂(即，第一组分)和透明质酸结合结构域(HABD；即，第二组分)的治疗分子
本申请提供靶向患者的组织的治疗分子，这些治疗分子包含治疗活性剂和HA-结合结构域(HABD)。每个治疗分子包含第一组分和一种或多种第二组分。该第一组分能够结合至眼睛中的治疗靶点。这些第二组分能够结合至HA，因此包含HA结合结构域(HABD)。
在一些实施例中，治疗分子为包含第一组分和一种或多种第二组分的融合蛋白。第一组分和第二组分彼此共价地结合，从而形成融合蛋白。在一些实施例中，治疗分子进一步包含肽接头。
在一些实施例中，治疗分子包含一种第二组分。在一些实施例中，治疗分子包含两种或更多种第二组分。特别地，如果使用由两种蛋白质(即，一条重链或其片段以及一条轻链或其片段)组成的抗体或其抗原结合片段，治疗分子可包含两种第二组分。在这些实施例中，第一第二组分连接至抗体或抗原结合片段的重链，并且第二第二组分连接至抗体或抗原结合片段的轻链。在一些实施例中，第一第二组分连接至Fab片段的重链的C末端，并且第二第二组分连接至Fab片段的轻链的C末端。
在一些实施例中，治疗分子进一步包含(除第一组分和第二组分以外)一种或多种第三组分。第二组分共价地结合至第一组分，并且第二组分非共价地结合至第三组分。在一些实施例中，第三组分为透明质酸(HA)。在这些实施例的一些中，第二组分能够结合HA，并且治疗分子蛋白质(即，共价地连接至第二组分的第一组分)可与HA(即，第三组分)预复合。在这些实施例的一些中，第一组分、第二组分和第三组分形成缀合物。
本文提供了第一组分、第二组分和第三组分的非限制性实例。
A.第一组分–治疗活性剂
在许多实施例中，第一组分能够结合至治疗靶点，使其成为生物活性剂或治疗活性剂。在一些实施例中，第一组分能够结合至眼睛中的治疗靶点。如本文所使用，术语“能够结合(capable of binding)”是指物质或试剂或组分可特异性结合至标靶并任选调节该标靶的活性。换言之，第一组分由于结合至眼睛中的治疗靶点，在眼睛中具有治疗活性。在一些实施例中，第一组分结合至治疗靶点后可活化、去活化、增加或降低该治疗靶点的活性。在一些实施例中，治疗靶点为眼睛中的合适结构，其活性与待治疗的眼睛疾病相关联。在一些实施例中，第一组分结合至信号转导级联中直接处于治疗靶点上游或下游的组分。在一些实施例中，第一组分包含用于治疗眼睛疾病的已知治疗药物。
优选地，特异性结合组分或结合结构域对其对应的靶分子具有至少106l/mol的亲和力。优选地，特异性结合结构域对其靶分子具有107/mol、或甚至更优选108/mol或甚至最优选109/mol的亲和力。“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所使用的“结合亲和力”，系指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对于其搭配物Y的亲和力通常可通过解离常数(KD)来表示。可以通过本领域已知的常规方法测量亲和力。如技术人员将理解的，术语“特异性(specific)”用于表示存在的其他生物分子不显著地结合至结合结构域的特异性结合剂。优选地，与靶分子之外的生物分子的结合水平导致结合亲和力分别仅为与靶分子的亲和力的10％或更小，更优选地仅为5％或更小。优选的特异性结合剂将满足上述亲和力以及特异性的最低标准。
在一些实施例中，该第一组分包含蛋白质诸如受体或其片段，该蛋白质结合治疗靶点、抗体或其片段、生长因子、半胱氨酸结肽、酶或DARpin。在一些实施例中，该蛋白质的大小可涵盖从小到大的范围。在一些实施例中，该蛋白质为包含2个至20个氨基酸的肽。在一些实施例中，该蛋白质为包含21个至50个氨基酸的多肽。在一些实施例中，该蛋白质为包含多于50个氨基酸的多肽。在一些实施例中，该蛋白质为包含两个或更多个链或氨基酸的蛋白复合物，其中每条氨基酸链可包含任意数量的氨基酸。在一些实施例中，第一组分不大于80kDa。在一些实施例中，第一组分大于80kDa。
在一些实施例中，第一组分包含可为DNA或RNA的核酸。该核酸可与标靶相关的核酸互补(例如，核酸与标靶的mRNA或其相关部分互补)。在一些实施例中，该核酸为适体。在一些实施例中，该核酸包含反义寡核苷酸。在一些实施例中，该核酸包含锁核酸。
1.眼睛中的治疗靶点
在一些实施例中，第一组分结合至眼睛中的治疗靶点。眼睛中可存在许多治疗靶点。随着有效靶向这些分子和途径的疗法的开发，将需要提供视力结果的改善，同时减少与频繁IVT注射相关联的治疗负担和风险。
a)促血管生成、炎症和生长因子介质
在一些实施例中，第一组分结合至治疗靶点，该治疗靶点为促血管生成、炎症和/或生长因子介质。促血管生成、炎症和生长因子介质参与视网膜疾病，例如新生血管性年龄相关性黄斑变性(AMD；湿式AMD)、糖尿病性视网膜变性和视网膜静脉阻塞。
这些促血管生成、炎症或生长因子介质分子的实例包括但不限于血小板源性生长因子(PDGF)、血管生成素、S1P、整合素ανβ3、整合素ανβ5、整合素α5β1、β细胞素(betacellulin)、apelin/APJ、红细胞生成素、补体因子D和TNFα。
b)年龄相关性黄斑变性(AMD)中的蛋白质
在一些实施例中，第一组分结合至蛋白质，其通常与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险增加有关。在一些实施例中，第一组分结合至补体途径组分，诸如C2、因子B、因子H、CFHR3,C3b、C5、C5a和C3a。在一些实施例中，第一组分结合至HtrA1、ARMS2、TIMP3、HLA、IL-8、CX3CR1、TLR3、TLR4、CETP、LIPC或COL10A1。
c)血管内皮生长因子(VEGF)
在一些实施例中，第一组分结合至血管内皮生长因子(VEGF)。已知VEGF与多种眼睛疾病相关，例如与糖尿病性视网膜变性或黄斑水肿相关联的疾病或病症。(见下文第III节。)
术语“VEGF”是指165-氨基酸血管内皮细胞生长因子、相关的121-、189-和206-氨基酸血管内皮细胞生长因子以及那些生长因子的天然生成的对偶基因和处理形式。VEGF可以指来自任何物种的VEGF蛋白质。
VEGF在正常发育和病理性血管生成中为必需的。缺氧诱导星状细胞分泌VEGF是引导视网膜血管形成的关键因素。VEGF水平升高也诱导视网膜和脉络膜中新血管的病理性生长。抑制血管生成因子(例如VEGF)已成为设计用于治疗病理性眼部血管生成(包括年龄相关性黄斑变性、增生性视网膜变性和早产儿视网膜变性)的治疗方法的主要策略。
术语“VEGF所介导的病症(VEGF-mediated disorder)”是指其症状或疾病状态的发生、进展或持续需要VEGF参与的任何病症。示例性VEGF所介导的病症包括但不限于：年龄相关性黄斑变性、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜变性、与晶状体病(phacomatoses)相关联的异常血管增生、水肿(诸如与脑肿瘤相关联的水肿)、Meigs综合征、类风湿性关节炎、银屑病和动脉粥样硬化。
在一些实施例中，第一组分为VEGF受体，诸如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。
在一些实施例中，第一组分为抗VEGF的抗体或抗原结合片段，更特别地为抗VEGFFab。本公开提供了VEGF抗体和抗原结合片段。可使用的其他抗VEGF抗体、VEGF拮抗剂和VEGF受体拮抗剂包括例如：雷珠单抗、贝伐珠单抗、阿柏西普、哌加他尼、CT-322和抗VEGF抗体及其片段，如US 2012/0014958、WO 1998/045331和WO 2015/198243中所述，这些专利通过引用整体而并入本文。在一些实施例中，第一组分包含靶向VEGF的药物，诸如下文第II.A.2.a)节所公开的那些。
d)红细胞生成素(EPO)
在一些实施例中，第一组分结合至红细胞生成素(EPO)。在一些实施例中，第一组分结合至红细胞生成素受体(EPOR)。在许多物种中，EPO是指红细胞生成素蛋白质。人、猕猴、小鼠、大鼠、兔EPO的蛋白质序列可公开获得。人EPO也可发生高糖基化。术语“EPO受体(EPO Receptor)”或“EPOR”可互换使用，是指不同物种中的红细胞生成素受体蛋白质。
e)血管生成素
在一些实施例中，第一组分结合至血管生成素诸如血管生成素2(ANG2)。已知ANG2为湿性AMD的候选治疗药物，因为它在血管生成和免疫活化中都发挥作用，这两个过程都涉及眼部病理性新血管形成。在人眼中，较高水平的ANG2与湿性AMD的疾病严重程度相关。眼内ANG2水平的升高也在糖尿病性视网膜变性和视网膜静脉阻塞患者中检测到，表明靶向眼内ANG2具有潜在的医学意义。ANG2是指不同物种中的蛋白质。也有研究人员建议使用VEGF-A/ANG2的联合抑制来大幅减少血管渗漏、免疫反应性和细胞凋亡。
f)白细胞介素
在一些实施例中，第一组分结合至白细胞介素，诸如白细胞介素(IL-)1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、IL-17A和IL-19。白细胞介素与眼睛疾病诸如葡萄膜炎(一种可能致盲的炎症性疾病)相关联。白细胞介素可来源于任何物种。
g)血小板衍生生长因子(PDGF)
在一些实施例中，第一组分结合至治疗靶点，该治疗靶点为血小板衍生生长因子(PDGF)或血小板衍生生长因子亚基B(PDGF-BB)。PDGF和PDGF-BB可来源于任何物种。在一些实施例中，第一组分包含PDGF拮抗剂，诸如下文第II.A.2.e)节所公开的那些。
h)VPDF
在一些实施例中，第一组分结合至VEGF和PDGF。各种蛋白质、抗体、抗体片段、结合结构域、激动剂和拮抗剂可结合至VEGF和PDGF。如本文所使用，术语“抗VP(anti-VP)”是指结合至VEGF和PDGF的双特异性抗体或其片段。
在一些实施例中，第一组分为双靶向Fab，即dutaFab。如本文所使用，“抗VPDF(anti-VPDF)”是指结合至VEGF和PDGF的dutaFab。
i)HtrA蛋白
在一些实施例中，第一组分结合至丝氨酸蛋白酶的HtrA家族的成员。HtrA蛋白具有包含至少一个C末端PDZ结构域的催化结构域以及与蛋白质代谢和细胞命运相关的独立于ATP的蛋白酶伴侣蛋白。Clausen等人,Molecular cell 10(3):443-445(2002)。人体内存在四种HtrA蛋白：HtrA1、HtrA2、HtrA3和HtrA4。在人类中，HtrA1、HtrA3和HtrA4共享相同的结构域架构：N末端IGFBP样模块和Kazal样模块、包含胰蛋白酶样折叠的蛋白酶结构域以及C末端PDZ结构域。人类遗传学研究已经发现，年龄相关性黄斑变性(AMD)的进展与HtrA1启动子区域中的单核苷酸多态性(SNP)之间存在强相关性，导致HtrA1转录本水平升高。Dewan等人,Science 314:989-992(2006)；Yang等人,Science 314:992-933(2006)。
在一些实施例中，第一组分结合至HtrA1。在一些实施例中，第一组分结合至HtrA2。在一些实施例中，第一组分结合至HtrA3。在一些实施例中，第一组分结合至HtrA4。
j)其他治疗靶点
在一些实施例中，第一组分结合至以下治疗靶点中的一者：因子P、因子D、TNFα、FGFR、IL-6R、Tie2、S1P、整合素αvβ3、整合素αvβ5、整合素α5β1、β细胞素(betacellulin)、apelin/APJ、补体因子D、TNFα、HtrA1、ST-2受体、胰岛素、人生长因子、补体因子H、CD35、CD46、CD55、CD59、补体受体1相关(CRRY)、神经生长因子、色素上皮衍生因子、内皮抑素、睫状神经营养因子、补体因子1抑制剂、补体因子样1、补体因子I等。
术语“因子D”是指来源于任何物种的因子D蛋白。
术语“因子P”是指来源于任何物种的因子P蛋白。人因子P可获自Complement Tech(Tyler,TX)。猕猴因子P可从猕猴血清中纯化(方案改编自Nakano等人，1986，J ImmunolMethods 90:77-83)。因子P在本领域中也称为“备解素(Properdin)”。
术语“FGFR2”是指来源于任何物种的成纤维细胞生长因子受体2。
2.治疗药物
用于治疗眼睛疾病的任何合适的治疗剂都可用作第一组分(如下面第III节中所述)。在一些实施例中，第一组分包含结合至眼睛中的标靶的公认的治疗药物。在一些实施例中，第一组分结合至人源性标靶。在一些实施例中，第一组分包含用于治疗眼睛疾病的公认的治疗药物。
a)靶向VEGF的药物
在一些实施例中，第一组分包含VEGF拮抗剂，其包括例如但不限于：(1)抗VEGF抗体(例如，
Figure BDA0004179509630000541
(雷珠单抗)、RTH-258(原ESBA-1008，抗VEGF单链抗体片段；Novartis)或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体诸如RG-7716；Roche))；(2)可溶性VEGF受体融合蛋白(例如，
Figure BDA0004179509630000542
阿柏西普))；(3)抗VEGF
Figure BDA0004179509630000543
(例如，abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan)；或(4)抗VEGF适体(例如，
Figure BDA0004179509630000544
哌加他尼钠)。
在一些实施例中，第一组分包含
Figure BDA0004179509630000545
(雷珠单抗)，其特别地用于治疗眼睛疾病。在一些情况下，眼睛疾病为年龄相关性黄斑变性(AMD；例如，湿性AMD)。在一些情况下，眼睛疾病为地图状萎缩(GA)。在一些情况下，眼睛疾病为糖尿病性黄斑水肿(DME)和/或糖尿病性视网膜变性(DR；例如，非增生性DR(NPDR)或增生性DR(PDR))。
在一些实施例中，第一组分包含RTH-258，其特别地用于治疗眼睛疾病。在一些情况下，眼睛疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，眼睛疾病为GA。
在一些实施例中，第一组分包含
Figure BDA0004179509630000546
(阿柏西普(aflibercept))，其特别地用于治疗眼睛疾病。在一些情况下，眼睛疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，眼睛疾病为GA。在一些情况下，眼睛疾病为DME和/或DR(例如，NPDR或PDR)。
在一些实施例中，第一组分包含abicipar pegol，其特别地用于治疗眼睛疾病。在一些情况下，眼睛疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，眼睛疾病为GA。
在一些实施例中，第一组分包含
Figure BDA0004179509630000547
(哌加他尼钠(pegaptanibsodium))，其特别地用于治疗眼睛疾病。在一些情况下，眼睛疾病为AMD(例如，湿性AMD)。在一些情况下，眼睛疾病为GA。
b)抗血管生成剂
在一些实施例中，第一组分包含抗血管生成剂。抗血管生成剂非限制性实例包括：抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab
Figure BDA0004179509630000548
(雷珠单抗)、RTH-258(原ESBA-1008、抗VEGF单链抗体片段；Novartis)、双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体诸如RG-7716；Roche)、可溶性重组受体融合蛋白(例如，
Figure BDA0004179509630000551
(阿柏西普)；也称为VEGF Trap Eye；Regeneron/Aventis)、VEGF变体、可溶性VEGF受体(VEGFR)片段、能够阻断VEGF的适体(例如，抗VEGF聚乙二醇化适体
Figure BDA0004179509630000552
(哌加他尼钠；NeXstarPharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals))、能够阻断VEGFR的适体、中和抗VEGFR抗体的适体、VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、抗VEGF
Figure BDA0004179509630000553
(例如，abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan)、抑制VEGF或VEGFR表达的小干扰RNA、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶)-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、色玛米尼(semaxaminib)(SU5416；SUGEN)和
Figure BDA0004179509630000554
(舒尼替尼(sunitinib)))以及它们的组合。
c)抗新血管形成剂
在一些实施例中，第一组分包含具有抗新生血管形成活性的药剂以用于治疗眼睛疾病，该药剂为诸如抗炎药物、哺乳动物靶向的雷帕霉素(mTOR)抑制剂(例如，雷帕霉素、
Figure BDA0004179509630000555
(依维莫司(everolimus))和
Figure BDA0004179509630000556
(坦罗莫司(temsirolimus)))、环孢霉素、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂(例如，抗TNFα抗体或其抗原结合片段(例如，英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木单抗)或可溶性受体融合蛋白(例如，依那西普(etanercept)))、抗补体药物、非类固醇抗炎药物(NSAID)或其组合。
d)神经保护剂
在一些实施例中，第一组分包含具有神经保护作用并可潜在地减少疾病进展的药剂。例如，该药剂可减少干性AMD向湿性AMD的进展。神经保护剂的实例包括被称为“神经类固醇类”的一类药物，其包括药物诸如去氢表雄酮(DHEA)(PRASTERATM和
Figure BDA0004179509630000557
)、硫酸脱氢表雄酮和硫化孕烯醇酮。
e)PDGF拮抗剂
在一些实施例中，第一组分包含PDGF拮抗剂。在一些实施例中，PDGF拮抗剂为(1)抗PDGF抗体(例如，REGN2176-3)、(2)抗PDGF-BB聚乙二醇化适体(例如，
Figure BDA0004179509630000561
E10030；Ophthotech/Novartis)、(3)可溶性PDGFR受体融合蛋白、(4)双PDGF/VEGF拮抗剂/抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))、(5)双特异性抗PDGF/抗VEGF抗体、(6)抗PDGFR抗体或(7)小分子抑制剂(例如，角鲨胺)。
f)补体系统拮抗剂
在一些实施例中，第一组分包含补体系统拮抗剂。补体系统拮抗剂的实例包括：补体因子C5拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，ARC-1905；Opthotech))、抗C5抗体(例如，LFG-316；Novartis)、备解素拮抗剂(例如，抗备解素抗体；CLG-561；Alcon)、补体因子D拮抗剂(例如，抗补体因子D抗体；兰帕利珠单抗(lampalizumab)；Roche)和C3阻断肽(例如，APL-2；Appellis)。
g)用于治疗眼睛疾病的公认药物
在一些实施例中，第一组分包含用于治疗眼睛疾病的公认的治疗药物。眼睛疾病的治疗如下面的第III节所述。公认药物的实例包括：非类固醇抗炎药物(NSAID)、类固醇(例如，用于减少炎症和/或纤维化)、抗生素、局部眼科麻醉剂、眼科粘合剂(例如，用于术后伤口闭合)、酶制剂(用于玻璃体手术)、DNA或RNA(例如用于基因治疗技术)、介导神经保护作用的药剂(诸如提供神经营养因子、阻断过量谷氨酸刺激、稳定Ca2+恒定、防止细胞凋亡、经由疫苗接种调节免疫状态、诱导内源性神经保护机制、抗氧化剂、维生素和矿物质补充剂)。
在一些实施例中，第一组分包含任何合适的DME和/或DR治疗剂，特别地用于治疗眼睛疾病，包括但不限于VEGF拮抗剂(例如，
Figure BDA0004179509630000562
或
Figure BDA0004179509630000563
)、皮质类固醇(例如，皮质类固醇植入物，
Figure BDA0004179509630000564
地塞米松IVT植入物；或
Figure BDA0004179509630000565
醋酸氟轻松IVT植入物)或配制用于通过IVT注射施用的皮质类固醇(例如，安奈德)或其组合。在一些情况下，眼睛疾病为DME和/或DR。
适合用作第一组分条件的用于治疗眼睛疾病的公认药物的更多实例包括但不限于：
Figure BDA0004179509630000571
(维替泊芬(verteporfin)；一种光活化的药物，其通常与使用非热学激光进行的光动力治疗结合使用)、PKC412、恩多维昂(Endovion)(NS 3728；NeuroSearch A/S)、神经滋养因子(例如，胶质源性的神经滋养因子(GDNF)和睫状神经滋养因子(CNTF))、地尔硫卓(diltiazem)、多佐胺(dorzolamide)、
Figure BDA0004179509630000572
9-顺式视黄醛、眼部药物(例如，碘磷灵(phospholine iodide)、二乙氧磷酰硫胆碱(echothiophate)或碳酸酐酶抑制剂)、维沃司他(veovastat)(AE-941；AEterna Laboratories,Inc.)、Sirna-027(AGF-745；Sima Therapeutics,Inc.)、神经滋养素(包括，仅作示例，NT-4/5，Genentech)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整合素拮抗剂(包括那些来自Jerini AG和Abbott Laboratories的)、EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、沙利度胺(如例如EntreMed,Inc.所用)、心肌营养素-1(Genentech)、2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫代钼酸盐(University of Michigan)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany,Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，美国专利号7,771,742中所述的那些，以及VEGFR抑制剂SUGEN(SU5416)，或Pfizer的Inlyta(达克替尼(dacomitinib))、
Figure BDA0004179509630000573
(劳拉替尼(lalorlatinib)))、NX-278-L(NeXstarPharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、视网膜细胞神经节神经保护剂(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M University System)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、环孢霉素A、用于光动力治疗中的治疗剂(例如，
Figure BDA0004179509630000574
受体靶向的PDT，Bristol-Myers Squibb,Co.；用于与PDT一起注射的卟吩姆钠(porfimer sodium)；维替泊芬，QLT Inc.；与PDT合用的罗他泊芬(rostaporfin)，Miravent Medical Technologies；与PDT合用的塔拉泊芬钠(talaporfin sodium)，NipponPetroleum；以及莫西沙芬镥(motexafin lutetium)，Pharmacyclics、Inc.)、反义寡核苷酸(包括，举例而言，由Novagali Pharma SA测试的产品以及ISIS-13650，IonisPharmaceuticals)及其组合。
在一些实施例中，第一组分包含组织因子拮抗剂(例如，hI-con1；IconicTherapeutics)、α-肾上腺素受体激动剂(例如，酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate)；Allergan)、肽疫苗(例如，S-646240；Shionogi)、淀粉样蛋白β拮抗剂(例如，抗β淀粉样蛋白单克隆抗体；GSK-933776)、S1P拮抗剂(例如，抗S1P抗体；iSONEPTM；Lpath Inc)、ROBO4拮抗剂、抗ROBO4抗体(例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)。
在一些实施例中，第一组分包含色氨酸-tRNA合成酶(TrpRS)、角鲨胺、
Figure BDA0004179509630000581
(用于长效悬浮液的醋酸阿奈可他；Alcon,Inc.)、康普瑞汀(Combretastatin)A4前驱药(CA4P)、
Figure BDA0004179509630000582
(米非司酮-ru486))、结膜下曲安奈德(subtenon triamcinolone acetonide)、IVT结晶曲安奈德、基质金属蛋白酶抑制剂(例如，普林斯他(Prinomastat)；AG3340；Pfizer)、醋酸氟轻松(包括氟轻松眼内植入物；Bausch&Lomb/控制递送系统)、力诺胺(linomide)、整合素β3功能的抑制剂、血管抑素及其组合。这些及其他治疗剂叙述于例如美国专利申请号US 2014/0017244中，该专利申请通过引用而以其整体并入本文。
3.抗体和抗原结合片段
在一些实施例中，第一组分包含或来源于能够结合抗原的抗体或其抗原结合片段。抗体或抗原结合片段结合至无关、非靶蛋白质的程度低于该抗体与标靶结合约10％，其通过例如表面等离子共振(SPR)所测量。在某些方面中，结合至该标靶的抗体或抗原结合片段的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9至10-13M)。当抗体的KD为1μM或更小时，称该抗体或其抗原结合片段与靶“特异性结合”。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包含双特异性抗体、至少缺少Fc结构域的抗体，Fab片段、(Fab’)2片段、Fab’片段、VhH片段、scFv片段、scFv-Fc片段或微型抗体。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至存在于眼睛中的抗原。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段可结合至VEGF、HtrA1、IL-33、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF或ANG2。
在一些实施例中，第一组分为抗VEGF抗体或抗体结合片段、抗PDGF抗体或抗体-结合片段、抗ANG2抗体或抗体结合片段或抗IL-1β抗体或抗体结合片段。结合VEGF的抗体的实例包括
Figure BDA0004179509630000591
(雷珠单抗)、
Figure BDA0004179509630000592
(阿柏西普)、
Figure BDA0004179509630000593
(布洛赛珠单抗-dbll)和
Figure BDA0004179509630000594
(贝伐珠单抗)。
在一些实施例中，抗体包含双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗体为抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体，诸如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中公开的任意双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或其变体。在一些实施例中，双特异性抗体为抗VPDF抗体，即抗VEGF和抗PDGF dutaFab抗体。
在一些实施例中，第一组分为抗IL-6抗体，例如EBI-031(ElevenBiotherapeutics；参见例如WO 2016/073890)、司妥昔单抗(siltuximab；
Figure BDA0004179509630000595
)、奥洛珠单抗(olokizumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、OPR-003、MEDI5117、PF-04236921或其变体。
在一些实施例中，第一组分为抗IL-6R抗体，例如托珠单抗(tocilizumab；
Figure BDA0004179509630000596
)(参见例如WO 1992/019579)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)、ALX-0061、SA237或其变体。
在一些实施例中，第一组分为RabFab，其为来源于在兔体内产生的亲本单克隆抗体(G10)的抗原结合Fab片段，针对来源于人cMET受体的细胞内结构域的磷酸化肽，因此不结合眼睛中的细胞外标靶。Shatz,W.等人,Mol.Pharm.,13(9):2996-3003(2016)。
在一些实施例中，抗原结合片段包含并非抗体或其抗原结合片段的肽或多肽。
4.生长因子
在一些实施例中，第一组分包含生长因子。在一些实施例中，生长因子包含成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子(NGF)、VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)和胰岛素样生长因子-I(IGF-I)。
5.半胱氨酸结肽
在一些实施例中，第一组分包含半胱氨酸结肽。在一些实施例中，半胱氨酸结肽包含与SEQ ID NO:92(半胱氨酸结肽序列)的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
半胱氨酸结肽可共价地连接至另一种分子以形成第一组分，包括上文第II.A.2节至上文第II.A.4节中所述的示例性第一组分中的任一者。在一些实施例中，第一组分包含半胱氨酸结肽，其共价地连接至抗VEGF抗原结合片段。
在一些实施例中，HABD(即，第二组分)共价地连接至第一组分的半胱氨酸结肽处。在一些实施例中，共价接头包含与SEQ ID NO:95的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，共价接头包含序列GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:95)。在一些实施例中，半胱氨酸结肽共价地连接至带有C末端His标签的VG1(SEQ ID NO:29)。在一些实施例中，半胱氨酸结肽共价地连接至具有Ig结构域缺失和C末端His标签的VG1(SEQ ID NO:32)。在一些实施例中，半胱氨酸结肽共价地连接带有N末端His标签的VG1。在一些实施例中，半胱氨酸结肽共价地连接至具有Ig结构域缺失和N末端His标签的VG1。
B.第二组分–透明质酸结合结构域(HABD)
在许多实施例中，第二组分包含或来源于HA结合蛋白(其包含HA结合结构域；HABD)。在一些实施例中，第二组分包含HABD。包含HABD的蛋白质的实例包括CD44、肿瘤坏死因子刺激基因-6(TSG6)、多功能蛋白聚糖、脑特异性连接蛋白(BRAL1)、淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)和聚集蛋白聚糖。
在一些实施例中，两种第二组分可不同或相同。例如，治疗分子可包含第二组分，该第二组分包含两个CD44结构域、两个TSG-6结构域、两个VG1结构域或前述结构域中的任意组合以形成一对两个不同的结构域。
眼睛是一种复杂的组织，其具有几个不同的隔室，包括角膜、房水、晶状体、玻璃体液、视网膜、视网膜色素上皮和脉络膜。这些隔室包括细胞外大分子诸如HA。
术语“透明质酸结合蛋白(hyaluronan-binding protein)”或“HA结合蛋白(HA-binding protein)”是指结合HA的蛋白质或蛋白质家族。通常，这些HA结合蛋白包含HABD。各种HA结合分子是本领域所熟知的，可用为第二组分(参见例如：Day等人,2002,JBio.Chem 277:4585；和Yang等人,1994,EMBO J 13:286-296)。示例性HA结合蛋白包括CD44、LYVE-1、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、Brevican、Neurocan、透明质酸结合蛋白1(HABP1；也称为C1qBP/C1qR和p32)、HAPLN1(也称为连接蛋白质和CRTL1)、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白质4(HAPLN4；也称为脑连接蛋白2)、Layilin、Stabilin-1、Stabilin-2、脑特异性连接蛋白(BRAL1)或肿瘤坏死因子刺激基因6(TSG-6)、RHA M、细菌HA合成酶和VI型胶原。
许多HA结合蛋白和肽片段含有共同的结构域，其长度约100个氨基酸，参与HA结合；该结构域被称为“连接结构域(LINK Domain)”(Yang等人,EMBO J 13:2,286-296(1994)和Mahoney等人,J Bio.Chem276:25,22764-22771(2001))。任何这些蛋白质都可用于本发明中。任何HA结合蛋白诸如上述示例性蛋白质的HABD都可包含于第二组分中以给予与HA结合的能力。优选地，第二组分包含CD44(CD44)结构域、脑特异性连接蛋白(BRAL1)结构域、肿瘤坏死因子刺激基因6(TSG-6)结构域、淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)结构域、透明质酸结合蛋白(HABP)结构域、聚集蛋白聚糖G1(AG1)结构域或多功能蛋白聚糖G1(VG1)结构域。用于眼睛中的示例性和合适的HA结合分子(包括肽标签)描述于WO 2014/99997和WO2015/19824中，其内容通过引用整体并入本文。其中所述的任何序列都可用于本发明中。
在一些实施例中，第二组分共价地连接至第一组分以便减少第一组分从眼睛中的清除，从而延长其眼内半衰期。第一组分可得益于更长的眼睛保留时间和/或更长的作用于眼睛疾病的时间。
此外，第二组分可非共价地结合至包含HA的第三组分以形成缀合物。在一些实施例中，缀合物中的各第二组分可结合至HA的单独分子。在一些实施例中，两种或多种第二组分可结合至相同HA分子。
在许多实施例中，HABD对HA的结合亲和力可处于几个范围内；结合亲和力可根据治疗活性剂的作用机制进行调节。例如，如果作用位置在玻璃体液中，则高结合亲和力可能有助于生物制剂保留在玻璃体液中。相反，如果作用位置在视网膜中，则较低的结合亲和力可能有助于生物制剂穿过玻璃体以到达视网膜。
在许多实施例中，HABD对HA的结合亲和力可使用包含表面等离子共振(SPR)在内的方法进行测量。不受理论的束缚，在一些实施例中，HABD对HA的结合亲和力(KD)范围包含10nM至10μM、5nM至10nM和100nM至5μM。
在许多实施例中，可观察HABD与HA的相互作用。在一些实施例中，使用包括荧光相关光谱(FCS)的方法观察相互作用。在FCS中，分子的扩散可通过监测溶液中的小体积部分的荧光强度来确定。荧光强度因分子的运动而产生波动，对这些波动的定量分析可得出分子的扩散时间。通过使用具有适当光谱特性的荧光染料，可确定生物基质中的扩散。在一些实施例中，FCS的观测值与SPR的测量值相关。
在一些实施例中，HABD包含相较于其来源蛋白质的野生型序列。在一些实施例中，HABD在其蛋白质序列中可包含相较于其来源蛋白质的一个或多个突变。在许多实施例中，这些突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代、添加、缺失和截短。
在一些实施例中，HABD包含单氨基酸取代或双氨基酸取代。在许多实例中，取代可包含保守突变，其中氨基酸取代将原始氨基酸改变为具有相似生化特性的不同氨基酸。在其他实例中，取代可包含非保守突变，其中氨基酸取代将原始氨基酸改变为具有不同生化特性的不同氨基酸。
在一些实施例中，HABD包含有助于HA结合的氨基酸。在一些实施例中，这些氨基酸可保守以维持HA结合亲和力。在一些实施例中，这些氨基酸可被取代以改变HA结合亲和力，具体取决于长效治疗所需的亲和力和所需的持续时间。
在一些实施例中，HABD包含有助于HABD和/或治疗分子的热稳定性的氨基酸。在一些实施例中，这些氨基酸可保留以维持热稳定性。在一些实施例中，这些氨基酸可被取代以改变热稳定性。
在一些实施例中，HABD包含相对于本文所公开的参照序列的一的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个突变。在一些实施例中，HABD包含1个至3个突变，其中这些1个至3个突变独立地包含单氨基酸取代、双氨基酸取代、添加、缺失和截短。在一些实施例中，HABD包含1个至5个突变，其中这些1个至5个突变独立地包含单氨基酸取代、双氨基酸取代、添加、缺失和截短。
在一些实施例中，第二组分包含或来源于CD44、TSG6或多功能蛋白聚糖。在一些实施例中，第二组分包含CD44结构域、TSG6结构域或多功能蛋白聚糖结构域。
1.CD44
在一些实施例中，第二组分来源于CD44(SEQ ID NO:1)。CD44受体包含连接结构域、GAG附着结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。描述了通过替代剪接处理的具有不同模块化组合物的几种同种型。在一些实施例中，第二组分来源于或包含CD44 HA受体结构域。在一些实施例中，第二组分来源于或包含SEQ ID NO:2。
2.肿瘤坏死因子刺激基因6(TSG6)
在一些实施例中，第二组分来源于TSG6。TSG-6，也称为TNFAIP6，由HA结合连接结构域接以CUB结构域组成。在一些实施例中，第二组分来源于或包含TSG6 HA结合连接结构域。在一些实施例中，第二组分来源于或包含SEQ ID NO:4。
3.多功能蛋白聚糖
在一些实施例中，第二组分来源于多功能蛋白聚糖。多功能蛋白聚糖包含以下结构域：VG1、GAG附着结构域和G3结构域(图8A)。VG1结构域(SEQ ID NO:29)包含Ig结构域、Link1和Link2(图8A)。在一些实施例中，第二组分包含Link1(SEQ ID NO:30)和/或Link2(SEQ ID NO:31)，其中Link1和/或Link2能够结合HA。
a)野生型VG1
在一些实施例中，HABD包含野生型(WT)VG1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示。在一些实施例中，HABD包含如Link1(SEQ ID NO:30)和/或Link2(SEQ ID NO:31)中所示的氨基酸序列。
b)突变VG1
在一些实施例中，HABD包含突变VG1。在许多实施例中，VG1突变相对于如SEQ IDNO:29(WT VG1)、32(VG1ΔIg)、60(WT VG1共有序列)或86(VG1ΔIg共有序列)所示的氨基酸序列。在一些实施例中，HABD包含与SEQ ID NO:29(WT VG1)、32(VG1ΔIg)、60(WT VG1共有序列)或86(VG1ΔIg共有序列)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施例中，HABD包含与SEQ ID NO:29(WT VG1)、32(VG1ΔIg)、60(WT VG1共有序列)或86(VG1ΔIg共有序列)至少95％相同的序列。
c)截短VG1
在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29(WT VG1)或60(WT VG1共有序列)包含截短突变。在一些实施例中，HABD包含从多功能蛋白聚糖的N末端上的1个至129个氨基酸的截短。在一些实施例中，HABD包含截短序列，其中不存在野生型多功能蛋白聚糖的Ig结构域。在一些实施例中，HABD包含与SEQ ID NO:32(VG1ΔIg)或SEQ ID NO:86(VG1ΔIg共有序列)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在一些实施例中，HABD包含与SEQ ID NO:32(VG1ΔIg)或SEQ ID NO:86(VG1ΔIg共有序列)至少95％相同的序列。在一些实施例中，HABD包含SEQ ID NO:32(VG1ΔIg)。
d)氨基酸取代
在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29包含以下氨基酸中的至少一者：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。在一些实施例中，HABD相对于SEQ IDNO:29包含以下氨基酸中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。
在一些实施例中，HABD包含序列，其中氨基酸可相对于野生型发生突变以提高或降低HA结合亲和力。在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的至少一个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29包含在以下位置中的2个、3个、4个、5个或6个的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少一者：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。在一些实施例中，HABD包含Y208A和H306A中的至少一者。
在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。在一些实施例中，HABD相对于SEQ ID NO:29包含以下突变中的至少2个、3个、4个、5个或6个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
在一些实施例中，HABD为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59。
4.脑特异性连接蛋白(BRAL1)
在一些实施例中，第二组分来源于BRAL1。BRAL1包含免疫球蛋白结构域、连接结构域模块1和连接结构域模块2。连接结构域模块1和2能够结合HA。在一些实施例中，第二组分包含来自BRAL1的连接结构域模块1和/或连接结构域模块2。
5.淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)
在一些实施例中，第二组分来源于LYVE-1。LYVE-1为CD44的同源物，其包含结合至HA的连接结构域。在一些实施例中，第二组分包含来自LYVE-1的连接结构域。
6.聚集蛋白聚糖
在一些实施例中，第二组分来源于聚集蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖包含三个球状结构域：G1结构域具有连接蛋白的结构模体并与HA相互作用；G2结构域与G1结构域同源并参与产物加工；G3结构域构成核心蛋白的羧基末端。在一些实施例中，第二组分包含来自聚集蛋白聚糖的G1结构域。
C.第三组分–透明质酸(HA)
在一些实施例中，治疗分子进一步包含一种或多种第三组分。在一些实施例中，第三组分包含HA。在一些实施例中，治疗分子(包含第一组分和第二组分)与HA预复合以形成缀合物。在一些实施例中，第三组分是分子量为5kDa至20kDa的HA。
在一些实施例中，治疗分子的第二组分非共价地结合至第三组分以形成缀合物。在一些实施例中，治疗分子的第二组分共价地结合至第三组分以形成缀合物。
优选地，共价地连接第一组分的第二组分以小于或等于10.0μM的KD结合至第三组分(即，透明质酸)。例如，第二组分可以小于或等于9.0μM、8.0μM、7.0μM、6.0μM、5.0μM、4.0μM、3.0μM、2.0μM、1.5μM、1.0μM或0.5μM的KD结合HA。
1.透明质酸(HA)
透明质酸(HA)是一种存在于细胞外基质和细胞表面的线性糖胺聚糖。HA含有重复的N-乙酰基葡糖胺(GlcNac)和葡萄糖醛酸(GlcUA)的双糖单元，它们通过交替的β1→3葡萄糖醛酸和β1→4葡糖胺(glucosaminidic)键连接，形成线性聚合物。HA进一步描述于以下文献中：Necas等人,2008,Veterinarni Medicina,53:397-411。糖胺聚糖普遍存在于所有脊椎动物的细胞外基质中，也存在于某些链球菌菌株的荚膜中。在功能上，HA分子对于维持组织中高度水合的细胞外基质很重要，其参与细胞粘着并支持细胞迁移。玻璃体液除水之外，主要由HA组成，其在保留眼睛中央部分的水分和结构方面表现优异。它有助于保持眼睛润滑并补充失去的任何水分。HA还通过与大量HA结合蛋白和细胞表面受体诸如CD44和淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)相互作用，表现出多种生物学功能。HA结合蛋白和HABD的实例在上文第II.B节中有所描述。
HA具有1000Da至10000000Da的宽分子量范围。组织中的天然高分子量HA在通过淋巴系统、淋巴结、肝脏和肾脏的代谢途径中降解为小分子。虽然已知HA在血浆中的半衰期为大约2.5分钟至5.5分钟，但是据报导，其在眼睛的玻璃体中的半衰期为大约70天。HA独特的物理化学性质和各种生物学功能使其在生物医学领域(诸如药物递送、关节炎治疗、眼科手术和组织工程)得到广泛应用。特别地，HA用于生物/药物通过各种递送途径的靶向特异性和长效递送已得到广泛研究。利用其粘弹性和粘膜粘附特性，HA已被开发为一种有效的局部眼科药物的递送载剂。
已表明，具有限定尺寸的HA适合于本发明。据此，HA可具有至少2、3、4、5、6、7、8或9kDa的分子量和/或至多60、50、40、30、25、20或15kDa的分子量。特别地，分子量的合适范围为3kDa至60kDa，特别地4kDa至30kDa，更特别地5kDa至20kDa。
在一些实施例中，优选地使用未经修饰的天然存在的HA。在这些实施例中，使用未经修饰的天然存在的HA减小了副作用。例如，将HABD与10kDa的HA预复合，可减少玻璃体液中的活体外沉淀，并减轻在猪和兔中观察到的眼内毒性。在其他实例中，在HABD为TSG-6或CD44的情况下，当TSG-6或CD44未与HA预复合时，观察到眼内毒性诸如炎症和视网膜。
在一些实施例中，HA为透明质酸盐，其包括但不限于透明质酸钾、透明质酸镁和透明质酸钙。
在一些实施例中，HA可具有较小的化学修饰。化学修饰可用于减少HA降解、增加或减少水溶性、改变HA扩散速率和/或HA粘度。已知本领域有两种对HA进行化学修饰的一般方法–(1)使用功能性化学试剂交联HA和(2)使用单功能试剂偶合HA。二乙烯基砜、双环氧化物、甲醛和双卤化物为用于交联HA的双功能试剂。经化学修饰的HA制剂包括但不限于甲基丙烯酸氨基乙酯HA、己二酸二酰肼接枝HA、二甲醚复合HA、HA-半胱氨酸乙酯、尿素交联HA和N-乙酰基半胱氨酸HA。特别受关注的是减少HA眼睛中的HA降解的修饰。
2.治疗分子与透明质酸(HA)预复合以形成缀合物
在一些实施例中，治疗分子与HA预复合以形成缀合物。治疗分子中包含的游离HABD在注射部位的初始浓度可能很高，导致不利影响，如下面的实例5中所述。在一些情况下，这些影响可能是由游离HABD在注射部位与IVT HA的接触引起。HABD与HA的预复合通过给予HABD时间从注射部位扩散到玻璃体的其余部分，减少了这些不利影响。当HABD从与预复合的HA相互作用转变为与IVT HA相互作用时，扩散时间减慢，并且玻璃体半衰期延长。因此，在一些实施例中，治疗分子为缀合物，包含该治疗分子，并且进一步包含一种或多种包含HA的第三组分。
在一些实施例中，缀合物包含治疗分子与HA之间的非共价相互作用。在一些实施例中，缀合物包含治疗分子与HA之间的共价相互作用。
在一些实施例中，缀合物可为经分离的缀合物，即，该缀合物不在待治疗的个体内。在一些方面中，将缀合物纯化至纯度高于95％或99％，该纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)来测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如：Flatman等人,J Chromatogr B 848:79-87(2007)。
D.融合蛋白
在一些实施例中，第一组分和第二组分为蛋白质，更优选地包含于融合蛋白中；该第一组分和第二组分经由共价接头连接。
融合蛋白是由两种或更多种原本分离的蛋白质或肽连接而成的蛋白质。该方法得到具有来源于原始、单独蛋白质中的每一者的功能特性的单一多肽。蛋白质可直接彼此融合。蛋白质也可经由接头融合，该接头可提高蛋白质彼此独立折叠并按预期表现的可能性。二聚体或多聚体融合蛋白可通过遗传工程通过与诱导蛋白质复合(诸如与抗体结构域)的肽结构域的原始蛋白质融合来生产。
在一些实施例中，第二组分直接结合至第一组分。这意味着第二组分直接跟在第一组分之后(反之亦然)，这些两种组分之间不存在其他化学元素(原子或基团)。在一些实施例中，第一组分的最后一个氨基酸紧邻第二组分的第一氨基酸。在一些实施例中，第二组分的最后一个氨基酸紧邻第一组分的第一氨基酸。
在一些实施例中，第二组分经由接头(特别地肽接头)间接地结合至第一组分。在一些实施例中，这意味着肽接头处于第一组分与第二组分之间。在一些实施例中，肽接头处于第一组分的最后一个氨基酸与第二组分的第一氨基酸之间。在一些实施例中，肽接头处于第二组分的最后一个氨基酸与第一组分的第一氨基酸之间。
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分共价地结合至第一组分的N末端和/或C末端。在一些实施例中，第一组分为抗体或抗原结合片段，并且这些一种或两种第二组分共价地结合至第一组分的C末端(直接结合或经由肽接头结合)。在融合蛋白为Fab-HABD的实施例中，HABD共价地结合至Fab的C末端。
1.肽接头
在许多实施例中，肽接头连接治疗活性剂(即第一组分)与HABD(即第二组分)。在一些实施例中，接头包含至少4个氨基酸。在一些实施例中，接头包含4个至25个氨基酸。在一些实施例中，接头包含5个至100个氨基酸。在一些实施例中，接头包含10个至50个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度不超过25个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度不超过50个氨基酸。
在一些实施例中，肽接头包含柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻蛋白质结构域可相对于彼此自由移动。因此，在一些实施例中，肽接头为甘氨酸-丝氨酸接头，即，由甘氨酸和丝氨酸残基模式所组成的肽接头。在一个实施例中，该肽接头为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，并且S＝丝氨酸。在这些实施例中，x＝3；n＝3、4、5或6；且m＝0、1、2或3。在其他实施例中，x＝4；n＝2、3、4或5；且m＝0、1、2或3。在一些实施例中，x＝4且n＝2或3。在一些实施例中，x＝4且n＝2。
在一些实施例中，肽接头由GGGGS(SEQ ID NO:27)或其多聚体组成，更尤其由(GGGGS)3(SEQ ID NO:28)组成。
在一些实施例中，肽接头包含(GS)n，其中G为甘氨酸，并且S为丝氨酸。在这些实施例中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，n＝10.在一些实施例中，接头为SEQID NO:95。
E.治疗分子和缀合物的某些实施例
1.VEGF
在一些实施例中，治疗分子包含(1)第一组分，其包含抗VEGF抗体、抗体片段、抗原结合片段或Fab；(2)一种或两种第二组分，其中第二组分包含CD44 HA受体结构域、TSG6结构域和/或VG1结构域。
在一些实施例中，缀合物包含(1)第一组分，其包含抗VEGF抗体、抗原结合片段、抗体片段或Fab；(2)一种或两种第二组分；以及(3)分子量范围为5kDa至20kDa的HA。
a)G6.31
在一些实施例中，第一组分为包含G6.31抗VEGF Fab的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:17中的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:18中的VL结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ IDNO:105所示的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:106所示的VL结构域的抗体。
b)PigFab
在一些实施例中，第一组分为包含PigFab抗VEGF Fab的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:66中的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:65中的VL结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ IDNO:97所示的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:98所示的VL结构域的抗体。
c)雷珠单抗
在一些实施例中，第一组分为包含雷珠单抗的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:77中的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:76中的VL结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:114所示的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:115所示的VL结构域的抗体。
d)CD44
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含CD44 HA受体结构域。在一些实施例中，第二组分包含SEQ ID NO:2。
e)TSG6
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含TSG6结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含SEQ ID NO:4。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:20。
f)VG1
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含VG1结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含以下SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或87中的一者或两者。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:76和/或SEQ ID NO:77。
g)半胱氨酸结肽(CKP)
在一些实施例中，第一组分在包含抗VEGF抗原结合片段之外，任选进一步包含半胱氨酸结肽(CKP)。在一些实施例中，CKP与SEQ ID NO:92具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施例中，治疗分子与SEQ ID NO:93具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，抗VEGF抗原结合片段与SEQ ID NO:94具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
在一些实施例中，该治疗分子包含第一组分，该第一组分包含抗VEGF抗原结合片段，并且半胱氨酸结肽可进一步包含第二组分，该第二组分包含如上文第II.B节所述的HABD。
在一些实施例中，缀合物包含(1)第一组分，其包含抗VEGF抗原结合片段，(2)一种或两种第二组分，其包含HABD，以及(3)分子量范围为5kDa至20kDa的HA。
2.NVS24
在一些实施例中，治疗分子包含(1)第一组分，其包含抗VEGF抗体NVS24，以及(2)一种第二组分，该第二组分包含TSG6(Lava12)结构域。
在一些实施例中，第一组分包含NVS24抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:21中的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ IDNO:22中的VL结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:109所示的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:110所示的VL结构域的抗体。
a)TSG6(Lava12)
在一些实施例中，第二组分包含TSG6(Lava12)结构域。在一些实施例中，第二组分包含SEQ ID NO:113。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:21和/或SEQ ID NO:22。
3.抗VEGF和抗PDGF双靶向抗体(抗VP-dutaFab；抗VPDF)
在一些实施例中，治疗分子包含(1)第一组分，其能够结合VEGF和PDGF(诸如双特异性抗体或双靶向抗体，dutaFab)，如上文II.A.1.h)节所述；以及(2)一种或两种第二组分，其包含CD44 HA受体结构域、TSG6结构域和/或VG1结构域。
在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:5中的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:6中的VL结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:99所示的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:100所示的VL结构域的抗体。
a)CD44
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含CD44 HA受体结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含SEQ ID NO:2。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8。
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含CD44-ko结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含如SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:26所示的CD44-ko结构域。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:26。
b)TSG6(Lava12)
在一些实施例中，第二组分包含TSG6(Lava12)结构域。在一些实施例中，第二组分包含SEQ ID NO:113。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:23和/或SEQ ID NO:24。
c)VG1
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含VG1结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含以下SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或87中的一者或两者。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72和/或SEQ ID NO:73。
4.RabFab
在一些实施例中，治疗分子包含(1)第一组分，其包含RabFab抗体(如上文第II.A.3节所述)；以及(2)一种或两种第二组分，其包含TSG6结构域和/或VG1结构域。
在一些实施例中，RabFab抗体包含RabFab VH和VL结构域。在一些实施例中，RabFab抗体包含：VH结构域，其包含于SEQ ID NO:13中；以及VL结构域，其包含于SEQ IDNO:14中。在一些实施例中，RabFab抗体包含SEQ ID NO:107所示的VH结构域。在一些实施例中，RabFab抗体包含SEQ ID NO:108所示的VL结构域。
a)TSG6
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含TSG6结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含SEQ ID NO:4。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16。
b)VG1
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含VG1结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含以下SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或87中的一者或两者。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:64。
5.20D12v2.3
在一些实施例中，第一组分为包含抗补体因子D抗体Fab(20D12v2.3)的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:75中的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:74中的VL结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:111所示的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ IDNO:112所示的VL结构域的抗体。
a)VG1
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含VG1结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含以下SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或87中的一者或两者。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:74和/或SEQ ID NO:75。
6.HtrA1
在一些实施例中，第一组分为包含能够结合人HtrA1的抗体或抗体片段的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:118中的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为具有包含于SEQ ID NO:119中的VL结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:116所示的VH结构域的抗体。在一些实施例中，第一组分为包含如SEQ ID NO:117所示的VL结构域的抗体。
a)VG1
在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含VG1结构域。在一些实施例中，这些一种或两种第二组分包含以下SEQ ID NO:29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或87中的一者或两者。
在一些实施例中，治疗分子包含SEQ ID NO:118和/或SEQ ID NO:119。
III.眼睛疾病的治疗
在眼睛疾病的治疗中使用材料和方法。眼睛疾病的特征可以为经改变或不受调控的新血管扩增和/或侵入眼部组织诸如视网膜或角膜的结构内。眼睛疾病的特征可以为视网膜组织(光受器和下方视网膜色素上皮细胞(RPE)和脉络膜毛细管)的萎缩。非限制性眼睛疾病包括例如年龄相关性黄斑变性(AMD)(例如，湿性AMD、干性AMD、中期AMD、晚期AMD、和地图状萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)(例如，局灶性、非中心性DME和弥漫性、涉及中心的DME)、视网膜变性、糖尿病性视网膜变性(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高海拔DR)、其他与缺血相关的视网膜变性、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如中心(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如近视CNV)、角膜血管新生、与角膜血管新生相关的疾病、视网膜血管新生、与视网膜/脉络膜血管新生相关的疾病、中心性浆液视网膜变性(CSR)、病理性近视、von Hippel-Lindau、眼组织胞浆病、FEVR、Coats’病、Norrie病、与骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征(OPPG)相关的视网膜异常、结膜下出血、红肿、眼血管新生疾病、血管新生性青光眼、色素性视网膜炎(RP)、高血压性视网膜变性、视网膜血管瘤增生、黄斑部毛细血管扩张、虹膜血管新生、眼内血管新生、视网膜变性、黄斑部囊样水肿(CME)、管脉炎、视乳头水肿、视网膜炎，包括但不限于CMV视网膜炎、眼黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、结膜炎(例如，感染性结膜炎和非感染性(例如，过敏性)结膜炎)、莱伯先天性黑蒙症(也称为Leber氏先天性黑蒙症或LCA)、葡萄膜炎(包括感染性和非感染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如多灶性脉络膜炎)、眼组织浆菌症、睑缘炎、干眼症、眼外伤、
Figure BDA0004179509630000761
病和其他眼科疾病，其中，该疾病或病症与血管新生、血管渗漏和/或视网膜水肿或视网膜萎缩有关。其他示例性眼睛疾病包括由纤维血管或纤维组织异常增生所引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜变性。
与角膜新生血管形成(虹膜新生血管形成、角部新生血管形成或皮肤发红)相关的示例性疾病包括但不限于，流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、角膜接触镜过度磨损、特应性角膜炎、上边缘性角膜炎、翼状干燥性角膜炎、干燥综合征(sjogrens)、酒糟鼻、小水疱病(phlyctenulosis)、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、卡波西肉瘤、蚕食性角膜溃疡、特里昂边缘性角膜变性(Terrien's marginal degeneration)、边缘性角质层分离、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性动脉炎、创伤、韦格纳结节病(Wegeners sarcoidosis)、巩膜炎、史蒂芬约翰逊综合征(Steven'sJohnson disease)、类天疱疮放射状角膜切开术和角膜移植排斥。
与脉络膜新血管形成和视网膜血管系缺陷(包括增加的血管渗漏、动脉瘤和毛细血管滴落)相关的示例性眼睛疾病包括但不限于，糖尿病性视网膜变性、黄斑变性、镰状细胞贫血、结节病、梅毒、弹性假黄瘤、Paget氏病、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜变性、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、伊尔斯病(Eales disease)、白塞氏病(Bechets disease)、引起视网膜炎或脉络膜炎造成的感染(例如，多灶性脉络膜)、假定眼组织胞浆菌病、贝斯特氏病(Bests disease)(卵黄状黄斑变性)、近视、视窝(optic pits)、斯塔加特氏病(Stargartsdisease)，睫状体扁平部炎、慢性视网膜脱离、高粘滞综合征、弓形体病、创伤和激光后并发症。
与视网膜组织(光感受器和下方RPE)相关的示例性眼睛疾病包括但不限于，萎缩性或非渗出性AMD(例如，地图状萎缩或晚期干性AMD)、黄斑萎缩(例如，与新血管形成相关的萎缩和/或地图状萎缩)、糖尿病性视网膜变性、斯特格氏病、Skorsby眼底萎缩症、视网膜劈裂症(视网膜神经感觉层的异常分裂)和色素性视网膜炎。
在根据(或如应用于)上述任何实施例的某些实施例中，眼睛疾病为选自由以下项所组成的组的眼内新血管疾病：增生性视网膜变性、脉络膜新血管形成(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性和其他局部缺血相关性视网膜变性、糖尿病性黄斑水肿,、病理性近视、逢希伯-林道病、眼睛组织胞浆菌病、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括CRVO和BRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成和早产儿视网膜变性(ROP)。在本发明的一个优选的实施例中，眼睛疾病为年龄相关性黄斑变性(AMD)，特别地湿性AMD或新生血管性AMD；糖尿病性黄斑水肿(DME)；糖尿病性视网膜变性(DR)，特别地增殖性DR或非增殖性DR；视网膜静脉阻塞(RVO)；或地图状萎缩(GA)。
本文所公开的治疗分子、缀合物和组合物可用为治疗哺乳动物受试者中眼睛疾病的药物。哺乳动物的实例包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人类灵长类动物，例如猴)、兔以和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选的是，受试者为人。在一些实施例中，治疗分子、缀合物和组合物的治疗靶点为人眼中的靶标。
IV.治疗方法
本文提供治疗眼睛疾病的方法，该方法包括将治疗分子、缀合物或组合物递送至患者的组织。在许多实施例中，这些方法包括施用治疗分子，使得该治疗分子可向靶组织提供治疗活性剂的长效递送。在许多实施例中，靶组织在眼睛中。
A.施用方法
治疗分子、缀合物或组合物可以任何有效、方便的方式施用，包括例如通过局部、口服、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、气管内或皮内途径等施用。优选的是，组合物适合于施用眼睛，更具体而言，组合物可适合于IVT施用。因此，在一优选的实施例中，组合物配制用于眼内递送，特别地用于IVT注射。在治疗中或作为预防剂时，治疗分子、缀合物或组合物可作为可注射的组合物(例如作为无菌水分散体)施用于个体。
不受该理论的束缚，认为注射缀合物可促进HA在与IVT HA相互作用之前从预复合的HABD扩散。由于解离缓慢，因此玻璃体中游离HABD的浓度较低。与未与HA预复合的治疗分子相比，玻璃体内较低浓度的游离HABD可能对眼睛的危害更小。
在一些实施例中，施用步骤是单次注射。在一些实施例中，施用步骤包含多于一次单次注射。
B.组合物
本文提供用为药物、特别地用于治疗眼睛疾病的组合物。组合物可被称为药物组合物，因为它们旨在用于制药领域或用为药物，是指以下制剂，其形式为允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含对组合物将施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。
在一些实施例中，组合物包含治疗分子。在一些实施例中，组合物包含缀合物。
在一些实施例中，组合物任选包含药用赋形剂、稀释剂或载体，诸如缓冲物质、稳定剂、防腐剂或其他成分，尤其是与药物组合物相关的通常所知的成分。
一般而言，任选选用的成分或附加成分的性质将取决于组合物的特定形式以和所采用的施用方式。药用载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。这些载体可包括但不限于生理兼容性盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等以及它们的组合。组合物可另外包含一种或多种其他治疗剂，特别地包含那些适合治疗或预防例如与眼睛疾病诸如视网膜血管疾病相关的疾病或病症的那些。制剂应适应施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括用为载体的医药上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。除生物学中性载剂以外，待施用的药物组合物可含有少量无毒的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。
组合物可包含稳定剂。术语“稳定剂(stabilizer)”是指保护组合物免受不利条件(诸如在加热或冷冻期间发生的那些条件)影响和/或延长本发明的缀合物在某种条件或状态下的稳定性或保存期限的物质。稳定剂的实例包括但不限于：糖类，诸如蔗糖、乳糖和甘露糖；糖醇，诸如甘露醇；氨基酸，诸如甘氨酸或谷氨酸；和蛋白质，诸如人血清白蛋白或明胶。
C.有效剂量
通常，在本公开的药物组合物中采用治疗有效量或有效剂量的治疗分子或缀合物。通过本领域技术人员已知的常规方法将治疗分子和缀合物配制为药用剂型。调整给药方案以提供最佳所需的反应(例如，治疗反应)。例如，可施用单次推注，可随时间的推移施用若干分开的剂量，或者可根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物尤其有利，其便于施用并确保剂量的均匀性。如本文所使用的剂量单位形式是指适合用为待治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的活性化合物，其用量经计算可产生与所需的药物载体相关的所需治疗效果。
可改变药物组合物中活性成分(即治疗分子和缀合物)的实际剂量水平，以获得可有效实现特定患者所需的治疗反应、组合物以及对患者无毒的施用模式的活性成分的量。所选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，这些因素包括：所采用的本发明的特定组合物的活性；施用途径；施用时间；所采用的特定化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所采用的特定组合物结合使用的其他药物、化合物和/或材料；接受治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病、一般健康状况和既往病史；以及类似因素。可选择和/或调整剂量水平以实现使用本文所述的一种或多种眼部/视觉评估所确定的治疗反应。医师或兽医可从剂量低于实现预期治疗效果所需的水平开始施用药物组合物中所采用的缀合物的治疗分子，并逐渐增加剂量，直至实现所需的效果。一般而言，本文所述的用于治疗眼睛疾病的组合物的有效剂量取决于许多不同的因素，这些因素包括施用方式、靶标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性还是治疗性的。
需要滴定治疗剂量以优化安全性和有效性。使用本发明的缀合物进行IVT施用的剂量可在每次注射0.1mg/眼至10mg/眼的范围内。每只眼睛的单一剂量可通过对每只眼睛进行1次或多次注射来实施。例如，20mg/眼的单一剂量可分2次递送，每次注射10mg，使总剂量为20mg。每次注射的体积可在10微升与50微升之间，而每个剂量的体积可在10微升与100微升之间。考虑经美国食品药品管理局(FDA)批准的适用于Lucentis的剂量和方案。适用于抗VEGF抗体或抗原结合片段的其他剂量和方案描述于US 2012/0014958中，并通过引用将其全文并入本文。
组合物可多次施用。单一剂量之间的施用间隔可为每周、每月或每年。间隔也可为不规则的，根据患者所需的再治疗确定，基于例如视觉敏锐度或黄斑水肿。此外，替代给药间隔可由医师确定并每月施用一次或在必要时施用以发挥效用。有效性基于眼睛的情况以及眼睛疾病的种类和严重程度，例如，特征在于病变性生长、抗VEGF治疗率、通过光学相干断层扫描(OCT)所测定的视网膜厚度和视觉敏锐度。剂量和频率可根据本发明的缀合物在患者体内的半衰期和治疗靶点(例如，VEGF、C5、EPO、因子P等)的水平而变化。然而，在本发明的一个优选的实施例中，组合物至多每三个月施用一次，特别地至多每四个月施用一次，更特别地每六个月施用一次。这反映了缀合物中第一组分相较于相应的未结合(游离)第一组分的延长的半衰期(并因此延长了有效性的持续时间)。据此，缀合物中第一组分的消除半衰期相较于未结合的第一组分延长了至少3倍、至少4倍或至少5倍。缀合物中第一组分的消除半衰期相较于游离的第一组分的相对增加可通过IVT注射施用这些分子并使用本领域已知的分析方法测量不同时间点的剩余浓度来确定，这些分析方法为例如ELISA、质谱法、蛋白质印迹、放射免疫测定或荧光标记。也可测量血液浓度，并将其用于计算从眼睛中清除的速率(Xu L等人,invest Ophthalmol Vis ScL,54(3):1816-24(2013))。一般而言，作为缀合物的一部分的分子(例如，抗体或片段)表现出长于游离分子的眼内半衰期。眼睛中的缀合物的半衰期相较于游离的第一组分可增加25％(例如，从5天增加至6.25天)，其半衰期相较于游离的第一组分增加50％(例如，从5天增加至7.5天)，其半衰期相较于游离的第一组分增加75％(例如，从5天增加至8.75天)，其半衰期相较于游离的第一组分增加100％(例如，从5天增加至10天)，在某些方面中，预期缀合物的半衰期相较于游离的第一组分可增加100％以上(例如，从5天增加至15天、20天或30天；从1周增加至3周、4周或更长时间；等等)。
D.组合疗法
组合疗法涵盖联合施用(其中两种或多种治疗剂包含于同一或单独的制剂中)以及单独施用，在单独施用的情况下，治疗分子和缀合物的施用可在施用另外的一种或多种治疗剂之前、同时和/或之后发生。在某些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物与另外化合物同时施用。在某些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物在另外化合物之前或之后施用。在一些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物的施用与另外治疗剂的施用彼此在约一个、两个、三个、四个或五个月内或者在约一周、两周或三周内或者在约一天、两天、三天、四天、五天或六天内。
任何合适的治疗眼睛疾病的治疗剂都可用为该另外化合物，特别地用为治疗眼睛疾病的药剂。眼睛疾病如上文第III节所述。此外，上文第II.A节所述的作为治疗分子的组分的任何分子也可用为组合疗法中所使用的另外化合物。
在一些实施例中，另外化合物为上文第II.A.1.h)节和Carmeliet等人在Nature407:249-257(2000)中所述的抗血管生成剂。其他合适的抗血管生成剂包括皮质类固醇、血管生成抑制性类固醇、醋酸阿奈可他、血管抑素、内皮抑素、酪氨酸激酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、源自基质细胞的因子(SDF-1)拮抗剂(例如，抗SDF-1抗体)、色素上皮衍生因子(PEDF)、γ-分泌酶δ样配体4、整合素拮抗剂、缺氧诱导因子(HIF)-1α拮抗剂、蛋白质激酶CK2拮抗剂、抑制位于新血管形成位点处的干细胞(例如，内皮祖细胞)的药物(例如，抗血管内皮钙粘蛋白(CD-144)抗体和/或抗SDF-1抗体)及其组合。
治疗分子、缀合物或组合物还可与治疗或手术方法联合施用以用于治疗眼睛疾病(例如AMD、DME、DR、RVO或GA)，该治疗或手术方法包括例如：激光凝固法(例如，全视网膜光凝固法(PRP))、隐结激光作用、黄斑裂孔手术、黄斑移位手术、可植入微型望远镜、PHI-运动血管造影(也称为微激光治疗和分支血管治疗(feeder vessel treatment))、光子束治疗、微刺激治疗、视网膜脱离和玻璃体手术、巩膜屈曲(scleral buckle)、黄斑下手术、经瞳孔热疗、光系统I治疗、RNA干扰(RNAi)的使用、体外流变过程(也称为膜过滤和流变治疗)、微芯片植入、干细胞治疗、基因替换治疗、核糖核酸酵素基因治疗(包括用于缺氧反应元件的基因治疗，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；以及PDEF基因治疗，GenVec)、光受器/视网膜细胞移植(包括可移植视网膜上皮细胞，Diacrin,Inc.；视网膜细胞移植物，例如，Astellas Pharma US,Inc.,ReNeuron,CHA Biotech)、针灸术及其组合。
治疗分子、缀合物或组合物也可与视觉周期调节剂(例如，依米司他盐酸盐(emixustat hydrochloride))；角鲨胺(例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；维生素和矿物质补充剂(例如，那些公开于Age-Related Eye Disease Study 1(AREDS1；锌和/或抗氧化剂)和Study 2(AREDS2；锌、抗氧化剂、叶黄素、玉米黄素和/或ω-3脂肪酸))；基于细胞的治疗，例如，NT-501(Renexus)；PH-05206388(Pfizer)、huCNS-SC细胞移植(StemCells)、CNTO-2476(脐带干细胞系；Janssen)、OpRegen(RPE细胞的悬浮液；Cell CureNeurosciences)或MA09-hRPE细胞移植(Ocata Therapeutics)组合施用。
在一些实施例中，该另外治疗剂为AMD治疗剂。例如，抗PDGFR抗体REGN2176-3可与阿柏西普(aflibercept)
Figure BDA0004179509630000831
共同调配。在一些情况下，这些共制剂可与治疗分子、缀合物或组合物组合施用。
在一些实施例中，该另外化合物包含表达内皮抑素和血管抑制素的慢病毒载体(例如，RetinoStat)。
在某些实施例中，该另外化合物与选自由以下项所组成的组的第二生物分子结合：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；β细胞素(betacellulin)；apelin/APJ；红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；以及在基因上与AMD风险关联的蛋白质，诸如补体途径成分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；以及TNFRSF10A。在某些实施例中，该另外化合物为抗体或其抗原结合片段，包括上文第II.A.3节所述的抗体和抗原结合片段的实例。
E.靶组织
在一些实施例中，靶组织包含眼睛、脑、骨骼和/或肿瘤。在一些实施例中，组织包含视网膜。在一些实施例中，将治疗分子、缀合物或组合物注射到眼睛、脑、骨骼或肿瘤中。在一些实施例中，将治疗分子、缀合物或组合物注射到玻璃体液、脑脊液或滑液中。在一些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物经皮下注射。
在一些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物相较于未经修饰的治疗活性剂提供了改善的兼容性、更长的停留时间和/或相对于注射部位的更长的半衰期。在一些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物相较于未经修饰的治疗活性剂可进一步提供在靶组织中的更长的药理作用持续时间。
在一些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物相较于未经修饰的治疗活性剂提供了改善的玻璃体兼容性、更长的玻璃体停留时间、更长的玻璃体半衰期和/或改善的药理作用持续时间。在一些实施例中，治疗分子、缀合物或组合物相较于未经修饰的治疗活性剂提供了改善的兼容性、更长的停留时间、更长的半衰期和/或在脑中的更长的药理作用持续时间。
F.将治疗分子结合至HA
在一些实施例中，方法包括在施用步骤之前将治疗分子结合至HA(即，将治疗分子与HA预复合以形成缀合物)。在这些实施例中，预复合允许治疗分子结合至HA。在这些实施例的一些中，将HA结合至治疗分子的HABD。HABD的实例在上文第II.B节中有所描述。
在一些实施例中，方法包括将包含治疗分子的第一溶液与包含HA的第二溶液混合。在一些实施例中，该混合包含容器。容器的实例包括小瓶、单室注射器和两室注射器。在一些实施例中，混合产生结合至HA的治疗分子，其准备用于施用受试者。
在一些实施例中，HA的大小范围为400Da至200kDa。在一些实施例中，HA为至少5kDa。在一些实施例中，HA为10kDa。在一些实施例中，HA大小/含量允许相对于HA结合位点的摩尔过量的HA存在于结合或预复合混合物中。在一些实施例中，HA大小/含量为HABD提供摩尔过量的结合当量。在一些实施例中，HA大小/数量允许HA与治疗分子的比率在1.5:1至1:1的范围内。
实例
以下为本发明的方法和组合物的实例。应当理解，鉴于上文给出的一般描述，可以实施各种其他实施例。
以下实例讨论了包含Fab片段或肽和透明质酸结合结构域的融合蛋白，即Fab-HABD。实例1至7涉及CD44和/或TSG6 HABD。实例8至18涉及VG1 HABD。
实例1.生成Fab-透明质酸结合结构域融合蛋白(Fab-HABD)并与HA复合
生成Fab片段与透明质酸结合结构域的融合蛋白(下文称为Fab-HABD)(表2)。通过经含Gly-Ser的接头序列将HABD重组融合至Fab片段的重链的C末端，形成Fab-HABD(在本文中称为“1x版”)。在一些情况下，将另外的HABD融合至Fab片段的轻链中的C末端(在本文中称为“2x版”)。
使用特异性结合至VEGF和PDGF(称为“VPDF”)、地高辛配基(称为“Dig”)和VEGF(克隆“G6.31”)的Fab片段生成Fab-HABD。
HABD来源于CD44(SEQ ID NO:2)或TSG6(SEQ ID NO:4)。
将Dig抗体与一个或两个CD44 HA受体结构域共价地连接，并用为非结合对照分子(SEQ ID NO：9至12)。
Figure BDA0004179509630000851
A.材料与方法
1.蛋白质表达
通过使用标准分子生物学技术进行限制性选殖或基因合成来生成各种Fab-HABD的表达质粒。针对每条多肽链生成单独的表达载体。在HEK293细胞(ThermoFisher)中进行表达，并以1:1的比率混合表达质体。
在一些情况下，TSG6在大肠杆菌中表达。
在一些情况下，RabFab-1xTSG6和RabFab-2xTSG6由稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞分泌产生。
2.蛋白质纯化
通过在4000rpm、4℃下离心20分钟来收集上清液。此后，无细胞上清液通过0.22μm瓶顶过滤器过滤并储存在冰箱(-20℃)中。
通过亲和层析法，使用抗Ckappa和抗CH1树脂以及尺寸排阻色谱法(SEC)从细胞培养上清液中纯化Fab-HABD。
简言之，在经1x PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的KappaSelect树脂(GE Healthcare)上捕获经无菌过滤的细胞培养上清液，用平衡缓冲剂洗涤，并用100mM柠檬酸钠(pH 2.8)进行洗脱。合并洗脱的抗体级分并将pH调节至7.5。然后在经1x PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH7.4)平衡的CaptureSelect IgG-CH1树脂(Life Technologies)上捕获蛋白质，用洗脱缓冲剂洗涤，并用100mM柠檬酸钠(pH 2.8)进行洗脱。在Nanodrop 800分光光度计(ThermoScientific)上在280nm下测定蛋白质样品的浓度。
分析型SEC经由HiLoad 16/60Superdex 200制备级柱(GE Healthcare)使用20mM组氨酸、140mM NaCl(pH 6.0)缓冲剂在1.5mL/min的流速下进行。
将尺寸排阻色谱法所得到的含抗体的合并级分于-80℃下冷冻并储存以备进一步使用。
在一些情况下，TSG6从大肠杆菌中纯化得出。简言之，使用由7M盐酸胍、50mMTris-HCl、100mM四硫磺酸钠和20mM亚硫酸钠组成的缓冲剂提取大肠杆菌细胞。使用
Figure BDA0004179509630000861
均质器均质化、离心并过滤上清液后，在经6M盐酸胍、25mM Tris-HCl(pH 8.6)平衡的Ni-NTA柱(GE Healthcare)上捕获带有His标签的蛋白质。将柱用25mM Tris-HCl(pH8.6)、0.1％Triton X-114洗涤，并用含有250mM咪唑的缓冲剂进行洗脱。将从柱上洗脱的TSG6通过以下方法再折叠：将其稀释至1.5mg/mL，然后在4℃的温度下用0.5M盐酸胍、0.5ML-精氨酸、1mM还原型谷胱甘肽(GSH)和1mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)的溶液进行透析过夜。在将缓冲剂交换为25mM乙酸钠(pH 5.0)后，通过SP-SepharoseTM(GE Healthcare)上的阳离子交换色谱纯化再折叠的材料。
在一些情况下，RabFab-1xTSG6和RabFab-2xTSG6由稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞分泌并从细胞培养基中纯化。这些蛋白质无需再折叠。RabFab-1xTSG6具有经由gly-gly-gly-gly-ser接头融合至TSG的该Fab；HABD在HC的C末端。RabFab-2xTSG6具有经由gly-gly-gly-gly-ser接头融合至TSG6的该Fab；一个HABD在HC的C末端，而另一个则在LC的C末端。两种蛋白质在重链的C末端都有His标签，其用于纯化。这些Fab-HABD使用3个柱层析步骤从CHO上清液中纯化得到，这些步骤包括：(1)在抗原亲和柱上捕获，如Shatz,W.等人,Mol.Pharm.,13(9):2996-3003(2016)中所述，(2)在Nickel-NTA柱上分离带有His标签的材料，然后(3)在SP-Sepharose上进行阳离子交换层析。
3.与透明质酸(HA)与复合
将Fab-HABD与10kDa透明质酸钠(Lifecore,Biomedical)以1:1(w/w)的比例混合，以形成Fab-HABD-HA缀合物(下文称为Fab-HABD-HAs)。混合后，将缀合物浓缩，并用AmiconUltra 10kDa截留浓缩器(Millipore)重新缓冲。最终制剂为20mM组氨酸pH 6.0、260mM蔗糖、140mM NaCl、0.02％ Tween 20。最后，将缀合物用0.22μm过滤器(Ultrafree-MC,Centrifugal Units 0.22μm,GV Durapore)过滤。通过相较于相应的Fab-HABD在SEC中向更短的保留时间偏移来监测蛋白质-HA缀合物的形成(见图1)。
实例2.Fab-HABD的分子特性
实例2.1.与HA的相互作用
A.材料与方法
检查Fab-HABD的HABD与HA结合的能力。使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)通过SPR测试Fab-CD44和Fab-TSG6 Fab-HABD与HA的结合(表3)。简言之，将Fab-CD44 Fab-HABD在80秒或120秒内注射到由HA包被的芯片(SCBS HY,Xantect Bioanalytics GmbH,Germany)上，其浓度范围各自为3.7nM至300nM。在一些实验中，通过将生物素-HA(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri U.S.)间接偶合到涂布有链霉亲和素(GE Healthcare)的S系列感测芯片SA上来制备经HA涂布的芯片。监测解离相600秒。随后，通过注入10mM甘氨酸(pH1.5)并持续60秒或注入3M MgCl2并持续30秒来再生表面。通过扣除由缓冲剂注射所获得的反应，以校正本体折射率差。所有实验都在25℃下使用PBS-T(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl,2.7mM KCl pH 7.4,0.05％ Tween-20)进行。使用BIAevaluation软件，将得出的曲线拟合至1:1Langmuir结合模型。所有实验都在25℃下使用PBS-T(10mM Na2HPO4,1mMKH2PO4,137mM NaCl,2.7mM KCl pH 7.4,0.05％ Tween-20)进行。
此外，通过等温滴定热测量定术(ITC)测试VDPF-2xCD44与HA的相互作用。简言之，将Fab-CD44融合物用PBS(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl,2.7mM KCl pH 7.4)透析。透析后，利用剩余的缓冲剂量溶解HA，因此所有分子都处于完全相同的缓冲剂条件下，以避免任何与缓冲剂相关的错配。将HA分子分别以10μM(10kDa HA)或2μM(50kDa HA)的浓度加载至样品池中。向参照池中加载去离子水。用浓度为150μM的Fab-CD44融合蛋白填充注射器。滴定实验在25℃下进行。使用Origin 7.0(OriginLab Corporation)中的一组位点模型计算亲和常数K以及化学计量比N。
类似地，使用ITC测量TSG6与10kDa HA的相互作用(表4)，不同之处在于，在这些实验中，将TSG6(20μM)置于量热仪池中并用注射器中的HA(50μM)进行滴定。如上所述，制备含有PBS的溶液，并且测量温度为25℃或37℃。这些测量在Auto PEAQ ITC仪器(MalvernInstruments)上进行。数据分析如前一段落所述，不同之处在于N固定为1.0，并且HA浓度和亲和常数K为可变参数。
B.结果
通过SPR所测得的Fab-CD44s和Fab-TSG6s与HA结合的KD如表3所示。
Figure BDA0004179509630000881
Figure BDA0004179509630000891
相互作用的强度由HABD序列以及交互的结合性决定(即，2x版经由密切结合至HA而表现出更高的功能亲和力)。
ITC分析(表4)得出如下所示的HA亲和力，计算得出其结合位点浓度为400-745μM，表明估计化学计量比为每条10kDa HA链对应于8-15个TSG6分子。使用池中50μM VPDF-2xCD44和注射器中150μM 10kDa HA的类似实验，得到KD为25μM，并且表观化学计量比为每条10kDa HA链对应于4.5个VPDF-2xCD44。CD44较弱的HA结合亲和力要求在ITC实验中使用更高的浓度。由2xCD44融合物的二价HA结合性质以及CD44相较于TSG6的更高的分子量可以预期，10kDa的结合化学计量比对于1xTSG6相较于2xCD44大2-3倍。相互作用的强度由HABD序列以及交互的结合性决定(即，2x版经由密切结合至HA而表现出更高的功能亲和力)。
Figure BDA0004179509630000892
在相互作用的化学计量比方面，发现平均每个10kDa HA分子可结合1.5个VPDF-2xCD44，而每个50kDa HA分子可结合5个VPDF-2xCD44。
根据SPR测量结果，VPDF-2xCD44能够同时结合VEGF和PDGF配体。对VEGF和PDGF与VPDF-2xCD44的结合与它们与未经修饰的VPDF的结合进行比较。简言之，使用标准偶合化学将PDGF偶合至S系列传感器芯片CM5(GE Healthcare)上，得到约4000共振单位(RU)的表面密度。注入浓度分别为3μg/mL的VPDF-2xCD44融合物以及未经修饰的VPDF对照后，注入浓度为5μg/mL的VEGF，以证明Fab同时结合至配体PDGF和VEGF。随后，通过注入10mM甘氨酸pH2.0并持续60秒来再生表面。SPR测量结果确认HABD与VPDF Fab片段重链的C末端的融合不干扰配体与靶蛋白的相互作用。
实例2.2.Fab-HABD的稳定性
将Fab-HABD用于眼睛中的长效递送，需要蛋白质在长达数月的范围内在体温下保持稳定。其先决条件是Fab-HABD的热稳定性高于37℃。
A.材料与方法
VPDF-2xCD44和TSG6的热稳定性通过静态光散射和蛋白质自体荧光来测试。将样品稀释至约1mg/mL，并使用Optim仪器(Avacta Inc.)以0.1℃/min的加热速率使温度从25℃升至80℃。在此过程中，记录用266nm激光照射后的光散射和荧光数据。测得聚集开始温度为约75℃，该温度被定义为散射强度增加的温度。同时，记录荧光发射光谱。
对于VPDF-CD44，当绘制荧光光谱的重心均值与温度的关系时，在约56℃和79℃处测得两次转变。这些转变表明蛋白质(可能为Fab和CD44结构域)变性。因此，与热解折叠相关的任何散射或光谱变化都远高于37℃，表明该Fab-HABD具有良好的稳定性。
B.结果
测得VPDF-2xCD44的两次转变分别在56℃和79℃下。这两个Tm表明VPDF-2xCD44变性的转变，其中CD44结构域在56℃下变性，Fab在79℃下变性。
对于TSG6，测得观察到的Tm起始为35℃，实测Tm为43℃。
实例3.大鼠激光脉络膜新血管形成(CNV)中的体内功效
A.材料与方法
在激光诱导的脉络膜新血管形成的体内大鼠模型(大鼠激光CNV)中研究Fab-HABD以测试以下假设：(1)Fab-HABD尽管结合至IVT HA，但在体内有效(即，Fab-HABD可抑制新血管形成)；以及(2)Fab-HABD相较于相应的未经修饰的Fab片段具有更长效的体内功效。
为此，大鼠在接受激光损伤(每只眼睛接受6次激光灼伤)前1周或3周接受蛋白质制剂的IVT注射。在设定激光损伤后一周，使用荧光血管造影(FA)成像分析血管生长的病变。
对Fab-HABD与相应的未经修饰的Fab片段进行比较。为检测Fab-HABD的持久功效，将未经修饰的Fab的剂量滴定至“最低效应剂量”(即，在大鼠模型的持续时间内，与载体相比，仅存在低程度的可检出新血管形成的抑制)，表明在模型的相同剂量和持续时间内，Fab-HABD具有更持久的功效。
B.结果
所有测试的Fab-HABD都表现出体内新血管形成的抑制作用(表5)。这一结果表明，Fab-HABD尽管在玻璃体内结合至HA，但到达相关组织以发挥药理作用。
Figure BDA0004179509630000911
在相同的模型设置内和相同的剂量下，所有测试的Fab-HABD相较于未经修饰的Fab片段表现出持续时间更长的药理作用(表5)。这表明结合至IVT HA的能力可延长体内药理作用。
尽管对HA的亲和力存在显著差异，但体内模型的分辨率不足以区分不同分子的功效的持久性。在模型中应用的低非治疗剂量下，未检测到耐受性问题。接受Fab-HABD剂量的大鼠的所有眼睛都完全正常，无任何干扰体征，与仅在活体阶段接受缓冲剂的眼睛相当。
实例4.使用RabFab、RabFab-1xTSG6和RabFab-2xTSG6进行的兔药代动力学(PK)研究
A.材料与方法
用于动物研究的蛋白质经由透析在20mM组氨酸-乙酸盐、150mM NaCl(pH 5.5)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)中进行配制。制剂是等渗的，通过冰点法所测得的渗透压在300mOsm/kg与340mOsm/kg之间。尺寸排阻色谱法(SEC)分析表明，这些制剂中所有蛋白质的单体比例都为≥95％。在最终给药浓度下，内毒素水平经评估为每只眼小于0.1EU。
在玻璃体半衰期研究中，进行额外的药代动力学研究，其中通过ITV注射向雌性兔的双眼施用对照品(PBS,n＝1)、0.15mg/眼的AlexaFluor-488标记的RabFab(n＝2)或剂量为0.05mg/眼(n＝2)、0.15mg/眼(n＝2)和2.5mg/眼(n＝4)的AlexaFluor-488(AF-488)标记的RabFab-2xTSG6，总体积为50μL。如先前所述，使用荧光光度测定法测量指定时间点的玻璃体和房水中的试验品浓度。Dickmann,L.J.等人,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,56(11):6991-6999(2015)。使用Phoenix WinNonlin(Certara Inc.,Mountain View,CA)，通过非房室分析用浓度-时间曲线来估计药代动力学参数。对于使用荧光亮度法生成的浓度-时间形态，由于高度可变性，将给药后前48小时内的采样结果排除在PK分析之外，该可变性可能归因于施用部位的个体差异和随后的试验品通过玻璃体的扩散。Dickmann,L.J.等人,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,56(11):6991-6999(2015)。PK分析使用非房室分析方法进行，清除率(CL)的计算公式为CL＝剂量/AUC，其中剂量为已知的且AUC使用线性梯形方法测得。稳态分布容积的计算公式为V＝CL/kel，使用清除率值以及由终末阶段斜率所获得的消除速率常数进行计算。消除半衰期的计算公式为t1/2＝ln(2)/kel。
B.结果
最初使用新西兰白兔的药代动力学(PK)实验检查HA结合影响眼内停留时间的能力。尽管兔玻璃体的HA浓度(约65μg/mL)远低于人类玻璃体(100-400μg/mL)或其他临床前物种诸如猪(其玻璃体HA为约180μg/mL)或食蟹猴(其玻璃体HA为约150μg/mL)，但是兔常被用于试验品IVT给药后的早期PK研究。研究设计为采用IVT注射0.3mg/眼的RabFab、0.3mg/眼的RabFab-1xTSG6或0.5mg/眼的RabFab-2xTSG6。使用离体添加的玻璃体液中的蛋白质的回收实验表明，可使用ELISA与先前描述的抗个体遗传型检测抗体(Shatz等人,2016Molecular Pharmaceutics)对RabFab和RabFab-1xTSG6进行定量。然而，通过ELISA获得的使用RabFab-2xTSG6时的回收率较差，使得对该材料的玻璃体浓度进行放射化学测定。在PK研究中，将RabFab-2xTSG6用125碘进行放射性标记。
如图2A所示，PK参数汇总于表6中，RabFab-1xTSG6和RabFab-2xTSG6相较于游离的RabFab都表现出更长的玻璃体停留时间。RabFab-1xTSG6的半衰期比RabFab长1.4倍，而RabFab-2xTSG6的半衰期则增加了2.2倍。这些结果表明，Fab与HABD的融合可增加这些分子在眼室中的保留时间。鉴于其他物种的玻璃体HA浓度较高，预计Fab-HABD在那些动物中的半衰期将获得更大幅度的延长。
Figure BDA0004179509630000931
此外，玻璃体半衰期研究表明，与通过荧光光度测定法观察到的RabFab相比，RabFab-2xTSG6的玻璃体半衰期增加了约3至4倍，在评估的范围内对剂量无明显依赖性(图2B)；然而，21天的研究持续时间不足以可靠地确定药代动力学参数，估计在研究结束时，大约40％的RabFab-2xTSG6仍残留在玻璃体内。
实例5.RabFab-1xTSG6和TSG6的兔眼耐受性
A.材料与方法
在新西兰白兔中评估游离TSG6和RabFab-1xTSG6单次ITV给药的毒性。设计并执行持续4周的单次IVT给药研究(表7)。通过ELISA测量血清中针对RabFab-1xTSG6或游离TSG6的抗药物抗体(ADA)。将平板用RabFab-1xTSG-6或游离TSG6包被，与采集自研究动物的血清孵育，然后用HRP-结合的山羊抗兔Fc抗体检测抗药物抗体。
Figure BDA0004179509630000932
Figure BDA0004179509630000941
B.结果
一般而言，接受RabFab-1xTSG-6的动物比接受游离TSG6施用的动物具有严重程度更低的结果。接受游离TSG6施用的动物具有显著的临床观察结果。尽管4只动物在第4天按计划接受尸检，但由于显著的临床观察结果以及动物福利问题，在第12天或第17天而不是第30天将其他4只动物提前牺牲。这些临床观察结果包括眼睑和结膜肿胀和发红、动物在工作人员接近时眼睛保持闭合以及眼部炎症和刺激。截至给药后3天，接受游离TSG6施用的动物表现出明显的后部初期白内障和可变的视网膜血管减弱，这些结果与晶状体和外部至完全视网膜变性的镜检结果相关。在接受RabFab-1xTSG6给药的动物中也存在类似但不太严重的结果。从给药后第7天开始，所有动物都出现明显的主要为单核细胞的炎症。炎症和视网膜变性与视网膜脱离、肥大和波形蛋白的外周迁移、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶阳性Müller细胞的证据呈多灶性相关。示出TSG6经由IVT给药后4天的视网膜变性的组织病理学图像如图3所示。
接受RabFab-1xTSG6施用并于第4天接受尸检的两只动物在第4天的血清中都存在抗药物抗体(ADA)的证据。然而，其中一只动物接受了ADA预给药，而该治疗组中的其余3只动物则未接受ADA预给药。该组中接受后期尸检的动物在第4天和第8天的血清ADA呈阴性，但在第15天变为ADA阳性。由于该测定的灵敏度不佳，因此对接受游离TSG6治疗的动物的血清ADA反应的分析尚无定论。
一般而言，接受RabFab-1xTSG6的动物比接受游离TSG6施用的动物具有严重程度更低的结果(表8)。每只动物都存在白内障，但白内障本质上是点状的，并且在显微切片中未发现相关性。无视网膜变性的临床证据，但在单只眼睛中存在极轻微至轻度外层视网膜变性的显微证据。从第8天开始出现类似的中度至重度玻璃体和房水细胞。在第4天和第17天对动物实施安乐死。
Figure BDA0004179509630000951
由于3/8动物在给药前的值高于临界值(2只动物接受游离TSG6施用，1只动物接受RabFab-1xTSG6施用)，对抗RabFab反应的评估变得复杂。然而，在施用试验品后，接受RabFab-1xTSG6施用的3/4动物出现新的ADA滴度或增加的ADA滴度：在第4天将其中1只动物处以安乐死，第17天将另外两只动物处以安乐死。相比之下，相较于给药前，仅接受游离TSG6施用的动物1(在第4天进行尸检)具有升高的ADA滴度。
临床体征和微观病变的早期发作表明TSG6在视网膜和晶状体变性中的直接作用；然而，稍后时间点的发现与出乎意料强烈的ADA反应混淆。断定Müller细胞的外周迁移为兔视网膜损伤或剥离视网膜后的非特异性反应。
实例6.小型猪中治疗剂量的药代动力学(PK)
本研究的目的是确定Fab-HABD和Fab-HABD-HAs的眼内和全身PK参数以及由此导致的眼内半衰期(t1/2)延长，其中通过IVT注射(IVT)向小型猪施用一次。此外，对抗药物抗体(ADA)、眼内耐受性和眼科病理学(在一些研究受试者中)进行研究。
A.材料与方法
14只
Figure BDA0004179509630000962
SPF小型猪双眼接受治疗剂量的以下试验品(50μL/眼)(表9)。
Figure BDA0004179509630000961
在IVT给药后，在整个研究期间(最多9周)定期采集接受试验品给药的动物的血液和房水样品，并在计划的安乐死后不久收集玻璃体液，以跟踪试验品的全身和眼内PK。分析血浆、房水和玻璃体液中的试验品浓度，进一步分析血浆和玻璃体样品中是否存在ADA。
B.结果：在该研究的活体阶段，关于接受VPDF-2xCD44的5只动物中的2只动物的眼睛的肉眼观察结果表明，猪眼无法耐受该试验品的IVT注射，导致提前牺牲这些动物。提供每只动物的一只眼睛用于组织病理学评估。简言之，这些肉眼观察结果为：玻璃体混浊，低于正常的玻璃体粘度，最后是视力丧失的行为体征。眼睛中的组织病理学发现包括血管周围/血管的中度混合细胞炎症，主要是虹膜、睫状体、小梁网和视网膜的单核细胞浸润。视网膜变性包括神经节细胞退化、INL中的细胞丢失、光受体聚集和PR层的细胞核移位。此外，在玻璃体内观察到嗜酸性蛋白性物质以及混合细胞浸润和纤维丝。在视神经中无异常发现。
相较于VPDF-2xCD44，接受VPDF-2xCD44+10kDa HA的5只动物中至少1只动物的眼睛的肉眼观察结果明显不太严重。短暂注意到双眼前房中的发红/白色膜在角膜后积聚，但不认为需要提前终止。
总之，VPDF-2xCD44与HA的复合(即，在IVT注射前用HA占据CD44 HA结合位点)的确改善了VPDF-2xCD44的眼内耐受性。
在接受未经修饰的VPDF的动物组中未发现肉眼观察结果或耐受性问题。
试验品VPDF-2xCD44和VPDF-2xCD44+10kDa HA的PK结果来自房水和玻璃体，其通过非房室分析由个体浓度时间数据计算得出，并以图形方式呈现于图4A至图4B中。
虽然5.8天的未经修饰的VPDF的IVT t1/2位于此类分子的预期范围内，但48天的VPDF-2xCD44+10kDa HA的IVT t1/2对应于眼内停留时间相较于未经修饰的VPDF增加约8倍。总之，VPDF-2xCD44+10kDa相较于未与HA复合的VPDF-2xCD44表现出显著改善的耐受性，并且相较于未经修饰的VPDF表现出显著改善的眼内半衰期。
实例7.与HA预复合以改善玻璃体兼容性
来自体内小型猪研究的肉眼观察结果(即，玻璃体混浊)表明,VPDF-2xCD44与猪玻璃体的不兼容性(即形成沉淀)可通过VPDF-2xCD44与纯HA预复合来减轻。为进一步检查这些效应并测试这些观察结果仅限于VPDF-2xCD44分子还是也可针对其他Fab-HABD检出，我们开发出离体测试系统来检测玻璃体变性。
开发出活体外“液滴”测试来评估几种Fab-HABD与HA预复合时的玻璃体兼容性。本实例说明，与HA预复合的Fab-HABD(即，缀合物)在活体外实验中与玻璃体相容。之前观察到的玻璃体不兼容性可能是由游离HABD引起，其通过HA预复合而得以减轻。结果显示，Fab-HABD与游离HABD的不兼容性取决于浓度。此外，CD44ko(一种包含使HA结合失效的点突变的Fab-HABD突变体)在预复合形式和经分离的形式中都与玻璃体相容。
实例7.1.VPDF-2xCD44与10kDa HA的预复合改善了玻璃体内(IVT)耐受性
A.材料与方法
在第一项测试中，将猪玻璃体在Dounce均质器中均质化10x，并通过以10000g离心2分钟以清除碎片。然后将一滴2μl经均质化的玻璃体施加至玻璃显微镜载玻片上。此外，将2μl供试样品(即，指定浓度的Fab-HABD或Fab-HABD-HA)加入玻璃体滴的顶部，无需进一步混合。在液滴合并后1分钟，通过光学显微镜以40倍的放大倍数在明场模式下检查样品的不均匀性和沉淀。
B.结果
与浓度为200mg/mL的未经修饰的VPDF在20mM组氨酸、140mM NaCl(pH 6.0)中混合的猪玻璃体为均匀且透明的(图5A)，而与浓度为20mg/mL的VPDF-2xCD44在20mM组氨酸、140mM NaCl(pH 6.0)中混合的猪玻璃体为不均匀的，并且表现出透明的沉淀体征(图5B)。
该结果表明，在体内IVT注射后，VPDF-2xCD44也与猪玻璃体不相容。因此，玻璃体不兼容性可能是导致VPDF-2xCD44体内耐受性问题的一个根本原因。
浓度为20mg/mL的VPDF-2xCD44与1％(w/v)HA(10kDa,Lifecore,Biomedical)在20mM组氨酸、140mM NaCl(pH 6.0)中的预复合导致玻璃体兼容性(图5C)。该结果反映了上述小型猪体内研究的结果，该研究表明VPDF-2xCD44与10kDa HA的预复合改善了IVT耐受性。
实例7.2.VPDF-2xCD44的玻璃体不兼容性依赖于浓度
A.材料与方法
为测试VPDF-2xCD44的玻璃体不兼容性的浓度依赖性，将2μl猪玻璃体与VPDF-2xCD44的1:4稀释液在20mM组氨酸、140mM NaCl(pH6.0)中以37.5mg/mL的起始浓度混合。通过光学显微镜检查玻璃体与蛋白质的混合物中的玻璃体不均匀性。
B.结果
检测到的不均匀性取决于蛋白质浓度(表10；图6A至图6F)。VPDF-2xCD44的玻璃体兼容性达到0.6至0.15mg/mL之间。将这些结果与上述体内小型猪研究的结果(VPDF-2xCD44的浓度＝17.4mg/mL)关联起来，表明IVT注射浓度为17.4mg/mL的VPDF-2xCD44溶液可能导致的类似的不均匀性可能是观察到的耐受性问题的根本原因。
Figure BDA0004179509630000981
Figure BDA0004179509630000991
实例7.3.VPDF-2xCD44的玻璃体不兼容性与其与玻璃体内(IVT)HA的相互作用有关
A.材料与方法
为测试VPDF-2xCD44的玻璃体不兼容性是否由VPDF-2xCD44与IVT HA的相互作用引起，我们设计了该分子的变体(VPDF2xCD44-ko)，该变体在CD44的HA结合位点内含有消除与HA的结合的点突变，并且同时保留蛋白质其余部分完整结合(在本文中称为“ko变体”)。
B.结果
CD44ko变体在瞬时表达、纯化和生物物理特性(分析级粒径筛析、变性SDS毛细管电泳)方面表现出相同的行为，并且其同一性身份通过质谱法确认。HA结合位点突变的引入导致亲和力完全丧失，如SPR结果所示(使用与实例2相同的方法进行测试)。
当按照上述实例7.2中所述，在与2x VPDF相同的浓度下测试该VPDF-2xCD44-ko变体的玻璃体兼容性时，未检测到玻璃体不均匀性，表明具有玻璃体兼容性(表11)。
Figure BDA0004179509630000992
实例7.4.VPDF-2xCD44经透明质酸酶预处理后与玻璃体兼容
A.材料与方法
此外，我们在用透明质酸酶预处理以降解HA的猪玻璃体中测试了VPDF-2xCD44的玻璃体兼容性。为此，将来自猪睾丸的透明质酸酶(Sigma)以2mg/mL(>1.5U/μL)的浓度溶于PBS中。将1μL透明质酸酶溶液加入50μL猪玻璃体中，并于37℃下孵育2小时。对照样品仅用PBS缓冲液处理。
B.结果
结果，VPDF-2xCD44在20mg/mL的浓度下与经透明质酸酶预处理的玻璃体混合时未表现出不均匀性，可能是由于高分子量的HA降解所致。
总之，这些结果表明玻璃体不兼容性可能是VPDF-2xCD44体内耐受性问题与CD44-HABD与高分子量IVT HA的相互作用有关的根本原因。实例7.5.Fab-HABD的玻璃体不兼容性与在特定浓度下HABD与玻璃体HA的相互作用有关
A.材料与方法
为测试玻璃体不兼容性是否仅为VPDF-2xCD44的特点，我们按照上文实例7.2和7.3所述，对其他Fab-HABD或单独HABD的玻璃体不均匀性进行测试。所测试的蛋白质如实例1所述。
B.结果
VPDF-1xCD44表现出与VPDF-2xCD44相当的玻璃体不均匀性。结果表明，2x版HA聚合物的结合性和潜在交联的增加与玻璃体不兼容性无关。结果表明，CD44 HABD与IVT HA之间的相互作用与玻璃体不兼容性有关(表12)。
Figure BDA0004179509630001001
包含TSG6结构域的Fab-HABD表现出与包含CD44的Fab-HABD相当的玻璃体不均匀性。Fab组分G6.31在相同浓度下未表现出玻璃体不均匀性，而孤立的TSG6结构域则表现出玻璃体不均匀性。这一结果再次支持玻璃体不兼容性与特定浓度下HABD与玻璃体HA的相互作用有关的观点。
实例7.6.玻璃体不兼容性可通过与HA预复合来解决
A.材料与方法
为测试检测到的VPDF-1xCD44和TSG6变体的玻璃体不兼容性能否通过与HA预复合来解决，我们生成表13中所示的缀合物，其中包含1％(w/v)HA(10kDa,Lifecore,Biomedical)。
B.结果
通过与10kDa HA预复合，测试的所有Fab-HABD的玻璃体不均匀性均得到解决(表13)。这些结果表明，HA结合蛋白与纯HA的预复合可作为一种改善玻璃体兼容性并由此改善这些分子的潜在的耐受性问题的方法。
Figure BDA0004179509630001011
实例7.7.Fab-HABD的玻璃体不兼容性并非猪玻璃体所特有
A.材料与方法
为测试检测到的含有CD44和TSG6的Fab-HABD的玻璃体不兼容性是否是仅发生于猪玻璃体中的效应，我们使用兔玻璃体代替猪玻璃体，按照上述实例7.1至7.6所述进行兼容性测试。
B.结果
对于所有测试的Fab-HABD，都检测到与猪玻璃体相同的玻璃体不兼容性。此外，在兔玻璃体中检测到的所有玻璃体不兼容性都可通过Fab-HABD与10kDa HA的预复合来解决。
这些结果表明玻璃体不兼容性并非猪玻璃体所特有。
实例7.8.体内注射诱导玻璃体不均匀性
A.材料与方法
为得到离体玻璃体兼容性测试结果与体内小型猪研究的耐受性结果之间的联系，我们测试了在整个猪眼中能否检测到玻璃体不均匀性以及该玻璃体不均匀能否通过HA预复合得到解决。
为此，屠宰后立即收集整只猪眼，并向其中注射50μl浓度为17.4mg/mL的VPDF-2xCD44于20mM组氨酸、140mM NaCl(pH 6.0)中的溶液+/-1％(w/v)HA 10kDa。眼睛(与上述体内小型猪研究相同)。然后将眼睛转移至HBSS(Lonza,Biowhittaker)中，并于37℃下保存4小时。孵育后，打开眼睛，取出玻璃体检查不均匀性。
B.结果
如图7A至图7C所示，注射时的玻璃体不兼容性可通过Fab-HABD与HA的预复合来解决。注射缓冲剂并不导致IVT不均匀，结果得到透明玻璃体(图7A)。注射VPDF-2xCD44导致注射侧周围玻璃体内出现致密的白色不均匀物(沉淀样)(图7B)。注射与纯HA预复合的VPDF的眼睛的玻璃体表现出显著差异(图7C)：尽管检测到不均匀物，但该不均匀物在整个玻璃体内的密度和厚度明显下降。
这些结果表明，VPDF-2xCD44所诱导的不均匀性也发生于整个猪眼中的注射部位附近。不受该理论的束缚，我们认为在体内注射时诱导相同的不均匀性，并且该不均匀性可能是观察到的耐受性问题的根本原因。
此外，VPDF-2xCD44与HA的预复合减少了在注射部位周围观察到的不均匀性。我们认为，同样的效应导致了在体内观察到VPDF-2xCD44-HA具有改善的耐受性。与实例7.5和7.6中玻璃体不兼容性也发生于另一种TSG6 HABD且同样可通过与纯HA预调配来解决的观察结果相结合，我们认为该方法是一种改善玻璃体兼容性并由此改善含有HABD的蛋白质的IVT耐受性的一般原则。
实例8.多功能蛋白聚糖VG1和VG1ΔIg HABD能够结合HA
研究多功能蛋白聚糖的HABD，以确定它们能否用为提供优于TSG6和CD44 HABD的眼内耐受性和眼内停留时间的HABD。
多功能蛋白聚糖经鉴定具有串联重复的连接模块。如图8A中所示，多功能蛋白聚糖的氨基酸序列编码Ig样结构域，该结构域接以两个连接模块，使得多功能蛋白聚糖的N末端片段(本文中将其命名为WT VG1)包含N末端Ig样结构域和2个连接结构域。在本实例中，我们得到WT VG1和不含Ig结构域的截短变体VG1ΔIg，并测试它们能否结合至HA。此外，在以下实例中，测试WT VG1以及由Fab和WT VG1所组成的Fab-HABD的活体外玻璃体兼容性和IVT注射给兔和小型猪时的耐受性。
A.材料与方法
通过使用标准分子生物学技术进行限制性克隆和/或基因合成来生成各种蛋白质的表达质粒。在CHO或HEK293细胞中进行表达。
通过在4000rpm、4℃下离心20分钟来收集上清液。此后，无细胞上清液通过0.22μm瓶顶过滤器过滤并储存在冰箱(-20℃)中。
通过使用Ni-NTA树脂的亲和层析法以及SEC，从细胞培养上清液中纯化WT VG1和VG1ΔIg的带有His标记的突变体。简言之，在HisTrap树脂上捕获经无菌过滤的细胞培养上清液，使用含有高浓度咪唑的缓冲剂进行洗涤和洗脱。将洗脱的蛋白质级分合并并浓缩，然后使用20mM组氨酸-乙酸盐、150mM NaCl(pH 5.5)作为运行缓冲液对其进行SEC分析。
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)，通过SPR测试WT VG1和VG1ΔIg与HA的结合。简言之，在80秒或120秒内，将WT VG1和VG1ΔIg注入S系列CM5芯片(GE HealthcareLife Science Solutions)上，该芯片通过固定化链霉亲和素间接包被有生物素-HA(Creative PEGWorks,North Carolina)。注射浓度范围为0.5nM至1μM。监测解离相300秒至600秒。随后，通过注入1M MgCl2并持续15秒以使表面再生。所有实验都在25℃下使用PBS(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl,2.7mM KCl,pH 7.4)进行。使用BIAevaluation软件，将得出的HA结合曲线拟合至1:1Langmuir结合模型。
B.结果
多功能蛋白聚糖HABD能够结合HA。各种蛋白质的HA结合KD如表14中所示。
Figure BDA0004179509630001031
实例9.WT VG1和TSG6蛋白质的糖胺聚糖结合形态
A.材料与方法
使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)通过SPR测量与硫酸肝素和硫酸软骨素的结合来确定WT VG1和TSG6的糖胺聚糖(GAG)结合形态。简言之，在180秒内将蛋白质注入通过链霉亲和素间接包被有生物素-硫酸肝素或生物素-硫酸软骨素的S系列CM5芯片(GEHealthcare Life Science Solutions)上。注射浓度范围分别为约5nM至1000nM。监测解离相120秒。随后，通过注入1M MgCl2并持续30秒以使表面再生。
B.结果
结果表明，WT VG1在结合方面比TSG6更具选择性(表15)。未观察到WT VG1结合至硫酸肝素或硫酸软骨素，而TSG6与肝素和硫酸软骨素都发生紧密结合。
Figure BDA0004179509630001041
实例10.包含VG1 HABD的Fab-HABD能够结合抗原和HA
A.材料与方法
A.1.构建体设计
Fab-HABD系通过或可通过WT VG1序列与Fab片段重链的C末端或IgG1重链的N末端重组融合产生。对于肽-VG1融合物，产生或可产生同时接附至WT VG1(EETI-VG1)的N末端和WT VG1(VG1-EETI)的C末端的肽(EETI)。还产生两种额外的构建体，其中在EETI与WT VG1(EETI-TEV-VG1与VG1-TEV-EETI)之间引入TEV裂解位点。使用或可能使用的接头如表16中所示。
Figure BDA0004179509630001042
Figure BDA0004179509630001051
A.2.与物种匹配的替代猪抗VEGF Fab的产生
由于对abYsis数据库的搜索未得到猪(Sus scrofa)IgG的重链和轻链配对的已知实例，因此我们试图通过从抗VEGF Fab(G6.31.AARR)的CDR移植以生成与已知抗原主动结合的抗体。在表达NCBI的序列标签(EST)数据库中搜索与G6.31骨架(VH4/VLK2)具有高序列同一性的猪mRNA EST。选择几个序列，并将来自G6.31.AARR的CDR移植到适当的骨架区内以生成“猪源性”G6.31.AARR。将重链和轻链序列随机配对并在30mL培养物中的293Expi或CHO细胞中表达。在Capto L树脂上进行纯化，然后进行尺寸排阻色谱法分析，通过SDS-PAGE、质谱检查纯化后的细胞，并评估其与人和猪VEGF的结合。选择一个对VEGF具有良好亲和力的序列用于放大和随后的tox/PK分析，并将该序列与VG1重组融合以生成PigFab-VG1。
A.3.蛋白质表达与纯化
通过将DNA构建体的阳离子脂质转染至CHO或293Expi细胞中进行蛋白质表达。培养物体积为30mL至35L。对于一些构建体，生成快速稳定的细胞株以增加单位培养物体积的蛋白质产量。
通过亲和层析进行纯化，其中将Ni-NTA树脂用于带有6x-组氨酸标记分子，或将Gamma bind Plus树脂用于Fab融合。在一些情况下，在Sephadex树脂上进行最终粒径筛析步骤之前，执行二次离子交换步骤。
A.4.HA结合
为确认VG1作为Fab-HABD保留其HA结合特性，如先前在实例2.1中所述使用SPR。使用单循环动力学进行实验，并监测解离长达600秒。测试的蛋白质浓度在不同蛋白质之间变化，但范围在500nM与6.25nM之间。
A.5.抗原结合
通过将相应抗原直接固定在S系列CM5芯片(GE Healthcare)上并按照实例2.1所述的SPR测量结合，对抗原结合进行测试。基于已知的相互作用亲和力，使用不同的蛋白质浓度。
B.结果
B.1.透明质酸(HA)结合
使用BIAevaluation软件，将所有HA结合数据拟合至1:1Langmuir结合模型。各种蛋白质的KD如表17中所示。
Figure BDA0004179509630001061
B.2.抗原结合
表18示出分析其抗原结合能力的蛋白质以及测量的KD。VG1与各种Fab重链的C末端融合不影响抗原结合。对于EETI-VG1融合，接头和附着位点的灵活性影响抗原结合。优选的是更灵活的接头和C末端融合。
Figure BDA0004179509630001062
Figure BDA0004179509630001071
实例11.HABD的活体外玻璃体兼容性
A.材料与方法
本实例描述了玻璃体液中VG1结构域溶解度的测试。使用Dounce均质器制备玻璃体液，然后以10000x g离心2分钟以去除碎片，将其用于这些研究。
额外的实验利用Alexa488标记的蛋白质，使得明场和荧光显微镜都可用于监测离体玻璃体液中的沉淀。通过连续注入三合一三通道□-载玻片(ibidi,USA,Inc.Cat#80316)的两个通道中的每一个，将等体积的试验品与玻璃体液混合，并通过显微镜目视监测混合界面。
B.结果
将TSG6与预先用PBS(pH 7.4)按1:4稀释的猪玻璃体液混合后，溶液变得混浊(图9A)，并且在混合物离心后观察到沉淀。相比之下，VG1与猪玻璃体以1:4和1:1的比例混合后，溶液保持澄清(图9B)，并且离心后未观察到沉淀。
进一步地，在离体猪玻璃体中观察到RabFab-TSG6沉淀(图10A)，而对于RabFab-VG1则未观察到沉淀(图10B)。类似地，比较VG1(图11A)、RabFab-VG1(图11B)或含有等浓度(基于质量)的RabFab-VG1和10kDa HA的制剂(图11C)，在离体兔玻璃体中未观察到沉淀。
与TSG6相比，VG1与10kDa HA的预制剂并不总是防止体外玻璃体液中产生沉淀所需的。
实例12.VG1与玻璃体液的离体相互作用
A.材料与方法
利用荧光相关光谱(FCS)检查分离的VG1和Fab-VG1 Fab-HABD与离体玻璃体液的相互作用。VG1和Fab-VG1使用PEG4-DY647-N-羟基琥珀酰亚胺酯共价标记在赖氨酸残基上。DY647的荧光发射可通过594nm或633nm的激光激发并在更长的波长下进行检测。控制反应化学，使得每个分子的标记水平不大于1个荧光染料。从刚屠宰的动物的眼睛中收集猪玻璃体液，并使用Dounce均质器进行均质化。将此材料用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4按1:3连续稀释。将标记的试验品添加至每个稀释的等分试样中，使其最终浓度为20nM。试验品为(1)游离VG1、(2)pigFab-VG1、(3)与10kDa HA以1:1等重量比混合的pigFab-VG1、(4)RabFab-VG1和(5)与10kDa HA以1:1等重量比混合的RabFab-VG1。在室温下孵育2小时后，进行FCS。
B.结果
FCS测量结果如图12中所示。与单独在缓冲液(PBS)中孵育相比，所有样品与未稀释或略微稀释的玻璃体一起孵育时皆表现出显著延迟的扩散。对于游离VG1、PigFab-VG1和RabFab-VG1，该延迟扩散一直持续到玻璃体被稀释超过6000倍(图12，第3、4、6和7行；从未稀释到稀释因子达到6561)。对于与10kDa HA共配制的样品，也观察到缓慢扩散，但当玻璃体液的稀释倍数≥729倍时，该效应消失(图12，第5行：PigFab-VG1+10kDa HA(1:1)，以及第8行：RabFab-VG1+10kDa HA(1:1)；从稀释因子为729到PBS)。这些结果表明玻璃体组分(最有可能是玻璃体液内源性高分子量HA)与含有VG1的试验品之间存在强烈的相互作用。即使存在低分子量HA，在玻璃体液稀释度较小时(图12，第5行：PigFab-VG1+10kDa HA(1:1)，以及第8行：RabFab-VG1+10kDa HA(1:1))，VG1也可与内源性HA发生相互作用。这表明VG1和Fab-VG1可从10kDa HA上解离并结合至玻璃体液中存在的HA。然而，一旦玻璃体液被大幅稀释，将不存在浓度足够高的高分子量HA竞争与低分子量HA结合的VG1(图12，第5行：PigFab-VG1+10kDa HA(1:1)，以及第8行：RabFab-VG1+10kDa HA(1:1)；从稀释因子为729到PBS)。与未结合的材料相比，结合至低MW HA的VG1发生很小或可以忽略不计的扩散减慢(图12，PBS对照用于第5行：PigFab-VG1+10kDa HA(1:1)，以及第8行：RabFab-VG1+10kDa HA(1:1)；这些样品具有未添加玻璃体的10kDa HA)。
实例13.与10kDa HA预复合对Fab-VG1的热应力稳定性的影响
A.材料与方法
使用抗HtrA1-VG1蛋白质测试Fab-VG1与10kDa HA的预复合对热应力稳定性的影响。在这些实验中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4配制浓度为3mg/mL的抗HtrA1-VG1，并向其中添加或不添加1.8mg/mL的10kDa HA。10kDa HA的1.8mg/mL(180μM)的浓度相对于抗HtrA1-VG1浓度(35μM)摩尔过量5倍。将这些制剂在37℃的温度下孵育4周，然后通过非还原型毛细管电泳十二烷基硫酸钠(NR CE-SDS)进行分析，如Michels等人2007(Anal.Chem.79,5963)所述。除单体种类和片段以外，通过NR CE-SDS可检测抗SDS变性的聚集体。
B.结果
如图13中所示且汇总于表19中，与10kDa HA的预复合抑制抗HtrA1-VG1中SDS稳定聚集体的形成。高分子量形式(HMWF)的形成率从每周1.2％降至每周0.1％。10kDa HA的存在似乎亦影响片段化，尽管比对聚集的影响小，但是当与HA复合时，低分子量形式(LWMF)的形成速率降低约2倍。这些结果表明，在中性pH下，制剂中包含10kDa HA使抗HtrA1-VG1在热应力条件下保持稳定。
Figure BDA0004179509630001091
实例14.
Figure BDA0004179509630001092
中VG1和VG1Fab-HABD的眼内耐受性A.材料与方法
A.1.玻璃体内(IVT)注射和终点评估
使用
Figure BDA0004179509630001093
评估VG1和Fab-VG1Fab-HABD的IVT注射的耐受性。该研究的设计如表20中所示。
Figure BDA0004179509630001094
Figure BDA0004179509630001101
每只小型猪的双眼经由IVT接受施用50μL的单次注射液。基于历史数据，该体积在小型猪中具有良好的耐受性。IVT注射程序由经过专业认证的兽医眼科医生执行。第1组小型猪接受媒剂对照注射液治疗。第2组小型猪接受经分离的WT VG1(按照上文实例8中所述产生)治疗。第3组小型猪接受pigFab-VG1(按照上文实例10中所述产生)治疗第4组小型猪接受与等重量的10kDa HA预配制的pigFab-VG1治疗。所有试验品都用20mM组氨酸-乙酸盐、150mM NaCl(pH 5.5)配制为指定的蛋白质浓度。第3组和第4组中pigFab-VG1的剂量代表使总内毒素水平保持为每只眼小于0.05内毒素单位(EU)的最大可行剂量。先前在小型猪眼内研究中已发现该水平的内毒素可耐受。鉴于WT VG1(约30kDa)与pigFab-VG1(约80kDa)之间的分子量差异，相较于第3组和第4组，第2组中的剂量水平代表每个剂量1.6HA结合摩尔当量。
在本研究评估了以下参数和终点：死亡率、临床体征、体重、眼科(检查、眼内压测量、宽视野彩色眼底成像、OCT成像和视网膜电图[ERG])、生物分析、毒物动力学参数、抗药物抗体评估、总体尸检结果和组织病理学检查。
由经过专业认证的兽医眼科医生经由间接检眼镜和裂隙灯生物显微镜对所有存活动物的双眼进行检眼镜检查。在治疗前和第1天(给药后)、第3、5、8、15、17、22和29天对所有动物进行眼科检查。
眼内压(IOP)是由经过专业认证的眼科医生在进行眼科检查的同时通过压平眼压法对所有存活动物的双眼测得。在治疗前和第1天(给药后)、第3、5、8、15、17、22和29天对所有动物的眼内压进行测量。
第29天，使用Clarity RetCam Shuttle在对所有存活的动物进行宽视野彩色眼底成像。如果可见，尝试拍摄所施用的试验品。
第29天，使用Heidelberg Spectralis HRA/OCT系统进行光学相干断层扫描；通过光神经进行单次、垂直、高分辨率线扫描。
第29天对所有存活的动物进行ERG评估。动物在ERG之前最少在暗处适应1小时。具有Ganzfeld圆顶刺激的全场闪光ERG(闪光强度符合ISCEV标准参数且光适应时间为5分钟(Retiport Gamma,Roland Consult))；幅度和延迟值由描记中测得。
通过胸廓入口经由前腔静脉采集所有存活动物的血样(约0.5mL)，用于测定试验品的血清浓度。动物在采血前不禁食，但与其他程序禁食相一致的时间间隔除外。在治疗前、第1天(给药后6小时和12小时)和第2、3、5、8、12、15、22和29天分别进行一次采血。
将血样收集到血清分离管中，并使其在受控室温下形成凝块，直至在收集后60分钟内在受控室温下以1300g离心10分钟。在离心开始后30分钟内，将所得血清制成1个等分试样，放入预先标记的0.50mL二维条形码Matrix管(Thermo Cat 3744)中。所有等分试样皆在干冰上快速冷冻，并于-60℃至-90℃下冷冻保存。
在ELISA测定中检测血清样品中抗药物抗体(ADA)的存在。将试验品固定在测定板上，与血清孵育并洗涤，然后用抗猪IgG试剂检测免疫复合物，该试剂具有与辣根过氧化物酶结合的Fc部分用于酵素性检测。
第15天，由经过专业认证的兽医眼科医生采集所有动物的房水。使用结膜钳固定眼球位置以进行房水采集，同时将31号针的尖端以大约90度角斜插入角膜缘后的巩膜。然后在针头进入虹膜与角膜之间的前房之前，将针头的角度变浅。缓慢抽出注射器柱塞以吸取最大可获得体积的房水，其最多可达50μL。取出针头，将巩膜外组织靠近穿刺部位并用结膜钳夹住。对侧眼实施相同的样品采集程序。将采集的样品储存于1.0mL玻璃基质trakmates 2D条形码储存管中，然后盖上TPE帽。将样品在液氮中冷冻，并冷冻储存于-60℃至-90℃。使用基于质谱的测定法测定房水中的试验品含量。
A.2.样品制备
PigFab标准校准曲线系通过将不同量的PigFab添加至用25mM碳酸氢铵稀释的猪水性基质中来进行。然后将标准品/样品处理如下：将来自半胱氨酰残基的二硫键在60℃下用10mM DTT还原1小时，然后将硫醇基团用55mM碘乙酰胺在室温下于暗处烷基化45分钟。然后将标准品/样品用36μg/mL胰蛋白酶(测序级胰蛋白酶，V5111，Promega)消化并在37℃下孵育过夜。消化后，将重肽加入标准品和样品溶液中。在0.5–12μg/mL浓度范围获得线性校准曲线。
A.3.带有标记的肽
购得在R(LLIYSASFLYSGVPSR m/z:891.98+2)氨基酸中含有重同位素标记的肽标准品(New England Peptide,Gardner,MA,USA)。表征和浓度数据由制造商提供。带有标记的肽于-80℃下储存于1mL水中。
A.4.通过质谱(MS)进行分析
在Acquity UPLC(Waters Corporation,Milford,MA)上使用ACQUITY UPLC CSHC18肽分析专用柱(
Figure BDA0004179509630001121
1.7μm,1mm×100mm)在梯度洗脱条件下分离来自PigFab的消化物。色谱柱保持于50℃下，并且自动进样器样品盘保持于8℃下。流动相为含有0.1％ FA的水(A)和含有0.1％ FA的乙腈(B)，流速为0.04mL/min。用以下梯度洗脱样品：B在2分钟内从2％增加至90％，然后在2分钟降至2％ B以重新平衡层析柱。进样体积为10μL。
Triple Quad 6500质谱仪(Ab Sciex,Framington,MA)在正离子多重反应监测(MRM)模式下操作，其配备有
Figure BDA0004179509630001122
Turbo V离子源。监测的PigFab前驱物(Q1)离子为LLIYSASFLYSGVPSR(m/z:886.98+2)，采用90V的去簇电位，并且监测到的产物(Q3)离子为359.20m/z，碰撞能量为29eV。还监测另外两个其他产物离子(765.39m/z和602.33m/z)作为定性离子，其碰撞能量分别为37eV和30eV。MS/MS设置参数如下：离子喷雾电压，4500V；气帘，30psi；雾化器气体(GS1)，25psi；温度，300℃；驻留时间，50ms。还生成PigFab的重肽(891.97m/z)，并使用369.204m/z的跃迁进行定量，其碰撞能量为29eV。
使用Sciex Analyst软件版本1.7.1(TripleTOF)进行数据采集。用PeakView 2.2显示原始数据。
B.结果
所有动物都存活至计划的终止日期。因此，无需实施计划外安乐死。试验品相关的眼科检查结果包括试验品注射区域内的玻璃体混浊和极轻微的后葡萄膜炎。
眼科检查结果如下：
(1)第2组(WT VG1)–第1天，6只动物中的2只在颞玻璃体内观察到极轻微的混浊。该结果在第3天消退，并且截至研究终止一直不存在。4只动物中的1只在第15天发生极轻微的后葡萄膜炎，其在第17天消退。认为极轻微的后葡萄膜炎无临床意义。
(2)第3组(pigFab-VG1)–第1天，所有6只动物在试验品注射区域的颞玻璃体内都表现出玻璃体混浊。第3天，该结果在所有6只动物中持续存在，并且在第5天，4/4只动物表现出涉及中央玻璃体的扩散体征。从第8天至第22天，我们观察到受影响的玻璃体区域减小，而在第29天，4只动物中仅有2只在颞玻璃体内发生轻微混浊。区域性玻璃体混浊在本质上似乎并非炎症，但似乎对玻璃体稠度具有局部影响。
(3)第4组(pigFab-VG1+10kDa HA)–在研究持续期间，未获得与试验品相关的眼科检查结果。
在整个研究期间的所有时间点，所有动物的眼内压值都处于正常范围内。
在任何时间点，所有动物都未表现出针对试验品的抗药物抗体(ADA)。
第29天拍摄的彩色眼底照片和光学相干断层扫描图像显示，所有第2组和第4组动物都具有正常的玻璃体和视网膜形态。所有第3组动物在眼底照片上具有极轻微的局部玻璃体混浊，并且在OCT上具有极轻微的玻璃体后高敏性，与眼科检查结果一致。
在第29天对所有动物进行视网膜电图分析。在Scotopic 0.01光强度下，动物编号3006双眼的b波振幅发生中等程度的减小。所有其他光强度都处于正常范围内，表明该动物具有影响昏暗视网膜功能的背景异常。动物编号2005和4003在眼睛之间表现出一些不对称性，其幅值OD相较于OS发生轻度减小。这一结果疑似与记录条件有关，包括非中心眼定位OD。在任何动物中均未发现任何表明试验品效应的结果。
在眼睛或视神经中，不存在与试验品有关的肉眼检查发现。
接受试验品治疗的动物的所有肉眼观察结果为该物种的背景发现，或被视为偶然发现且与试验品无关。这些观察结果发生率低，在发生率或严重程度方面缺乏明确的剂量关系，并且/或不存在相关的与试验品有关的镜检发现。
在眼睛或视神经中，不存在与试验品有关的镜检发现。
所有镜检观察结果都被视为是偶然发现且与试验品无关。这些观察结果是该物种的已知背景发现，并且/或对于接受对照和试验品治疗的动物具有相似的发生率和严重程度。
通过质谱法测定房水样品中PigFab-VG1的水平。在小型猪眼中IVT注射1.8mg/眼的PigFab-VG1或与等质量的10kDa HA预复合的PigFab-VG1后，获得高房水水平并保持30天(图14)。这些结果表明，在为期4周的研究期间，小型猪眼中存在可测量水平的试验品。30天时的浓度至少比未经修饰的Fab的实测值高一个数量级(图4A)。
在Gottingen小型猪中，通过单次IVT施用各个剂量水平的WT VG1(1.13mg/眼)、pigFab-VG1(1.8mg/眼)或pigFab-VG1+10kDa HA(1.8mg/眼)具有良好的耐受性。所有动物都存活至计划的终止时间，无异常临床观察结果，并且体重不受影响。在研究期间使用单次注射时缺少针对试验品的可检测到的免疫反应，由此允许评估试验品的直接效应。眼科检查结果仅限于：在试验品注射部位发生短暂极轻微的玻璃体混浊，其在第3天消退(WT VG-1)；以及在试验品注射部位附近发生玻璃体混浊，其在研究终止时未完全消退(pigFab-VG1)。不存在有关pigFab-VG1+10kDa HA的检眼镜发现，所有动物的IOP、OCT和ERG结果都正常。在眼睛或视神经中，不存在与试验品有关的肉眼观察或镜检效应。
实例15.VPDF-VG1在大鼠激光诱导的脉络膜新血管形成(大鼠激光CNV)中的功效
在激光诱导的脉络膜新血管形成的体内大鼠模型(大鼠激光CNV)中研究Fab-HABD以测试以下假设：(1)Fab-HABD在体内有效(即，Fab-HABD可抑制新血管形成)；以及(2)Fab-HABD的体内功效持续时间相当于或优于未经修饰的Fab片段。
A.材料与方法
大鼠在接受激光损伤(每只眼睛接受6次激光灼伤)前1周或3周接受蛋白质制剂的IVT注射。在设定激光损伤后一周，使用荧光血管造影(FA)成像分析血管生长的病变。
对Fab-HABD与相应的未经修饰的Fab片段进行比较。为检测Fab-HABD的持久功效，将未经修饰的Fab的剂量滴定至“最低效应剂量”(即，在大鼠模型的持续时间内，与载体相比，仅存在低程度的可检出新血管形成的抑制)，表明在模型的相同剂量和持续时间内，Fab-HABD具有更持久的功效。
B.结果
如图15所示，在激光治疗前7或21天施用VPDF-VG1，有效抑制了CNV病变。在本研究中，VPDF-VG1的效果的持久性与未经修饰的Fab相当。
实例16.新西兰白兔中VG1和VG1 Fab-HABD的眼内耐受性
A.材料与方法
本研究的目的是确定试验品WT VG1、RabFab-VG1以及与1:1(w/w)10kDa HA预配制的RabFab-VG1在单次双侧IVT注射给雄性新西兰白兔后30天观察期内的眼内耐受性。研究设计如表21中所示。
Figure BDA0004179509630001151
Figure BDA0004179509630001161
在本研究评估了以下参数和终点：死亡率、临床体征、体重、食物消耗量、眼科(即，检查、眼内压测量、宽视野彩色眼底成像、OCT和ERG)、生物分析、毒物动力学参数、抗药物抗体评估、总体尸检结果和组织病理学检查。
B.结果
基于对体重和食物消耗量的评估，不存在全身性试验品相关效应。也不存在肉眼宏观尸检发现，认为所有组织都处于正常范围内。
在给药前和研究的第8、15、22和29天测定兔血清中抗药物抗体(ADA)的存在。给药前，指定接受WT VG1给药的6只动物中的3只具有可测量的血清ADA。类似地，分别指定接受RabFab-VG1或RabFab-VG1+10kDa HA治疗的1/6和0/6动物具有针对试验品的预先存在的血清ADA。在第8天，WT VG1和RabFab-VG1组中的所有动物在血清中皆表现出针对试验品的ADA，并且在研究期间保持阳性，而在RabFab-VG1+10kDa HA组中，则有2/3的动物具有血清ADA。在第15天，所有动物的血清ADA皆呈阳性，并一直持续到研究结束。
在接受WT VG1、RabFab-VG1以及RabFab-VG1+10kDa HA治疗的动物中，临床检眼镜结果与前葡萄膜炎和后葡萄膜炎的发展一致，但治疗组之间的严重程度有所不同。例如，WTVG1导致在第22天发生中度前葡萄膜炎和后葡萄膜炎，包括一些眼睛的后囊下白内障。相比之下，接受RabFab-VG1治疗的大多数动物在同一时间点表现出轻度葡萄膜炎。此外，接受RabFab-VG1+10kDa HA治疗的动物仅表现出极轻微至轻度前葡萄膜炎和后葡萄膜炎。在每个治疗组中，在第18天开始全身抗炎症治疗(其中还包括对接受WT VG1给药的动物进行局部眼睛治疗)后，在第29天发生葡萄膜炎体征得到改善。眼内压下降与活动性葡萄膜炎一致，而玻璃体混浊的变化程度也对应于不同组中葡萄膜炎的严重程度。在这些情况下，在接受RabFab-VG1+10kDa HA治疗的动物中，玻璃体混浊仅限于微弱的玻璃体混浊，而WT VG1动物则表现出中度混浊和后极白内障。通过OCT和ERG也观察到治疗依赖性效应严重程度，其中暗视和明视幅值减小表明接受WT VG1治疗的眼睛的视网膜功能发生严重改变和变性。
相较于其他试验品(其中RabFab-VG1效应(图16B)不太严重且RabFab-VG1+10kDaHA效应(图16C)仅限于玻璃体且严重程度仅为极轻微至轻度)，在接受WT VG1治疗的眼睛中，眼内镜检效应也为最显著(图16A)。WT VG1相关的玻璃体炎症包括视神经乳头附近的区域、视网膜脱离和不同程度的坏死以及与晶状体后囊相邻的炎症细胞层。此外，前房内含有均质的嗜酸性粒细胞物质，该物质与血清蛋白相一致。在视网膜中，WT VG1相关炎症的特征在于混合细胞类型延伸至视网膜实质，并且伴随极轻微至显著坏死与血管和血管周围炎症。在视网膜中央观察到反应性Muller细胞。
与WT VG1类似，接受RabFab-VG1治疗的眼睛表现出极轻微至中度弥漫性光受体病变，其通常与反应性Muller细胞有关。然而，RabFab-VG1光受体层病变与WT VG1相关的视网膜坏死不同，因为该病变仅对光受体层有选择性，而视网膜坏死则涉及多个视网膜层。此外，接受WT VG1和RabFab-VG1治疗的眼睛都存在玻璃体中的纤维血管膜特征。在这些情况下，膜由纤维母细胞、大量新血管和早期胶原沉积组成。还观察到与膜分离的牵引带。与WTVG1和RabFab-VG1相比，RabFab-VG1+10kDa HA相关效应仅限于极轻微至轻度单核炎症，该炎症局限于玻璃体和内界膜。
总之，向新西兰白兔单次IVT施用WT VG1、RabFab-VG1或RabFab-VG1+10kDa HA导致前葡萄膜炎和后葡萄膜炎的发展，在施用WT VG1的动物中最严重，在施用RabFab-VG1的动物中呈中度，并且在施用RabFab-VG1+10kDa HA的动物中呈轻度至中度。在镜检中，除炎症以外，WT VG1和RabFab-VG1分别存在显著的视网膜坏死和视网膜变性，其与ERG幅值减小相关。研究结束时，RabFab-VG1+10kDa HA眼睛中不存在活动性前葡萄膜炎的体征，并且仅观察到极轻微的慢性后葡萄膜炎。尽管这些结果的解释与第15天针对所有试验品的ADA观察结果混淆，但RabFab-VG1与10kDa HA的预复合或结合似乎的确改善了该Fab-HABD在兔眼中的耐受性。
Fab-VG1的脑保留
通过小鼠脑室内注射测试通过VG1进行HA结合以实现在脑中保留的能力。出于这些目的，将非标靶结合抗体抗单纯疱疹病毒-1糖蛋白D(抗gD)用为Fab片段(抗gD Fab)、完整IgG(抗gD IgG)或作为与VG1的融合蛋白(抗gD Fab-VG1；BRD)。
A.材料与方法
A.1.动物
在这些研究中使用的野生型C57BL/6小鼠获自堪萨斯大学繁殖群。使用活体动物的方案(AUS 75-15；批准日期：2021年1月25日)获得堪萨斯大学机构动物护理与使用委员会(IACUC)的批准。所有动物都由动物护理单位(ACU)人员和兽医在温度控制的环境下进行照护，其中采用12小时暗/光循环，并且动物不受限制地获得饲料和水。
A.2.抗体与IRDye800CW NHS酯的结合
根据制造商的说明，将抗体与IRDye800结合。简言之，将抗体在含有10％磷酸钾缓冲剂pH 9(v/v)的PBS中与IRDye800在25℃下反应2小时。使用截留分子量为7kDa的ZebaSpin脱盐柱(Fisher Scientific)去除多余的染料。使用SDS-PAGE评估结合的抗体纯度。使用Odyssey CLx NIR扫描仪在800nm下扫描SDS-PAGE凝胶，确认所有多余的染料都已去除。
A.3.脑室内注射
使用1.5-2％异氟醚麻醉5-10周龄的健康C57BL/6小鼠并将其放入立体定位仪(Stoelting Co.)中。做中线矢状切口以暴露小鼠的头骨并标识前囟。在颅骨右侧1.0mm和前囟前0.3mm处开一个小孔。将带有33号可拆卸针头的10μL Hamilton注射器(编号7762-06)装配到立体定位仪上，并用于将5μL浓度为1mg/mL的抗体溶液注入小鼠侧脑室2.25mm的深度。以1μL/min的速率输注抗体。在临安乐死前，将来自下颌下静脉的血样(约100μL)采集到含有肝素锂作为抗凝剂的冷冻血浆收集管中。将样品保存在冰上直至以10000×g离心3分钟，并将血浆储存于-80℃直至分析。在不同时间点之后，用4-5％异氟醚深度麻醉小鼠的同时经由经心灌注含0.1％ Tween-20的HBSS冰冷溶液以牺牲小鼠。收集脑、心、肺、肝、脾和肾并保存在冰上直至分析。
A.4.抗体器官定量
对分离的器官称重，并在1mL PBS中机械均质化。标准近红外荧光(NIRF)抗体溶液通过用不同量的PBS稀释储备液来制得。然后在96孔板中通过将10μL标准溶液添加至100μL均质空白器官中并使用Odyssey Clx扫描仪扫描各孔，为每个器官生成校准曲线。将各孔的荧光强度与每克器官的抗体浓度制图以获得线性曲线。对来自接受脑室内注射的小鼠的器官与校准曲线进行比较，以确定抗体沉积。类似地，用首先稀释5倍的空白血浆进行血浆分析。然后，向100μL稀释血浆的等分试样中添加10μL抗体标准品以生成标准曲线，与接受脑室内注射的小鼠的血浆样品进行比较。
B.结果
如图17所示，与等效剂量的抗gD Fab(SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121)或抗gDIgG(SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:122)相比，抗gD Fab-VG1(BRD；SEQ ID NO:121和SEQ IDNO:124)在脑中持续时间更长，并提供更大的暴露水平(以曲线下面积(AUC)表示)。这些暴露水平的差异具有统计学显著性，抗gD Fab-VG1与抗gD Fab相比，p值小于0.01；抗gD Fab-VG1与抗gD IgG相比，p值小于0.001。
实例18.VG1亲和变体的生成
A.材料与方法
A.1.WT VG1的结晶和HA结合残基的鉴定
使用商业结晶筛选(Hampton Research和Qiagen)确定与HA结合的WT VG1的结晶条件。HA结合的VCAN的结构系通过用HA6-mer浸泡晶体获得。收获晶体并在不含冷冻保护剂的液氮中快速冷冻。使用Stanford同步辐射光源(SSRL)光束线12-2或14-1，分别在Pilatus6M或Eiger 16M检测器(Dectris)上收集衍射数据。通过在COOT中建立模型对结构进行迭代细化，然后用REFMAC5、BUSTER或Phenix-Refine进行精修。Adams,P.D.等人,ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.,66(Pt 2):213-221(2010)；Blanc,E.等人,ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.,60:2210-2221(2004)；Emsley,P.等人,ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.,66:486-501(2010)；Emsley和Cowtan,ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.,66:2126-2132(2004)；Murshudov,G.N.等人,ActaCrystallogr.D Biol.Crystallogr.,67:355-367,(2011)。
使用PyMol和/或Chimera分析WT VG1-HA缀合物结构(图18)，并基于氢键、静电和疏水性相互作用电位鉴定与HA发生相互作用的残基。
A.2.微差扫描荧光法(DSF)
使用微差扫描荧光(DSF)测量WT VG1和单一氨基酸变体的热稳定性。简言之，将0.1mg/mL纯化的蛋白质与Sypro Orange染料在PBS中混合。在25℃至95℃的温度梯度范围内以0.05°/秒的增量处理各样品，并在585nm下监测荧光的增加。使用自定义excel宏将原始荧光单位绘制为负导数并计算Tm。
A.3.基于WT VG1-HA缀合物晶体结构设计的VG1变体
根据WT VG1-HA缀合物晶体结构(图18)，发现HA仅结合至link1结构域。因此，使用建模来预测可能参与HA结合的link 2残基。为验证晶体结构并鉴定减弱WT VG1的HA结合亲和力的突变体，使晶体接触的残基突变为丙氨酸，或在一些情况下，突变为替代氨基酸。此外，一些WT VG1残基与HA不产生晶体接触但对于TSG6中的HA结合很重要(基于VG1连接域结构与TSG-6连接结构域之间的序列比对；图8B)，它们也突变为丙氨酸。为检查突变的组合效应，形成几种双位点突变体，例如Lys260和Phe261分别变成Arg和Tyr(KF260RY)，并测试HA结合能力。表22列出如实例10中所述的方法所产生的VG1变体。产生和测试的VG1变体的氨基酸序列比对如图19所示。
Figure BDA0004179509630001201
Figure BDA0004179509630001211
A.4.分子特性
如实例10中所述，通过SPR测量HA结合。注射突变体120秒并监测解离180秒。
B.结果
B.1.VG1变体具有降低的HA结合水平
突变体R160A、Y161A和D197A在2至7μM范围内表现出减弱的HA结合。表23示出通过SPR所测得的各VG1变体的实测ka(M-1s-1)、kd(s-1)和KD(M)。
Figure BDA0004179509630001212
Figure BDA0004179509630001221
B.2.VG1变体的稳定性
表24使出产生的VG1突变体以及各突变体的实测Tm(解链温度；℃)。虽然大多数突变相较于WT VG1对热稳定性的影响轻微降低或无影响，但Y208A和H306A的Tm分别表现出2.16℃和2.81℃的改善。
Figure BDA0004179509630001222
Figure BDA0004179509630001231
均等形式
认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本实施例。前述说明和实例详述了某些实施例并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解的是，无论前述内容在文本中的详细程度如何，实施例皆可以多种方式实践，并应根据所附权利要求书及其任何均等形式进行解释。
如本文所使用，术语“约”系指数值(包括例如整数、分数和百分比)，无论是否明确指出皆如此。术语“约”一般是指本领域普通技术人员将认为等同于所述值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所述范围+/-5-10％)。当诸如“至少”和“约”等术语位于数值或范围列表之前时，这些术语将修改列表中所提供的所有值或范围。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入到最接近的有效数字的数值。

Claims (95)

1.一种靶向患者的组织的治疗分子，其包含透明质酸结合结构域和治疗活性剂，其中所述透明质酸结合结构域包含多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域。
2.一种靶向患者的组织的治疗分子，其包含透明质酸结合结构域和治疗活性剂，其中所述透明质酸结合结构域包含经由HA-结合结构域结合至透明质酸的多功能蛋白聚糖的至少两个连接结构域。
3.根据权利要求1或2所述的治疗分子，其中所述透明质酸的范围为从400Da至200kDa。
4.根据权利要求3所述的治疗分子，其中所述透明质酸为至少5kDa。
5.根据权利要求3或4所述的治疗分子，其中所述透明质酸为10kDa。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸对所述多功能蛋白聚糖的连接结构域提供摩尔过量的结合当量。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸允许范围为从1.5:1至1:1的透明质酸与治疗分子的比例。
8.86根据权利要求1至7中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域具有10nM至10μM的KD。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域具有5nM至8μM的KD。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域具有100nM至5μM的KD。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域与SEQ ID NO:86、60、32或29至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域与86、60、32或29至少95％相同。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个突变。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含1个至3个突变，其中所述1个至3个突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代和截短。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含1个至5个突变，其中所述1个至5个突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代和截短。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域具有相对于SEQ ID NO:29的截短突变。
17.根据16所述的治疗分子，其中所述截短突变包含在N末端上的1个至129个氨基酸的截短。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域为截短序列，其中不存在野生型多功能蛋白聚糖的Ig结构域。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下氨基酸中的至少一个：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下氨基酸中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、Y230、F261、D295和R233。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下位置中的至少一个中的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下位置中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个中的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下位置中的2个、3个、4个、5个或6个突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下突变中的至少一个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含Y208A和H306A中的至少一个。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下突变中的至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域包含相对于SEQ ID NO:29的以下突变中的至少2个、3个、4个、5个或6个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
28.根据任一项权利要求1至27中所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或SEQID NO:59。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂包含寡肽、蛋白质或核酸。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂包含抗体、抗原结合片段、半胱氨酸结肽、生长因子或适体。
31.根据30所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂能够结合抗原。
32.根据31所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂能够结合结合VEGF、HtrA1、IL-33、C5、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF或ANG2。
33.根据权利要求31或32所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂为抗体或其抗原结合片段(包括但不限于Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、VhH片段、scFv片段、scFv-Fc片段或微型抗体)。
34.根据权利要求31或32所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂为寡肽或蛋白质。
35.根据权利要求29或34所述的治疗分子，其中所述寡肽或蛋白质为半胱氨酸结肽或酶。
36.根据113所述的治疗分子，其中所述半胱氨酸结肽与SEQ ID NO:92至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
37.根据权利要求1至108中任一项所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂为生长因子，所述生长因子包含成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子(NGF)、VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)以及胰岛素样生长因子I(IGF-I)。
38.根据110所述的治疗分子，其中结合VEGF的所述治疗活性剂包含雷珠单抗、阿柏西普、布洛赛珠单抗-dbll和贝伐珠单抗。
39.根据权利要求1至110中任一项所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂为核酸。
40.根据117所述的治疗分子，其中所述核酸为适体、反义寡核苷酸和/或锁核酸。
41.根据118所述的治疗分子，其中所述适体结合VEGF。
42.根据权利要求108、118或119中任一项所述的治疗分子，其中所述适体经聚乙二醇化。
43.根据权利要求108或118至120中任一项所述的治疗分子，其中所述适体为
Figure FDA0004179509620000051
44.根据权利要求1至121中任一项所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂与所述透明质酸结合结构域经由接头共价地连接。
45.根据122所述的治疗分子，其中所述接头为至少4个氨基酸。
46.根据122或123所述的治疗分子，其中所述接头不长于50个氨基酸。
47.根据权利要求122至124中任一项所述的治疗分子，其中所述接头为4个至25个氨基酸。
48.根据权利要求122至125中任一项所述的治疗分子，其中所述接头包含(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3、4、5或6，且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，且m＝0、1、2或3)。
49.根据权利要求122至126中任一项所述的治疗分子，其中所述接头包含GGGS(SEQ IDNO:84)或其多聚体，更尤其包含(GGGGS)3(SEQ ID NO:85)。
50.根据权利要求122至125中任一项所述的治疗分子，其中所述接头包含(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
51.根据权利要求122至125或128中任一项所述的治疗分子，其中所述接头包含GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:95)。
52.根据权利要求1至107中任一项所述的治疗分子，其中所述治疗活性剂包含抗VEGF抗原结合部分和半胱氨酸结肽。
53.根据权利要求30、35、36或52所述的治疗分子，其中所述半胱氨酸结肽与所述透明质酸结合结构域经由接头连接，所述接头包含序列GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:95)。
54.根据权利要求52或53所述的治疗分子，其中所述序列包含(a)抗VEGF抗原结合部分；以及(b)与SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的治疗分子，其中所述透明质酸结合结构域能够非共价地结合至透明质酸。
56.一种递送靶向患者的组织的治疗分子的方法，其包括将根据权利要求1至133中任一项所述的治疗分子施用于所述患者，并且允许所述治疗分子向靶组织提供治疗活性剂的长效递送。
57.根据权利要求56所述的方法，其进一步包括在施用步骤之前将所述治疗分子与透明质酸结合。
58.根据权利要求57所述的方法，其进一步包括将包含所述治疗分子的第一溶液与包含所述透明质酸的第二溶液混合。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述混合包括容器。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述容器为两室注射器。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述混合产生结合至透明质酸的治疗分子，所述治疗分子准备用于施用于受试者。
62.根据权利要求56至61中任一项所述的方法，其中所述施用步骤为单次注射。
63.根据权利要求56至62中任一项所述的方法，其中所述靶组织包括眼睛或大脑。
64.根据权利要求56至63中任一项所述的方法，其中相较于未经修饰的治疗活性剂，所述治疗分子提供改善的玻璃体兼容性、更长的玻璃体停留时间、更长的玻璃体半衰期和/或改善的药理作用持续时间。
65.一种治疗分子，其包含：
a.能够结合至眼睛中的治疗靶点的第一组分，
b.能够结合至透明质酸的一种或多种第二组分，其中所述一种或多种第二组分共价地结合至所述第一组分，以及
c.任选地，包含透明质酸的一种或多种第三组分，
其中，如果存在一种或多种第三组分，则所述一种或多种第三组分非共价地结合至所述一种或多种第二组分。
66.根据权利要求65所述的治疗分子，其中所述第一组分为蛋白质、肽、受体或其片段、受体的配体、darpin、核酸、RNA、DNA或适体。
67.根据权利要求65或67所述的治疗分子，其中所述第一组分选自抗体、抗原结合片段，特别地抗体片段，更特别地至少缺乏Fc结构域的抗体片段，尤其地其中所述片段为或包含(Fab')2片段、Fab'片段、Fab片段、VhH片段、scFv片段、scFv-Fc片段以及微型抗体，更特别地Fab片段。
68.根据权利要求65至68中任一项所述的治疗分子，其中所述第二组分包含透明质酸受体CD44(CD44)结构域、脑特异性连接蛋白(BRAL1)结构域、肿瘤坏死因子刺激基因6(TSG-6)结构域、淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)结构域或透明质酸结合蛋白(HABP)结构域、聚集蛋白聚糖G1(AG1)结构域或多功能蛋白聚糖G1(VG1)结构域。
69.根据权利要求65至69中任一项所述的治疗分子，其中缀合物包含一种第二组分或两种彼此相同的第二组分。
70.根据权利要求65至69中任一项所述的治疗分子，其中所述第三组分为透明质酸，其中所述透明质酸
a.具有以下分子量：
i.选自3kDa至60kDa、4kDa至30kDa、5kDa至20kDa或400Da至200kDa；
ii.是至少2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa或9kDa；或
iii.是至多60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、20kDa或15kDa；
b.对所述一种或两种第二组分提供摩尔过量的结合当量；以及
c.具有减少眼睛中透明质酸降解的修饰。
71.根据权利要求65至69中任一项所述的治疗分子，其中所述第二组分能够以10nM至10μM、5nM至8μM或100nM至5μM的KD结合至透明质酸。
72.根据权利要求65至71中任一项所述的治疗分子，其中
a.所述第一组分和所述第二组分包含在融合蛋白中，特别地其中第二组分中的一种或两种共价地结合至所述第一组分的N末端和/或C末端，更特别地其中所述第一组分为抗体或抗原结合片段，并且其中所述一种或两种第二组分共价地结合至所述第一组分的C末端；和/或
b.所述一种或两种第二组分直接地结合至所述第一组分或经由接头间接地结合至所述第一组分，所述接头特别地为至少4个氨基酸和/或至多50个或至多25个氨基酸的接头，更特别地所述接头为(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，
(x＝3，n＝3、4、5或6，且m＝0、1、2或3)或(x＝4，n＝2、3、4或5，且m＝0、1、2或3)。
73.根据权利要求65至72中任一项所述的治疗分子，其中所述治疗靶点为VEGF、C2、C3a、C3b、C5、C5a、HtrA1、IL-33、因子P、因子D、EPO、EPOR、IL-1β、IL-17A、IL-10、TNFα、FGFR2、PDGF或ANG2。
74.根据权利要求65至73中任一项所述的治疗分子，其中
a.所述第一组分为抗VEGF的抗体或抗原结合片段；和/或
b.所述一种或两种第二组分中的每一者包含CD44结构域或TSG-6结构域或VG1结构域；和/或
c.所述第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸。
75.根据权利要求65至74中任一项所述的治疗分子，其中
a.所述第一组分为抗VEGF抗体或抗原结合片段，所述一种或两种第二组分包含CD44结构域，并且所述第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸；
b.所述第一组分为抗VEGF抗体或抗原结合片段，所述一种或两种第二组分包含TSG-6结构域，并且所述第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸；或
c.所述第一组分为抗VEGF抗体或抗原结合片段，所述一种或两种第二组分包含VG1结构域，并且所述第三组分是分子量为5kDa至20kDa的透明质酸。
76.根据权利要求65至75中任一项所述的治疗分子，其中
a.所述第一组分包含
i.SEQ ID NO:97、99、105、109或114的VH结构域；以及
ii.SEQ ID NO:98、100、106、110或115的VL结构域；并且
b.所述第二组分包含SEQ ID NO:2。
77.根据权利要求65至75中任一项所述的治疗分子，其中
a.所述第一组分包含
i.SEQ ID NO:97、99、105、109或114的VH结构域；以及
ii.SEQ ID NO:98、100、106、110或115的VL结构域；并且
b.所述第二组分包含SEQ ID NO:4。
78.根据权利要求65至75中任一项所述的治疗分子，其中
a.所述第一组分包含
i.SEQ ID NO:97、99、105、109或114的VH结构域；以及
ii.SEQ ID NO:98、100、106、110或115的VL结构域；并且
b.所述第二组分包含SEQ ID NO:86、60、32或29。
79.根据权利要求78所述的治疗分子，其中所述第二组分与SEQ ID NO:86、60、32或29至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
80.根据权利要求78或79所述的治疗分子，其中所述第二组分包含1个至5个突变，其中所述1个至5个突变包含单氨基酸取代、双氨基酸取代和/或截短。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的治疗分子，其中所述第二组分具有相对于SEQID NO:29的截短突变。
82.根据权利要求81所述的治疗分子，其中所述截短突变包含在N末端上的1个至129个氨基酸的截短。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的治疗分子，其中所述第二组分为截短序列，其中不存在野生型多功能蛋白聚糖的Ig结构域。
84.根据权利要求78至83中任一项所述的治疗分子，其中所述第二组分包含相对于SEQID NO:29的以下位置中的1个、2个、3个、4个、5个或6个中的突变：R160、Y161、E194、D197、Y208、R214、M222、Y230、R233、K260、F261、D295、Y296、H306、R312、L325、Y326和R327。
85.根据权利要求78至84中任一项所述的治疗分子，其中所述第二组分包含相对于SEQID NO:29的以下突变中的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个：R160A、Y161A、D197A、D197S、Y208A、Y208F、R214K、M222A、Y230A、Y230F、R233A、K260A、K260R、F261Y、KF260RY、D295A、D295S、Y296A、Y296F、DY295SF、H306A、R312A、L325A、Y326A、R327A和LYR325LFK。
86.根据权利要求78至85中任一项所述的治疗分子，其中所述第二组分包含Y208A和H306A中的至少一个。
87.根据权利要求78或79所述的治疗分子，其中所述第二组分为SEQID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58或SEQ ID NO:59。
88.根据权利要求65至87中任一项所述的治疗分子，其中所述第一组分进一步包含半胱氨酸结肽。
89.根据权利要求88所述的治疗分子，其中所述半胱氨酸结肽与SEQID NO:92具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
90.根据权利要求88或89所述的治疗分子，其中氨基酸序列包含与SEQ ID NO:93或SEQID NO:94至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
91.一种用作药物的组合物，所述组合物包含根据权利要求65至90中任一项所述的治疗分子和任选的药用赋形剂、稀释剂或载体。
92.一种用于治疗眼睛疾病或脑疾病的组合物，所述组合物包含根据权利要求65至90中任一项所述的治疗分子和任选的药用赋形剂、稀释剂或载体。
93.根据权利要求92所使用的所述组合物，其配制用于眼内递送，特别地用于玻璃体内注射。
94.根据权利要求92或93所使用的所述组合物，其中所述眼睛疾病为年龄相关性黄斑变性(AMD)，特别地为湿性AMD或新生血管性AMD，糖尿病性黄斑水肿(DME)，糖尿病性视网膜病变(DR)，特别地为增生性DR或非增生性DR，视网膜静脉阻塞(RVO)或地图状萎缩(GA)。
95.一种递送靶向患者的组织的治疗分子的方法，其包括将根据权利要求65至90中任一项所述的治疗分子或根据权利要求91至94中任一项所述的组合物施用于患者，并允许所述治疗分子向靶组织提供第一组分的长效递送。
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