CN116333826B - 一种用于磁微粒免疫诊断的清洗液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，具体涉及一种用于磁微粒免疫诊断的清洗液。本发明提供的清洗液包括蛋白变性剂和缓冲溶液，适用于磁微粒免疫诊断当中。与现有清洗液相比，本清洗液原材料价廉易得，同时检测结果精密准确，可长期稳定保存，适用于临床医学诊断项目中，降低非特异性吸附、提高免疫诊断的抗干扰性和准确性。

Description

一种用于磁微粒免疫诊断的清洗液

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种用于磁微粒免疫诊断的清洗液。

背景技术

磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的胶态复合材料，其可均匀分散于一定基液中，具有高度稳定性。人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团(如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等)固定酶、抗体等具有生物活性的物质。其中悬浮性磁微粒具有较高的比表面积，其作为载体能够更为充分地与样品反应，与酶标板载体相比具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。

目前常用的清洗液是在pH缓冲液中添加特定作用的物质配制而成，所谓特定作用的物质一般是解决反应体系出现的某一特定问题而添加的相应物质。比如通过在缓冲液中添加适量的表面活性剂，可起到增加亲水力的作用；也可同时添加几种物质，通过它们之间的相互协同作用共同解决相关的问题，如同时添加糖和聚乙二醇作为保护剂，可以增加亲水力，添加一定浓度的叠氮化钠作为防腐剂可起到抑菌作用。

免疫检测分析仪是临床检验最常用的仪器之一，为临床提供了许多具有临床价值的参数，对疾病的诊断治疗具有重要的意义。但在实际工作中常常会受到一些异常因素的干扰，如在临床检验过程中经常会因标本自身的干扰因素导致错误的结果判定。具体比如免疫球蛋白的干扰、巨球蛋白血症和多发性骨髓瘤导致的血浆中IgM增高、高浓度的免疫球蛋白干扰抗原和抗体的结合作用进而引起检测结果假性增高或降低。另外血浆内大量的纤维蛋白原也会影响磁微粒的免疫反应速度及均一性，进而影响到抗原抗体的结合，处理不当甚至会出现非特异性结合。

因此，提供一种原材料价廉易得，同时检测结果精确可靠，可长期稳定保存，并且可通用于不同的磁微粒免疫诊断项目，降低非特异性吸附的清洗液，对于临床医学诊断具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种清洗液。该清洗液包括蛋白变性剂和缓冲溶液，可用于临床医学诊断中实现降低非特异性吸附，提高磁微粒免疫诊断的抗干扰性和准确性。

为此，本发明第一方面提供一种清洗液，所述清洗液包括蛋白变性剂和缓冲溶液，所述蛋白变性剂包括丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸。

与现有清洗液相比，本发明提供的清洗液包含特定的组分，用于磁微粒免疫诊断中时，可降低非特异性吸附，减少假阳性或假阴性检测结果出现，提高检测结果灵敏度，且可长期稳定保存，在临床医学诊断领域具有巨大潜力。

根据本发明的实施方案，所述丙酮的质量百分比为1.0％-3.0％，所述二硫苏糖醇的质量百分比为0.01％-0.1％，所述巯基乙醇的质量百分比为0.1％-1.0％，所述尿素的质量百分比为1.0％-6.0％，所述十二烷基硫酸钠的质量百分比为0.01％-1.0％，所述3-巯基丙酸的质量百分比为0.01％-0.1％。

根据本发明的优选的实施方案，所述丙酮的质量百分比为2.0％-3.0％，所述二硫苏糖醇的质量百分比为0.06％-0.1％，所述巯基乙醇质量百分比为0.6％-1.0％，所述尿素的质量百分比为3.0％-6.0％，所述十二烷基硫酸钠的质量百分比为0.06％-1.0％，所述3-巯基丙酸的质量百分比为0.05％-0.1％。

根据本发明的实施方案，所述缓冲溶液包括选自磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述缓冲溶液浓度为0.1-0.5mol/L。

根据本发明的优选的实施方案，所述缓冲溶液浓度为0.1-0.2mol/L。

根据本发明的实施方案，所述清洗液的pH值为7.0-9.0。

根据本发明的实施方案，所述清洗液还包括表面活性剂和/或防腐剂。

根据本发明的实施方案，所述表面活性剂包括选自吐温20、吐温80、Triton X-100中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述防腐剂包括选自Proclin300、叠氮化钠中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述表面活性剂的质量百分比为0.05-0.1％，所述防腐剂的质量百分比为0.1-0.5％。

根据本发明的优选的实施方案，所述表面活性剂的质量百分比为0.05％，所述防腐剂的质量百分比为0.1％。

本发明第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的清洗液。

本发明第三方面提供第一方面所述的清洗液在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒为磁微粒检测试剂盒。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了经本发明实施例1配制的清洗液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关性；

图2显示了经本发明实施例2配制的清洗液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关性；

图3显示了经本发明实施例3配制的清洗液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关性；

图4显示了经本发明实施例4配制的清洗液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关性；

图5显示了经本发明实施例5配制的清洗液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关性；

图6显示了经常规缓冲溶液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关性。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，蛋白变性剂和缓冲溶液的含量均按照配制完成后的清洗液总重量计。

根据本发明的实施例，本发明第一方面提供一种清洗液，所述清洗液包括蛋白变性剂和缓冲溶液，所述蛋白变性剂包括丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸。

发明人发现，清洗液中蛋白变性剂含量过高或过低容易对磁微粒的清洗效果产生影响，蛋白变性剂过低，清洗液将不能改变干扰蛋白的理化性质，从而导致洗涤效果差；蛋白变性剂的含量过高将提高清洗液的生产成本。本发明选择的蛋白变性剂含量在降低清洗液生产成本的同时也保持了良好的清洗效果。

根据本发明的实施例，所述丙酮的质量百分比为1.0％-3.0％，所述二硫苏糖醇的质量百分比为0.01％-0.1％，所述巯基乙醇的质量百分比为0.1％-1.0％，所述尿素的质量百分比为1.0％-6.0％，所述十二烷基硫酸钠的质量百分比为0.01％-1.0％，所述3-巯基丙酸的质量百分比为0.01％-0.1％。

根据本发明的优选的实施例，所述丙酮的质量百分比为2.0％-3.0％，所述二硫苏糖醇的质量百分比为0.06％-0.1％，所述巯基乙醇质量百分比为0.6％-1.0％，所述尿素的质量百分比为3.0％-6.0％，所述十二烷基硫酸钠的质量百分比为0.06％-1.0％，所述3-巯基丙酸的质量百分比为0.05％-0.1％。

根据本发明的实施例，所述缓冲溶液包括选自磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述缓冲溶液浓度为0.1-0.5mol/L。

根据本发明的优选的实施例，所述缓冲溶液浓度为0.1-0.2mol/L。

根据本发明的实施例，所述清洗液的pH值为7.0-9.0。

根据本发明的实施例，所述清洗液还包括表面活性剂和/或防腐剂。

根据本发明的实施例，所述表面活性剂包括选自吐温20、吐温80、Triton X-100中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述防腐剂包括选自Proclin300、叠氮化钠中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述表面活性剂的质量百分比为0.05-0.1％，所述防腐剂的质量百分比为0.1-0.5％。

根据本发明的优选的实施例，所述表面活性剂的质量百分比为0.05％，所述防腐剂的质量百分比为0.1％。

根据本发明的实施例，本发明第二方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的清洗液。

根据本发明的实施例，本发明第三方面提供第一方面所述的清洗液在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒为磁微粒检测试剂盒。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

0.1M的磷酸盐缓冲溶液中加入丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸、叠氮化钠、吐温20，充分混匀，调节pH值为7.4。其中，丙酮质量百分比为1.0％，二硫苏糖醇质量百分比为0.01％，巯基乙醇质量百分比为0.1％，尿素质量百分比为1.0％，十二烷基硫酸钠质量百分比为0.01％，3-巯基丙酸质量百分比为0.01％，叠氮化钠质量百分比为0.1％，吐温20质量百分比为0.05％。

实施例2

0.1M的磷酸盐缓冲溶液中加入丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸、叠氮化钠、吐温20，充分混匀，调节pH值为7.4。其中，丙酮质量百分比为1.5％，二硫苏糖醇质量百分比为0.03％，巯基乙醇质量百分比为0.3％，尿素质量百分比为2.0％，十二烷基硫酸钠质量百分比为0.03％，3-巯基丙酸质量百分比为0.03％，叠氮化钠质量百分比为0.1％，吐温20质量百分比为0.05％。

实施例3

0.1M的磷酸盐缓冲溶液中加入丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸、叠氮化钠、吐温20，充分混匀，调节pH值为7.4。其中，丙酮质量百分比为2％，二硫苏糖醇质量百分比为0.06％，巯基乙醇质量百分比为0.6％，尿素质量百分比为3.0％，十二烷基硫酸钠质量百分比为0.06％，3-巯基丙酸质量百分比为0.05％，叠氮化钠质量百分比为0.1％，吐温20质量百分比为0.05％。

实施例4

在0.1M的磷酸盐缓冲溶液中加入丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸、叠氮化钠、吐温20，充分混匀，调节pH值为7.4。其中，丙酮质量百分比为3％，二硫苏糖醇质量百分比为0.09％，巯基乙醇质量百分比为0.9％，尿素质量百分比为5.0％，十二烷基硫酸钠质量百分比为0.09％，3-巯基丙酸质量百分比为0.08％，叠氮化钠质量百分比为0.1％，吐温20质量百分比为0.05％。

实施例5

在0.1M的磷酸盐缓冲溶液中加入丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸、叠氮化钠、吐温20，充分混匀，调节pH值为7.4。其中，丙酮质量百分比为3％，二硫苏糖醇质量百分比为0.1％，巯基乙醇质量百分比为1.0％，尿素质量百分比为6.0％，十二烷基硫酸钠质量百分比为1.0％，3-巯基丙酸质量百分比为0.1％，叠氮化钠质量百分比为0.1％，吐温20质量百分比为0.05％。

实施例6

根据本发明的一些具体实施例，清洗液的使用方法如下：

采用全自动化学发光免疫分析仪SMART 500H自动实现免疫反应的加样以及后续的清洗和读值步骤。

(1)加样：全自动化学发光免疫分析仪将性能验证所用的标本、甲胎蛋白(AFP)抗体偶联的磁微粒与碱性磷酸酶偶联的抗体依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；

(2)清洗：使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，加入500μL清洗液，去除磁场，然后再次使磁微粒在磁场中沉降，去除上清液；如此重复清洗2-4次，以去除未结合的抗体偶联物和杂质；

(3)读值：加入发光底物液200μL，碱性磷酸酶催化一定浓度的APS-5底物发光后采用全自动化学发光免疫分析仪测定标本的发光强度和浓度值。

性能探索实验以常规缓冲溶液进行对照实验，配制方法为：在0.1M的磷酸盐缓冲溶液中加叠氮化钠和吐温20，充分混匀，调节pH值为7.4。其中叠氮化钠质量百分比为0.1％，吐温20质量百分比为0.05％。

1、本底验证

测试20次空白标本(不含AFP)，将20次测试结果取均值，比较经实施例1-5配制的清洗液处理及常规缓冲溶液处理的发光值大小，实验结果如表1所示。

表1缓冲溶液与实施例清洗液本底验证结果

实验结果表明，经实施例1-5配制的清洗液处理后的样本发光值均低于经常规缓冲溶液处理后的样本发光值，表明采用本发明方案制备的清洗液具有更好的清洗效果。同时经实施例1-5配制的清洗液处理后的样本发光值也存在差异，其中经实施例5配制的清洗液的清洗效果最佳。

2、抗干扰测试

从磁微粒免疫诊断试剂中挑选AFP进行以下实验。

收集39例标本，经检验中心检测标定浓度值并作为检测样本。在样本中分别添加血红蛋白、胆红素和甘油三酯作为实验组样本，其中实验组样本血红蛋白的终浓度为1000mg/dL、胆红素的终浓度为50mg/dL、甘油三酯的终浓度为3000mg/dL。比较经实施例1-5配制的清洗液处理及缓冲溶液处理的浓度值与标定样本浓度的相关性及相对偏差，具体结果参见表2和表3，图1-6。

三种干扰物来源信息如下：

血红蛋白，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

胆红素，购自国药集团化学试剂北京有限公司。

甘油三脂，购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

表2缓冲溶液与实施例清洗液抗干扰测试结果

表3缓冲溶液与实施例清洗液检测结果与标定样本浓度的相对偏差

实验结果表明，实施例1-5配制的清洗液处理测定的样本浓度与标定样本浓度相近，数值相对偏差基本在5％以内，而经缓冲溶液处理的样本浓度则相差较大，部分数值相对偏差达到近20％。同时经实施例1-5配制的清洗液处理及缓冲溶液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关系数分别为0.9986、0.9986、0.9998、0.9998、0.9989、0.9888，以及判定系数分别为0.9972、0.9972、0.9995、0.9996、0.9978、0.9778(图1-6)。以上结果表明相对于缓冲溶液而言，本发明提供的清洗液处理后测定的样本浓度与标定样本浓度的相关性更好，抗干扰性更强，测试准确度更高。

3、精密度验证

将AFP国家标准品(来源于中国食品药品检定研究院，编号为150542)配制成10ng/mL、100ng/mL和500ng/mL共3个浓度点，分别用前述的常规缓冲溶液、实施例1-5配制的清洗液对每个浓度样本重复测定10次，计算10次测定结果的平均值AVE和标准差SD，根据公式CV＝SD/AVE×100％得出变异系数CV。结果如表4-1、表4-2、表4-3所示：

表4-1缓冲溶液与实施例清洗液精密度验证结果

表4-2缓冲溶液与实施例清洗液精密度验证结果

表4-3缓冲溶液与实施例清洗液精密度验证结果

实验结果表明，经简单缓冲溶液清洗检测的结果与标准结果的符合率较差，而本发明提供的清洗液符合率较好，同时本发明提供的清洗液测试结果的标准差及变异系数均低于缓冲溶液，表明本发明提供的清洗液检测的精密度以及检测灵敏度明显优于缓冲溶液。

4、稳定性验证

将实施例1配制的清洗液与国外厂家贝克曼原装清洗液分别分装成3瓶，室温放置0个月、6个月、12个月进行检测。然后采用全自动化学发光仪分别对6瓶清洗液进行AFP项目精密度测定，重复检测10次，实验结果如表5-1、表5-2和表5-3所示。

表5-1进口贝克曼清洗液与实施例1配制的清洗液放置0个月精密度验证结果

表5-2进口贝克曼清洗液与实施例1配制的清洗液放置6个月精密度验证结果

表5-3进口贝克曼清洗液与实施例1配制的清洗液放置12个月精密度验证结果

实验结果表明，进口贝克曼清洗液和实施例1配制的清洗液分别室温放置6个月和12个月之后，进口贝克曼清洗液测试结果的精密度较差，而本发明提供的清洗液精密度良好，表明本发明提供的清洗液可保持长时间稳定。同时本发明提供的清洗液测试结果的标准差及变异系数均低于进口贝克曼清洗液，表明本发明提供的清洗液检测的精密度以及检测灵敏度明显优于贝克曼进口清洗液。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种清洗液，其特征在于，包括蛋白变性剂和缓冲溶液，所述蛋白变性剂包括丙酮、二硫苏糖醇、巯基乙醇、尿素、十二烷基硫酸钠、3-巯基丙酸；

其中，所述丙酮的质量百分比为2.0％-3.0％，所述二硫苏糖醇的质量百分比为0.06％-0.1％，所述巯基乙醇的质量百分比为0.6％-1.0％，所述尿素的质量百分比为3.0％-6.0％，所述十二烷基硫酸钠的质量百分比为0.06％-1.0％，所述3-巯基丙酸的质量百分比为0.05％-0.1％；

所述缓冲溶液浓度为0.1-0.5mol/L；

所述清洗液的pH值为7.0-9.0。

2.根据权利要求1所述的清洗液，其特征在于，所述缓冲溶液包括选自磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的清洗液，其特征在于，所述缓冲溶液浓度为0.1-0.2mol/L。

4.根据权利要求1-3任一项所述的清洗液，其特征在于，所述清洗液还包括表面活性剂和/或防腐剂。

5.根据权利要求4所述的清洗液，其特征在于，所述表面活性剂包括选自吐温20、吐温80、TritonX-100中的至少一种；

任选地，所述防腐剂包括选自Proclin300、叠氮化钠中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的清洗液，其特征在于，所述表面活性剂的质量百分比为0.05-0.1%，所述防腐剂的质量百分比为0.1-0.5%。

7.根据权利要求6所述的清洗液，其特征在于，所述表面活性剂的质量百分比为0.05%，所述防腐剂的质量百分比为0.1%。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7任一项所述的清洗液。

9.权利要求1-7任一项所述的清洗液在制备试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒为磁微粒检测试剂盒。