CN116323951A

CN116323951A - 生产l-谷氨酸的重组微生物及利用其生产l-谷氨酸的方法

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Publication number: CN116323951A
Application number: CN202180070938.9A
Authority: CN
Inventors: 权娜罗; 宋规显; 李珍南; 奉贤珠; 徐昌一; A·R·李
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2023-06-23
Also published as: TWI834985B; ZA202303416B; AU2021341221A1; BR112023004335A2; TW202210629A; MX2023002783A; US20230323413A1; CA3191344A1; JP2023540315A; EP4198132A4; JP7584632B2; WO2022055094A1; EP4198132A1; AU2021341221B2; AR123450A1

Abstract

本公开涉及一种生产L‑谷氨酸的重组微生物，其包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸，以及使用所述微生物生产L‑谷氨酸的方法。

Description

生产L-谷氨酸的重组微生物及利用其生产L-谷氨酸的方法

【技术领域】

本公开涉及包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸的生产L-谷氨酸的微生物以及利用该蛋白生产L-谷氨酸的方法。

【背景技术】

L-谷氨酸，它是发酵生产的代表性氨基酸，因其独特的口感，在食品领域自不必说，而且是在医药产品领域和其他动物饲料领域也广泛应用的重要氨基酸之一。已知通过使用棒杆菌属(Corynebacterium)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、青霉属(Penicillium)、克雷伯菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)或泛菌属(Pantoea)等的微生物来生产L-谷氨酸的方法(美国专利号3,220,929和6,682,912)。

目前正在进行各种研究，以开发高效生产L-谷氨酸的微生物和发酵工艺技术。例如，靶材料特异性方法，例如增加编码参与氨基酸生物合成的酶的基因的表达或去除棒杆菌属(Corynebacterium)微生物中氨基酸生物合成不需要的基因，主要用于提高L-谷氨酸的生产产量(美国专利号9109242B2和8030036B2)。

【发明内容】

【技术问题】

本发明人对生产高浓度L-谷氨酸进行了深入研究，结果，本发明人通过导入外源蛋白，开发出生产高浓度L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，从而完成了本公开。

【技术方案】

本公开的一个目的是提供一种生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物，所述重组微生物包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸。

本公开的另一目的是提供一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物，所述重组微生物包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸。

【有利效果】

所述包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸的生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物能以高收率生产L-谷氨酸，因此可以有利地用于L-谷氨酸的工业化生产。

【附图简述】

图1是pDCM2质粒的示意图。

【最佳模式】

本公开将具体描述如下。本公开中公开的每个描述和实施例也可以应用于其它描述和实施例。也就是说，本公开中公开的各种元素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不受以下具体描述的限制。此外，本领域技术人员将认识到或能够确定，通过使用不超过常规实验，许多等同于本文描述的本公开的具体实施方式。这些等同物旨在被本公开所包含。

根据本公开的一个方面，提供了一种生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物，所述重组微生物包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸。

如本文所用，术语“SbtA蛋白”是指，作为碳酸氢盐转运蛋白之一，通过促进HCO₃ ^-(一种膜不可渗透的碳酸氢盐)的膜通过而有助于加速二氧化碳(CO₂)处理，并为捕获和有效利用二氧化碳而被表达的蛋白质之一。碳酸氢盐转运蛋白包括SbtA蛋白、BicA蛋白等，它们将碳酸氢盐运输到细胞中，导致碳酸氢盐在细胞中积累。

在本公开中，所述SbtA蛋白可以是来源于不同于本公开的微生物的微生物的蛋白质，或者可以是不同于本公开的微生物中固有存在的蛋白质。

在本公开中，所述SbtA蛋白可以是来源于蓝细菌(Cyanobacteria)的蛋白，但不限于此。具体而言，SbtA蛋白可以是来源于集胞藻属(Synechocystis)微生物的蛋白质，更具体地说，它可以是来源于集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC 6803或集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC 6714的蛋白质。

本公开的SbtA蛋白可以包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：1的氨基酸序列可以从美国国立卫生研究院(NIH)GenBank获得，这是一个已知的数据库。具体地，与本公开的SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列可以是与SEQ ID NO:1具有至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96.26％、至少97％、至少97.5％、至少97.7％、至少97.8％、至少98％、至少98.5％、至少98.7％、至少98.8％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或至少99.8％但小于100％的同源性或同一性的氨基酸序列。例如，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％但小于100％同源性或同一性的氨基酸序列可以是SEQ ID NO：30的氨基酸序列。同样显而易见的是，当氨基酸序列具有这样的同源性或同一性并且显示出与SbtA蛋白或碳酸氢盐转运蛋白活性相等或相应的活性时，即使该氨基酸序列具有缺失、修饰、保守取代，或在其序列的一部分中添加，具有这样的氨基酸序列的蛋白也属于本公开的SbtA蛋白质。

本公开的SbtA蛋白可以具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。此外，本公开的SbtA蛋白可以具有、由或基本上由与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列组成。本公开的SbtA蛋白不排除在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的上游或下游添加无意义的序列(即，在氨基酸序列的N末端和/或C末端添加不改变蛋白质功能的序列)、或自然发生的突变或其沉默突变，或保守的替代。

在SbtA蛋白中，术语“保守取代”是指一种氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。这种氨基酸取代通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性而发生。通常，保守替代可能对蛋白质或多肽的活性几乎没有影响。

在本公开中，编码SbtA蛋白的多核苷酸可以是sbtA基因。此外，编码SbtA蛋白的多核苷酸可能来源于蓝细菌(Cyanobacteria)。具体地，本公开的编码SbtA蛋白的多核苷酸可以包含编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。具体地，编码本公开的SbtA蛋白的多核苷酸可以包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQID NO：31的核苷酸序列，或者与其具有至少90％同一性并编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列的核苷酸序列。包含编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸可以是具有编码与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列的核苷酸序列或由或基本上由编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列组成的多核苷酸。

本文所用的术语“多核苷酸”是指核苷酸单体通过共价键以链状连接并且具有预定长度或更长的DNA链的核苷酸的聚合物。

显然，当多核苷酸包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列、SEQ ID NO：31的核苷酸序列或与这些核苷酸序列具有至少90％同一性并编码与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列时，即使在每个核苷酸序列的一部分中存在缺失、修饰、保守取代或添加，这样的多核苷酸属于本公开的多核苷酸。在本发明的多核苷酸中，术语“保守替换”是指用具有类似结构和/或化学财产的另一核苷酸替换一个核苷酸。

本公开的多核苷酸可以在其编码区域内具有各种修饰，在该范围内，多核苷酸序列不因密码子简并性或考虑到由多核苷酸在其中表达的生物体所优选的密码子而改变。具体地，本公开的多核苷酸可以是含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸。

此外，本公开的多核苷酸可以包括但不限于能够与可从已知的sbtA基因序列获得的探针(例如，与部分或全部核苷酸序列互补的序列)在严格的条件下杂交，由此多核苷酸序列不是用于导入的微生物中的天然存在的序列，同时可以增加L-谷氨酸的生产能力的任何多核苷酸序列。

或者，本公开的多核苷酸可以包括但不限于任何能够与可从已知基因序列获得的探针(例如，与本公开的部分或全部多核苷酸序列互补的序列)在严格的条件下杂交的序列。术语“严格条件”是指使多核苷酸之间能够进行特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(见J.Sambrook et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。其实例可包括：具有较高同源性或同一性的多核苷酸，例如具有至少70％、至少75％、至少76％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的多核苷酸相互杂交，但具有较低同源性或同一性的多核苷酸不会相互杂交的条件；或在作为典型的蛋白印迹杂交的洗涤条件的对应于60℃，1×SSC，0.1％SDS，特别是60℃，0.1×SSC，0.1％SDS和更具体地是68℃，0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度和温度下进行一次(特别是两次或三次)洗涤的条件。

杂交需要取决于杂交的严格程度而即使可能存在核苷酸之间的错配，但两个核酸具有互补序列。术语“互补”用于说明可以相互杂交的核苷酸之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开的多核苷酸还可以不仅包括基本相似的核酸序列，而且包括与整个序列互补的分离核酸片段。

具体地，与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸可以通过在包括使用在T_m为55℃的杂交步骤的杂交条件，使用上述条件检测。此外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的进行适当调节。

杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度及其之间的互补程度，并且其变量是本领域公知的(例如，Sambrook等人，同上)。

本文所用的术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似程度，并且可以表示为百分比。术语同源性和同一性通常可以互换使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以使用标准比对算法来确定，并且由要使用的程序建立的默认间隙惩罚可以一起使用。基本上，同源或相同的序列通常可以在中度或高度严格的条件下全部或部分地相互杂交。很明显，杂交还包括与含有通常密码子或考虑多核苷酸中密码子简并性的多核苷酸杂交。

任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性，可以使用已知的计算机算法来确定，例如“FASTA”程序，使用Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444。或者，这可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定，该算法在欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS)包的Needleman程序中执行(Rice et alia,2000,Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.,et alia,Nucleic Acids Research12:387(1984)),)，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul,S.F.,et alia,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego,1994,and CARILLO et alia(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，同源性，相似性或同一性可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过比较序列信息来确定，例如，Needleman et alia,(1970),J Mol Biol.48:443,as known in Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482。简而言之，GAP程序将同源性，相似性或同一性定义为通过将相似排列的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可能包括：(1)一元比较矩阵(包含单位值1和非恒等值0)和Gribskovet alia(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵(如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical ResearchFoundation,pp.353-358(1979)中公开)(或NCBI NUC4.4 EMOSSS版本的取代矩阵)；(2)每个缺口的罚款为3.0，每个缺口中每个交易品种的额外罚款为0.10(或缺口开盘罚款为10，缺口扩展罚款为0.5)；(3)对末端差距不处罚。

本公开的重组微生物中所含的SbtA蛋白可以通过本领域已知的常规方法在棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物中表达。

本文所用的术语“表达”相对于蛋白质是指将靶蛋白质导入微生物或靶蛋白质被修饰以在微生物中表达的状态。为了本公开的目的，“靶蛋白”可以是上述SbtA蛋白。

如本文所用，术语“导入”相对于蛋白质是指将特定蛋白质的活性导入到不受该蛋白质活性的微生物中的。该术语也可以表示为不受蛋白质活性的微生物中特定蛋白质活性的增强。

蛋白质的导入可以通过向宿主细胞中导入编码表现出与蛋白质等效/相似活性的蛋白质的外源性多核苷酸或其密码子优化的突变型多核苷酸来进行。外源性多核苷酸可以不受其来源或序列的限制使用，只要外源性多核苷酸表现出与蛋白质相同/相似的活性。此外，为了优化宿主细胞中导入的外源性多核苷酸的转录和翻译，可以优化其密码子并将其导入宿主细胞。所述导入可以通过本领域技术人员适当选择的任何已知转化方法进行，并且通过在宿主细胞中导入的多核苷酸的表达，生产蛋白质，并且可以增强其活性。

本文所用的术语“增强”多肽的活性是指多肽的活性与其内源性活性相比的增加。增强可以与术语激活、上调、过表达、增加等互换使用。本文中的激活、增强、上调、过表达和增加可以包括以下所有内容：展示最初未拥有的活性；或表现出与内源性活性或修饰前活性相比有所改善的活性。“内源活性”是指母体菌株在修饰前最初具有的特定多肽的活性，或由于天然或人为因素引起的遗传变异而发生转化时未修饰的微生物的活性。该术语可与“修改前活性”互换使用。与多肽的内在活性相比，多肽活性的“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”是指母体菌株在修饰前最初具有的特定多肽或非修饰微生物的活性和/或浓度(表达水平)的改善。

增强可以通过导入外源性多肽或通过增强多肽的固有活性和/或其浓度(表达水平)来实现。多肽活性的增强可以通过相应多肽的活性程度或表达水平的增加或由相应多肽生产的产物的量来鉴定。

多肽活性的增强可以通过应用本领域公知的各种方法来实现，并且只要目标多肽的活性与预修饰微生物相比得到增强就不受限制。具体地，本领域技术人员熟知的基因工程和/或蛋白质工程，其作为分子生物学的常规方法，可以使用，但不限于此(例如，Sitnicka et alia,Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16,Sambrook et alia,Molecular Cloning 2012，等等)。

具体地，本公开的多肽活性的增强可以是：

(1)编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数增加；

(2)用具有强活性的序列替换编码多肽染色体上的基因表达控制区；

(3)对编码多肽的基因转录本的起始密码子或5'-UTR区的核苷酸序列进行修饰；

(4)对多肽的氨基酸序列进行修饰，从而增强多肽的活性；

(5)对编码多肽的多核苷酸序列进行修饰以增强多肽的活性(例如，对多肽基因的多核苷酸序列进行修饰以编码修饰的多肽以增强多肽的活性)；

(6)导入表现出多肽活性的外源多肽或编码该多肽的外源多核苷酸；

(7)对编码多肽的多核苷酸进行密码子优化；

(8)通过分析多肽的三级结构选择对暴露部位进行修饰或化学修饰；或

(9)选自第(1)项～第(8)项中的两种或两种以上的组合，但对其没有特别限制。

更具体地，这些描述如下。

编码第(1)项中的多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数的增加可以通过将可操作地连接编码相应多肽的多核苷酸并且可以独立于宿主复制和起作用的载体导入到宿主细胞中来实现。或者，第(1)项可以通过将编码相应的多肽的多核苷酸的一个拷贝或两个或多个拷贝导入到宿主细胞中的染色体中来实现。导入染色体的方式可以是将能够将多核苷酸插入宿主细胞染色体的载体导入宿主细胞，但不限于此。

第(2)项中用具有强活性的序列替换编码多肽的染色体上的基因表达控制区可以是，例如，通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合在序列中发生的突变，以进一步增强表达控制区的活性，或者用具有更强活性的序列进行替换。所述表达控制区可包括，但不特别限于，启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列等。例如，替换可以是用强启动子替换原始启动子，但不限于此。

强启动子的已知实例可以是CJ1至CJ7启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子，λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(US10584338 B2)、O2启动子(美国10273491B2)、tkt启动子和yccA启动子等，但不限于此。

编码起始密码子的核苷酸序列或编码第(3)项中多肽的基因转录物的5'-UTR区的修饰可以是，例如，用与内源性起始密码子相比能够使多肽的表达率更高的编码起始密码码的核苷酸序列取代，但不限于此。

第(4)项和第(5)项中氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是通过多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列中的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合发生的突变，以增强多肽的活性，或用修饰为具有更强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或修饰为具有增加活性的氨基酸顺序或多核苷酸顺序替换，但不限于此。具体地，可以通过同源重组将多核苷酸插入染色体来进行替换，但不限于此。本文中使用的载体还可以包括用于检查染色体插入的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即确认靶核酸分子是否已插入，并且可以使用赋予可选表型(例如耐药性、营养不足、细胞毒性药物耐药性、表面修饰蛋白表达等)的标记。在处理选择性试剂的情况下，只有能够表达选择标记的细胞才能存活或表达其他表型性状，从而能够轻松选择转化的细胞。

导入表现出第(6)项中多肽活性的外源性多肽可以是将编码多肽的外源性多核苷酸导入宿主细胞，该多肽表现出与多肽等效/相似的活性。外源性多核苷酸不限于其起源或序列，只要外源性多核苷酸表现出与多肽相同/相似的活性即可。所述导入可以通过本领域技术人员适当选择的任何已知转化方法进行，并且通过在宿主细胞中导入的多核苷酸的表达，生产多肽，并且可以增强其活性。

编码第(7)项多肽的密码子优化可以是内源性多核苷酸的密码子优化以增加其在宿主细胞中的转录或翻译，或者外源性多核苷酸的密码子优化，以便在宿主细胞中对其进行优化的转录或翻译。

通过分析第(8)项中的多肽的三级结构选择的暴露位点的修饰或化学修饰可以是，例如，使得通过将待分析的多肽的序列信息与存储基础蛋白的序列信息的数据库进行比较，根据序列相似性程度来确定候选模板蛋白，通过基于候选者识别结构来选择待修饰或化学修饰的暴露位点，并且对暴露位点进行修饰或化学修饰。

这种多肽活性的增强可能意味着与野生型或非修饰微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度相比，相应多肽的活性或浓度(表达水平)增加；或增加从相应的多肽获得的产物的量，而不限于此。

本公开的微生物中多核苷酸的一部分或全部修饰可通过以下方式诱导：(a)采用同源重组或工程化核酸酶(例如CRISPR-Cas9)进行基因组编辑，使用用于染色体插入微生物的载体，和/或(b)用光(例如紫外线和辐射)和/或化学品处理，但不限于此。修饰部分或全部基因的方法可以包括使用DNA重组技术的方法。例如，含有与靶基因同源的核苷酸序列或载体可能被导入微生物中以带来同源重组，导致部分或全部基因缺失。待导入的核苷酸序列或载体可以包括显性选择标记，但不限于此。

本文所用的术语“载体”是指DNA构建体，其包含可操作地与适当的控制序列连接的靶多核苷酸序列，使得靶基因可以导入适当的宿主。控制序列可以包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于控制转录和翻译终止的序列。载体在转化到适当的宿主中后，可以独立于宿主基因组进行复制或功能，或者可以整合到基因组本身中。例如，染色体中的靶多核苷酸可以通过载体被修饰的多核苷酸替换，用于将染色体插入细胞中。将多核苷酸插入染色体可以使用本领域已知的任何方法，例如同源重组，但不限于此。

本公开的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的例子可能包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可用作噬菌体载体或粘粒载体；基于pBR、基于pUC、基于pBluescriptII、基于pGEM、基于pTZ、基于pCL和基于pET的载体可用作质粒载体。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC载体。更具体地说，本公开中使用的载体可以是构建用于在棒杆菌属(Corynebacterium)染色体中插入和替换基因的pDCM2(图1，SEQ ID NO：32)，但对其没有特别限制，并且可以使用已知的表达载体。

本文所用的术语“转化”是指将含有编码靶蛋白的多核苷酸的载体导入宿主细胞以在宿主细胞中表达由多核苷酸编码的蛋白。转化的多核苷酸可以包括可以在宿主细胞中表达的任何多肽，无论多核苷酸是插入并位于染色体中还是位于宿主细胞的染色体外。此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式导入，只要它可以导入宿主细胞并表达即可。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式导入，表达盒是包含自我表达所需的所有因子的基因构建体。表达盒通常可以包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是表达载体的形式，以实现自我复制。此外，多核苷酸可以以本身的形式导入宿主细胞中，并且可操作地与在宿主细胞中表达所需的序列连接，但不限于此。

本文所用的术语“可操作连接”是指基因序列和启动子序列之间的功能连接，用于启动和介导编码本公开靶蛋白的多核苷酸的转录。

本公开的转化载体的方法包括将核酸导入细胞的任何方法，并且可以根据宿主细胞选择和执行本领域已知的任何合适的标准技术。该技术的实例可以是电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙法(CaCl₂)沉淀法、显微注射法、聚乙二醇法(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-DMSO法等，但不限于此。

如本文所用，术语“重组微生物”包括所有具有人工遗传修饰的微生物，并且是指由于插入用于表达外源性蛋白质的外源性基因或增强或削弱内源性基因的活性而使特定机制减弱或增强的微生物，其可以是包括用于生产靶蛋白质或产物的遗传修饰的微生物。

例如，本公开的重组微生物可以是：通过SbtA蛋白或编码SbtA蛋白质的多核苷酸和包括该多核苷酸的载体中的任何一种进行基因修饰的微生物；经修饰以表达所述蛋白质或编码所述蛋白质的多核苷酸的微生物；表达所述蛋白质或编码所述蛋白质的多核苷酸的重组微生物；或具有蛋白质活性的重组微生物，但不限于此。

此外，本公开的重组微生物可以通过额外增强L-谷氨酸生物合成途径中某些蛋白质的活性或额外削弱L-谷氨酸降解途径中某些蛋白质的活性来增加生产L-谷氨酸的能力的微生物。

具体地，本公开的微生物可以是与OdhA蛋白进一步减弱的微生物。更具体地说，本公开的微生物可以是具有删除OdhA基因的微生物。OdhA蛋白的序列可以从NCBI GenBank(一个已知的数据库)获得，并且例如，可以是GenBank登录号WP_060564343.1，但不限于此，并且可以包括那些表现出等效活性的那些，不受限制。

OdhA蛋白的减弱或OdhA基因的缺失仅仅是一个例子，并且不限于此，本公开的微生物可以包括在L-谷氨酸生物合成途径中的蛋白质活性增强或在L-谷氨酸降解途径中的蛋白质活性被削弱的各种微生物。

又作为另一实例，本公开的重组微生物可以作为微生物的母体菌株使用用化合物处理以便能够生产L-谷氨酸的微生物，具体地，该化合物可以是N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)，但不限于此。

就本公开的目的而言，本公开的重组微生物是指与修饰前的母体菌株或非修饰微生物相比具有改进的生产L-谷氨酸能力的微生物。“非修饰微生物”不排除含有微生物中天然发生突变的菌株，可以是天然微生物本身、野生型微生物本身，或者是调节L-谷氨酸生物合成途径中参与基因表达水平之前的微生物，或者是导入不是内源性存在的sbtA基因之前的微生物。

在本公开中，母体菌株可以是野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869中的OdhA减弱的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869中的OdhA缺失的菌株、通过用诱变剂(如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG))处理谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10656菌株而获得的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)BL2(保藏号KFCC-11074，韩国专利号10-0292299)。

如本文所用，术语“减弱”多肽具有一个概念，包括与固有活性相比活性的所有降低或不存在。减弱可以与失活、缺乏、下调、减少、减少、衰减等互换使用。

减弱还可以包括：由于编码多肽的多核苷酸的突变等，多肽本身的活性与原始微生物所具有的多肽本身的活性相比降低或消除的情况；由于抑制编码多肽的多核苷酸基因的表达或抑制翻译成多肽，细胞中整个多肽的活性和/或浓度(表达水平)低于天然菌株的情况；未表达多核苷酸的情况；和/或尽管多核苷酸表达，但多肽没有活性的情况。“内源活性”是指母体菌株在修饰前最初具有的特定多肽或野生型或非修饰微生物在因天然或人为因素引起的遗传变异而发生转化时的活性。该术语可与“修改前的活性”互换使用。与内源性活性相比，多肽活性的“减弱”、“失活”、“缺乏”、“降低”或“衰减”意味着多肽的活性与修饰前母株或非修饰微生物最初具有的特定多肽的活性相比降低。

多肽活性的减弱可以通过本领域已知的任何方法来实现，但不限于此，并且可以通过应用本领域公知的各种方法(例如，Nakashima N et al.,Bacterial cellularengineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2):2773-2793,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012等)来实现。

具体地，本公开的多肽的减弱可以是：

(1)删除编码多肽的部分或全部基因；

(2)修饰表达控制区(或表达控制序列)以降低编码多肽的基因的表达；

(3)对构成多肽的氨基酸序列进行修饰，从而消除或削弱多肽的活性(例如，在氨基酸序列上删除/取代/添加至少一个氨基酸)；

(4)对编码多肽的基因序列进行修饰，从而消除或削弱多肽的活性(例如，在多肽基因的核苷酸序列上删除/取代/添加至少一个核苷酸，从而编码修饰的多肽以消除或削弱多肽的活性)；

(5)对编码起始密码子或编码多肽的基因转录本的5'-UTR区的核苷酸序列进行修饰；

(6)导入与编码多肽的基因转录本互补结合的反义寡核苷酸(例如反义RNA)；

(7)在Shine-Dalgarno序列上游添加与Shine-Dalgarno序列互补的基因编码多肽的序列，从而形成二级结构，使得核糖体无法附着；

(8)在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'端加入逆转录启动子(逆转录工程，RTE)；或

(9)选自第(1)项～第(8)项中的两个或两种以上的组合，但对其没有特别限制。

例如，这些描述如下。

第(1)项中编码多肽的部分或全部基因的缺失可以是在染色体中编码内源性靶蛋白的全部多核苷酸的消除，用多核苷酸替换而删除某些核苷酸，或者用标记基因替换。

对第(2)项中的表达控制区(或表达控制序列)的修饰可以是通过删除、插入、非保守或保守替换、或其组合，或用具有较弱活性的序列替换表达对照区(或表达控制序列)上的突变。所述表达控制区包括启动子、操纵子序列、用于编码核糖体结合位点的序列、以及用于控制转录和翻译终止的序列，但不限于此。

编码第(5)项中的多肽的基因转录物的起始密码子或5'-UTR区的核苷酸序列的修饰可以是，例如，用编码多肽表达率较低的另一个起始密码子而不是内源性起始密码子的核苷酸序列取代，但不限于此。

第(3)项和第(4)项中对氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是通过在多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列中缺失、插入、非保守或保守取代或其组合对序列的修饰，以削弱多肽的活性，或用修饰为具有较弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列或修饰为不具有活性的氨基酸顺序或多核苷酸顺序替换，但不限于此。例如，可以通过将突变引入多核苷酸序列以形成终止密码子来抑制或减弱基因的表达。

在项目(6)中引入与编码多肽的基因转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)可以参考，例如文献(Weintraub,H.et al.,Antisense-RNA as amolecular tool forgenetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986)。

在项目(7)中，添加与编码Shine-Dalgarno序列上游的多肽的基因的Shine-Dalgarno序列互补的序列以形成使核糖体不可能附着的二级结构可能使mRNA翻译不可能或降低其速率。

在第(8)项中编码多肽(逆转录工程，RTE)的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'端添加逆转录启动子可以使反义核苷酸与编码多肽的基因的转录物互补，从而削弱多肽的活性。

本公开的重组微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、粗乳棒杆菌(Corynebacterium crudilactis)、沙漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、高效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、静止棒杆菌(Corynebacterium stationis)、奇异棒杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、模仿棒杆菌(Corynebacterium imitans)、睾丸棒杆菌(Corynebacterium testudinoris)或微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescen)，以及更具体地说谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，但不限于此。

与未修饰的微生物相比，本公开的重组微生物可具有增加或改进的生产L-谷氨酸的能力。

根据本公开的另一方面，提供了一种生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物，所述重组微生物包括SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸。

所述“SbtA蛋白”、“编码SbtA蛋白的多核苷酸”和“重组微生物”如上所述。

SbtA蛋白可以来源于蓝细菌(Cyanobacteria)，但不限于此，其如上所述。

所述SbtA蛋白可与SEQ ID NO：1具有至少90％的同一性，但不限于此，其如上所述。

棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，但不限于此，其如上所述。

在重组微生物中，OdhA可以被另外削弱或者odhA可以被删除。此外，OdhA可以含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列，但不限于此，如上所述。

此外，重组微生物可用作经NTG处理的微生物的母体菌株，但不限于此，其如上所述。

本文所用的术语“培养”是指在适当调整的环境条件下使微生物生长。本公开的培养程序可以根据本领域已知的适当培养基或培养条件进行。该培养程序可由本领域技术人员根据菌株容易地调整和采用。具体地，所述培养物可以是分批型、连续型和补料分批型培养物，但不限于此。

本文所用的“培养基”是指含有作为微生物培养所需的营养物质作为主要成分的混合物，其中所述培养基提供营养物质、生长因子等，包括对生存和生长至关重要的水。具体地，至于用于培养本公开的微生物的培养基和其它培养条件，任何用于微生物通常培养的培养基都可以不受特别限制地使用。然而，本公开的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中在需氧条件下，同时调节温度、pH等而进行培养。具体而言，棒杆菌属(Corynebacterium)的培养基可以在文献中找到(”Manualof Methods for General Bacteriology“by the American Society for Bacteriology(Washington D.C.，USA，1981))。

在本公开中，碳源可包括：碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖和麦芽糖)；糖醇(如甘露醇和山梨糖醇)；有机酸(如丙酮酸、乳酸和柠檬酸)；和氨基酸(如谷氨酸、蛋氨酸和赖氨酸)。此外，可以使用天然有机营养源，例如淀粉水解物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浸泡液，具体地，可以使用碳水化合物，例如葡萄糖和无菌预处理的糖蜜(即糖蜜转化为还原糖)，并且可以不受限制地使用适量的其他碳源。这些碳源可以单独使用，也可以以两种或两种以上的组合使用，但不限于此。

至于氮源、无机氮源，如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵；氨基酸，如谷氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺；和有机氮源，如蛋白胨、NZ-胺、肉类提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸泡液、酪蛋白水解物、鱼类或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等都可以使用。这些氮源可以单独使用，也可以以两种或多种的组合使用，但不限于此。

磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。至于无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等，此外，还可以包括氨基酸、维生素和/或合适的前体。这些组成成分或前体可以分批或连续的方式添加到培养基中。然而，本公开的培养基不限于此。

培养基的pH值可以通过在微生物培养过程中以适当的方式向培养基中加入化合物，例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸来调节。此外，可以加入消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，以抑制泡沫的形成。此外，可以将氧气或含氧气体注入培养基中以维持培养基的好氧状态，或者，为了保持培养基的厌氧或非有氧状态，可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体，或者不注入气体，但这并不限于此。

培养基的温度可以是20℃～45℃，具体为25℃～40℃，但不限于此。培养期可以持续到可以得到所需量的有用物质为止，并且可以具体为10～160小时，但不限于此。

培养生产的L-谷氨酸可以释放到培养基中或者可以保留在细胞中而不被释放。

本公开的L-谷氨酸的生产方法还可以包括在培养步骤之前制备生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物的步骤，或者制备用于培养重组微生物的培养基的步骤。

此外，本公开的L-谷氨酸的生产方法还可以包括从重组微生物或培养基中回收L-谷氨酸的步骤，在培养步骤之后。

回收L-谷氨酸的方法可以通过使用本领域已知的根据本公开的微生物培养方法的适当方法收集所需的L-谷氨酸，例如分批型、连续型和分批补料型培养方法。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收所需的L-谷氨酸。

此外，回收步骤可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的合适方法进行。

回收的L-谷氨酸可以是纯化形式，也可以是含有L-谷氨酸的微生物发酵液，但不限于此。

根据本公开的又一方面，提供了一种用于生产L-谷氨酸的组合物，该组合物包含：生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物，所述重组微生物包括SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸；或培养着所述重组微生物的培养基。

所述“SbtA蛋白”、“编码SbtA蛋白的多核苷酸”、“重组微生物”和“培养基”如上所述。

本公开的组合物还可以含有任何合适的赋形剂，其通常用于生产L-谷氨酸的组合物，并且赋形剂的实例可以是保存剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。

【发明模式】

在下文中，将参照示例性实施例详细描述本公开。然而，这些示例性实施例仅仅是用于说明本公开的优选实施例，因此不旨在限制本公开的权利范围。同时，本文未描述的技术事项可以由与本公开类似的本领域或技术领域的技术人员充分理解和容易地实现。

【实施例1：质粒的构建】

设计了用于在棒杆菌属(Corynebacterium)染色体中插入和替换基因的质粒(pDCM2，图1，SEQ ID NO：32)，并使用BIONICS有限公司的基因合成服务合成质粒。质粒被设计为包括限制性内切酶，便于在克隆中使用，参考与众所周知的sacB系统相关的论文(Gene，145(1994)69-73)。这样合成的pDCM2质粒具有以下特征。

(1)质粒具有仅在大肠埃希氏菌(E.coli)中起作用的复制原点，因此其自我复制在大肠埃希氏菌(E.coli)中是可能的，但其在棒杆菌属(Corynebacterium)中不可能自我复制。

(2)质粒具有卡那霉素抗性基因作为选择标记。

(3)质粒具有Levan蔗糖基因(sacB)作为二级阳性选择标记。

(4)从pDCM2质粒获得的遗传信息没有留在最终构建的菌株中。

【实施例2：构建源自蓝细菌(Cyanobacteria)的碳酸氢盐转运蛋白表达载体】

为了研究将编码源自蓝细菌(Cyanobacteria)(特别是集胞藻属(Synechocystissp.)PCC6803)的碳酸氢盐(HCO₃ ^-)转运蛋白的sbtA和bicA基因导入菌株时L-谷氨酸生产能力的提高，首先构建了sbtA或bicA的表达载体。

为了将这两个基因插入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中，合成了将集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC6803来源的sbtA(SEQ ID NO:3)对于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行密码子优化的序列(SEQ ID NO：2)和将集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC6803来源的bicA(SEQ ID NO：6)对于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行密码码优化的序列(SEQ ID NO：5)。

将pDCM2载体用于插入两个基因，并使用CJ7合成启动子(韩国专利第10-0620092和WO 2006-065095)作为表达启动子。

具体地，分别利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)转座酶或整合酶中的BBD29_01410位点(以下称为CglE0286)和BBD29_00440位点作为染色体上同源重组的位点而构建pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA载体和pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA载体。

具体而言，使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，连同SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的引物组，通过PCR获得发生染色体同源重组的CglE0286上游和下游区域的基因片段。使用Solg^TM Pfu-XDNA聚合酶作为聚合酶，PCR扩增条件为：在95℃变性5分钟；在95℃变性30秒，在58℃退火30秒，以及在72℃聚合60秒的30个循环；然后在72℃聚合5分钟。

扩增的CglE0286的上游和下游区域，以及用EcoRI和SalI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体，使用Gibson组装法(DG Gibson et al.，NATURE METHODS，VOL.6NO.5，MAY 2009，NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix)进行克隆，从而获得重组质粒，然后将其命名为pDCM2-ΔCglE0286。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段以计算的摩尔数混合，然后在50℃保存1小时来进行克隆。

使用合成的SEQ ID NO：7的CJ11-sbtA作为模板，结合SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的引物进行PCR处理，并通过PCR获得CJ7-sbtA基因片段。采用Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，PCR扩增条件为：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃聚合60秒的30个循环；然后在72℃聚合5分钟。

将扩增的CJ7-sbtA和用Scal限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2-ΔCglE0286载体，使用Gibson组装方法克隆，从而得到重组质粒，然后命名为pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段混合计算出摩尔数来进行克隆，然后在50℃保存1小时。

此外，使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：17的引物组，通过PCR获得了发生染色体同源重组的CglE0085的上游和下游区域的基因片段。采用Solg^TMPfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，PCR扩增条件为：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃聚合60秒的30个循环；然后在72℃聚合5分钟。

将扩增的CglE0085上游和下游区域，以及用EcoRI和SalI限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体使用Gibson组装方法克隆，从而获得重组质粒，命名为pDCM2-ΔCglE0085。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段混合计算出摩尔数来进行克隆，然后在50℃保存1小时。

使用合成的SEQ ID NO：18的CJ7-bicA作为模板，与SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的引物一起进行PCR，从而获得CJ7-bicA基因片段。采用Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，PCR扩增条件为：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃聚合60秒的30个循环；然后在72℃聚合5分钟。

将扩增的CJ7-bicA和用Scal限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2-ΔCglE0085载体使用Gibson组装方法克隆，从而得到重组质粒，命名为pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段混合计算出摩尔数来进行克隆，然后在50℃保存1小时。

本文中使用的引物序列示于下表1中。

【表1】

将构建的pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA载体和pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA载体导入到以下实施例中的菌株中。

【实施例3：制备来源于野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的L-谷氨酸生产菌株及导入碳酸氢盐转运蛋白的菌株的制备】

【实施例3-1：制备来源于野生型谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)并具有L-谷氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)】

为了制备来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869并具有L-谷氨酸产生能力的菌株，基于现有技术(Appl Environ Microbiol.2007年2月；73(4):1308-19.Epub 2006年12月8日)制备具有odhA基因缺失的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13869ΔodhA菌株。

具体地，对于odhA的缺失，使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869染色体DNA作为模板，使用SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQID NO：22的引物集，通过PCR获得odhA基因的上游和下游区域。采用Solg^TM Pfu-X DNA聚合酶作为聚合酶，PCR扩增条件为：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃聚合60秒的30个循环；然后在72℃聚合5分钟。

将扩增的odhA上游和下游区域以及用Smal限制性内切酶切割的用于染色体转化的pDCM2载体使用Gibson组装方法克隆，从而获得重组质粒，将其命名为pDCM2-ΔodhA。通过将Gibson组装试剂和每个基因片段混合计算出摩尔数来进行克隆，然后在50℃保存1小时。

将构建的pDCM2-ΔodhA载体通过电穿孔的方式转化谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869菌株，然后进行二次交叉，从而得到染色体上带有odhA基因缺失的菌株。采用SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24和基因组测序方法对基因缺失进行PCR鉴定，制备的菌株命名为ATCC13869ΔodhA。

本文中使用的引物序列示于下表2中。

【表2】

【实施例3-2：从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中导入碳酸氢盐转运蛋白并具有L-谷氨酸产生能力的菌株的制备】

通过将实施例2中构建的pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA载体和pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA载体导入实施例3-1中制备的ATCC13869ΔodhA菌株中，研究了碳酸氢盐转运蛋白的导入对L-谷氨酸生产能力的影响。

具体而言，将实施例2中构建的pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA载体通过电穿孔转化到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869ΔodhA菌株中，然后进行二次交叉，从而获得在染色体上的CglE0286位点插入CJ7 sbyA基因的菌株。

通过使用能够扩增导入CJ7-sbtA基因的同源重组的上游和下游区域的外部位点的SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的PCR和基因组测序鉴定相应的基因操作，并将制备的菌株命名为CA02-1474。

此外，通过电穿孔将实施例2中的pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA载体转化到谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13869ΔodhA菌株中，然后进行二次交叉，从而获得在染色体上的CglE0085位点插入CJ7-bicA基因的菌株。

通过使用能够扩增导入CJ7-bicA基因的同源重组的上游和下游区域的外部位点的SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的PCR和基因组测序鉴定相应的基因操作，制备的菌株被命名为CA02-1475。

本文中使用的引物序列示于下表3中。

【表3】

SEQ ID NO：	名称	序列
			25	CJ7-sbtA_confirm_F	CAAGCAGCAA GTGCCACAC
26	CJ7-sbtA_confirm_R	CCAACTGCTC CGACGAAG
			27	CJ7-bicA_confirm_F	ATTCCCAAAG GTGCCAGC
28	CJ7-bicA_confirm_R	CAGTGCGCAA AAGGCCTC

为了考察L-谷氨酸的生产能力，以ATCC13869ΔodhA菌株为对照，将上述制备的CA02-1474和CA02-1475菌株按以下方法培养。

将每种菌株接种到由种子培养基组成的平板培养基中，并在30℃培养20小时。然后，将菌株的一环接种到如下含有25mL生产培养基的250mL转角挡板烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养40小时。培养完成后，用高效液相色谱(HPLC)测定L-谷氨酸的生产量，测定结果见表4。

【种子培养基】

1％葡萄糖、0.5％牛肉提取物、1％多聚蛋白胨、0.25％氯化钠、0.5％酵母提取物、2％琼脂、0.2％尿素、pH 7.2

【生产培养基】

6％原糖、5％碳酸钙、2.25％硫酸铵、0.1％一磷酸钾、0.04％硫酸镁、10mg/L硫酸铁、0.2mg/L盐酸硫胺素、50μg/L生物素。

【表4】

菌株名称	L-谷氨酸浓度(g/L)	L-谷氨酸浓度增加(％)
			ATCC13869△odhA	1.9	-
CA02-1474	2.9	52.6％
			CA02-1475	2.1	10.5％

如表4所示，与ATCC13869ΔodhA菌株或导入bicA基因的CA02-1475菌株相比，导入sbtA基因的CA02-1474菌株中L-谷氨酸的浓度显著增加。将CA02-1474于2020年7月28日根据《布达佩斯条约》保藏在保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，并指定保藏号KCCM12775P。

【实施例4：从导入碳酸氢盐转运蛋白的N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)突变体制备具有L-谷氨酸产生能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株】

为了研究除了来源于野生型棒杆菌属(Corynebacterium sp.)的菌株外，在具有增加的L-谷氨酸产生能力的来源于NTG突变体棒杆菌属(Corynebacterium sp.)的菌株中，该基因是否也显示出等效的效果，将该基因导入被称为生产L-谷氨酸的NTG突变体的KFCC11074菌株(韩国专利号10-0292299)中。

将实施例2中的pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA载体通过电穿孔转化到KFCC11074菌株中，然后进行二次交叉，从而获得在染色体上插入该基因的菌株。通过使用SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的PCR和基因组测序鉴定相应的基因操作，并将该菌株命名为CA02-1476。

将制备的CA02-1476和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC11074菌株按以下方法进行发酵滴度试验。

将每种菌株接种到由种子培养基组成的平板培养基中，并在30℃培养20小时。然后，将菌株的一个环接种到含有25mL生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃以200rpm振荡培养40小时。培养完成后，用高效液相色谱(HPLC)测定L-谷氨酸的量，测定结果见表5。

【种子培养基】

1％葡萄糖，0.5％牛肉提取物，1％多聚蛋白胨，0.25％氯化钠，0.5％酵母提取物，2％琼脂，0.2％尿素，pH 7.2

【生产培养基】

6％原糖、5％碳酸钙、2.25％硫酸铵、0.1％一磷酸钾、0.04％硫酸镁、10mg/L硫酸铁、0.2mg/L盐酸硫胺素、500μg/L生物素。

【表5】

如表5所示，与KFCC11074菌株相比，CA02-1476菌株使L-谷氨酸浓度增加了34.8％。

从上述描述中，本公开所涉及的本领域的技术人员将能够理解，本公开可以以其它特定形式体现而不背离其技术精神或本质特征。在这方面，本文公开的示例性实施例仅用于说明目的，不应被解释为限制本公开的范围。本公开的范围应理解为，从权利要求及其等同物的定义和范围来源的所有更改或修改都属于公开的范围。

【国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约】

国际表格

国际保藏机构对原始保藏的收条

根据细则第7.1条发给

至：希杰(CJ)第一制糖株式会社

韩国，首尔市，中区，东湖路330，CJ第一制糖中心，(邮)100-400

¹根据细则第6.4(d)条，上述日期是国际保藏机构处于获得的状态的日期。

----------------------------

兹证明，上述翻译与原文内容无异。

2020年9月9日

特许法人HANOL

序列表

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> 生产L-谷氨酸的重组微生物及利用其生产L-谷氨酸的方法

<130> OPA21083-PCT

<150> KR 10-2020-0115570

<151> 2020-09-09

<160> 32

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 374

<212> PRT

<213> 未知的

<220>

<223> SbtA

<400> 1

Met Asp Phe Leu Ser Asn Phe Leu Thr Asp Phe Val Gly Gln Leu Gln

1 5 10 15

Ser Pro Thr Leu Ala Phe Leu Ile Gly Gly Met Val Ile Ala Ala Leu

20 25 30

Gly Thr Gln Leu Val Ile Pro Glu Ala Ile Ser Thr Ile Ile Val Phe

35 40 45

Met Leu Leu Thr Lys Ile Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Ile Arg Asn

50 55 60

Ser Asn Leu Thr Glu Met Leu Leu Pro Val Ala Phe Ser Val Ile Leu

65 70 75 80

Gly Ile Leu Ile Val Phe Ile Ala Arg Phe Thr Leu Ala Lys Leu Pro

85 90 95

Asn Val Arg Thr Val Asp Ala Leu Ala Thr Gly Gly Leu Phe Gly Ala

100 105 110

Val Ser Gly Ser Thr Met Ala Ala Ala Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser

115 120 125

Lys Ile Ser Tyr Glu Ala Trp Ala Gly Ala Leu Tyr Pro Phe Met Asp

130 135 140

Ile Pro Ala Leu Val Thr Ala Ile Val Val Ala Asn Ile Tyr Leu Asn

145 150 155 160

Lys Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ala Ala Ser Ile Glu Glu Ser Phe Ser

165 170 175

Lys Gln Pro Val Ala Ala Gly Asp Tyr Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Pro

180 185 190

Arg Thr Arg Gln Glu Tyr Leu Ser Gln Gln Glu Pro Glu Asp Asn Arg

195 200 205

Val Lys Ile Trp Pro Ile Ile Glu Glu Ser Leu Gln Gly Pro Ala Leu

210 215 220

Ser Ala Met Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly Ile Phe Thr Lys Pro Glu

225 230 235 240

Ser Val Tyr Glu Gly Phe Tyr Asp Pro Leu Phe Arg Gly Leu Leu Ser

245 250 255

Ile Leu Met Leu Ile Met Gly Met Glu Ala Trp Ser Arg Ile Gly Glu

260 265 270

Leu Arg Lys Val Ala Gln Trp Tyr Val Val Tyr Ser Leu Ile Ala Pro

275 280 285

Ile Val His Gly Phe Ile Ala Phe Gly Leu Gly Met Ile Ala His Tyr

290 295 300

Ala Thr Gly Phe Ser Leu Gly Gly Val Val Val Leu Ala Val Ile Ala

305 310 315 320

Ala Ser Ser Ser Asp Ile Ser Gly Pro Pro Thr Leu Arg Ala Gly Ile

325 330 335

Pro Ser Ala Asn Pro Ser Ala Tyr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Ile Gly

340 345 350

Thr Pro Ile Ala Ile Gly Val Cys Ile Pro Leu Phe Ile Gly Leu Ala

355 360 365

Gln Thr Leu Gly Ala Gly

370

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的sbtA

<400> 2

atggattttc tttctaattt cttgaccgac ttcgtgggtc aactgcagtc acccactctg 60

gcgtttctga tcggcggtat ggtaatcgcc gctctgggaa ctcaattggt tattcccgaa 120

gccatctcaa cgattatcgt tttcatgttg cttactaaaa ttggacttac cggaggtatg 180

gcgattcgga atagcaacct gaccgagatg cttttgcccg tggccttctc cgtcattttg 240

ggaattttga tcgtatttat cgcgcgtttc actttggcta agctccccaa tgtgcgcact 300

gtggacgccc ttgctacggg tggtctcttc ggtgcggtgt caggaagcac gatggccgcc 360

gccctgacta cgcttgagga atcaaaaatt tcatatgaag catgggcagg agctttgtac 420

ccttttatgg atattccggc cttggtcacg gcaattgttg ttgccaacat ctatttgaat 480

aaacggaaac gtaaaagcgc cgcagcatca atcgaagaga gcttctcgaa gcagcccgta 540

gcggctggcg actatggaga tcagactgat tatccacgta cccgtcagga atacctctct 600

cagcaagagc cggaggacaa tcgcgtcaaa atttggccaa tcattgaaga gtcgcttcaa 660

ggcccagccc tttcagctat gttgttggga cttgcactgg gtattttcac gaaacctgaa 720

tcggtgtatg agggattcta cgatcctctt tttcgcggac tcctgtcgat tctgatgctg 780

attatgggca tggaagcctg gagccgtatc ggcgagcttc gtaaggtagc tcagtggtat 840

gtcgtttact ctttgatcgc tccgatcgta cacggattta tcgcttttgg actgggtatg 900

atcgcccatt acgctacggg attcagcctc ggtggagtgg tcgttctggc cgtaattgcc 960

gcatcttctt ctgatatctc tggcccacct accctgcgtg ccggcattcc gagcgcaaat 1020

ccgtcggcat atatcggtag ctctactgca atcggaaccc ccatcgcaat cggtgtgtgt 1080

attcctctct tcatcggtct cgcccagacg cttggcgcgg gctaa 1125

<210> 3

<211> 1125

<212> DNA

<213> 未知的

<220>

<223> sbtA

<400> 3

atggattttt tgtccaattt cttgacggac ttcgtgggac aattgcagtc cccaacccta 60

gcctttctga ttggggggat ggttattgcc gcccttggca cccaattggt aattccagag 120

gcgatttcta cgatcatcgt ctttatgttg ctcactaaga ttggcctaac cgggggcatg 180

gcaattcgga actccaactt gacggaaatg ctcctacccg tggcattctc tgtgatattg 240

ggaattctta ttgtcttcat cgcccgtttt accctggcta aactgcctaa cgtcagaacc 300

gtggatgccc tggccaccgg cggcttgttt ggggcagtca gtggctctac aatggctgcc 360

gccctcacta cgttggaaga atcaaaaatt tcctacgaag cctgggctgg tgctctgtat 420

ccctttatgg atattcctgc cctggtaacg gcgatcgtcg tagctaatat ttatctcaat 480

aagagaaaac gtaagtctgc tgctgctagt attgaggaat cgttcagcaa gcaacccgtt 540

gccgccgggg attatggcga ccaaacggat tatcctcgta cccgccaaga gtatttaagc 600

cagcaagaac cggaagataa tcgggtcaaa atctggccaa ttatcgaaga aagtttacaa 660

ggccctgccc tatcagccat gttgttaggt cttgccctgg gcatatttac caagccggaa 720

agtgtctatg aaggttttta tgatcctctt tttcgaggac tactttccat cttgatgctg 780

attatgggca tggaagcttg gtccagaatt ggtgaactac gtaaagtagc tcaatggtat 840

gtggtctata gcctaatagc tcccatagtg cacgggttta ttgcctttgg tcttggtatg 900

attgcccact atgctacggg tttcagtctg ggtggtgtgg tagttttagc agttatcgcc 960

gcttctagct ctgatatctc cgggcctcct accttgcgag caggtatccc atctgccaac 1020

ccctctgcct atatcggttc atccaccgcc atcggtactc ccattgccat cggcgtgtgc 1080

ataccgcttt tcattgggct tgcccagacc cttggtgcag gttaa 1125

<210> 4

<211> 564

<212> PRT

<213> 未知的

<220>

<223> BicA

<400> 4

Met Gln Ile Thr Asn Lys Ile His Phe Arg Asn Leu Gln Gly Asp Leu

1 5 10 15

Phe Gly Gly Val Thr Ala Ala Val Ile Ala Leu Pro Met Ala Leu Ala

20 25 30

Phe Gly Ile Ala Ser Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Leu Trp Gly Ala

35 40 45

Val Ile Val Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Gly Gly Thr Pro Thr Leu

50 55 60

Ile Ser Glu Pro Thr Gly Pro Met Thr Val Val Gln Thr Ala Val Ile

65 70 75 80

Ala Ser Leu Val Ala Ala Asp Pro Asp Asn Gly Leu Ala Met Ala Phe

85 90 95

Thr Val Val Met Met Ala Gly Leu Phe Gln Ile Ala Phe Gly Leu Leu

100 105 110

Lys Leu Gly Lys Tyr Val Thr Met Met Pro Tyr Thr Val Ile Ser Gly

115 120 125

Phe Met Ser Gly Ile Gly Ile Ile Leu Val Ile Leu Gln Leu Ala Pro

130 135 140

Phe Leu Gly Gln Ala Ser Pro Lys Gly Gly Val Ile Gly Thr Leu Gln

145 150 155 160

Ala Leu Pro Asn Leu Val Ser Asn Val Arg Pro Val Glu Thr Leu Leu

165 170 175

Ala Leu Met Thr Val Gly Ile Ile Trp Phe Met Pro Ser Arg Trp Lys

180 185 190

Lys Phe Ala Pro Pro Gln Leu Val Ala Leu Val Leu Gly Thr Ile Ile

195 200 205

Ser Ile Thr Leu Phe Gly Asp Leu Asp Ile Arg Arg Ile Gly Glu Ile

210 215 220

Gln Ala Gly Leu Pro Ala Leu Gln Leu Pro Val Phe Gln Ala Asp Gln

225 230 235 240

Leu Gln Arg Met Leu Ile Asp Ala Ala Val Leu Gly Met Leu Gly Cys

245 250 255

Ile Asp Ala Leu Leu Thr Ser Val Val Ala Asp Ser Leu Thr Arg Thr

260 265 270

Glu His Asn Ser Asn Lys Glu Leu Val Gly Gln Gly Ile Gly Asn Val

275 280 285

Met Ser Gly Leu Phe Gly Gly Leu Gly Gly Ala Gly Ala Thr Met Gly

290 295 300

Thr Val Val Asn Ile Gln Ser Gly Gly Arg Thr Ala Leu Ser Gly Leu

305 310 315 320

Ile Arg Ala Met Val Leu Leu Val Val Ile Leu Gly Ala Ala Lys Leu

325 330 335

Ala Ala Thr Ile Pro Leu Ala Val Leu Ala Gly Ile Ala Phe Lys Val

340 345 350

Gly Val Asp Ile Ile Asp Trp Gly Phe Leu Lys Arg Ala His His Val

355 360 365

Ser Ile Lys Gly Ala Leu Ile Met Tyr Ala Val Ile Val Leu Thr Val

370 375 380

Leu Val Asp Leu Ile Ala Ala Val Gly Ile Gly Val Phe Ile Ala Asn

385 390 395 400

Ile Leu Thr Ile Asp Arg Met Ser Ala Leu Gln Ser Lys Ala Val Lys

405 410 415

Ser Ile Ser Asp Ala Asp Asp Glu Ile Leu Leu Ser Ala Asn Glu Lys

420 425 430

Arg Trp Leu Asp Glu Gly Asn Gly Arg Val Leu Leu Phe Gln Leu Ser

435 440 445

Gly Pro Met Ile Phe Gly Val Ala Lys Ala Ile Ala Arg Glu His Asn

450 455 460

Ala Ile Gln Glu Cys Ala Ala Ile Val Phe Asp Leu Ser Asp Val Pro

465 470 475 480

His Leu Gly Val Thr Ala Ser Leu Ala Leu Glu Asn Ala Ile Glu Glu

485 490 495

Ala Ala Glu Lys Gly Arg Ala Val Tyr Ile Val Gly Ala Thr Gly Gln

500 505 510

Thr Lys Arg Arg Leu Glu Lys Leu Gln Val Phe Arg Phe Val Pro Glu

515 520 525

Ser Asn Cys Tyr Asp Asp Arg Ser Glu Ala Leu Lys Asp Ala Val Leu

530 535 540

Ala Leu Gly Pro His Glu Ser Glu Asp Ser Pro Ser Ser Ser Ser Val

545 550 555 560

Gln Thr Thr Tyr

<210> 5

<211> 1695

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的bicA

<400> 5

atgcagatta cgaacaagat tcactttcgt aatttgcagg gtgatctttt tggcggcgtt 60

acggccgctg ttattgcatt gcctatggct ttggcttttg gaattgcatc gggtgcgggt 120

gccacggccg gactctgggg agccgtaatt gtgggcttct tcgccgcact gttcggagga 180

acccctacgc ttatttcaga gccaaccgga cccatgaccg ttgtgcagac cgccgtgatc 240

gcttctcttg tagctgcgga tcccgataac ggccttgcta tggcattcac ggtggtgatg 300

atggccggtt tgtttcagat tgccttcggt ctgctcaaac ttggaaaata tgtgaccatg 360

atgccatata cggtaatctc tggctttatg tccggcattg gtattatttt ggtaattctg 420

caacttgcgc ccttccttgg acaagcttct ccgaaaggag gcgtgatcgg aacgctgcaa 480

gcacttccca acctcgtgtc gaatgtacgg cccgtagaaa cgttgctggc attgatgacc 540

gtcggtatta tctggttcat gccttctcgt tggaagaaat tcgcgcctcc gcaactcgta 600

gccctggtac tcggcacgat tatttctatc acccttttcg gagatcttga cattcgccgg 660

atcggagaaa tccaagcggg cttgccagcc cttcaactcc cggttttcca agccgatcag 720

ttgcagcgga tgctgatcga tgcagcagtc ctcggaatgc ttggatgtat tgacgccctc 780

cttacgtcgg tagttgccga ttctctgacc cgcaccgagc ataactcgaa taaagaactc 840

gttggccaag gtatcggaaa cgtaatgtca ggcttgttcg gtggtctggg cggcgccggc 900

gcaacgatgg gcactgtggt gaacatccaa tccggaggcc gcacggccct gtctggtttg 960

attcgcgcta tggttctgct ggtggtcatc ttgggagctg caaagctggc agccaccatt 1020

ccgcttgctg tgcttgctgg aattgcgttt aaggtaggtg tagacattat cgactggggc 1080

tttctgaagc gcgcacacca tgtgtcaatt aagggcgcac ttatcatgta tgctgttatc 1140

gtcctcactg tcctggtaga tctcatcgcc gcggttggta ttggagtctt tatcgcgaac 1200

attcttacca tcgaccggat gtcggccttg caatcaaaag cggtgaaatc aatttctgat 1260

gcagatgacg aaattctttt gtctgccaat gaaaaacgtt ggttggacga aggcaatggt 1320

cgcgtcttgc tctttcagtt gagcggacct atgatctttg gagtggcaaa agcgatcgca 1380

cgggaacaca atgcgatcca ggaatgtgct gccatcgtat ttgacttgag cgacgttccc 1440

catctcggtg tcaccgcatc attggctctt gagaacgcaa ttgaagaggc agcagagaag 1500

ggacgtgccg tttatatcgt gggcgccacc ggacagacca agcgccgttt ggagaaactt 1560

caagtctttc gcttcgtccc agaaagcaac tgttacgacg accgctctga ggcgcttaaa 1620

gacgccgtgc tcgcgttggg accccatgag tcggaagatt cgccgagcag ctcttccgtg 1680

cagaccactt attga 1695

<210> 6

<211> 1695

<212> DNA

<213> 未知的

<220>

<223> bicA

<400> 6

atgcaaataa ctaacaaaat tcattttagg aacctgcagg gggacctttt tggcggggtt 60

acagcggcgg ttattgccct gcccatggcc ttagccttcg ggattgcttc cggagcaggg 120

gctacggccg gactctgggg ggcggtgatc gtagggtttt tcgcggcctt atttggcggc 180

acccccacct taatttccga accgactggg cccatgacgg tggtgcaaac ggcggttatt 240

gctagtttag tggcggcaga tcccgacaat ggcttggcca tggccttcac tgtggtaatg 300

atggcggggt tgttccagat tgcctttggt ctgctcaaat tgggcaaata tgtcaccatg 360

atgccctaca cagtcatttc cggctttatg tccggcattg ggattatttt ggtgattttg 420

caactggctc cctttcttgg ccaagctagt cccaagggag gggtaatcgg caccctccag 480

gccctcccta acctagtaag caatgtcagg ccggtggaaa ccctattggc gctcatgacg 540

gtgggcatta tttggtttat gccttcccgt tggaaaaagt ttgctccgcc ccaattggtg 600

gctttagtgt tggggacaat tatttccatc accctatttg gcgatctgga tatccgtcgc 660

attggggaaa ttcaggccgg tttgcccgct ctacagctac cagtgtttca ggctgatcaa 720

ttacagagaa tgctgattga tgcggctgtt ctgggaatgc tgggctgtat tgatgccctc 780

ctgacttcgg tggtggctga tagcttgacc cgcacagaac ataactccaa caaggaatta 840

gtcggccagg gcatcggcaa tgtaatgtcc ggtttatttg gtggcttggg gggagctggg 900

gccaccatgg ggacggtggt aaatatccag tccgggggac gcacagctct gtctggcttg 960

atccgggcga tggtgttgct ggtggtaatt ttaggcgcag ctaaattggc ggctaccatt 1020

cccctagccg tattggctgg tattgcgttc aaagttgggg tggacattat tgattggggg 1080

ttcctcaagc gggctcacca tgtctccatc aaaggggcct tgattatgta tgccgtcatt 1140

gtcctgacgg tgttggtgga tttaattgcg gcagtaggta ttggtgtatt tattgccaat 1200

attctcacca ttgaccgtat gagtgcgttg cagtccaaag ctgtgaaaag tattagcgat 1260

gccgacgacg aaattctcct ttccgccaat gagaaacgtt ggctagatga gggcaatggc 1320

cgggtcttgc ttttccaact cagtggccca atgatttttg gggtggccaa ggcgatcgcc 1380

agggaacata atgccattca agaatgtgcc gccattgttt ttgatctgag cgatgtgccc 1440

catttgggag taaccgcttc cctggccctg gaaaatgcca ttgaagaagc ggcggaaaaa 1500

ggtcgggccg tttacattgt gggggcaaca gggcaaacca agcgacgctt ggaaaaattg 1560

caagtgttcc gctttgttcc tgaaagtaat tgctatgacg accgttctga agctctcaag 1620

gacgctgtcc tagctttggg acctcatgaa agtgaggact ccccttccag ttcttccgtc 1680

cagaccacat actga 1695

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0286_up_F

<400> 7

aacgacggcc agtgaattcc ggacgtttac gctgat 36

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0286_up_R

<400> 8

agtactaaac cggaagggcc tgtaaaggcc 30

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0286_down_F

<400> 9

ccttccggtt tagtactaaa caggaagagc cccttta 37

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0286_down_R

<400> 10

tgcatgcctg caggtcgacc gcatgtggtg gcaaaa 36

<210> 11

<211> 1477

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-sbtA

<400> 11

ggcccttccg gtttagtaga aacatcccag cgctactaat agggagcgtt gaccttcctt 60

ccacggaccg gtaatcggag tgcctaaaac cgcatgcggc ttaggctcca agataggttc 120

tgcgcggccg ggtaatgcat cttctttagc aacaagttga ggggtaggtg caaataagaa 180

cgacatagaa atcgtctcct ttctgttttt aatcaacata caccaccacc taaaaattcc 240

ccgaccagca agttcacagt attcgggcac aatatcgttg ccaaaatatt gtttcggaat 300

atcatgggat acgtacccaa cgaaaggaaa cactcatgga ttttctttct aatttcttga 360

ccgacttcgt gggtcaactg cagtcaccca ctctggcgtt tctgatcggc ggtatggtaa 420

tcgccgctct gggaactcaa ttggttattc ccgaagccat ctcaacgatt atcgttttca 480

tgttgcttac taaaattgga cttaccggag gtatggcgat tcggaatagc aacctgaccg 540

agatgctttt gcccgtggcc ttctccgtca ttttgggaat tttgatcgta tttatcgcgc 600

gtttcacttt ggctaagctc cccaatgtgc gcactgtgga cgcccttgct acgggtggtc 660

tcttcggtgc ggtgtcagga agcacgatgg ccgccgccct gactacgctt gaggaatcaa 720

aaatttcata tgaagcatgg gcaggagctt tgtacccttt tatggatatt ccggccttgg 780

tcacggcaat tgttgttgcc aacatctatt tgaataaacg gaaacgtaaa agcgccgcag 840

catcaatcga agagagcttc tcgaagcagc ccgtagcggc tggcgactat ggagatcaga 900

ctgattatcc acgtacccgt caggaatacc tctctcagca agagccggag gacaatcgcg 960

tcaaaatttg gccaatcatt gaagagtcgc ttcaaggccc agccctttca gctatgttgt 1020

tgggacttgc actgggtatt ttcacgaaac ctgaatcggt gtatgaggga ttctacgatc 1080

ctctttttcg cggactcctg tcgattctga tgctgattat gggcatggaa gcctggagcc 1140

gtatcggcga gcttcgtaag gtagctcagt ggtatgtcgt ttactctttg atcgctccga 1200

tcgtacacgg atttatcgct tttggactgg gtatgatcgc ccattacgct acgggattca 1260

gcctcggtgg agtggtcgtt ctggccgtaa ttgccgcatc ttcttctgat atctctggcc 1320

cacctaccct gcgtgccggc attccgagcg caaatccgtc ggcatatatc ggtagctcta 1380

ctgcaatcgg aacccccatc gcaatcggtg tgtgtattcc tctcttcatc ggtctcgccc 1440

agacgcttgg cgcgggctaa actaaacagg aagagcc 1477

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-sbtA_F

<400> 12

ggcccttccg gtttagt 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-sbtA_R

<400> 13

ggctcttcct gtttagt 17

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0085_up_F

<400> 14

aacgacggcc agtgaattcg ctcgaatgcc tgactgaca 39

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0085_up_R

<400> 15

gtttagtact aaaccggaag ggccaaagga cgacttcacg gtta 44

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0085_down_F

<400> 16

ccggtttagt actaaacagg aagagccatt gaggatgcga aactgt 46

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CglE0085_down_R

<400> 17

tgcatgcctg caggtcgacg taatcgaatc accggccag 39

<210> 18

<211> 2047

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-bicA

<400> 18

ggcccttccg gtttagtaga aacatcccag cgctactaat agggagcgtt gaccttcctt 60

ccacggaccg gtaatcggag tgcctaaaac cgcatgcggc ttaggctcca agataggttc 120

tgcgcggccg ggtaatgcat cttctttagc aacaagttga ggggtaggtg caaataagaa 180

cgacatagaa atcgtctcct ttctgttttt aatcaacata caccaccacc taaaaattcc 240

ccgaccagca agttcacagt attcgggcac aatatcgttg ccaaaatatt gtttcggaat 300

atcatgggat acgtacccaa cgaaaggaaa cactcatgca gattacgaac aagattcact 360

ttcgtaattt gcagggtgat ctttttggcg gcgttacggc cgctgttatt gcattgccta 420

tggctttggc ttttggaatt gcatcgggtg cgggtgccac ggccggactc tggggagccg 480

taattgtggg cttcttcgcc gcactgttcg gaggaacccc tacgcttatt tcagagccaa 540

ccggacccat gaccgttgtg cagaccgccg tgatcgcttc tcttgtagct gcggatcccg 600

ataacggcct tgctatggca ttcacggtgg tgatgatggc cggtttgttt cagattgcct 660

tcggtctgct caaacttgga aaatatgtga ccatgatgcc atatacggta atctctggct 720

ttatgtccgg cattggtatt attttggtaa ttctgcaact tgcgcccttc cttggacaag 780

cttctccgaa aggaggcgtg atcggaacgc tgcaagcact tcccaacctc gtgtcgaatg 840

tacggcccgt agaaacgttg ctggcattga tgaccgtcgg tattatctgg ttcatgcctt 900

ctcgttggaa gaaattcgcg cctccgcaac tcgtagccct ggtactcggc acgattattt 960

ctatcaccct tttcggagat cttgacattc gccggatcgg agaaatccaa gcgggcttgc 1020

cagcccttca actcccggtt ttccaagccg atcagttgca gcggatgctg atcgatgcag 1080

cagtcctcgg aatgcttgga tgtattgacg ccctccttac gtcggtagtt gccgattctc 1140

tgacccgcac cgagcataac tcgaataaag aactcgttgg ccaaggtatc ggaaacgtaa 1200

tgtcaggctt gttcggtggt ctgggcggcg ccggcgcaac gatgggcact gtggtgaaca 1260

tccaatccgg aggccgcacg gccctgtctg gtttgattcg cgctatggtt ctgctggtgg 1320

tcatcttggg agctgcaaag ctggcagcca ccattccgct tgctgtgctt gctggaattg 1380

cgtttaaggt aggtgtagac attatcgact ggggctttct gaagcgcgca caccatgtgt 1440

caattaaggg cgcacttatc atgtatgctg ttatcgtcct cactgtcctg gtagatctca 1500

tcgccgcggt tggtattgga gtctttatcg cgaacattct taccatcgac cggatgtcgg 1560

ccttgcaatc aaaagcggtg aaatcaattt ctgatgcaga tgacgaaatt cttttgtctg 1620

ccaatgaaaa acgttggttg gacgaaggca atggtcgcgt cttgctcttt cagttgagcg 1680

gacctatgat ctttggagtg gcaaaagcga tcgcacggga acacaatgcg atccaggaat 1740

gtgctgccat cgtatttgac ttgagcgacg ttccccatct cggtgtcacc gcatcattgg 1800

ctcttgagaa cgcaattgaa gaggcagcag agaagggacg tgccgtttat atcgtgggcg 1860

ccaccggaca gaccaagcgc cgtttggaga aacttcaagt ctttcgcttc gtcccagaaa 1920

gcaactgtta cgacgaccgc tctgaggcgc ttaaagacgc cgtgctcgcg ttgggacccc 1980

atgagtcgga agattcgccg agcagctctt ccgtgcagac cacttattga actaaacagg 2040

aagagcc 2047

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> odhA_up_F

<400> 19

tgaattcgag ctcggtaccc ttgaacggaa ttgggtgg 38

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> odhA_up_R

<400> 20

cccaggtggc atcggtacct tcacccagcg ccacgcag 38

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> odhA_down_F

<400> 21

cgctgggtga aggtaccgat gccacctggg ttggtcaag 39

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> odhA_down_R

<400> 22

gtcgactcta gaggatcccc ggacaaggaa tggagaga 38

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> odhA_del_F

<400> 23

cttaccgttg ttgccctt 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> odhA_del_R

<400> 24

ctccttcacc cacatcatt 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-sbtA_confirm_F

<400> 25

caagcagcaa gtgccacac 19

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-sbtA_confirm_R

<400> 26

ccaactgctc cgacgaag 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-bicA_confirm_F

<400> 27

attcccaaag gtgccagc 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ7-bicA_confirm_R

<400> 28

cagtgcgcaa aaggcctc 18

<210> 29

<211> 1221

<212> PRT

<213> 未知的

<220>

<223> OdhA

<400> 29

Met Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu

1 5 10 15

Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp

20 25 30

Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr

35 40 45

Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro

50 55 60

Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro

65 70 75 80

Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln

85 90 95

Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys

100 105 110

Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr

115 120 125

Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met

130 135 140

Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr

145 150 155 160

His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp

165 170 175

Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val

180 185 190

Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp

195 200 205

Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met

210 215 220

Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser

225 230 235 240

Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser

245 250 255

Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu

260 265 270

Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro

275 280 285

Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val

290 295 300

Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln

305 310 315 320

Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr

325 330 335

Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr

340 345 350

Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys

355 360 365

Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His

370 375 380

Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro

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Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile

405 410 415

Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu

420 425 430

Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr

435 440 445

Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg

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Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln

465 470 475 480

Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe

485 490 495

Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu

500 505 510

Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr

515 520 525

Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg

530 535 540

Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser

545 550 555 560

Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly

565 570 575

Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln

580 585 590

Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser

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His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys

610 615 620

Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu

625 630 635 640

Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu

645 650 655

Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr Ile

660 665 670

His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser

675 680 685

Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys

690 695 700

Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val

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Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe

725 730 735

Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp

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Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu

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Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu

770 775 780

Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met

785 790 795 800

Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu

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Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu

820 825 830

Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala

835 840 845

Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala

850 855 860

Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp

865 870 875 880

Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val

885 890 895

Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His

900 905 910

Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His

915 920 925

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Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser

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Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp

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Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly

980 985 990

Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His

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Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg

1010 1015 1020

Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser

1025 1030 1035 1040

Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp

1045 1050 1055

Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn

1060 1065 1070

Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe

1075 1080 1085

Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys

1090 1095 1100

Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg

1105 1110 1115 1120

Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met

1125 1130 1135

Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr

1140 1145 1150

Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln

1155 1160 1165

Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn

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Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala

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Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp

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Glu Ala Phe Glu Ala

1220

<210> 30

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<212> PRT

<213> 未知的

<220>

<223> SbtA

<400> 30

Met Asp Phe Leu Ser His Phe Leu Thr Asp Phe Val Gly Gln Leu Gln

1 5 10 15

Ser Pro Thr Leu Ala Phe Leu Ile Gly Gly Met Val Ile Ala Ala Leu

20 25 30

Gly Thr Gln Leu Val Ile Pro Glu Ala Ile Ser Thr Ile Ile Val Phe

35 40 45

Met Leu Leu Thr Lys Ile Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Ile Arg Asn

50 55 60

Ser Asn Leu Thr Glu Met Leu Leu Pro Met Ile Phe Ser Val Ile Leu

65 70 75 80

Gly Ile Leu Ile Val Phe Ile Ala Arg Phe Thr Leu Ala Lys Leu Pro

85 90 95

Asn Val Lys Thr Val Asp Ala Leu Ala Thr Gly Gly Leu Phe Gly Ala

100 105 110

Val Ser Gly Ser Thr Met Ala Ala Ala Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser

115 120 125

Lys Ile Ser Tyr Glu Ala Trp Ala Gly Ala Leu Tyr Pro Phe Met Asp

130 135 140

Ile Pro Ala Leu Val Thr Ala Ile Val Val Ala Asn Ile Tyr Leu Asn

145 150 155 160

Lys Lys Lys Arg Arg Ala Ala Ala Ala Ile Glu Gly Ser Leu Ser Lys

165 170 175

Gln Pro Val Ala Ala Gly Asp Tyr Gly Asp Gln Gln Asp Tyr Pro Arg

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Thr Arg Gln Glu Tyr Leu Ser Gln Gln Glu Pro Glu Asp Asn Arg Val

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Lys Ile Trp Pro Ile Ile Glu Glu Ser Leu Gln Gly Pro Ala Leu Ser

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Ala Met Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly Ile Phe Thr Lys Pro Glu Ser

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Val Tyr Glu Gly Phe Tyr Asp Pro Leu Phe Arg Gly Leu Leu Ser Ile

245 250 255

Leu Met Leu Ile Met Gly Met Glu Ala Trp Ser Arg Ile Gly Glu Leu

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Arg Lys Val Ala Gln Trp Tyr Val Val Tyr Ser Leu Val Ala Pro Ile

275 280 285

Val His Gly Phe Ile Ala Phe Gly Leu Gly Met Ile Ala His Tyr Thr

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Thr Gly Phe Ser Leu Gly Gly Val Val Val Leu Ala Val Ile Ala Ala

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Ser Ser Ser Asp Ile Ser Gly Pro Pro Thr Leu Arg Ala Gly Ile Pro

325 330 335

Ser Ala Asn Pro Ser Ala Tyr Ile Gly Ala Ser Thr Ala Ile Gly Thr

340 345 350

Pro Ile Ala Ile Gly Val Cys Ile Pro Leu Phe Ile Gly Leu Ala Gln

355 360 365

Thr Leu Gly Ala Gly

370

<210> 31

<211> 1119

<212> DNA

<213> 未知的

<220>

<223> SbtA

<400> 31

atggattttt tatcccactt tttaacggat tttgttggac agttgcagtc cccaacccta 60

gcctttttga ttggggggat ggttattgcc gcccttggta cccaattggt aattccagag 120

gcgatttcta cgatcatcgt ctttatgttg ctcactaaga ttggcctgac cgggggcatg 180

gcaattcgca actccaactt aacggaaatg ctcctgccga tgatattctc cgtaatattg 240

ggaattctaa ttgtattcat cgcccgtttt accctggcta aacttcccaa tgttaaaacc 300

gtggatgccc ttgccactgg tggcttgttt ggggcagtta gtggttctac gatggccgcc 360

gccctaacta cgttggaaga atcaaaaatt tcctacgaag cttgggctgg tgccctctat 420

ccttttatgg atattcctgc cctagtaacg gcgatcgtag tggccaatat ttatctcaat 480

aagaagaagc gtcgtgccgc ggccgccatt gagggatctt taagcaagca acccgttgcc 540

gcaggggatt atggcgatca gcaggattat cctcgtaccc gccaggagta tttgagccag 600

caggaaccgg aggataatcg ggtcaagatc tggccgatca tcgaagaaag tttacaaggt 660

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gtctatgaag gtttctatga tcctcttttt cgaggcctac tttctatctt gatgctcatt 780

atggggatgg aggcttggtc cagaattggc gaactacgta aagtagctca atggtatgtg 840

gtctatagcc tggtagctcc gatagtgcac gggtttattg cctttggtct tggtatgatt 900

gcccactaca ctacgggatt cagcctgggc ggtgtcgtag ttttagcagt catcgccgct 960

tctagttctg atatctccgg cccccccacc ttgcgagccg gtatcccgtc ggccaatccc 1020

tctgcttata ttggtgcatc caccgctatc ggtactccca ttgccatcgg cgtgtgcata 1080

ccgcttttca ttgggcttgc ccagaccctt ggtgcaggt 1119

<210> 32

<211> 5803

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pDCM2

<400> 32

gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag 60

ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 120

tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc 180

agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgaagctag cttttatcgc cattcgccat 240

tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 300

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cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 420

tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 480

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 540

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 600

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 660

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 720

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 780

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 840

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 900

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ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1020

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 1080

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accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1440

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1500

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttgggg 1560

tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ctgatagaaa 1620

cagaagccac tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca 1680

tcacccgacg cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa 1740

ataaatcctg gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga 1800

gacgttgatc ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg 1860

ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctgata gaaacagaag ccactggagc 1920

acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt 1980

gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc 2040

ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg 2100

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ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 2520

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aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 2640

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tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agggcgtccc ggaaaacgat 2760

tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt 2820

gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaaaa ggttaggaat acggttagcc atttgcctgc 2880

ttttatatag ttcantatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca 2940

ataggatatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca 3000

aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc 3060

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acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta 3180

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gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc 3300

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gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt 3540

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agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga tgaactgctg tacattttga 3720

tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa 3780

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tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct 4560

ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg 4620

gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga 4680

ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata 4740

gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata 4800

tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcacc 4860

ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 4920

gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 4980

agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5040

acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5100

gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatccgc gccttgagcc tggcgaacag 5160

ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5220

ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5280

agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 5340

aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 5400

ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 5460

cacgatagcc gcgctgcctc gtcttggagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 5520

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attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 5640

gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat 5700

cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag 5760

ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccg 5803

Claims

1.生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物，所述重组微生物包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述SbtA蛋白来源于蓝细菌(Cyanobacteria)。

3.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述SbtA蛋白含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物的OdhA蛋白的活性进一步减弱。

6.生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括在培养基中培养生产L-谷氨酸的棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物，所述重组微生物包含SbtA蛋白或编码SbtA蛋白的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述SbtA蛋白来源于蓝细菌(Cyanobacteria)。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述SbtA蛋白含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述棒杆菌属(Corynebacterium)的重组微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括从所述重组微生物或培养基中回收L-谷氨酸。

11.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组微生物的OdhA蛋白的活性进一步减弱。