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CN116286746B - 利用液相色谱纯化淀粉酶的方法 - Google Patents

利用液相色谱纯化淀粉酶的方法 Download PDF

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CN116286746B CN202310510465.0A CN202310510465A CN116286746B CN 116286746 B CN116286746 B CN 116286746B CN 202310510465 A CN202310510465 A CN 202310510465A CN 116286746 B CN116286746 B CN 116286746B
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amylase
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Abstract

本发明公开了一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，属于生物制剂技术领域。其包括以下步骤：（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，然后烘干即可。本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。

Description

利用液相色谱纯化淀粉酶的方法
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体地说，涉及一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法。
背景技术
淀粉酶作为一种基本的工业用酶，分为α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。其中α-淀粉酶是一种应用较为广泛的工业用酶，它可以作用于淀粉和其它多糖的内部α-1-4糖苷键，从而产生葡萄糖和麦芽糖等多种物质，目前工业上利用其生产了乙醇、高果糖玉米糖浆、食品、纺织物和洗涤剂等。作为重要的大分子生物催化剂，酶分子具有高效性和特异性，是常用的化学催化剂的良好替代品。此外，酶促反应是在较为温和的条件下进行，所产生的副产物和污染少。因此，近年来，酶分子在制药、化工、生物、食品等行业的应用明显增加。然而，酶分子在极端条件下具有相对较低的稳定性，并且在商业应用中成本颇高。为了改善这些局限性，提高酶活力、稳定性、再利用能力和酶的效率成为了研究的热点。其中，研究多采用超声波处理、微波辐射、高静水压、超临界二氧化碳处理以及蛋白质工程修饰酶分子等方法对酶的特性进行改善。例如，通过对酶分子表面的多聚赖氨酸修饰可以有效提高肌氨酸氧化酶的pH稳定性和热稳定性；还有研究者通过改善亚临界和超临界处理条件进而增强了α-淀粉酶的酶活力等。由于生物技术在不断发展和吸引新方法，基于绿色和科学的原则，超声波作为绿色、科学以及高效的物理技术受到越来越多的关注。但是，现有技术对于淀粉酶的纯化产率较低，而且酶活力也较低。
发明内容
1、要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。具体来说，利用枯草芽孢杆菌进行有效发酵，可以得到高产率的淀粉酶，同时，合适的凝胶过滤的凝胶材质能够有效过滤杂质，起到提纯淀粉酶的效果，并利用合适的洗脱分离工艺实现淀粉酶活性的保留。
2、技术方案
一种利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.16139，保藏日期为2018年7月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
所述的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 150份-200份，
壳聚糖 80份-120份，
β-磷酸三钙 20份-60份，
环氧氯丙烷 0.5份-1.5份。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中所述的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
所述103中的pH值计算公式适配为：；所述104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1.本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。具体来说，利用枯草芽孢杆菌进行有效发酵，可以得到高产率的淀粉酶，同时，合适的凝胶过滤的凝胶材质能够有效过滤杂质，起到提纯淀粉酶的效果，并利用合适的洗脱分离工艺实现淀粉酶活性的保留。
2.通过设置的具体调节步骤策略对提取液中的pH值准确计算，然后准确计算酸碱中和剂的需要添加量，以保证pH值的准确调节，进一步提高了淀粉酶的纯化效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.16139，保藏日期为2018年7月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 150份，
壳聚糖 120份，
β-磷酸三钙 20份，
环氧氯丙烷 1.5份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例2
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 200份，
壳聚糖 80份，
β-磷酸三钙 60份，
环氧氯丙烷 0.5份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例3
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 170份，
壳聚糖 110份，
β-磷酸三钙 30份，
环氧氯丙烷 1.2份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例4
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 180份，
壳聚糖 90份，
β-磷酸三钙 30份，
环氧氯丙烷 0.8份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
实施例5
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 175份，
壳聚糖 100份，
β-磷酸三钙 40份，
环氧氯丙烷 1份，
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中/>为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
103中的pH值计算公式适配为：；104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为/>；1042、求出酸碱中和剂的需要添加量/>。
对比例1
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 175份，
β-磷酸三钙 40份，
环氧氯丙烷 1份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
对比例2
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 175份，
壳聚糖 100份，
环氧氯丙烷 1份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
对比例3
利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，低温烘干，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的培养基为NB营养肉汤；
的NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm；
步骤（1）中发酵的pH值为7.0。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
明胶 175份，
壳聚糖 100份，
β-磷酸三钙 40份，
环氧氯丙烷 1份。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中的凝胶材质的制备方法如下：
将明胶、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h，即可。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为赛默飞生产的052962型离子交换色谱柱。
上述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，
步骤（2）中洗脱分离的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
实施例6
选择实施例1-5配制的淀粉酶及对比例1-3配制的淀粉酶，进行下述测试。
参照在先文献（ema Agüloğlu Fincan, Sadin Özdemir, Adem Karakaya, BarışEnez, Sibel Demiroğlu Mustafov, Mehmet Sefa Ulutaş, Fatih Şen, Purificationand characterization of thermostable α-amylase produced from Bacilluslicheniformis So-B3 and its potential in hydrolyzing raw starch, LifeSciences, Volume 264, 2021, 118639, ISSN 0024-3205, https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118639.）进行相关指标测定，结果见下表1：
表1实施例1-5及对比例1-3配制的淀粉酶的酶活力和产率测试结果
酶活力（U/mg） 产率（%）
对比例1 101 4.25
对比例2 94 3.87
对比例3 82 4.56
实施例1 133 7.23
实施例2 135 7.44
实施例3 141 7.67
实施例4 147 7.82
实施例5 150 7.85
从以上结果（表1）可以看出，本发明的工艺方法对于淀粉酶的纯化具有明显的提升作用，使用后不仅产率提升，而且酶活力的保留较大。具体来说，利用枯草芽孢杆菌进行有效发酵，可以得到高产率的淀粉酶，同时，合适的凝胶过滤的凝胶材质能够有效过滤杂质，起到提纯淀粉酶的效果，并利用合适的洗脱分离工艺实现淀粉酶活性的保留。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术专利，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术专利也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
包括以下步骤：
（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；步骤（1）中发酵的pH值为7.0；步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：
101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，/>为i高度上采集的提取液的pH值；
102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中/>为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为/>，其中为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，/>，其中h为容器中溶液的高度；
103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；
104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂；
所述103中的pH值计算公式适配为：；
所述104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：
1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为；
1042、求出酸碱中和剂的需要添加量；
所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.16139，保藏日期为2018年7月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，然后烘干；步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；
步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：
葡聚糖 150份-200份，
壳聚糖 80份-120份，
β-磷酸三钙 20份-60份，
环氧氯丙烷 0.5份-1.5份。
2.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中发酵采用的培养基为NB营养肉汤；
所述NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。
3.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中发酵的时间为24h；
步骤（1）中发酵的温度为35℃；
步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm。
4.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（1）中离心的转速为12000rpm；
步骤（1）中离心的时间为15min；
步骤（1）中离心的温度为4℃。
5.根据权利要求4所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述凝胶材质的制备方法如下：
将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h。
6.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为052962型离子交换色谱柱。
7.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：
步骤（2）中洗脱分离采用的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。
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