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CN116284018A - 一种呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法及其应用 - Google Patents

一种呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法及其应用 Download PDF

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CN116284018A
CN116284018A CN202310319881.2A CN202310319881A CN116284018A CN 116284018 A CN116284018 A CN 116284018A CN 202310319881 A CN202310319881 A CN 202310319881A CN 116284018 A CN116284018 A CN 116284018A
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方静
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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及呋喃并[2,3‑b]喹啉衍生物、其互变异构体、药用盐、前药或溶剂化物在制备治疗慢性肾病的药物中的应用，所述呋喃并[2,3‑b]喹啉衍生物的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure DDA0004151307390000011
其中R1为甲氧基；R2为氢、羟基、甲氧基；R3为氢、羟基、甲氧基；R4为氢、甲氧基。实验表明本发明的化合物具有显著的治疗慢性肾病作用。本发明的化合物制备途径多样性，经济性，且具有活性明确、毒性小等特点，具备广阔的应用前景。

Description

一种呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于医药与化工领域，具体涉及一种呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法及应用。
背景技术
慢性肾病(renal fibrosis，RF)是一种慢性进行性纤维化肾病，与几乎所有慢性肾脏疾病(chronickidney disease，CKD)和进展性肾病相关。目前RF明确的发病机制尚不清楚。RF发病因素有很多，肾脏在受到损伤、感染、高血压以及不良生活习惯等多种因素影响后，肾脏发生细胞受损、纤维化和硬化，这个过程即肾脏纤维化的过程，其病理特征为损伤、炎症、肌成纤维细胞活化迁移和肾小管上皮细胞-间充质转化，以及细胞外基质沉积和重塑。损伤后纤维基质的沉积最初可能有助于组织修复，轻度损伤后纤维基质能在组织修复过程中被吸收。然而，在发生CKD的慢性损伤后，损伤是不断进行的，纤维基质不会被完全吸收，纤维基质沉积不受抑制，最终破坏器官结构，减少血液供应，扰乱器官功能。纤维化会降低组织修复的能力，最终导致肾衰竭。
从目前研究来看，抑制肌成纤维细胞激活和分化、减少炎症反应、清除细胞外基质沉积等是改善慢性肾病的主要途径。鉴于RF的发生日益普遍和相关死亡率的不断增加，迫切需要研发安全有效的治疗慢性肾病的药物。
呋喃并喹啉类化合物广泛存在于植物中，如白鲜、臭草、松风草和竹叶椒，这些化合物具有一定的生物活性，如白鲜碱(小剂量)对离体蛙心有兴奋作用，可使心肌张力增加，对离体兔耳血管有明显收缩作用，对家兔和豚鼠子宫平滑肌有强力收缩作用。此外，还具有抗菌和皮肤湿疹、皮肤瘙痒的治疗作用。然而呋喃并喹啉类衍生物抗RF的活性评价，未曾有文献报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法及其在制备治疗慢性肾病的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物、其互变异构体、药用盐、前药或溶剂化物在制备治疗慢性肾病的药物中的应用，所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0004151307370000011
其中R1为甲氧基；R2为氢、羟基、甲氧基；R3为氢、羟基、甲氧基；R4为氢、甲氧基。
优选的，所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构和取代基如表1所示：
表1本发明呋喃[2,3-b]喹啉生物碱类化合物取代基和结构
Figure BDA0004151307370000021
Figure BDA0004151307370000031
优选的，所述药物还包括药用载体、辅剂或赋形剂。
上文所述药学上可接受的“载体、辅剂或赋形剂”是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂，赋形剂如水等，填充剂如淀粉蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、明胶等；另外还可以以组合物中加入其他辅料如香味剂、甜味剂等。
本发明的化合物可以作为有利化合物或作为溶剂化物的晶体形式。溶剂化的方法是本领域内公知的，适当的溶剂化物是药用溶剂化物。在具体实施方案中，溶剂化物是水合物。
优选的，所述慢性肾病为肾纤维化。
一种呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取制备方法，所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构式为：
Figure BDA0004151307370000032
所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取制备方法包括以下步骤：
S1、将芸香枝叶粉碎，加水超声提取，浓缩提取液、过滤，滤液上大孔树脂柱吸附，并依次用水、50％乙醇及90％乙醇洗脱，收集90％乙醇的洗脱液，浓缩，得到流浸膏；将流浸膏上正相硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXC-1～YXC-14；
S2、将YXC-5上凝胶柱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇溶液洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXC5-1～YXC5-6；
S3、将YXC5-2经反相半制备型HPLC，得到化合物呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物LYY-12(tR＝40.134min)。
优选的，将芸香枝叶超声提取两次，每次1h，并合并提取液。
优选的，所述大孔树脂柱为D101大孔树脂柱。
优选的，以二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇体积比从100:0至0:1。
洗脱过程中边洗边点薄层板，至洗脱出来的溶剂没有物质，即更换下一个梯度。
优选的，合并相似馏分之前还包括鉴定馏分，以薄层色谱跟踪点板鉴定。
优选的，石油醚-二氯甲烷-甲醇溶液中，石油醚-二氯甲烷-甲醇的体积比为(5-20):5:1，最优为5:5:1。
这个比例的石油醚-二氯甲烷-甲醇溶液分离效果在所尝试的体系中最优，正好能把物质按不同极性分开。而用二氯甲烷和甲醇体系(10:1、5:1、2:1)或石油醚和乙酸乙酯体系(10:1、5:1、2:1)，均会出现部分化合物分不开。
优选的，反相半制备型HPLC的柱子为苯基柱，流动相为体积比为29:71的乙腈-水。苯基柱的分离效果(峰形和保留时间，分离度)优于C18和C8柱。根据多次试验结果，流动相中，以29:71的比例的分离效果最好，明显优于(40-50):(50-60)的比例的乙腈-水溶液。
优选的，药渣加80％乙醇溶液没过药材超声提取，浓缩提取液，滤液用石油醚萃取三次，合并石油醚层部分用乙酸乙酯萃取三次，浓缩冻干后得乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物上正相硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXY-1～YXY-18。
YXY-4上正相硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXY4-1～YXY4-10。
YXY4-6析出结晶经鉴定为呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物LYY-12。
优选的，YXY4-6结晶后的剩余的溶解部分继续用甲醇溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统(1:1)洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXY4-6-1～YXY4-6-6；YXY-4-6-3和YXY-4-6-5部分析出晶体，即为呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物LYY-12。
优选的，将药渣超声提取两次，每次1h，并合并提取液。
优选的，石油醚-乙酸乙酯溶液梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯体积比从4:1至1:2。
优选的，化合物呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物LYY-12的提取制备方法中，LYY-12主要存在于药渣醇提部分中。优选的，所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法包括以下步骤：
(1)在强碱中依次滴加丙二酸二酯、氯乙酰氯、催化剂反应，得到化合物1；
所述丙二酸二酯的结构为：
Figure BDA0004151307370000041
其中，R选自C1-C4支链或直链烷基、苯基或取代苯基；所述取代苯基的取代基包括卤素、C1-C4支链或直链烷基、C1-C4烷氧基；
(2)将芳基胺滴加在步骤(1)制得的化合物1中，反应后加入乙酸乙酯的水溶液沉淀，得到固相的化合物2和溶液；
所述芳基胺的结构为：
Figure BDA0004151307370000042
R2、R3和R4分别独立的选自氢、羟基、卤素、C1-C4的直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、苄氧基；
(3)将化合物2加入到惰性溶剂中，升温至250-260℃回流搅拌0.5h-1h，后加入石油醚，过滤、干燥，得到化合物3；
(4)向化合物3中加入氯代试剂反应，后用二氯甲烷低温萃取、浓缩得化合物4；
(5)在冰浴下，在化合物4中加入还原剂反应，后浓缩、二氯甲烷萃取、水洗、干燥得化合物5；
(6)在化合物5中加入硫酸氢钾或盐酸，回流反应3h-5h，后用乙酸乙酯萃取、碱中和、干燥，得到化合物6；
(7)在碱的作用下，在化合物6中加入亲核试剂，回流反应2-3d，后用乙酸乙酯萃取、水洗、干燥，得到粗品，粗品经正相柱层析分离纯化得所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物；
所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构为：
Figure BDA0004151307370000051
其中R1为甲氧基；R2为氢、羟基、甲氧基；R3为氢、羟基、甲氧基；R4为氢、甲氧基。
优选的，所述步骤(1)和(2)中，C1-C4支链或直链烷基包括甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、叔丁基。
优选的，所述步骤(1)和(2)中，所述C1-C4烷氧基选自甲氧基、乙氧基、丙氧基。
优选的，所述步骤(1)中，所述强碱为氢化钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠中的一种。
优选的，所述步骤(1)中，所述催化剂选自三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或1,8-二氮杂环[5,4,0]十一烯-7；进一步优选为三乙胺。此步骤不加催化剂，产物的产率极低。
优选的，所述步骤(1)的反应温度为0-30℃。
优选的，所述步骤(1)中，加氯乙酰氯反应1～2h后，再加入三乙胺，继续反应2-4h。
优选的，所述步骤(2)中的溶液分为有机相和水相，有机相减压浓缩，经乙醚等醚类搅拌分散，过滤得到粗品，粗品经乙醇重结晶得化合物2纯品。
优选的，所述步骤(3)中的惰性溶剂为不含活泼氢和酯基的在高温下不与反应物发生反应的溶剂。优选惰性溶剂为二苯醚。
优选的，所述步骤(4)中的氯代试剂选自三氯氧磷、三氯化磷、五氯化磷、草酰氯、二氯亚砜、磺酰氯或氯气，优选三氯氧磷。三氯氧磷在本发明的反应体系中选择性最佳。
优选的，所述步骤(4)的氯化反应还加入表面活性剂，优选为三辛基甲基氯化铵。在表面活性剂的促溶下，三氯氧磷进一步提高了反应的选择性。
步骤(3-6)中的萃取试剂经过多次优化，效果最佳，能取得别的有机溶剂不能达到的选择性。
优选的，所述步骤(5)的还原剂选自硼氢化钠、硼氰化钠、四硼酸锂、四氢化锂铝酸盐或二异丁基氢化铝。
优选的，所述步骤(7)中正相柱层析的流动相为石油醚/乙酸乙酯体积比为2/1混合溶液。
优选的，所述步骤(7)中的碱包括氢化钠、氢氧化钠、烷基醇钠或烷基醇钾，烷基醇钠包括甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠。
优选的，所述步骤(7)中的亲核试剂选自醇、酚、硫醇、硫酚、胺、N-杂环化合物。
优选的，所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的合成路线如下：
Figure BDA0004151307370000061
本发明的合成方法以丙二酸二酯和芳基胺为起始原料，经七步反应合成所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物。化学合成方法反应简单，萃取过程经过优化，中间步骤只需要经过简单的萃取过滤，成品处理操作简便，只需要经一次柱层析分离即制备得所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物纯品，而不需要像现有技术一样每个步骤都经过过柱分离。
下面对本发明做进一步的解释：
本发明从芸香中发现了化合物LYY12，经鉴定为香草木宁，通过研究首次发现LYY12具有改善慢性肾病的肾脏作用。香草木宁，英文名kokusaginine，别名：6,7-dimethoxydictamnine，本发明将它简称为LYY12。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将式(Ⅰ)命名4,6,7-trimethoxyfuro[2,3-b]quinoline，其中文名为4,6,7-三甲氧基呋喃[2,3-b]喹啉。它的分子式：C14H13NO4，分子量为：259.257。化学文摘号(CAS)为：484-08-2。是从白鲜属(Dictamnus dasycarpus Turcz)植物中提取到的一种生物碱，也可来源于臭草(rutagraveolens)，臭山羊(orixajaponica)、花椒(zanthoxylumbungeanummaxim.)、臭常山属(ormasp.)、山油柑属(acronychiasp.)、吴茱萸属(evodiasp.)、拟芸香属(haplopayllumsp.)、蜜茱萸属(melicopesp.)植物。它具有提高去甲肾上腺素和多巴胺水平(Chem.Res.Toxicol,2014,27(2),219-239)；光毒作用(Planta Medica 1981,41(2),136-42.)；杀虫(Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 1999,41st,451-456.)、抗锥虫活性(ChemMedChem 2022,17(5),e202100784)、抗炎(J.Ethnopharmacol.2019,238,111827；Bio.Med.Chem.2011,19(21),6340-6347；AJPTR2017,7(2),315-324)、对人类癌细胞系(HL-60,SMMC-7721,A-549,MCF-7和SW480)的抗增殖活性(Nat.Pro.Res.2022,36,379-384)、对人乳腺癌细胞生长和多药耐药抑制作用(Bio.Med.Chem.Lett.2018,28(14),2490-2492)和解痉挛作用(AJPTR 2017,7(2),315-324)等。
本发明通过建立慢性肾病动物模型，观察LYY12对小鼠慢性肾病的治疗作用。研究结果表明，LYY12对慢性肾病具有良好的治疗作用。
本发明通过人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)、大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)研究不同剂量的LYY、HL系列化合物的慢性肾病抑制作用，通过CCK8检测不同浓度孵育后细胞增殖情况，筛选出LYY12进行下一步动物实验。
实验动物采取雄性、7周龄C57小鼠。实验正式开展前所有小鼠适应性喂养一周，所有小鼠自由摄食饮水，采用12h的昼夜周期。将制备的LYY12溶于0.5％CMC-Na，制备下述给药组不同浓度的剂量，小鼠随机分为空白组(N)、模型组(M)、LYY12高剂量组(LYY12-H)、LYY12中剂量组(LYY12-M)、LYY12低剂量组(LYY12-L)。除空白组小鼠外，其余组小鼠均需建立慢性肾病模型。
本发明通过让C57BL/6小鼠连续21天每日自主摄入含0.2％的腺嘌呤饲料诱导建立慢性肾病模型，摄入腺嘌呤饲料的同时开始给药，分别按10ml/kg体积灌胃给予小鼠CMC-Na、LYY12 10mg/kg/day(低剂量)、20mg/kg/day(中剂量)、40mg/kg/day(高剂量)和别嘌醇20mg/kg/day，给药21天。研究结果表明，LYY12不同剂量对慢性肾病均具有不同程度的改善作用。0.2％腺嘌呤饲料诱导后，小鼠体重明显下降，尿素氮和肌酐值升高，皮质肾小管扩张萎缩情况严重，皮质中细胞管型和蛋白管型增加，间质炎症浸润增加，胶原沉积加重，而经过LYY12给药治疗后，小鼠肾功能明显改善，肾组织结构损伤明显改善，胶原沉积情况得到缓解，同时LYY12能够明显减轻小鼠肾组织炎症，以上这些结果充分表明LYY12能够有效治疗慢性肾病。
本发明所用LYY12产品采用常规天然产物化学与分离纯化及药物合成方法制得。本实验室采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达99％以上，并经过质谱法和核磁共振法分析鉴定，表明本实验室所用的LYY12产品化学结构正确。此项研究表明LYY12其纯度和化学结构符合开展体内、体外生物学活性和药理作用研究要求。
本发明的有益效果为：
本发明首次发现所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物对慢性肾病有治疗作用；具体而言，通过C57BL/6小鼠连续21天每日自主摄入含0.2％的腺嘌呤饲料诱导建立慢性肾病模型，摄入腺嘌呤饲料的同时开始给药，分别灌胃给予小鼠LYY1210mg/kg、20mg/kg和40mg/kg，给药21天。研究结果表明，高剂量的LYY12相比于别嘌醇，能够更为显著的减少小鼠体重降低以及改善小鼠肾功能及肾结构损伤，表明LYY12具有较好的治疗效果。并以丙二酸二乙酯和3，4-二甲氧基苯胺为原料，经七步反应合成了所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物，合成方法简单，操作简便，该合成路线为香草木宁提供了一种高效的合成方法，为其工业化生产提供了可行的路线和方案。
附图说明
图1为化合物LYY12的HRESI-MS图；
图2为化合物LYY12的核磁共振氢谱图；
图3为化合物LYY12的核磁共振碳谱图；
图4为化合物LYY38的HRESI-MS图；
图5为化合物LYY38的核磁共振氢谱图；
图6为化合物LYY38的核磁共振碳谱图；
图7为化合物LYY40的HRESI-MS图；
图8为化合物LYY40的核磁共振氢谱图；
图9为化合物LYY40的核磁共振碳谱图；
图10为化合物LYY66的HRESI-MS图；
图11为化合物LYY66的核磁共振氢谱图；
图12为化合物LYY66的核磁共振碳谱图；
图13为化合物LYY68的HRESI-MS图；
图14为化合物LYY68的核磁共振氢谱图；
图15为化合物LYY103的HRESI-MS图；
图16为化合物LYY103的核磁共振氢谱图；
图17为化合物LYY103的核磁共振碳谱图；
图18为化合物HL-14的HRESI-MS图；
图19为化合物HL-14的核磁共振氢谱图；
图20为化合物HL-14的核磁共振碳谱图；
图21为化合物HL-17的HRESI-MS图；
图22为化合物HL-17的核磁共振氢谱图；
图23为化合物HL-17的核磁共振碳谱图
图24为化合物HL-18的HRESI-MS图；
图25为化合物HL-18的核磁共振氢谱图；
图26为化合物2a的核磁共振氢谱图；
图27为化合物3a的核磁共振氢谱图；
图28为香草木宁的核磁共振氢谱图；
图29为LYY、HL系列化合物对NRK-49F细胞增殖的影响；
图30为LYY、HL系列化合物对HK-2细胞增殖的影响；
图31为0.2％腺嘌呤饲料诱导的慢性肾病小鼠造模结果图；
图32为LYY12对慢性肾病小鼠肾功能的影响；
图33为LYY12对慢性肾病小鼠肾组织的影响
具体实施方法
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取
取芸香枝叶10kg粉碎，加水溶液没过药材超声提取两次，每次1h，合并提取液，浓缩，过滤得水提液，药渣备用，水提液上D101大孔树脂柱吸附，依次用水、50％乙醇及90％乙醇洗脱，分别收集水、50％乙醇及90％乙醇洗脱液，浓缩，得到三个洗脱部位的流浸膏。其中90％乙醇部分流浸膏约14.3g,上正相硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统(二氯甲烷与甲醇体积比从100:0至0:1)梯度洗脱，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXC-1～YXC-14。
YXC-3上Sephadex LH-20凝胶柱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇系统(5:5:1)，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXC3-1～YXC3-10，YXC3-6,经反相半制备型HPLC，苯基柱，以29％乙腈-水作为流动相，得到流份YXC3-6-3，得化合物LYY-68(6mg)(tR＝35.601min)，得到化合物LYY-66(8mg)(tR＝39.956min)。
YXC-5上Sephadex LH-20凝胶柱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇系统(5:5:1)，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXC5-1～YXC5-6，YXC5-2经反相半制备型HPLC，苯基柱，以29％乙腈-水作为流动相,得到化合物LYY-12(10mg)(tR＝40.134min)。
YXC-6上Sephadex LH-20凝胶柱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇系统(5:5:1)，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXC6-1～YXC6-11，YXC6-4经反相半制备型HPLC，苯基柱，以20％乙腈-水作为流动相，得到流份YXC6-4-4，YXC6-4-4继续经反相半制备型HPLC，以20％乙腈-水作为流动相，得化合物LYY-38(8mg)(tR＝37.353min)。
YXC6-5经反相半制备型HPLC，苯基柱，以30％乙腈-水作为流动相，得到流份YXC6-5-2，YXC6-5-2继续经反相半制备型HPLC，以30％乙腈-水作为流动相，得化合物LYY-40(12mg)(tR＝18.581min)。
YXC6-2上正相硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯系统(2:1)洗脱，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXC6-2-1～YXC6-2-11。YXC6-2-9经反相半制备型HPLC，C18柱，以30％乙腈-水作为流动相，得到流份YXC6-2-9-2，YXC6-2-9-2继续经反相半制备型HPLC，苯基柱，以59％乙腈-水作为流动相，得化合物LYY-103(10mg)(tR＝19.56min)。
药渣加80％乙醇溶液没过药材超声提取两次，每次1h，合并提取液，浓缩，过滤得醇提液，醇提液用石油醚萃取三次，合并石油醚层部分用乙酸乙酯萃取三次，浓缩冻干后得乙酸乙酯萃取物(80g)。乙酸乙酯萃取物上正相硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统(二氯甲烷与甲醇体积比从100:0至0:1)梯度洗脱，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXY-1～YXY-18。
YXY-4上正相硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯系统(石油醚与乙酸乙酯体积比从4:1、2:1、1:1、1:2)梯度洗脱，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXY4-1～YXY4-10。YXY4-6用甲醇溶解,溶解部分上Sephadex LH-20凝胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统(1:1)，薄层色谱跟踪点板，合并相似馏分，减压干燥，合并得到流份YXY4-6-1～YXY4-6-6，YXY-4-6-3和YXY-4-6-5部分析出晶体为LYY12。不溶部分析出结晶经鉴定为化合物LYY12。YXY4-6-4经制备型薄层色谱以二氯甲烷-甲醇系统(20:1)分离，得到YXY4-6-4-1～YXY4-6-4-4。YXY4-6-4-3经反相半制备型HPLC，C18柱，以38％甲醇-甲酸水作为流动相，得化合物HL-14(2mg)(tR＝30.060min)，得到化合物HL-18(2mg)(tR＝46.783min)。YXY4-6-4-3继续经反相半制备型HPLC，苯基柱，以38％甲醇-甲酸水作为流动相，得到流份YXY4-6-4-3-6，为化合物HL-17(2mg)(tR＝38.108min)。
结果：经鉴定，各化合物的结构如下：
化合物LYY-12为淡黄色针状晶体，化学结构式为：
Figure BDA0004151307370000091
光谱数据如下：ESI-MS m/z:260.0924[M+H]+(calcd for C14H13NO4)。ESI-MS如图1所示。核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图2和图3所示。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ：7.72(d,J＝3.0Hz,3H),7.46(d,J＝2.4Hz,3H),7.28(s,3H),7.17(d,J＝2.4Hz,3H),4.94(s,2H),4.60(s,1H),4.46(d,J＝2.4Hz,9H),3.97(d,J＝2.5Hz,9H),3.94(d,J＝2.5Hz,9H),3.31(s,12H),1.32(s,1H),1.30–1.20(m,2H).13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ：158.55,155.39,150.22,144.77,143.97,114.95,107.36,107.06,104.37,102.57,60.78,57.24,57.20.
化合物LYY-38为棕色粉末，化学结构式为：
Figure BDA0004151307370000092
光谱数据如下：ESI-MS m/z:246.0774[M+H]+(calcd for C13H11NO4)。ESI-MS如图4所示，核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图5和图6所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：8.54(s,6H),7.97–7.89(m,2H),7.74(d,J＝3.0Hz,2H),7.33(d,J＝2.9Hz,2H),7.10(dd,J＝9.1,2.1Hz,2H),4.62(s,7H),4.48(t,J＝1.9Hz,7H),3.96(t,J＝1.9Hz,7H),3.70(s,2H),3.65(s,3H),3.34(d,J＝1.9Hz,7H),3.15(p,J＝6.5,5.6Hz,6H),2.53(t,J＝6.6Hz,2H),1.62(d,J＝11.7Hz,1H),1.36–1.26(m,16H),1.21(s,1H),0.89(d,J＝7.9Hz,1H).13C NMR(151MHz,Methanol-d4)δ：170.28,151.92,144.07,142.46,119.79,117.48,106.42,61.68,60.05,49.89,47.74,21.63,9.33.
化合物LYY-40为棕红色粉末，化学结构式为：
Figure BDA0004151307370000101
ESI-MS m/z:216.0682[M+H]+(calcd for C12H9NO4)。ESI-MS如图7所示，核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图8和图9所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：7.81–7.70(m,2H),7.52(s,1H),7.36–7.26(m,2H),4.48(s,3H).13C NMR(151MHz,Methanol-d4)δ：163.80,157.49,155.18,145.06,141.06,128.82,123.34,120.86,106.14,104.89,104.80,59.99.
化合物LYY-66为白色粉末，化学结构式为：
Figure BDA0004151307370000102
ESI-MS m/z:230.0839[M+H]+(calcd for C13H11NO3)。ESI-MS如图10所示，核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图11和图12所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：7.80(d,J＝2.8Hz,1H),7.77(s,1H),7.58(d,J＝2.9Hz,1H),7.38(d,J＝2.9Hz,1H),7.36(t,J＝2.9Hz,2H),4.63(d,J＝7.5Hz,1H),4.52(s,3H),3.92(s,3H),3.34(s,4H).13C NMR(151MHz,Methanol-d4)δ：164.07,157.80,157.75,145.20,141.82,128.98,123.83,120.40,106.21,105.09,101.36,60.08,56.01.
化合物LYY-68为白色粉末，化学结构式为：
Figure BDA0004151307370000103
ESI-MS m/z:200.0699[M+H]+(calcd for C12H9NO2)。ESI-MS如图13所示，核磁共振氢谱图如图14所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：8.31(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),7.88(dt,J＝8.5,0.9Hz,1H),7.83(d,J＝2.8Hz,1H),7.72(ddd,J＝8.4,6.8,1.5Hz,1H),7.49(ddd,J＝8.2,6.8,1.2Hz,1H),7.40(d,J＝2.8Hz,1H),4.62(s,2H),4.53(s,3H),3.34(s,9H).
化合物LYY-103为白色针状，化学结构式为：
ESI-MS如图15所示，核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图16和图17所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：8.03(d,J＝9.4Hz,1H),7.75(d,J＝2.8Hz,1H),7.35(d,J＝9.4Hz,1H),7.31(d,J＝2.8Hz,1H),4.48(s,3H),4.01(s,3H),3.97(s,3H),3.35(s,1H).13CNMR(151MHz,MeOD)δ166.10,159.29,153.92,144.48,143.99,142.65,142.04,119.70,115.89,113.46,106.53,106.37,106.28,103.57,103.38,101.74,61.76,60.11,59.98,57.23,56.44,56.39,49.90,49.48,49.33,49.19,49.05,48.91,48.77,48.62.
Figure BDA0004151307370000111
化合物HL-14为淡黄色粉末，化学结构式为：
ESI-MS m/z:216.0685[M+H]+(calcd for C12H9NO3)。ESI-MS如图18所示，核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图19和图20所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：7.76(d,J＝2.8Hz,1H),7.73(d,J＝9.1Hz,1H),7.52(d,J＝2.7Hz,1H),7.33–7.26(m,2H),4.47(s,3H).13C NMR(151MHz,MeOD)δ：163.48,157.16,154.84,144.74,140.76,128.51,123.01,120.55,105.80,104.58,104.49,64.13,59.67,49.29,49.14,49.00,48.86,48.72,48.58,48.43,48.29.
Figure BDA0004151307370000112
化合物HL-17为白色粉末，化学结构式为：
ESI-MS m/z:246.0793[M+H]+(calcd for C13H11NO4)。ESI-MS如图21所示，核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图22和图23所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：7.70(d,J＝2.8Hz,1H),7.53(s,1H),7.29(d,J＝2.8Hz,1H),7.16(s,1H),4.48(s,3H),3.98(s,3H).13C NMR(151MHz,MeOD)δ：164.17,157.55,152.03,148.51,143.39,143.10,113.54,109.36,105.92,102.75,101.28,59.61,56.05,49.14,49.00,48.86,48.72,48.57,48.43,48.29.
Figure BDA0004151307370000113
化合物HL-18为黄色油状，化学结构式为：
ESI-MS m/z:246.0791[M+H]+(calcd for C13H11NO4)。ESI-MS如图24所示，核磁共振氢谱图如图25所示。1H NMR(600MHz,Methanol-d4)δ：7.93(d,J＝9.0Hz,11H),7.74(d,J＝2.8Hz,13H),7.32(s,9H),7.10(d,J＝9.2Hz,13H),5.34(s,1H),4.60(s,5H),4.47(s,37H),3.96(s,33H),3.89–3.82(m,4H),3.65(dd,J＝6.7,4.3Hz,3H),3.58(t,J＝5.6Hz,3H),3.35(s,4H),3.21(t,J＝7.3Hz,3H),3.16(t,J＝6.6Hz,3H),2.35–2.30(m,3H),2.18(t,J＝7.4Hz,3H),2.06–2.03(m,2H),1.77(s,2H),1.64–1.58(m,6H),1.53–1.48(m,3H),1.37–1.25(m,25H),0.94–0.85(m,8H),0.10(s,2H).
Figure BDA0004151307370000121
实施例2.
香草木宁的化学合成
Figure BDA0004151307370000122
方案A：单次柱层析制备香草木宁
化合物2a的合成：
方法1：在100mL的圆底瓶中，4g氢化钠(60％)用干燥石油醚淋洗后加入到20mL四氢呋喃中分散，室温搅拌，1h内缓慢滴加丙二酸二乙酯(16g，15mL)，滴加完毕备用。另取500mL反应瓶，将氯乙酰氯(5.6g,4mL)用30mL干燥四氢呋喃溶解后，冰浴下将前一步制备的溶液1h内缓慢滴加入该反应瓶，控制反应温度低于30℃。滴毕后室温搅拌1h，随后加入三乙胺(10g，13.5mL)，继续搅拌2h。随后在冰浴下，1h内缓慢滴加3,4-二甲氧基苯胺(7.8g)的干燥四氢呋喃(50mL)溶液，控制温度不超过30℃，滴毕后室温搅拌过夜。薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯2：1)分析原料反应完全后，减压浓缩除去四氢呋喃，加入300mL乙酸乙酯和100mL水萃取，期间产生固体过滤，可得化合物2a纯品2.2g。将滤液的有机相干燥，减压浓缩后用乙醚搅拌分散，过滤得到粗品，粗品加入10mL乙醇重结晶得3.2g化合物2a，灰白色固体，产率42％，核磁共振氢谱如图26所示，核磁数据为1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ：10.08(s,1H),6.88(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H),6.83–6.77(m,2H),4.60(s,2H),4.32(q,J＝7.0Hz,2H),3.83(d,J＝2.2Hz,7H),1.34(t,J＝7.1Hz,4H),1.24(s,1H),1.19(d,J＝4.6Hz,2H)。
方法2：在25mL的圆底瓶中，0.3g氢化钠(60％)用干燥石油醚淋洗后加入到2.1mL四氢呋喃中分散，室温搅拌，1h内缓慢滴加丙二酸二乙酯(2.1g，1.96mL)，滴加完毕备用。另取100mL反应瓶，将氯乙酰氯(0.77g,0.54mL)用2.9mL干燥四氢呋喃溶解后，冰浴下将前一步制备的溶液1h内缓慢滴加入该反应瓶，控制反应温度低于30℃。滴毕后室温搅拌1h。随后在冰浴下，1h内缓慢滴加3,4-二甲氧基苯胺(1g)的干燥四氢呋喃(4.3mL)溶液，控制温度不超过30℃，滴毕后室温搅拌过夜。薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯2：1)分析原料反应完全后，40℃减压除去四氢呋喃，加入30mL乙酸乙酯和10mL水萃取，合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩硅胶柱层析后得0.23g化合物2a，产率16％。
化合物3a的合成：
在100mL反应瓶中，将化合物2a(2.2g)加入22mL二苯醚中，升温至250-260℃回流搅拌1h，薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯1：1)分析原料反应完全，冷却至室温；向反应液中缓慢滴加200mL石油醚，将产生的固体过滤，滤饼用石油醚淋洗，得到1.8g褐色固体化合物3a粗品，核磁共振氢谱如图27所示，核磁数据为1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ：13.06(s,3H),7.54(s,3H),7.49–7.43(m,1H),7.23–7.18(m,1H),7.13–7.03(m,1H),6.99(s,3H),4.97(s,1H),4.85(s,6H),4.18(s,1H),3.94(s,9H),3.90(s,9H),3.85–3.75(m,4H),3.23(s,1H),2.10–2.01(m,1H),1.52(t,J＝7.2Hz,1H),1.35(s,1H),1.32–1.28(m,5H),0.92(t,J＝7.0Hz,1H)。
化合物4a的合成：
在25mL的反应瓶中加入1.8g上一步化合物3a，随后加入4mL三氯氧磷和320mg三辛基甲基氯化铵，氮气保护下于室温搅拌48h。薄层色谱(二氯甲烷：甲醇5：1或石油醚：乙酸乙酯1：1)分析原料反应完全，将反应液倒入20mL碎冰中，加入二氯甲烷(3x50mL)萃取，合并干燥过滤浓缩得化合物4a粗品。
化合物5a的合成：
上一步的化合物4a用20mL二氯甲烷/甲醇1：1混合溶剂溶解，冰浴下加入270mg硼氢化钠，室温搅拌反应1h。薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯1：1)分析原料反应完全后，加入5mL水猝灭硼氢化钠，40℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，乙酸乙酯(3x50 mL)萃取，合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩除去乙酸乙酯得化合物5a粗品。
化合物6a的合成：
上一步的化合物5a加入干燥的1,4-二氧六环(20mL)搅拌，加入硫酸氢钾1g，升温至110℃回流搅拌3h。薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯2：1)分析原料反应完全，减压除去二氧六环，加50mL乙酸乙酯萃取，饱和碳酸钠水溶液(3x20mL)洗涤至中性，水相用乙酸乙酯(3x50mL)萃取，合并乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到化合物6a粗品。
香草木宁的合成：
上一步化合物6a粗品加入甲醇(5mL)室温搅拌，加入甲醇钠甲醇溶液(5.4M)5mL，80℃加热回流反应3天。薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯1：1)分析原料反应完全，40℃减压除去甲醇，加入50mL乙酸乙酯和20mL水萃取，水相用乙酸乙酯(3x50 mL)萃取，合并干燥，过滤浓缩得到粗品，粗品经硅胶正向层析柱分离(石油醚：乙酸乙酯3：1至石油醚：乙酸乙酯1：1)，得到香草木宁237mg，核磁共振氢谱如图28所示，核磁数据为1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ：7.51(d,J＝2.8Hz,3H),7.42(s,3H),7.27(s,3H),7.19(s,1H),6.98(t,J＝2.8Hz,3H),4.38(d,J＝2.9Hz,9H),3.96(d,J＝2.0Hz,18H),2.15(t,J＝7.7Hz,1H),1.99–1.92(m,2H),1.59–1.54(m,1H),1.35(d,J＝5.4Hz,1H),1.30(d,J＝3.0Hz,1H),1.24(d,J＝29.0Hz,6H),1.22(s,7H),1.18(s,11H),1.16(s,3H),1.15(s,1H),1.04(s,1H),0.82(s,1H),0.83–0.74(m,2H),0.78(s,2H),0.36(s,1H)。
结果：合成得到香草木宁。
方案B：两次柱层析制备香草木宁
化合物2a的合成：
在25mL的圆底瓶中，900mg氢化钠(60％)用干燥石油醚淋洗后加入到6mL四氢呋喃中分散，室温搅拌，1h内缓慢滴加丙二酸二乙酯(2.1g，5.9mL)，滴加完毕备用。另取100mL反应瓶，将氯乙酰氯(2.3g,1.6mL)用9mL干燥四氢呋喃溶解后，冰浴下将前一步制备的溶液1h内缓慢滴加入该反应瓶，控制反应温度低于30℃。滴毕后室温搅拌1h，随后加入三乙胺(3.8g，5.2mL)，继续搅拌2h。随后在冰浴下，1h内缓慢滴加3,4-二甲氧基苯胺(3.0g)的干燥四氢呋喃(13mL)溶液，控制温度不超过30℃，滴毕后室温搅拌过夜。薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯2：1)分析原料反应完全后，减压浓缩除去四氢呋喃，加入50mL乙酸乙酯和20mL水萃取，期间产生固体过滤，得化合物2a纯品210mg。将滤液的有机相干燥，减压浓缩后用乙醚搅拌分散，过滤得到粗品，粗品加入2mL乙醇重结晶得600mg化合物2a，产率27％。
化合物3a的合成：
在50mL反应瓶中，将810mg化合物2a加入5.4mL二苯醚中，升温至250-260℃回流搅拌1h，反应完全冷却至室温；向反应液中缓慢滴加石油醚20mL，固体析出后过滤，滤饼用石油醚淋洗，得到730mg褐色固体化合物3a。
化合物4a的合成：
在25mL的反应瓶中加入上一步化合物3粗品，随后加入1.5mL三氯氧磷和117mg三辛基甲基氯化铵，氮气保护下于室温搅拌48h。反应完全后将反应液倒入20mL碎冰中，加入二氯甲烷(3*50mL)萃取，合并有机相干燥浓缩得粗品，粗品经柱层析得275mg化合物4a，产率35％。
化合物5a的合成：
上一步的化合物4a用5mL二氯甲烷/甲醇1：1混合溶剂溶解，冰浴下加入190mg硼氢化钠，室温搅拌反应1h。反应完全后加入2mL水猝灭硼氢化钠，40℃下减压除去二氯甲烷和甲醇，乙酸乙酯(3*50mL)萃取，合并乙酸乙酯相，过滤浓缩除去乙酸乙酯得224mg化合物5a粗品。
化合物6a的合成：
上一步的化合物5a加入干燥的1,4-二氧六环(11.2mL)搅拌，加入硫酸氢钾1.1g，升温至110℃回流搅拌3h。反应完全后减压除去二氧六环，加30mL乙酸乙酯稀释，饱和碳酸钠水溶液(10mL)洗涤至中性，水相用乙酸乙酯(3*50mL)反萃取，合并乙酸乙酯相，干燥浓缩得到196mg化合物6a粗品。
香草木宁的合成：
上一步化合物6a加入甲醇(5mL)室温搅拌，加入甲醇钠甲醇溶液(5.4M)1mL，80℃加热回流反应3天。反应完后减压除去甲醇，加入50mL乙酸乙酯和20mL水萃取，有机相干燥浓缩得到粗品，粗品经硅胶正向层析柱分离(石油醚：乙酸乙酯3：1至石油醚：乙酸乙酯1：1)，得到香草木宁113mg。
结果：合成得到香草木宁。
实施例3
呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物对NRK-49F细胞增殖抑制作用
方法：NRK-49F细胞受到刺激后可被激活，进一步增殖后产生大量细胞外基质在肾间质异常沉积造成肾间质纤维化。将NRK-49F细胞以完全DMEM培养基(含10％胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素)于37摄氏度，5％CO2饱和湿度条件下培养。每24h换一次液。取对数生长细胞，加0.25％胰蛋白酶消化，以完全培养基稀释细胞浓度，接种至96孔细胞培养板中。在培养过夜后，每孔中加入不同浓度的LYY12、38、40、66、68、103，HL-14、17、18(0μM-320μM)继续培养24小时。采用CCK8检测试剂盒，检测对NRK-49F细胞增殖的抑制能力，本实验重复三次。
结果：如图29所示，LYY-12浓度＞20μM、LYY-38>320μM、LYY-40>160μM、LYY-68浓度为20μM及320μM、LYY-103>10μM，HL-14、17、18＞10μM对NRK-49F细胞的增殖有显著的抑制作用，初步验证了LYY-12、38、40、68、103及HL-14、17、18在细胞中具有治疗慢性肾病活性的潜力，LYY-66在细胞中的治疗慢性肾病活性的潜力较弱。
实施例4
呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物对HK-2细胞增殖抑制作用
方法：HK-2细胞属于正常成人肾小管上皮细胞系，是肾小管的外面的一层细胞。将HK-2细胞以完全DMEM培养基(含10％胎牛血清，100μg/mL青霉素，100μg/mL链霉素)于37摄氏度，5％CO2饱和湿度条件下培养。每24h换一次液。取对数生长细胞，加0.25％胰蛋白酶消化，以完全培养基稀释细胞浓度，接种至96孔细胞培养板中。在培养过夜后，每孔中加入不同浓度的LYY12、38、40、66、68、103，HL-14、17、18(0μM-640μM)继续培养24小时。采用CCK8检测试剂盒，检测对HK-2细胞增殖抑制能力，本实验重复三次。
结果：如图30所示，LYY-12、66、103＞160μM才对HK-2细胞的增殖有显著的抑制作用；LYY-40>40μM，HL-14、18＞20μM、HL-17＞10μ对HK-2细胞的增殖有显著的抑制作用，LYY38、68在0μM-320μM浓度范围内对HK-2细胞的增殖无显著的抑制作用，不影响正常细胞的增殖(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。实验证明LYY12在浓度20μM～80μM下对NRK-49F细胞增殖有抑制作用，而对正常HK-2细胞增殖无抑制作用，因此优选LYY-12做后面的试验。
实施例5
0.2％腺嘌呤饲料诱导的慢性肾病小鼠造模
方法：通过C57BL/6小鼠连续21天每日摄入含0.2％的腺嘌呤饲料诱导建立慢性肾病模型。实验共两组，每组6只。正常组小鼠摄入正常饲料，实验组小鼠摄入含0.2％的腺嘌呤饲料，在第22天处死，摘眼球取小鼠血液，37℃静置30min后13000rpm离心10min后得血清进行肾功能检测；取小鼠右肾，4％多聚甲醛固定，通过HE染色和Masson染色检测肾组织病理学变化。
结果：如图31所示，正常组的肌酐值及尿素氮值在正常值范围内，肾组织病理显示无病理损伤，胶原沉积不明显。与正常组相比，模型组小鼠肌酐值及尿素氮值升高明显，且病理结果显示小鼠肾组织皮质肾小管扩张萎缩情况严重，皮质中细胞管型和蛋白管型增加，间质炎症浸润增加，胶原沉积情况严重。表明方法进行慢性肾病小鼠造模均成功。
实施例6
呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物改善0.2％腺嘌呤饲料诱导的慢性肾病小鼠肾功能
方法：通过C57BL/6小鼠连续21天每日摄入含0.2％的腺嘌呤饲料诱导建立慢性肾病模型，摄入腺嘌呤饲料的同时开始给药，分别灌胃给予小鼠LYY1210mg/kg、20mg/kg、40mg/kg和别嘌醇20mg/kg，给药21天，在第22天处死，取正常组、模型组、以及0.2％腺嘌呤饲料诱导后分别灌胃三种剂量LYY12和别嘌醇组的小鼠血液，37℃静置30min后13000rpm离心10min后得血清进行肾功能检测。
结果：如图32所示，10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg LYY12均能不同程度降低血浆肌酐及尿素氮值，改善肾功能，随着浓度增加改善效果越来越好。LYY-12 40mg/kg改善肌酐值升高的效果与别嘌醇相当、改善尿素氮值升高的效果优于别嘌醇(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
实施例7
呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物改善0.2％腺嘌呤饲料诱导的慢性肾病小鼠肾组织病理损伤
方法：通过C57BL/6小鼠连续21天每日自主摄入含0.2％的腺嘌呤饲料诱导建立慢性肾病模型，摄入腺嘌呤饲料的同时开始给药，分别灌胃给予小鼠LYY1210mg/kg、20mg/kg、40mg/kg和别嘌醇20mg/kg，给药21天，在第22天处死，取正常组、模型组、以及0.2％腺嘌呤饲料诱导后分别灌胃三种剂量LYY12和别嘌醇组的小鼠右肾，4％多聚甲醛固定，通过HE染色和Masson染色检测肾组织病理学变化。
结果：如图33所示，HE染色评分结果表明，0.2％腺嘌呤饲料诱导后小鼠肾组织皮质肾小管扩张萎缩情况严重，皮质中细胞管型和蛋白管型增加，间质炎症浸润增加，灌胃给药LYY12 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg和别嘌醇后，肾组织均出现不同程度改善。高剂量的LYY12相比别嘌醇能够更加显著地改善小鼠肾部病理损伤。Masson染色评分结果表明0.2％腺嘌呤饲料诱导后小鼠肾小管间质胶原沉积情况严重，灌胃给药LYY12 20mg/kg、40mg/kg和别嘌醇后，胶原沉积情况均出现不同程度改善。高剂量的LYY12相比别嘌醇能够更加显著地改善小鼠胶原沉积情况(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
研究结果表明，高剂量的LYY12相比于别嘌醇，能够更为显著的改善小鼠肾功能及肾结构损伤，表明LYY12具有较好的治疗效果。

Claims (14)

1.呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物、其互变异构体、药用盐、前药或溶剂化物在制备治疗慢性肾病的药物中的应用，其特征在于，所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0004151307360000011
其中R1为甲氧基；R2为氢、羟基、甲氧基；R3为氢、羟基、甲氧基；R4为氢、甲氧基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构和取代基如下表所示：
Figure FDA0004151307360000012
Figure FDA0004151307360000021
3.一种呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将芸香枝叶粉碎，加水超声提取，浓缩提取液、过滤，药渣备用，滤液上大孔树脂柱吸附，并依次用水、50％乙醇及90％乙醇洗脱，收集90％乙醇的洗脱液，浓缩，得到流浸膏；将流浸膏上正相硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXC-1～YXC-14；
S2、将YXC-5上凝胶柱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇溶液洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXC5-1～YXC5-6；
S3、将YXC5-2经反相半制备型HPLC，得到化合物呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物；
所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构如下所示：
Figure FDA0004151307360000022
4.根据权利要求3所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，将芸香枝叶超声提取两次，每次1h，并合并提取液；优选的，所述大孔树脂柱为D101大孔树脂柱。
5.根据权利要求3所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，以二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇体积比从100:0至0:1；优选的，合并相似馏分之前还包括鉴定馏分，以薄层色谱跟踪点板鉴定。
6.根据权利要求3所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，石油醚-二氯甲烷-甲醇溶液中，石油醚-二氯甲烷-甲醇的体积比为(5-20):5:1，优选为5:5:1。
7.根据权利要求3所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，反相半制备型HPLC的柱子为苯基柱，流动相为体积比为29:71的乙腈-水。
8.根据权利要求3所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，药渣加80％乙醇溶液超声提取，浓缩提取液、过滤，滤液用石油醚萃取三次，合并石油醚层部分用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物上正相硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXY-1～YXY-18；
YXY-4上正相硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXY4-1～YXY4-10；
YXY4-6析出结晶，即为呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物。
9.根据权利要求8所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，YXY4-6析出结晶后留下的溶解部分上凝胶柱，以二氯甲烷-甲醇系统洗脱，合并相似馏分，干燥，得到流份YXY4-6-1～YXY4-6-6；
YXY-4-6-3和YXY-4-6-5部分析出晶体，即为呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物。
10.根据权利要求8所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，将药渣超声提取两次，每次1h，并合并提取液。
11.根据权利要求8所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的提取方法，其特征在于，石油醚-乙酸乙酯溶液梯度洗脱过程中，石油醚与乙酸乙酯体积比从4:1至1:2；优选的，合并相似馏分之前还包括鉴定馏分，以薄层色谱跟踪点板鉴定。
12.一种呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在强碱中依次滴加丙二酸二酯、氯乙酰氯、催化剂反应，得到化合物1；
所述丙二酸二酯的结构为：
Figure FDA0004151307360000031
其中，R选自C1-C4支链或直链烷基、苯基或取代苯基；所述取代苯基的取代基包括卤素、C1-C4支链或直链烷基、C1-C4烷氧基；
(2)将芳基胺滴加在步骤(1)制得的化合物1中，反应后加入乙酸乙酯的水溶液沉淀，得到固相的化合物2和溶液；
所述芳基胺的结构为：
Figure FDA0004151307360000041
R2、R3和R4分别独立的选自氢、羟基、卤素、C1-C4的直链或支链烷基、C1-C4烷氧基、苄氧基；
(3)将化合物2加入到惰性溶剂中，升温至250-260℃回流搅拌0.5h-1h，后加入石油醚，过滤、干燥，得到化合物3；
(4)向化合物3中加入氯代试剂反应，后用二氯甲烷低温萃取、浓缩得化合物4；
(5)在冰浴下，在化合物4中加入还原剂反应，后浓缩、二氯甲烷萃取、水洗、干燥得化合物5；
(6)在化合物5中加入硫酸氢钾或盐酸，回流反应3h-5h，后用乙酸乙酯萃取、碱中和、干燥，得到化合物6；
(7)在碱的作用下，在化合物6中加入亲核试剂，回流反应2-3d，后用乙酸乙酯萃取、水洗、干燥，得到粗品，粗品经正相柱层析分离纯化得所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物；
所述呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的结构为：
Figure FDA0004151307360000042
其中R1为甲氧基；R2为氢、羟基、甲氧基；R3为氢、羟基、甲氧基；R4为氢、甲氧基。
13.根据权利要求12所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中正相柱层析的流动相为石油醚/乙酸乙酯体积比为2/1混合溶液。
14.根据权利要求12或13所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的制备方法，其特征在于，所述的呋喃并[2,3-b]喹啉衍生物的合成路线如下所示：
Figure FDA0004151307360000051
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