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CN116261567A - 多功能性正交蛋白嵌合体 - Google Patents

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CN116261567A
CN116261567A CN202180053036.4A CN202180053036A CN116261567A CN 116261567 A CN116261567 A CN 116261567A CN 202180053036 A CN202180053036 A CN 202180053036A CN 116261567 A CN116261567 A CN 116261567A
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S·穆克吉
A·M·阿里
A·伯克
F·波拉特
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Columbia University in the City of New York
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Abstract

本文公开了工程化的异源二聚体或异源三聚体蛋白，所述异源二聚体或异源三聚体蛋白使用包含由氨基酸接头连接的1‑5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和单独的或与IgG2Fc结构域联合的IgG2铰链结构域。所述异源二聚体和异源三聚体蛋白还能够包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、结合表达于免疫细胞(例如，自然杀伤细胞)上的分子的多肽和/或结合表达于另一类型的免疫细胞(例如，T细胞)上的分子的多肽。本文还公开了编码所述蛋白的核酸、包含所述核酸的载体、组合物和治疗方法。

Description

多功能性正交蛋白嵌合体
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月3日提交的美国临时专利申请第63/047,938号、2020年7月10日提交的美国临时专利申请第63/050,346号、2020年9月8日提交的美国临时专利申请第63/075,388号、2021年2月3日提交的美国临时专利申请第63/145,083号和2021年5月17日提交的美国临时专利申请第63/189,412号的优先权，所述专利申请全部以引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交并据此以引用的方式整体并入的序列表。
背景技术
CD33出现在大多数急性骨髓性白血病(AML)白血病细胞上，是免疫疗法的一个有吸引力的靶点，并且代表了现有疗法效果不佳的目标人群。吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)是一种融合CD33单克隆抗体和DNA断裂细胞毒性卡奇霉素的药物，在2000年至2010年间可用于首次AML复发后的患者，但之后因增加患者死亡率且没有明显的益处而被撤销(Lowenburg等人2010)。2017年，它被重新推向市场用于原发性CD33+AML，与阿糖胞苷和柔红霉素(阻止DNA合成的DNA嵌入剂)联合使用，适度提高了中位存活期。作为单一疗法，它不能改善结果(Renneville等人2014)。目前处于I期临床试验的双特异性T细胞接合剂(BiTE)将CD33+AML靶向CD3+T细胞(Krupka等人2014)。BiTE，包括那些被批准用于B细胞恶性肿瘤的药物，如靶向CD19+B细胞以通过CD3+T细胞进行破坏的博纳吐单抗(blinatumomab)，其生物利用度非常低，以至于一次连续注射数周，重复数月，这促使人们需要替代免疫治疗方法(Nanbakhsh等人2014)。
许多恶性肿瘤，包括AML，都与自然杀伤(NK)细胞毒性应答的活性下降有关。NK活化配体(如ULBP1)的表达与存活率呈正相关，但已知即使在其通常会上调的条件下，在AML中其表达也被抑制(Elias等人2014)。CD48是NK受体2B4的配体，其在表达如AML1-ETO的融合蛋白的AML细胞表面下调(Mastaglio等人2018年)。相比之下，NK抑制配体如PD-L2上调(Dulphy等人2016)。在一些情况下，AML已被证明会异常调节NK细胞的成熟，以及用受体如NKG2D的可溶性配体或外泌体结合的配体“分散”NK细胞(Mundy-Bosse等人2014)。随着AML负荷的增加，对NK成熟的抑制作用更强，如CD11b+CD27+NK细胞数量减少所指示(Stringaris等人2014)。NK细胞的活化-抑制平衡(其中细胞毒性功能取决于NK细胞上抑制性和活化性受体的表达和接合)经常被AML扰乱，使活化性受体的表面表达减少并使抑制性受体如NKG2A的表达增加(Orleans-Lindsay等人2001)。在外泌体或可溶性配体的情况下，NK细胞难以找到适当的靶点，如果可以开发一种利用NK细胞毒性应答而不依赖白血病细胞表面上天然配体的方法，那么就揭示了治疗机会。
在AML环境中T细胞和NK细胞的功能降低。原代母细胞和AML细胞系(如HL60)均已证明能够抑制T细胞和NK细胞的生长，而不影响细胞溶解活性或导致这些细胞死亡(LeDieu等人2009)。一项更全面的患者筛选表明，循环中的T细胞大幅增加，而活性没有增加，其他人注意到调节性T细胞的比例尤其增加(Shenghui等人2011；Schnoffeil等人2015)。向记忆T细胞转变与PD-1表达升高相关，已再次证明未显示细胞毒性T细胞活性受损或“耗尽”(Chamuleau等人2008)。在一些AML中上调的经由吲哚胺2,3-双加氧酶和精氨酸酶II的色氨酸和精氨酸的分解也导致T细胞增殖和活化不良，并且其可作为骨髓恶性肿瘤免疫回避的有用血清指标(Thorsson等人2018)。炎症情况也与AML逃避T细胞活性有关，但尚未利用特定相互作用的预测和治疗潜力(Benci等人2016；Chen等人2019)。归根结底，成髓细胞避免免疫清除的方法——调节免疫亚群、抑制细胞毒性和掩饰自身——千差万别且难以预测。
目前，需要新的方法来治疗如急性骨髓性白血病(AML)等疾病，这些疾病的结果尤其是在无法接受加强化疗(目前的护理标准)的老年患者中的结果仍然很差，中位存活期仅为5至10个月(Dohner等人2015)。
发明内容
本公开提供了工程化蛋白或多功能性正交蛋白嵌合体。
多特异性或多功能性蛋白是可基于对两种或更多种不同类型的剂(蛋白质、DNA、RNA或细胞)中每一者的相互作用特异性和亲和力同时接合这些剂的生物分子。
例如，由两种不同的单克隆抗体(一种对免疫细胞(例如，T或NK)具有特异性，另一种对癌细胞具有特异性)基因工程化而来的双特异性或双功能性抗体正被用于增强肿瘤杀伤力。传统上，这些多特异性蛋白被制成融合蛋白，但这些融合蛋白可能由于接合位点的空间位阻而失去功能。合成生物学的最新进展使合成多肽的产生成为可能，此类合成多肽允许产生经由基于氢键合的非共价相互作用形成的正交蛋白异源二聚体，类似于在两条反平行DNA链之间观察到的情况。
本文显示了改进的多特异性或多功能性或异源或异源二聚体或异源三聚体蛋白，所述蛋白使用包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和单独的或与IgG2 Fc结构域联合的IgG2铰链结构域。这些多功能性蛋白显示出优于先前描述的多功能性蛋白的改进的特性。一方面，使用IgG序列允许形成共价二硫键，使蛋白质更加稳定。这些多功能性蛋白具有类似抗体的特性，并通过Fc结构域参与人体的补体系统。此外，这些多功能性蛋白与抗体一样，在体内不易被破坏。此外，由于这些蛋白质是类似抗体的，因此与先前公开的标准双特异性蛋白相比，它们具有较低的免疫原性和更好的药代动力学。
虽然有本文例示的工程化蛋白，但可以扩展包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和单独的或与IgG2 Fc结构域联合的IgG2铰链结构域的创新使用，以构建具有其他特异性的也具有优异的结合和细胞毒特性的工程化蛋白。这些工程化蛋白可以包含结合任何谱系特异性细胞表面抗原或由癌细胞和肿瘤细胞表达和/或过表达的其他抗原的抗原结合片段或其他部分，以及结合表达于免疫细胞上的分子的任何多肽。
本文例示了一种异源二聚体双特异性蛋白，其使用蛋白质ULBP1的NKG2D结合结构域来产生具有结合CD33蛋白(存在于骨髓细胞上)的单克隆抗体的抗原识别结构域的异源二聚体，以使NK细胞与骨髓细胞接合。参见图1、图2和图10。
此外，本文例示了一种异源二聚体双特异性蛋白，其使用结合CD3蛋白(存在于T细胞上)和CD33蛋白(存在于骨髓细胞上)的单克隆抗体的抗原识别结构域，以使T细胞与骨髓细胞接合。参见图1、图2和图10。
本文还例示了一种异源二聚体双特异性蛋白，其使用结合CD16蛋白(存在于NK细胞上)的单克隆抗体的抗原识别结构域来产生具有结合CD33蛋白(存在于骨髓细胞上)的单克隆抗体的抗原识别结构域的异源二聚体，以使NK细胞与骨髓细胞接合。参见图23。
虽然本文例示的工程化蛋白利用结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段或其他部分，但本公开包括包含识别由癌细胞和肿瘤细胞表达和/或过表达的其他抗原的抗原结合片段或其他部分的工程化蛋白。本公开还包括包含结合表达于免疫细胞上的其他分子的多肽的工程化蛋白。
这些示例性异源二聚体蛋白包含IgG2铰链结构域。参见图1A和图23A。
本文还显示了包含IgG2铰链结构域和IgG2 Fc结构域(CH2和CH3结构域)的示例性异源二聚体蛋白。参见图1B和图23B。
还可以构建包含超过两个多肽的多功能性蛋白。这些蛋白质可以通过将每个异源二聚体X、Y或Z的单体a与接头和融合至靶结合结构域的单体b组合来形成。虽然该示意图显示了三特异性蛋白质，但可以如本文的示意图和方法所示构建四特异性蛋白以及包含超过四个多肽的工程化蛋白。参见图9。
这些合成分子的用途包括治疗靶向、基因编辑、诊断、通过同时活化和/或去活化两个或更多个信号进行通路操纵。
本公开提供了一种工程化异源二聚体蛋白。在一些实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含：第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述共价二聚化结构域共价结合。
在一些实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含：第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述共价二聚化结构域共价结合。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽中的包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域选自由6DMPb和6DMPa组成的组。
在一些实施方案中，第一共价二聚化结构域和/或第二共价二聚化结构域包含IgG2铰链结构域。在一些实施方案中，第一共价二聚化结构域和/或第二共价二聚化结构域还包含IgG2 Fc结构域。
在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原可以是CD33、CD19或本文所述的任何谱系特异性细胞表面抗原。
在一些实施方案中，表达于NK细胞上的分子可以是NKG2D，并且结合表达于NK细胞上的分子的多肽是ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB，或它们的突变体或片段。在一些实施方案中，结合表达于NK细胞上的分子的多肽是ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA或MICB的胞外结构域。
在一些实施方案中，表达于NK细胞上的分子是CD16，并且结合表达于NK细胞上的分子的多肽是CD16的单克隆抗体。
在一些实施方案中，表达于T细胞上的分子是CD3，并且结合表达于T细胞上的分子的多肽是CD3的单克隆抗体。
在一些实施方案中，抗原结合片段是单链抗体片段(scFv)。
本公开还提供了包含三个多肽的工程化异源三聚体蛋白，或包含超过三个多肽、包含四个多肽、包含五个多肽、包含六个多肽或包含超过六个多肽的工程化蛋白，其中工程化异源蛋白包含具有工程化蛋白中其他各个多肽的结合结构域的另外多肽。
在一些实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含：第一多肽，所述第一多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(a1)和第一共价二聚化结构域；第二多肽，所述第二多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(b1)和第二共价二聚化结构域；第三多肽，所述第三多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(c1)和第三共价二聚化结构域；和第四多肽，所述第四多肽包含三个包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，其中每个结构域是a1、b1和c1的结合结构域(a2、b2和c2)，以及第四、第五和第六共价二聚化结构域；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽和所述第三多肽和所述第四多肽通过所述共价二聚化结构域共价结合。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽中的包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域选自由6DMPb和6DMPa组成的组。
在一些实施方案中，第一共价二聚化结构域、第二共价二聚化结构域、第三共价二聚化结构域、第四共价二聚化结构域、第五共价二聚化结构域和/或第六个共价二聚化结构域包含IgG2铰链结构域。在一些实施方案中，一个或多个共价二聚化结构域还包含IgG2 Fc结构域。
在一些实施方案中，谱系特异性细胞表面抗原可以是CD33、CD19或本文所述的任何谱系特异性细胞表面抗原。
在一些实施方案中，表达于NK细胞上的分子可以是NKG2D，并且结合表达于NK细胞上的分子的多肽是ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB，或它们的突变体或片段。在一些实施方案中，结合表达于NK细胞上的分子的多肽是ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA或MICB的胞外结构域。
在一些实施方案中，表达于NK细胞上的分子可以是CD16，并且结合表达于T细胞上的分子的多肽是CD16的单克隆抗体。
在一些实施方案中，表达于T细胞上的分子是CD3，并且结合表达于T细胞上的分子的多肽是CD3的单克隆抗体。
在一些实施方案中，第三多肽是趋化因子或细胞因子蛋白，其增加免疫应答。趋化因子或细胞因子蛋白包括但不限于CXCL(包括CXCL14)、GCSF和白细胞介素(包括IL2和IL16)。
在一些实施方案中，抗原结合片段是单链抗体片段(scFv)。
在某些实施方案中，第一和第二和第三工程化异源二聚体蛋白中的第一多肽包含与SEQ ID NO:1(图3)至少80％或至少90％同一的氨基酸。在一些实施方案中，工程化异源二聚体蛋白中的第一多肽包含与SEQ ID NO:4(图6)至少80％或至少90％同一的氨基酸。
在某些实施方案中，第一工程化异源二聚体中的第二多肽包含与SEQ ID NO:2(图4)至少80％或至少90％同一的氨基酸。在一些实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白中的第二多肽包含与SEQ ID NO:5(图7)至少80％或至少90％同一的氨基酸。
在某些实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白中的第二多肽包含与SEQ ID NO:3(图5)至少80％或至少90％同一的氨基酸。在一些实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白中的第二多肽包含与SEQ ID NO:6(图8)至少80％或至少90％同一的氨基酸。
在某些实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白中的第二多肽包含与SEQ ID NO:26(图23A)至少80％或至少90％同一的氨基酸。在一些实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白中的第二多肽包含与SEQ ID NO:27(图23B)至少80％或至少90％同一的氨基酸。
本公开提供了一种包含任何工程化蛋白或编码任何工程化蛋白的核酸分子的组合物。
本公开还提供了一种编码第一工程化异源二聚体蛋白的核酸分子。工程化二聚体蛋白可包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。
本公开还提供了一种编码第二工程化异源二聚体蛋白的核酸分子。工程化二聚体蛋白可包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。
本公开还提供了一种编码第三工程化异源二聚体蛋白的核酸分子。工程化二聚体蛋白可包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。
本公开还提供了一种编码工程化三聚体蛋白的核酸分子。工程化异源三聚体蛋白可包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(iii)第三多肽，所述第三多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域；和(iv)第四多肽，所述第四多肽包含三个包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，其中每个结构域是a1、b1和c1的结合结构域(a2、b2和c2)，以及如本文所述的第四、第五和第六共价二聚化结构域。
本公开提供了一种包含任何本发明核酸分子的载体，或一种包含任何本发明核酸分子的组合物。
本公开提供了一种包含本发明的载体或核酸分子的细胞。
本公开提供了一种包含至少一种载体的组合物，所述载体编码：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。
本公开提供了一种包含至少一种载体的组合物，所述载体编码：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。
本公开提供了一种包含至少一种载体的组合物，所述载体编码：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(iii)第三多肽，所述第三多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域；和(iv)第四多肽，所述第四多肽包含三个包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，其中每个结构域是a1、b1和c1的结合结构域(a2、b2和c2)，以及如本文所述的第四、第五和第六共价二聚化结构域。
本公开提供了一种包含任何工程化蛋白、任何核酸分子、任何本发明载体和/或任何本发明细胞的组合物。
本公开还涵盖一种包含任何工程化蛋白、任何核酸分子、任何本发明载体、任何本发明细胞和/或任何本发明组合物的药盒。
本公开提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任何工程化蛋白、任何核酸分子、任何本发明载体、任何本发明细胞和/或本文公开或描述的任何本发明组合物。
本公开提供了一种治疗受试者的造血系统恶性肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任何工程化蛋白、任何核酸分子、任何本发明载体、任何本发明细胞和/或本文公开或描述的任何本发明组合物。
造血系统恶性肿瘤可以是骨髓恶性肿瘤。
造血系统恶性肿瘤可以是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。
造血系统恶性肿瘤可以是急性骨髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病。
附图说明
出于说明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的某些实施方案。然而，本发明不限于附图中描绘的实施方案的精确布置(arrangements)和手段(instrumentalities)。
图1是各种结合蛋白的示意图。图1A是抗CD33、抗CD3和NKG2D结合蛋白的示意图，其中在工程化蛋白中仅使用了IgG2铰链结构域。图1B是抗CD33、抗CD3和NKG2D结合蛋白的示意图，其中在工程化蛋白中使用了IgG2铰链和IgG2 Fc结构域。
图2是使免疫细胞与癌细胞接合的双功能性蛋白二聚体的示意图。
图3是仅具有IgG2铰链结构域的抗CD33构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图4是仅具有IgG2铰链结构域的ULBP1构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图5是仅具有IgG2铰链结构域的抗CD3构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图6是具有IgG2铰链和IgG2 Fc结构域的抗CD33构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图7是具有IgG2铰链和IgG2 Fc结构域的ULBP1构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图8是具有IgG2铰链和IgG2 Fc结构域的抗CD3构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
图9是工程化异源三聚体蛋白的示意图。
图10是具有IgG2铰链和6DMPa/b异源二聚化结构的工程化异源二聚体蛋白的示意图。图10A是抗CD33/抗CD3异源二聚体蛋白。图10B是抗CD33/ULPB1异源二聚体蛋白。
图11是研究中使用的表达载体的质粒图谱。图11A是aCD33-6DMPa-铰链表达载体的图谱。图11B是ULBP1-6DMPb-铰链表达载体的图谱。图11C是aCD3-6DMPb表达载体的图谱。
图12是显示用抗CD33-ULBP1嵌合体1和2质粒转染的293T细胞中的抗CD33/ULBP工程化蛋白的表达和纯化的免疫印迹。图12A显示了细胞中的表达。图12B显示了上清液中的表达和纯化。
图13是显示CHO细胞中的基于铰链的构建体的表达和纯化的免疫印迹。蛋白质分泌到上清液中并且可使用钴树脂进行6xHis纯化并用咪唑洗脱。
图14显示了与单独的抗CD33构建体或与其中一种工程化异源二聚体蛋白一起孵育的HL-60细胞的FACS图。图14A显示了与抗FLAG抗体的共孵育。图14B显示了与抗MYC抗体的共孵育。
图15是总结工程化异源二聚体蛋白与HL-60细胞的结合实验的表格。
图16是总结工程化异源二聚体蛋白与Jurkat细胞的结合实验的表格。
图17是总结工程化异源二聚体蛋白与PMBC的结合实验的表格。
图18显示了使用MOLM14细胞和抗CD33/抗CD3工程化异源二聚体蛋白的细胞毒性测定的结果。图18A是展示流式细胞术门控方案的代表性点图。单个dTomato+(MOLM14)细胞被门控，并且特定杀伤细胞％被评估为也为DAPI+的dTomato+细胞的总％。图18B是使用抗CD33/抗CD3工程化异源二聚体蛋白的MOLM14细胞中的细胞毒性的结果的图。
图19显示了使用HL60细胞和抗CD33/抗CD3工程化异源二聚体蛋白的细胞毒性测定的结果。图19A是展示流式细胞术门控方案的代表性点图。单个CellTrace Violet+(HL-60)细胞被门控，并且特定杀伤细胞％被评估为也为DAPI+的CellTrace Violet+细胞的总％。图19B是显示使用抗CD33/抗CD3工程化异源二聚体蛋白的HL-60细胞中的细胞毒性测定的结果的图。
图20是显示与单体相比使用抗CD33/抗CD3工程化异源二聚体蛋白的HL-60细胞中的细胞毒性测定的进一步结果的图。
图21是显示在HL-60细胞中使用蛋白质滴定(即，增加抗CD33/抗CD3工程化异源二聚体蛋白)的剂量依赖性细胞毒性测定的结果的图。
图22是显示在HL-60细胞中使用效应物滴定(即，增加效应物/靶标比率)的剂量依赖性细胞毒性测定的结果的图。
图23是抗CD16构建体的氨基酸序列。图23A是仅具有IgG2铰链结构域的抗CD16构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。图23B是具有IgG2铰链和IgG2 Fc结构域的抗CD16构建体的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)。
图24显示了抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白的体内抗肿瘤活性的结果。图24A是实验的示意图。图24B是用于监测FFluc-dtomato转导的MOLM14的生长的生物发光成像(BLI)的图像。图24C是用单独的MOLM14、未载荷T细胞或载荷抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白的T细胞治疗的小鼠中BLI的定量的图。图24D是Kaplan-Meier存活图。用载荷抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白的T细胞治疗的小鼠与2个对照组(未治疗或未载荷T细胞)相比具有更好的存活率。对数秩检验*p<0.05。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“工程化蛋白”或“工程化异源二聚体蛋白”或“工程化异源三聚体蛋白”或“工程化异源蛋白”或“多功能性蛋白”或“多功能性正交蛋白嵌合体”或“蛋白嵌合体”等是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质结构域的杂合多肽。一个结构域可位于融合蛋白的氨基末端(N末端)部分或位于融合蛋白的羧基末端(C末端)部分。本文提供的任何蛋白质均可通过本领域已知的任何方法产生。例如，本文提供的蛋白质可通过重组蛋白表达和纯化产生，这特别适合于包含肽接头的融合蛋白。用于重组蛋白表达和纯化的方法是众所周知的，并且包括由Green和Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))描述的方法，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。这些术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常，蛋白质、肽或多肽的长度将为至少三个氨基酸。蛋白质、肽或多肽可以指单一蛋白质或多种蛋白质的集合。蛋白质、肽或多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体如糖基、羟基、磷酸基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团、用于缀合的接头、功能化或其他修饰等。蛋白质、肽或多肽也可以是单个分子或可以是多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可能只是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或它们的任何组合。
术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指脊椎动物，优选哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于人灵长类动物、非人灵长类动物或鼠、牛、马、犬或猫物种。在本公开的上下文中，术语“受试者”还涵盖可在体外或离体培养或在体内操纵的组织和细胞。术语“受试者”可与术语“生物体”互换使用。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。这些术语是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合物形式。多核苷酸的实例包括但不限于基因或基因片段的编码或非编码区、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。可进一步修饰多核苷酸中的一个或多个核苷酸。核苷酸序列可被非核苷酸组分间断。还可在聚合后，如通过与标记剂缀合来修饰多核苷酸。
术语“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成通过核苷酸残基碱基之间的氢键合而稳定的复合物的反应。氢键合可通过沃尔森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可构成更广泛过程(如PCR的起始或酶对多核苷酸的裂解)中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为给定序列的“互补序列”。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指可将DNA或RNA序列(例如，外来基因)引入宿主细胞以转化宿主并促进所引入序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体包括但不限于质粒、噬菌体和病毒。载体通常包含可传递因子的DNA，其中插入了外来DNA。将一个DNA区段插入另一DNA区段的常用方法涉及使用称为限制性酶的酶，这种酶在称为限制性位点的特定位点(特定核苷酸组)裂解DNA。“盒”是指编码表达产物的DNA编码序列或DNA区段，其可以插入载体中的限定限制性位点处。盒限制性位点被设计用来确保将盒插入正确的阅读框中。通常，外来DNA被插入到载体DNA的一个或多个限制性位点处，然后由载体连同可传递的载体DNA携带到宿主细胞中。已插入或添加了DNA的DNA区段或序列，如表达载体，也可称为“DNA构建体”或“基因构建体”。一种常见的载体类型是“质粒”，它一般是一种独立的双链DNA分子，通常是细菌来源的，可以很容易地接受另外的(外来)DNA，并且可以很容易地引入合适的宿主细胞中。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合于插入外来DNA的限制性位点。编码DNA是编码特定蛋白质或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调控或以其他方式介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同基因或来自不同基因并且可以来自相同或不同的生物体。已描述了大量的载体，包括质粒和真菌载体，用于复制和/或在多种真核和原核宿主中表达。非限制性实例包括pKK质粒(Clonetech)、pUC质粒、pET质粒(Novagen,Inc.,Madison,WI)、pRSET或pREP质粒(Invitrogen,San Diego,CA)或pMAL质粒(New England Biolabs,Beverly,MA)，和许多适当的宿主细胞，使用本文公开或引用的方法或相关领域技术人员已知的其他方法。重组克隆载体将通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统、一种或多种用于在宿主中选择的标志物(例如，抗生素抗性)，以及一种或多种表达盒。
术语“重组表达载体”是指允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽的基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，条件是所述构建体包含编码所述mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列时，并且使所述载体在足以在所述细胞内表达所述mRNA、蛋白质、多肽或肽的条件下与所述细胞接触。本公开的载体整体上不是天然存在的。载体的部分可以是天然存在的。本公开的非天然存在的重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，所述核苷酸可以是单链或双链的，合成的或部分从天然来源获得的，并且可含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。
如本文所用，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。
“抗体”、“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能片段”或“抗原结合部分”可互换使用来表示抗体的保留特异性地结合至特定抗原的能力的一个或多个片段或部分(Holliger等人,Nat.Biotech.(2005)23(9):1126)。本发明的抗体可以是抗体和/或其片段。抗体片段包括Fab、F(ab')2、scFv、二硫键连接的Fv、Fc或变体和/或混合物。抗体可以是嵌合的、人源化的、单链的或双特异性的。本公开涵盖所有抗体同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。合适的IgG亚型包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体轻链或重链可变区由被三个称为互补决定区(CDR)的高变区间断的“框架”区组成。本发明的抗体或抗原结合部分的CDR可来自非人或人来源。本发明的抗体或抗原结合部分的框架可以是人的、人源化的、非人的(例如，经修饰以降低人中的抗原性的鼠框架)或合成的框架(例如，共有序列)。
本发明的抗体或抗原结合部分可以小于约10-7M、小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M或小于约10-12M的解离常数(KD)特异性地结合。。根据本公开的抗体的亲和力可使用常规技术容易地确定(参见例如，Scatchard等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.(1949)51:660；和美国专利第5,283,173号、第5,468,614号或等效物)。
由核酸序列编码的工程化蛋白的抗原识别部分可含有任何谱系抗原特异性的抗原结合抗体片段。所述抗体片段可包含一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)、或前述任一者的组合。
术语“宿主细胞”意指以任何方式选择、修饰、转化、生长、使用或操纵的任何生物体的任何细胞，用于由所述细胞产生物质，例如由所述细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。如本文所述，宿主细胞可进一步用于筛选或其他测定。
术语“细胞谱系”是指具有共同祖先并且从相同类型的可识别细胞发育成特定可识别/功能细胞的细胞。本文使用的细胞谱系包括但不限于呼吸系统、前列腺、胰腺、乳腺、肾、肠、神经、骨骼、血管、肝、造血、肌肉或心脏细胞谱系。
当用于提及谱系特异性抗原的基因表达或功能时，术语“抑制”是指谱系特异性抗原的基因表达或功能水平的降低，其中抑制是对基因表达或功能的干扰的结果。抑制可以是完全的，在这种情况下没有可检测的表达或功能，或者可以是部分的。部分抑制的范围可从接近完全抑制到几乎没有抑制。
术语“治疗(treat/treatment)”等是指在疾病发作后减缓、缓解、改善或缓和疾病的症状中的至少一种症状或者逆转疾病的手段。
对状态、病症或疾患的“治疗”包括：
(1)预防或延迟可能患有或易患所述状态、病症或疾患但尚未经历或显示所述状态、病症或疾患的临床症状的人出现所述状态、病症或疾患的临床症状；或者
(2)抑制所述状态、病症或疾患，即阻止、减少或延迟疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床症状、体征或检查；或者
(3)缓解疾病，即引起所述状态、病症或疾患或其至少一种临床或亚临床症状或体征的消退。
对要治疗的受试者的益处在统计学上是显著的，或者至少对患者或医师是可察觉的。
术语“预防(prevent/prevention)”等是指在明显的疾病发作之前采取行动，以预防疾病发展或使疾病的程度最小化或减缓疾病的发展过程。
“免疫应答”是指在宿主体内发展的针对目标组合物或疫苗的细胞免疫应答和/或抗体介导的免疫应答。这种应答通常包括受试者产生特异性针对目标组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、调节性T细胞和/或细胞毒性T细胞。
“治疗有效量”或“有效量”意指当施用至动物以治疗状态、病症或疾患时足以实现此类治疗的化合物或剂的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗动物的年龄、体重、身体状况和应答性而变化。
本文公开的组合物可包含“治疗有效量”或“预防有效量”的本文所述化合物。“治疗有效量”是指以剂量和在需要的时间段内能有效获得所需的治疗结果的量。抗体或抗体部分的治疗有效量可根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中化合物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。“预防有效量”是指以剂量和在需要的时间段内能有效获得所需的预防结果的量。通常，由于预防剂量是在疾病发生之前或疾病早期阶段用于受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。
虽然可以按原样使用本公开提供的组合物用于治疗，但可能优选的是以药物制剂形式，例如，以与根据预期施用途径和标准药学实践而选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载剂的混合物形式进行施用。因此，在一方面，本公开提供了一种药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂包含至少一种活性组合物或其药学上可接受的衍生物，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载剂。从与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上说，赋形剂、稀释剂和/或载剂必须为“可接受的”。
本公开的组合物可以配制用于以任何方便的方式施用以用于人类或兽医学。因此，本发明在其范围内包括包含适用于人类或兽医学的本发明的产品的药物组合物。
如本文所用，术语“药物组合物”是指可以在治疗和/或预防疾病或病症的情形下施用至受试者的组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含活性成分，例如本发明的融合多肽、核酸分子、载体、剂等，以及任选的药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载剂。
用于治疗用途的可接受的赋形剂、稀释剂和载剂在药学领域是众所周知的，并且例如在Remington:The Science and Practice of Pharmacy.Lippincott Williams&Wilkins(A.R.Gennaro edit.2005)中有所描述。药物赋形剂、稀释剂和载剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。
如本文所用，否则短语“药学上可接受的”是指在施用给人时为“总体上视为安全的”，例如为生理上可耐受的并且通常不会产生过敏反应或类似不良反应(如胃部不适、头晕等)的分子实体和组合物。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出，以用于动物并且更具体地为用于人。
治疗性制剂的剂量将有很大差异，这取决于疾病的性质、患者的病史、施用频率、施用方式、剂从宿主中的清除等。初始剂量可能较大，随后是较小的维持剂量。剂量的施用频率可低至每周一次或每两周一次，或者分成较小的剂量每天一次、每半周一次等施用，以维持有效剂量水平。在一些情况下，口服施用比静脉内施用需要更高的剂量。在一些情况下，局部施用将包括根据需要每天施加数次，持续数天或数周以提供有效的局部剂量。
术语“载剂”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物载剂可以是无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、芝麻油等。水或含水盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油水溶液优选用作载剂，特别是用于可注射溶液。或者，载剂可以是固体剂型载剂，包括但不限于粘合剂(用于压丸)、助流剂、囊封剂、食用香料和着色剂中的一者或多者。适合的药物载剂描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。
如本文所用的术语“剂”意指产生或能够产生作用的物质，并且将包括但不限于化学物质、药物、生物制剂、小有机分子、抗体、核酸、肽和蛋白质。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于该值是如何测量或确定的，即测量系统的限度，即特定目的(如药物制剂)所需的精确度。例如，“约”可意指根据本领域中的规范在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可意指给定值的多达20％，优选多达10％，更优选多达5％，并且还更优选多达1％的范围。或者，特别是关于生物系统或方法，所述术语可意指在某一值的某一数量级内，优选在5倍内，并且更优选在2倍内。当在本申请和权利要求中描述特定值时，除非另外陈述，否则应设想意指在特定值的可接受误差范围内的术语“约”。
一般技术
除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中充分阐明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1989)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Cul ture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑):Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practice approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑Harwood Academic Publishers,1995)；DNA Cloning:Apractical Approach,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑1985)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984》；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑(1986》；Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press,(1986)。
本公开提供了包含结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段的剂，所述剂可以引起表达所述谱系特异性细胞表面抗原的细胞的细胞死亡。涉及结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段和结合表达于免疫细胞如自然杀伤(NK)细胞和/或T细胞上的分子的多肽的组合的免疫疗法将提供一种有效的治疗造血系统恶性肿瘤的方法。
本公开提供了第一和第三工程化异源二聚体蛋白，所述第一和第三工程化异源二聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(i)结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段；和(ii)结合表达于免疫细胞上的分子的多肽。在一些实施方案中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述分子是ULBP。在一些实施方案中，所述分子是CD16。
本公开提供了第二工程化异源二聚体蛋白，所述第二工程化异源二聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(i)结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段；和(ii)结合表达于T细胞上的分子的多肽。在一些实施方案中，所述分子是CD3。
本公开还提供了工程化异源三聚体蛋白，所述工程化异源三聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(i)结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段；和(ii)结合免疫细胞(例如，NK细胞)的多肽；(iii)结合表达于T细胞上的分子(例如，CD3)的多肽。
参见图2、图9和图10。
本发明的组合物和方法可以帮助活化携带NKG2D的免疫效应细胞，如自然杀伤(NK)细胞和/或CD8+T细胞。本发明的组合物和方法可以增强或促进针对病变细胞(如肿瘤细胞)的细胞免疫应答，所述细胞免疫应答可以诱导细胞毒性(例如，最终导致病变细胞如肿瘤细胞的死亡)。本发明的组合物和方法可以增强受试者的免疫应答，包括但不限于以下一项或多项：自然杀伤(NK)细胞的上调；T细胞(例如，γδT细胞、αβT细胞)功能的上调；自然杀伤T(NKT)细胞功能的上调；以及B细胞功能的上调。在一些实施方案中，NK细胞、T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和B细胞功能中的一者或多者的上调包括能够抑制或减少癌症进展的活性的增强和/或禀赋。
在一些实施方案中，抑制癌症进展可以通过肿瘤细胞的细胞溶解来实现，例如，通过直接诱导肿瘤细胞凋亡，通过刺激内在宿主抗肿瘤应答来诱导肿瘤细胞溶解，通过刺激内在宿主抗肿瘤应答来诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移，抑制肿瘤细胞增殖以及诱导肿瘤细胞衰老。
本公开还提供了一种或多种编码本发明的工程化蛋白、剂或组合物的核酸(多核苷酸)分子。
本公开的其他方面提供了包含本文提供的任何核酸(或多核苷酸)分子的载体。此外，在本公开的范围内的是由本文所述的核酸编码的多核苷酸和表达此类多核苷酸的细胞。
在一些实施方案中，细胞可获自患有造血系统恶性肿瘤的患者。在一些实施方案中，细胞是造血细胞，如造血干细胞(例如，CD34+)。在一些实施方案中，提供了细胞，例如，用于本文提供的工程化蛋白的重组表达和纯化。细胞包括适合于重组蛋白表达的任何细胞，例如，包含表达或能够表达工程化蛋白的基因构建体或载体的细胞(例如，已用本文所述的一种或多种载体转化或转染的细胞，或具有基因组修饰的细胞，例如表达本文提供的蛋白质的细胞)。用于转化细胞、基因修饰细胞以及在此类细胞中表达基因和蛋白质的方法在本领域中是众所周知的，并且包括由例如Green和Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(2012))以及Friedman和Rossi,Gene Transfer:Delivery and Expressionof DNA and RNA,A Laboratory Manual(第1版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2006))提供的那些方法。
此外，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的剂、多肽、核酸(或多核苷酸)分子、载体、细胞和/或组合物。
本公开还提供了一种治疗造血系统恶性肿瘤的方法。所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的所公开的任何工程化蛋白或编码所述工程化蛋白的多核苷酸。所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的剂或组合物，或编码所述剂(例如，多肽的组合)或组合物的多核苷酸。
本公开的另一方面提供了一种用于治疗造血系统恶性肿瘤(或血液系统赘生物)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的所公开的任何工程化蛋白或编码所述工程化蛋白的多核苷酸。所述方法可包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的剂或组合物，或编码所述剂(例如，多肽的组合)或组合物的多核苷酸。
本公开还涉及使用所述工程化蛋白治疗造血系统恶性肿瘤如骨髓恶性肿瘤的方法。
此外，在本公开的范围内的是包含本发明的剂、多肽、核酸(或多核苷酸)分子、载体、细胞和/或组合物的药盒。
工程化异源蛋白
本公开提供了工程化异源蛋白。
在一个实施方案中，本公开提供了第一和第三工程化异源二聚体蛋白，所述第一和第三工程化异源二聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(i)结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段；和(ii)结合表达于免疫细胞上的分子的多肽。在一些实施方案中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述分子是ULBP。在一些实施方案中，所述分子是CD16。
在另一实施方案中，本公开提供了第二工程化异源二聚体蛋白，所述第二工程化异源二聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(i)结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段；和(ii)结合表达于T细胞上的分子的多肽。在一些实施方案中，所述分子是CD3。
在又另一实施方案中，本公开提供了工程化异源三聚体蛋白，所述工程化异源三聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：(i)结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段；和(ii)结合免疫细胞(例如，NK细胞)的多肽；(iii)结合表达于T细胞上的分子(例如，CD3)的多肽。
在一些实施方案中，第三多肽是趋化因子或细胞因子蛋白，其增加免疫应答。趋化因子或细胞因子蛋白包括但不限于CXCL(包括CXCL14)、GCSF和白细胞介素(包括IL2和IL16)。
在一些实施方案中，抗原结合片段结合为2型谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段结合为1型谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD19)的谱系特异性细胞表面抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段结合由癌症和/或肿瘤细胞表达或过表达的抗原。
结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽可以是以下片段的片段：ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB、Raet1a、Raet1b、Raet1c、Raet1d、Raet1e、H60b、H60c或HCMV UL18，其同源物，其突变体，或其片段。结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽可以是以下的胞外结构域：ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB、Raet1a、Raet1b、Raet1c、Raet1d、Raet1e、H60b、H60c、HCMV UL18，其同源物，其突变体，或其片段。
在某些实施方案中，ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB、Raet1a、Raet1b、Raet1c、Raet1d、Raet1e、H60b、H60c或HCMV UL18的片段包含ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB、Raet1a、Raet1b、Raet1c、Raet1d、Raet1e、H60b、H60c或HCMV UL18的胞外结构域。在某些实施方案中，ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB、Raet1a、Raet1b、Raet1c、Raet1d、Raet1e、H60b、H60c或HCMV UL18的片段包含ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB、Raet1a、Raet1b、Raet1c、Raet1d、Raet1e、H60b、H60c或HCMV UL18、其同源物、其突变体或其片段的胞外结构域。
在一些实施方案中，结合表达于NK细胞上的分子的多肽是NK细胞的细胞表面标志物的抗体。在一些实施方案中，细胞表面标志物是CD16。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子的多肽是T细胞的细胞表面标志物的抗体。在一些实施方案中，细胞表面标志物是CD3。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在某些实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。参见图1和图10B。
在某些实施方案中，抗原结合片段包括但不限于Fab、F(ab')2、Fab’、F(ab)’、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段、分离的CDR、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPa(Chen等人2019)。在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPb(Chen等人2019)。
在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2铰链结构域。在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2结构域和IgG2 Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域是CH2和CH3结构域。
第一工程化异源二聚体蛋白可被设计为以任何顺序放置功能部分(结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，以及结合表达于NK细胞上的分子的多肽)。在某些实施方案中，结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段位于融合多肽的N末端或C末端。在某些实施方案中，结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽位于融合多肽的C末端或N末端。
在一些实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白从N末端到C末端包含结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv，和ULBP1的胞外结构域(或ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA或MICB的胞外结构域)。在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端包含ULBP1的胞外结构域(或ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA或MICB的胞外结构域)，和结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv。
第一工程化异源二聚体蛋白还可包含信号序列，和/或一个或多个接头。在融合多肽中，这些功能部分可以连续地或非连续地共价连接(例如，它们可以由接头分隔开)。接头的长度可为多达50个、多达40个、多达30个、多达20个、多达18个、多达15个、多达12个、多达11个或多达10个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10-20个、8-10个、8-12个、8-15个、8-20个或8-30个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约7-10个、7-12个、7-15个、7-20个或7-30个氨基酸残基。
一种类型的衍生化蛋白是通过交联两种或更多种多肽(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联剂包括具有由适当间隔区分隔开的两个不同反应基团的异双功能的交联剂(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。可用于衍生化(或标记)蛋白质的可用的可检测剂包括荧光剂、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性的示例性荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。多肽也可以用可检测的酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等衍生化。多肽也可以用辅基(例如，链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)衍生化。
第一工程化异源二聚体蛋白可以衍生化或连接至另一功能分子。例如，第一工程化异源二聚体蛋白可功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价相互作用)至一个或多个其他分子实体，如抗体或抗体片段、可检测剂、免疫抑制剂、细胞毒性剂、药剂、可介导与另一分子(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载剂，或可用于蛋白质纯化的配体，如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A。细胞毒性剂可包括放射性同位素、化学治疗剂和毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)，及其片段。
第一工程化异源二聚体蛋白还可包含可用于多肽生产和/或检测的片段(例如，标签)，包括但不限于多聚组氨酸(例如，六个组氨酸残基)、麦芽糖结合蛋白、GST、绿色荧光蛋白(GFP)、血凝素，或碱性磷酸酶、分泌信号肽(例如，前胰蛋白酶原(preprotyrypsin)信号序列)、Myc和/或FLAG。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:1(图3)和SEQ ID NO:2(图4)或SEQ ID NO:4(图6)和SEQ IDNO:5(图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含信号序列，所述信号序列包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IL2分泌信号序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)(图3、图4、图6和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与Myc：EQKLISEEDL(SEQ IDNO:8)(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与FLAG：DYKDDDDK(SEQ IDNO:14)(图4和图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含抗CD33scFv，其包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与美国专利公布第20130078241号中公开的抗CD33scFv至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:9(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
抗CD33轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:9)：
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:10(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
抗CD33重链可变区(VH)(SEQ ID NO:10)：
QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSSSSA
在某些实施方案中，结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与野生型ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB或HCMV UL18(包括人ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB或HCMV UL18)的全长或片段，或Raet1a、Raet1b、Raet1c、Raet1d、Raet1e、H60b、H60c的人同系物的全长或片段的氨基酸序列至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，人ULBP1具有UniProt登录号Q9BZM6。在一个实施方案中，胞外结构域人ULBP1包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：Q9BZM6-1的氨基酸残基27至216。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含ULBP1胞外结构域，所述ULBP1胞外结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:15(图4和图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
ULBP1胞外结构域(Q9BZM6-1的27至216aa)(SEQ ID NO:15)：
WVDTHCLCYDFIITPKSRPEPQWCEVQGLVDERPFLHYDCVNHKAKAFASLGKKVNVTKTWEEQTETLRDVVDFLKGQLLDIQVENLIPIEPLTLQARMSCEHEAHGHGRGSWQFLFNGQKFLLFDSNNRKWTALHPGAKKMTEKWEKNRDVTMFFQKISLGDCKMWLEEFLMYWEQMLDPTKPPSLAPG
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:12(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
6DMPa(SEQ ID NO:12)：
GTKEDILERQRKIIERAQEIHRRQQEILEELERIIRKPGSSEEAMKRMLKLLEESLRLLKELLELSEESAQLLYEQR
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:16(图4和图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
6DMPb(SEQ ID NO:16)：
TEKRLLEEAERAHREQKEIIKKAQELHRRLEEIVRQSGSSEEAKKEAKKILEEIRELSKRSLELLREILYLSQEQKGSLVPR
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IgG2铰链：ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:13)(图3、图4、图6和图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2Fc结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2 Fc结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:19(图6和图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
IgG2 Fc结构域(SEQ ID NO:19)：
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一个实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个接头，所述一个或多个接头包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:11：GGGGSGGGGSGGGGS(图3、图4、图6和图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，第一工程化异源二聚体蛋白包含His6标签(HHHHHH；SEQ IDNO:20)。
在某些实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。
在某些实施方案中，抗原结合片段包括但不限于Fab、F(ab')2、Fab’、F(ab)’、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段、分离的CDR、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPa(Chen等人2019)。在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPb(Chen等人2019)。
在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2铰链结构域。在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2结构域和IgG2 Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域是CH2和CH3结构域。
第二工程化异源二聚体蛋白可被设计为以任何顺序放置功能部分(结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，以及结合表达于T细胞上的分子的多肽)。在某些实施方案中，结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段位于融合多肽的N末端或C末端。在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子的多肽位于融合多肽的C末端或N末端。
在一些实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白从N末端到C末端包含结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv，和结合表达于T细胞上的分子(例如，抗CD3单克隆抗体)的多肽。在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端包含结合表达于T细胞上的分子(例如，抗CD3单克隆抗体)的多肽，和结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv。
第二工程化异源二聚体蛋白还可包含信号序列，和/或一个或多个接头。在第二工程化异源二聚体中，这些功能部分可以连续地或非连续地共价连接(例如，它们可以由接头分隔开)。接头的长度可为多达50个、多达40个、多达30个、多达20个、多达18个、多达15个、多达12个、多达11个或多达10个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10-20个、8-10个、8-12个、8-15个、8-20个或8-30个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约7-10个、7-12个、7-15个、7-20个或7-30个氨基酸残基。
一种类型的衍生化蛋白是通过交联两种或更多种多肽(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联剂包括具有由适当间隔区分隔开的两个不同反应基团的异双功能的交联剂(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。可用于衍生化(或标记)蛋白质的可用的可检测剂包括荧光剂、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性的示例性荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。多肽也可以用可检测的酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等衍生化。多肽也可以用辅基(例如，链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)衍生化。
第二工程化异源二聚体蛋白可以衍生化或连接至另一功能分子。例如，第二工程化异源二聚体蛋白可功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价相互作用等)至一个或多个其他分子实体，如抗体或抗体片段、可检测剂、免疫抑制剂、细胞毒性剂、药剂、可介导与另一分子(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载剂，或可用于蛋白质纯化的配体，如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A。细胞毒性剂可包括放射性同位素、化学治疗剂和毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)，及其片段。
第二工程化异源二聚体蛋白还可包含可用于多肽生产和/或检测的片段(例如，标签)，包括但不限于多聚组氨酸(例如，六个组氨酸残基)、麦芽糖结合蛋白、GST、绿色荧光蛋白(GFP)、血凝素，或碱性磷酸酶、分泌信号肽(例如，前胰蛋白酶原信号序列)、Myc和/或FLAG。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:1(图3)和SEQ ID NO:3(图5)或SEQ ID NO:4(图6)和SEQ IDNO:6(图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含信号序列，所述信号序列包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IL2分泌信号序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)(图3、图5、图6和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与Myc：EQKLISEEDL(SEQ IDNO:8)(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与FLAG：DYKDDDDK(SEQ IDNO:14)(图5和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含抗CD33scFv，其包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与美国专利公布第20130078241号中公开的抗CD33scFv至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:9(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
抗CD33轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:9)：
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:10(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
抗CD33重链可变区(VH)(SEQ ID NO:10)：
QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSSSSA
在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子的多肽包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:17和18的氨基酸系列至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含结合CD3的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:17(图5和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
抗CD3重链可变区(VH)(SEQ ID NO:17)：
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含结合CD3的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:18(图5和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
抗CD3轻链可变区(VH)(SEQ ID NO:18)：
DIQLTQSPAIMSASPGGKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:12(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
6DMPa(SEQ ID NO:12)：
GTKEDILERQRKIIERAQEIHRRQQEILEELERIIRKPGSSEEAMKRMLKLLEESLRLLKELLELSEESAQLLYEQR
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:16(图5和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
6DMPb(SEQ ID NO:16)：
TEKRLLEEAERAHREQKEIIKKAQELHRRLEEIVRQSGSSEEAKKEAKKILEEIRELSKRSLELLREILYLSQEQKGSLVPR
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IgG2铰链：ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:13)(图3、图5、图6和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2Fc结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2 Fc结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:19至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。(图6和图8)。
IgG2 Fc结构域(SEQ ID NO:19)：
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个接头，所述一个或多个接头包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:11：GGGGSGGGGSGGGGS(图3至图8)或与SEQ ID NO:21：GGSGGSGGSGGSGG(图5和图8，CD3 VH-VL接头)或与SEQ ID NO:22：SGSGSG(图5和图8，CD3-VL内的接头)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含His6标签(HHHHHH；SEQ IDNO:20)。
在某些实施方案中，本公开提供了第三工程化异源二聚体蛋白，所述第三工程化异源二聚体蛋白包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和如本文所述的第二共价二聚化结构域。参见图23。
在某些实施方案中，抗原结合片段包括但不限于Fab、F(ab')2、Fab’、F(ab)’、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段、分离的CDR、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPa(Chen等人2019)。在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPb(Chen等人2019)。
在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2铰链结构域。在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2结构域和IgG2 Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域是CH2和CH3结构域。
第三工程化异源二聚体蛋白可被设计为以任何顺序放置功能部分(结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，以及结合表达于NK细胞上的分子的多肽)。在某些实施方案中，结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段位于融合多肽的N末端或C末端。在某些实施方案中，结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽位于融合多肽的C末端或N末端。
在一些实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白从N末端到C末端包含结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv，和结合表达于NK细胞上的分子(例如，抗CD16单克隆抗体)的多肽。在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端包含结合表达于NK细胞上的分子(例如，抗CD16单克隆抗体)的多肽，和结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv。
第三工程化异源二聚体蛋白还可包含信号序列，和/或一个或多个接头。在融合多肽中，这些功能部分可以连续地或非连续地共价连接(例如，它们可以由接头分隔开)。接头的长度可为多达50个、多达40个、多达30个、多达20个、多达18个、多达15个、多达12个、多达11个或多达10个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10-20个、8-10个、8-12个、8-15个、8-20个或8-30个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约7-10个、7-12个、7-15个、7-20个或7-30个氨基酸残基。
一种类型的衍生化蛋白是通过交联两种或更多种多肽(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联剂包括具有由适当间隔区分隔开的两个不同反应基团的异双功能的交联剂(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。可用于衍生化(或标记)蛋白质的可用的可检测剂包括荧光剂、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性的示例性荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。多肽也可以用可检测的酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等衍生化。多肽也可以用辅基(例如，链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)衍生化。
第三工程化异源二聚体蛋白可以衍生化或连接至另一功能分子。例如，第三工程化异源二聚体蛋白可功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价相互作用)至一个或多个其他分子实体，如抗体或抗体片段、可检测剂、免疫抑制剂、细胞毒性剂、药剂、可介导与另一分子(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载剂，或可用于蛋白质纯化的配体，如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A。细胞毒性剂可包括放射性同位素、化学治疗剂和毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)，及其片段。
第三工程化异源二聚体蛋白还可包含可用于多肽生产和/或检测的片段(例如，标签)，包括但不限于多聚组氨酸(例如，六个组氨酸残基)、麦芽糖结合蛋白、GST、绿色荧光蛋白(GFP)、血凝素，或碱性磷酸酶、分泌信号肽(例如，前胰蛋白酶原信号序列)、Myc和/或FLAG。
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:1(图3)和SEQ ID NO:26(图23A)或SEQ ID NO:4(图6)和SEQID NO:27(图23B)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含信号序列，所述信号序列包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IL2分泌信号序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)(图3、图4和图23)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与Myc：EQKLISEEDL(SEQ IDNO:8)(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与FLAG：DYKDDDDK(SEQ IDNO:14)(图23)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含抗CD33scFv，其包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与美国专利公布第20130078241号中公开的抗CD33scFv至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:9(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
抗CD33轻链可变区(VL)(SEQ ID NO:9)：
EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKR
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:10(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
抗CD33重链可变区(VH)(SEQ ID NO:10)：
QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSSSSA
在某些实施方案中，结合表达于NK细胞上的分子的多肽包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:28和29的氨基酸系列至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二工程化异源二聚体蛋白包含结合CD16的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:28(图23)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
抗CD16重链可变区(VH)(SEQ ID NO:28)：
EVQLVESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRSLLFDYWGQGTLVTVSR
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含结合CD16的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:29(图23)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
抗CD16轻链可变区(VH)(SEQ ID NO:29)：
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVG
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:12(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
6DMPa(SEQ ID NO:12)：
GTKEDILERQRKIIERAQEIHRRQQEILEELERIIRKPGSSEEAMKRMLKLLEESLRLLKELLELSEESAQLLYEQR
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:16(图23)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
6DMPb(SEQ ID NO:16)：
TEKRLLEEAERAHREQKEIIKKAQELHRRLEEIVRQSGSSEEAKKEAKKILEEIRELSKRSLELLREILYLSQEQKGSLVPR
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IgG2铰链：ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:13)(图3和图23)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2Fc结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2 Fc结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:19(图6和图23)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
IgG2 Fc结构域(SEQ ID NO:19)：
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一个实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含一个或多个接头，所述一个或多个接头包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:11：GGGGSGGGGSGGGGS(图3、图6和图23)或与SEQ ID NO:30：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(图23，CD16VH-VL接头)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，第三工程化异源二聚体蛋白包含His6标签(HHHHHH；SEQ IDNO:20)。
在某些实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(a1)和第一共价二聚化结构域；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(b1)和第二共价二聚化结构域；和(iii)第三多肽，所述第三多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(c1)和第三第二共价二聚化结构域；和(d)第四多肽，所述第四多肽包含三个包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，其中每个结构域是a1、b1和c1的结合结构域(a2、b2和c2)，以及如本文所述的第四、第五和第六共价二聚化结构域。
在某些实施方案中，抗原结合片段包括但不限于Fab、F(ab')2、Fab’、F(ab)’、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段、分离的CDR、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子。在一些实施方案中，scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPa(Chen等人2019)。在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPb(Chen等人2019)。
在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2铰链结构域。在一些实施方案中，共价二聚化结构域是IgG2结构域和IgG2 Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域是CH2和CH3结构域。
工程化异源三聚体蛋白可被设计为以任何顺序放置功能部分(结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段，和结合表达于NK细胞上的分子的多肽，和结合表达于T细胞上的分子的多肽)。在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子的多肽抗原结合片段位于融合多肽的N末端或C末端。在某些实施方案中，结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽位于融合多肽的C末端或N末端。
在一些实施方案中，工程化异源三聚体蛋白从N末端到C末端包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv，和ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA或MICB)的胞外结构域或结合CD16的多肽。在一些实施方案中，融合多肽从N末端到C末端包含ULBP1的胞外结构域(或ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA或MICB的胞外结构域)、结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33或CD19)的scFv，和结合表达于T细胞上的分子的多肽。
工程化异源三聚体蛋白还可包含信号序列，和/或一个或多个接头。在融合多肽中，这些功能部分可以连续地或非连续地共价连接(例如，它们可以由接头(例如，接头氨基酸残基)分隔开)。接头的长度可为多达50个、多达40个、多达30个、多达20个、多达18个、多达15个、多达12个、多达11个或多达10个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10-20个、8-10个、8-12个、8-15个、8-20个或8-30个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头的长度为约7-10个、7-12个、7-15个、7-20个或7-30个氨基酸残基。
一种类型的衍生化蛋白是通过交联两种或更多种多肽(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联剂包括具有由适当间隔区分隔开的两个不同反应基团的异双功能的交联剂(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。可用于衍生化(或标记)蛋白质的可用的可检测剂包括荧光剂、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性材料。非限制性的示例性荧光可检测剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。多肽也可以用可检测的酶如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等衍生化。多肽也可以用辅基(例如，链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)衍生化。
工程化异源三聚体蛋白可以衍生化或连接至另一功能分子。例如，异源三聚体蛋白可功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价相互作用等)至一个或多个其他分子实体，如抗体或抗体片段、可检测剂、免疫抑制剂、细胞毒性剂、药剂、可介导与另一分子的蛋白质或肽(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)缔合的蛋白质或肽、氨基酸接头、信号序列、免疫原性载剂，或可用于蛋白质纯化的配体，如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸标签和葡萄球菌蛋白A。细胞毒性剂可包括放射性同位素、化学治疗剂和毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)，及其片段。
工程化异源三聚体蛋白还可包含可用于多肽生产和/或检测的片段(例如，标签)，包括但不限于多聚组氨酸(例如，六个组氨酸残基)、麦芽糖结合蛋白、GST、绿色荧光蛋白(GFP)、血凝素，或碱性磷酸酶、分泌信号肽(例如，前胰蛋白酶原信号序列)、Myc和/或FLAG。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个信号序列，所述一个或多个信号序列包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IL2分泌信号序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:7)(图3至图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与Myc：EQKLISEEDL(SEQ ID NO:8)(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个标签，所述一个或多个标签包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与FLAG：DYKDDDDK(SEQ ID NO:14)(图4、图5、图7和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含ULBP1胞外结构域，所述ULBP1胞外结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:15(图4和图7)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含抗CD33 scFv，其包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与美国专利公布第20130078241号中公开的抗CD33 scFv至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在某些实施方案中，结合表达于NK细胞上的分子的多肽包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:28和29(图23)的氨基酸系列至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:9(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含结合CD33的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:10(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列：
在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子的多肽包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:17和18(图5和图8)的氨基酸系列至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:12(图3和图6)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，所述多肽结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:16(图5和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2铰链结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与IgG2铰链：ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:13)(图3至图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个共价二聚化IgG2 Fc结构域，所述一个或多个共价二聚化IgG2 Fc结构域包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:19至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
(图6至图8)。
在一个实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含一个或多个接头，所述一个或多个接头包含以下(或基本上由以下组成，或由以下组成)：与SEQ ID NO:11GGGGSGGGGSGGGGS(图3、图5、图6和图8)或与SEQ ID NO:21GGGGGSGGSGGSGG或与SEQ ID NO:22SGSGSG(图5和图8)至少或约50％、至少约55％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约81％、至少或约82％、至少或约83％、至少或约84％、至少或约85％、至少或约86％、至少或约87％、至少或约88％、至少或约89％、至少或约90％、至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％、或约100％同一的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，工程化异源三聚体蛋白包含His6标签(HHHHHH；SEQ ID NO:20)。
在一些实施方案中，第三多肽是趋化因子或细胞因子蛋白，其增加免疫应答。趋化因子或细胞因子蛋白包括但不限于CXCL(包括CXCL14)、GCSF和白细胞介素(包括IL2和IL16)。
本文显示，所公开的工程化蛋白结合表达CD33的细胞，如HL60和MOLM细胞，并对其具有细胞毒性。还显示当细胞中的CD33表达增加时，工程化蛋白的结合效率提高。此外，工程化蛋白的细胞毒性在如MOLM的细胞中增加，其中CD33表达增加。
在某些实施方案中，结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段是野生型抗原结合片段片段的衍生物或修饰形式或变体。
在某些实施方案中，结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽是野生型多肽片段的衍生物或修饰形式或变体。
在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子的多肽是野生型多肽片段的衍生物或修饰形式或变体。
如本文所用，术语变体还表示通过一种或多种基因和/或化学修饰获得的不同于野生型蛋白质或肽的任何肽、假肽(并入非生物化学元件的肽)或蛋白质。遗传和/或化学修饰可以理解为意指对所考虑的蛋白质或肽的一个或多个残基的任何突变、取代、缺失、添加和/或修饰。化学修饰可以指对通过化学反应或通过将生物或非生物分子化学接枝到蛋白质的任何数量的残基上而产生的肽或蛋白质的任何修饰。
本发明的多肽或肽可包括氨基酸或肽的变体、类似物、直系同源物、同系物和衍生物。本发明的多肽或肽可包含一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然存在的氨基酸、仅在无关生物系统中天然存在的氨基酸、修饰的氨基酸等)、具有取代键联的肽，以及本领域已知的其他修饰。本发明的多肽或肽可包含拟肽，如类肽。本发明的多肽或肽可包含通过例如糖基化、酰化(例如，乙酰化、甲酰化、豆蔻酰化、棕榈酰化、脂酰化)、烷基化(例如，甲基化)、异戊二烯化或异戊烯化(例如，法呢基化、香叶酰香叶酰化)、硫酸化、酰胺化、羟基化、琥珀酰化等修饰的一个或多个氨基酸残基。本发明的多肽和剂可以被糖基化、磺化和/或磷酸化和/或接枝到复合糖或接枝到亲脂性化合物(例如像多碳链或胆固醇衍生物)。
谱系特异性细胞表面抗原
本公开的方面提供靶向谱系特异性细胞表面抗原(例如靶癌细胞上的抗原)的剂。这种剂可包含结合并靶向所述谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段可以是与谱系特异性抗原特异性结合的单链抗体(scFv)。如本文所用，术语“谱系特异性细胞表面抗原”和“细胞表面谱系特异性抗原”可互换使用，并且是指充分存在于细胞表面上并与一个或多个细胞谱系群体相关的任何抗原。例如，抗原可存在于一个或多个细胞谱系群体上，而在其他细胞群体的细胞表面上不存在(或处于降低的水平)。
一般而言，谱系特异性细胞表面抗原可基于多种因素进行分类，所述因素如抗原和/或呈递所述抗原的细胞群体是否是宿主生物体的存活和/或发育所需的。以下表1中提供了示例性类型的谱系特异性抗原的总结。
表1.谱系特异性抗原的分类
Figure BDA0004096823910000631
Figure BDA0004096823910000641
1型类别的谱系特异性抗原可在多种不同的组织，包括卵巢、睾丸、前列腺、乳腺、子宫内膜和胰腺中表达。在一些实施方案中，所述剂靶向为1型抗原的细胞表面谱系特异性抗原。
在一些实施方案中，所述剂靶向为2型抗原的细胞表面谱系特异性抗原。例如，CD33是在正常骨髓细胞以及急性骨髓性白血病(AML)细胞中表达的2型抗原(Dohner等人2015)。
本公开的方法和组合物可靶向多种抗原。针对这些抗原的单克隆抗体可商购或使用标准技术产生，包括用目标抗原对动物进行免疫，然后是常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature(1975)256:495的标准体细胞杂交技术，如上文所论述。可使用任何标准DNA或蛋白质测序技术对抗体或编码所述抗体的核酸进行测序。
在一些实施方案中，使用本文所述的方法和组合物靶向的细胞表面谱系特异性抗原是白细胞或白细胞亚群的细胞表面谱系特异性抗原。在一些实施方案中，细胞表面谱系特异性抗原是与骨髓细胞相关的抗原。在一些实施方案中，细胞表面谱系特异性抗原是分化抗原(CD)簇。CD抗原的实例包括但不限于CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD16、CD16b、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD32c、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60a、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64a、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66F、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75S、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85A、CD85C、CD85D、CD85E、CD85F、CD85G、CD85H、CD85I、CD85J、CD85K、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD99R、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CD121b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD152、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156a、CD156b、CD156c、CD157、CD158b1、CD158b2、CD158d、CD158e1/e2、CD158f、CD158g、CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159a、CD159c、CD160、CD161、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167a、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202b、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235a、CD235b、CD236、CD236R、CD238、CD239、CD240、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD252、CD253、CD254、CD256、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD280、CD281、CD282、CD283、CD284、CD286、CD288、CD289、CD290、CD292、CDw293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300a、CD300c、CD300e、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、306、CD307a、CD307b、CD307c、D307d、CD307e、CD309、CD312、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD344、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD359、CD360、CD361、CD362和CD363。
在一些实施方案中，细胞表面谱系特异性抗原是CD19、CD20、CD11、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33、CD66b、CD41、CD61、CD62、CD235a、CD146、CD326、LMP2、CD22、CD52、CD10、CD3/TCR、CD79/BCR和CD26。在一些实施方案中，所述细胞表面谱系特异性抗原是CD33或CD19。
或者或此外，细胞表面谱系特异性抗原可以是癌抗原，例如差异存在于癌细胞上的细胞表面谱系特异性抗原。在一些实施方案中，癌抗原是对组织或细胞谱系具有特异性的抗原。与特定类型的癌症相关的细胞表面谱系特异性抗原的实例包括但不限于CD20、CD22(非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL))、CD52(B细胞CLL)、CD33(急性髓细胞性白血病(AML))、CD10(gp100)(普通(前B型)急性淋巴细胞性白血病和恶性黑素瘤)、CD3/T细胞受体(TCR)(T细胞淋巴瘤和白血病)、CD79/B细胞受体(BCR)(B细胞淋巴瘤和白血病)、CD26(上皮和淋巴恶性肿瘤)、人白细胞抗原(HLA)-DR、HLA-DP和HLA-DQ(淋巴恶性肿瘤)、CD307e和BCMA(骨髓瘤)、RCAS1(妇科癌、胆管腺癌和胰腺导管腺癌)、封闭蛋白(Claudin)3、TMPRSS3和Her2(卵巢癌)、Her2(乳腺癌)以及前列腺特异性膜抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原CD33与AML细胞相关。
在某些实施方案中，结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段的长度为多达或约500个、多达或约490个、多达或约480个、多达或约470个、多达或约460个、多达或约450个、多达或约440个、多达或约430个、多达或约420个、多达或约410个、多达或约400个、多达或约390个、多达或约380个、多达或约370个、多达或约360个、多达或约350个、多达或约340个、多达或约330个、多达或约320个、多达或约310个、多达或约200个、多达或约190个、多达或约180个、多达或约170个、多达或约160个、多达或约150个、多达或约140个、多达或约130个、多达或约120个、多达或约110个、多达或约100个、多达或约90个、多达或约80个、多达或约70个、多达或约60个、多达或约50个、多达或约40个、多达或约30个、多达或约20个、多达或约15个，或多达或约10个氨基酸残基。在某些实施方案中，结合谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD33)的抗原结合片段的长度为约100-200个、80-210个、80-250个、150-250个、100-30个、50-200个、150-250个、150-300个、300-400个、200-400个、400-500个或150-190个氨基酸残基。
NK细胞表面受体结合肽
在某些实施方案中，本发明的融合多肽或组合物包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子(如C型凝集素样受体(例如，NKG2D))的多肽。
C型凝集素样NK细胞受体可能是一种表达于自然杀伤细胞表面上的受体。这种类型的示例性NK细胞受体包括但不限于NKG2D(GENBANK登录号BC039836)、Dectin-1(GENBANK登录号AJ312373或AJ312372)、肥大细胞功能相关抗原(GENBANK登录号AF097358)、HNKR-P1A(GENBANK登录号U11276)、LLT1(GENBANK登录号AF133299)、CD69(GENBANK登录号NM_001781)、CD69同系物、CD72(GENBANK登录号NM_001782)、CD94(GENBANK登录号NM_002262或NM_007334)、KLRF1(GENBANK登录号NM_016523)、氧化的LDL受体(GENBANK登录号NM002543)、CLEC-1、CLEC-2(GENBANK登录号NM016509)、NKG2C(GENBANK登录号AJ001684)、NKG2A(GENBANK登录号AF461812)、NKG2E(GENBANK登录号AF461157)、WUGSC:H_DJ0701O16.2或骨髓DAP12相关凝集素(MDL-1；GENBANK登录号AJ271684)。在特定实施方案中，NK细胞受体是人NKG2D或人NKG2C。
如本文所用，术语“自然杀伤组2D”、“NKG2D”和“NKG2D受体”，也称为KLRK1，是指在多种类型的免疫细胞，特别地是NK细胞、CD8+T细胞、一些CD4+T细胞和γδT细胞上发现的活化性细胞表面分子。术语NKG2D和NKG2D受体包括人NKG2D受体的变体、同种型和同系物(参见，例如，Diefenbach等人,Nat Immunol.(2002)3(12):1142-9中描述的同种型)。NKG2D是一种II型跨膜蛋白，其具有细胞外C型(即，Ca2+结合)凝集素样结构域但缺乏Ca2+结合位点。它可以与衔接蛋白(如DAP10或DAP12)形成异源二聚体，并识别蛋白质配体(包括但不限于MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6)。
在某些实施方案中，NKG2D结合肽是NKG2D的激动剂。在某些实施方案中，NKG2D结合肽是NKG2D的拮抗剂。在某些实施方案中，NKG2D结合肽既不是NKG2D的拮抗剂，也不是NKG2D的激动剂。
结合表达于NK细胞上的分子的多肽可以是NK细胞表面受体的配体，如NKG2D细胞表面受体的配体。NKG2D的配体(或NKG2D配体)的非限制性实例包括MHC I类链相关(MIC)抗原(如MICA和MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)(如ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6等)(Bahram Adv.Immunol.(2000)76:1-60；Cerwenka和Lanier Immunol.Rev.(2001)181:158-169；Cosman等人Immunity(2001)14:123-133；Kubin等人Eur.J.Immunol.(2001)31:1428-1437)。鼠NKG2D配体包括，例如，视黄酸早期诱导型1基因产物(RAE-1)和次要组织相容性抗原肽H60。NK细胞可以通过免疫调节多肽配体与NK细胞表面受体的相互作用来调节。例如，可调节NK细胞活性的NKG2D受体的配体包括趋化因子(如muCCL21)和应激诱导型多肽配体(如MHC I类链相关抗原和ULL16结合蛋白)。据报告，鼠H60次要组织相容性抗原肽也与NKG2D受体结合。参见，例如，Robertson等人Cell Immunol.(2000)199(1):8-14；Choi等人Immunity(2002)17(5):593-603；和Farag等人,Blood,(2002)100(6):1935-1947。如本文所用，术语“NKG2D配体”是指特异性结合NKG2D受体的结合配偶体。示例性配体包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBPS、ULBP6以及它们的功能片段，如MIC和ULBP蛋白的可溶形式。
表2列出了示例性的NKG2D结合蛋白和结构域。
表2.NKG2D结合蛋白和结构域
Figure BDA0004096823910000691
Figure BDA0004096823910000701
*起始和结束氨基酸编号是基于由uniport ID标识的蛋白质序列。
MIC和ULBP蛋白充当结合免疫效应细胞(包括NK细胞、NKT细胞、αβCD8+T细胞和γδCD8+T细胞)上的C型凝集素样活化性受体自然杀伤组2D(NKG2D)的配体。
如本文所用，术语“ULBP蛋白”是指具有未加工蛋白的特征组织的MHC I类相关分子的成员，该组织包括N末端信号序列、位于中心的α-1和α-2结构域，以及C末端细胞膜结合结构域，该结构域可以是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结构域或跨膜结构域。某些种类的ULBP蛋白具有细胞质结构域。一般来说，ULBP蛋白与MICA/MICB蛋白的氨基酸序列同一性较弱。ULBP家族成员是效应细胞受体NKG2D的配体，已知可活化NK细胞。如本文所用。“ULBP蛋白”包括人ULBP蛋白的活性变体、同种型和物种同系物，并且包括具有NKG2D受体结合活性的片段。
如本文所用，术语“ULBP1”，也被描述为“视黄酸早期转录物1蛋白”或“RAET1”，是指MHC I类家族的成员，包括人ULBP1的变体、同种型和物种同系物。所述蛋白作为受体NKG2D的配体发挥作用。ULBP1蛋白活化原代NK细胞中的多个信号传导通路。ULBP1中的C末端膜相关结构域包含GPI结构域。ULBP1与MICA和MICB的同源性较弱，并且与ULBP2和ULBP3具有约55％至60％的氨基酸序列同一性。人ULBP1的示例性序列可作为NCBI登录号NP_079494.1获得。人ULBP1的DNA和蛋白质序列已由Cosman等人,Immunity(2001)14(2):123-133报告，DNA登录号AF304377，EMBL数据库，European Bioinformatics Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UK。
如本文所用，术语“ULBP2”，也被描述为“视黄酸早期转录物1H蛋白”或“RAET1H”，是指MHC I类家族的成员，包括人ULBP2的变体、同种型和物种同系物。所述蛋白作为受体NKG2D的配体发挥作用。ULBP2活化原代NK细胞中的多个信号传导通路。ULBP2中的C末端膜相关结构域包含GPI结构域。ULBP2与MICA和MICB的同源性较弱，并且与ULBP1和ULBP3具有约55％和60％的氨基酸序列同一性。人ULBP2的示例性序列可作为NCBI登录号NP_079493.1获得。人ULBP2的DNA和蛋白质序列已由Cosman等人,Immunity(2001)14(2):123-133报告，DNA登录号AF304378，EMBL数据库，European Bioinformatics Institute,Wellcome TrustGenome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UK。
如本文所用，术语“ULBP3”，也被描述为“视黄酸早期转录物1N蛋白”或“RAET1N”，是指MHC I类家族的成员，包括人ULBP3的变体、同种型和物种同系物。所述蛋白作为受体NKG2D的配体发挥作用。ULBP2中的C末端膜相关结构域包含GPI锚定结构域。ULBP3活化原代NK细胞中的多个信号传导通路。ULBP3与MICA和MICB的同源性较弱。人ULBP3的示例性序列可作为NCBI登录号NP_078794.1获得。人ULBP3的DNA和蛋白质序列已由Cosman等人,Immunity(2001)14(2):123-133报告，DNA登录号AF304379，EMBL数据库，EuropeanBioinformatics Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB101SD,UK。
如本文所用，术语“ULBP4”，也被描述为“视黄酸早期转录物1E蛋白”或“RAET1E”，是指MHC I类家族的成员，包括人ULBP4的变体、同种型和物种同系物。所述蛋白作为受体NKG2D的配体发挥作用。ULBP4的C末端区域包含跨膜结构域和细胞质结构域(参见，例如，美国专利公布US20090274699)。ULBP4通过结合受体NKG2D参与活化NK细胞并诱导NK介导的溶解(参见，例如，Kong等人,Blood(2009)114(2):310-17)。ULBP4与ULBP3的序列同一性高于与ULBP1和ULBP2的序列同一性。人ULBP4的示例性氨基酸序列可作为NCBI登录号NP_001230254.1；NP 001230256.1；NP 001230257.1；和NP631904.1获得。如本文所用，术语“ULBP5”，也被描述为“视黄酸早期转录物1G蛋白”或“RAET1G”，是指MHC I类家族的成员，包括人ULBP5的变体、同种型和物种同系物。所述蛋白的C末端区域具有跨膜结构域和细胞质结构域。ULBP5通过结合受体NKG2D而参与活化NK细胞和NK细胞介导的细胞毒性。人ULBP5的示例性序列可作为NCBI登录号NP_001001788.2获得。
如本文所用，术语“ULBP6”，也被描述为“视黄酸早期转录物1L蛋白”或“RAET1L”，是指MHC I类家族的成员，包括人ULBP6的变体、同种型和物种同系物。类似于ULBP1、ULBP2和ULBP3，ULBP6含有GPI锚定结构域。ULBP6通过结合受体NKG2D而参与活化NK细胞和NK细胞介导的细胞毒性。人ULBP6的示例性序列可作为NCBI登录号NP_570970.2获得。
与MICA和MICB一样，ULBP蛋白的一个已知功能是结合NKG2D受体并活化NK细胞活性。
MICA是MHC I类链相关基因A蛋白(MICA)，包括人MICA的变体、同种型和同系物，并且包括具有功能性MICA活性的MICA的片段。MICA蛋白包含三个细胞外Ig样结构域(即α-1、α-2和α-3)、一个跨膜结构域和一个细胞内结构域。该蛋白质在胃上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞中以及在角质形成细胞和单核细胞的细胞质中以低水平表达。MICA的示例性序列可作为NCBI登录号NP_000238.1获得。其他示例性MICA序列可在美国专利公布20110311561中找到。
MICB是MHC I类链相关基因B蛋白(MICB)，包括人MICB的变体、同种型和同系物，并且包括具有功能性MICB活性的MICB的片段。MICB与MICA具有约84％的序列同一性。MICB蛋白包含三个细胞外Ig样结构域(即α-1、α-2和α-3)、一个跨膜结构域和一个细胞内结构域。MICB的示例性序列可作为UniProtKB登录号Q29980.1获得。其他示例性MICB序列可在美国专利公布20110311561中找到。
NKG2D配体(NKG2D受体的配体)还可以包括抗NKG2D抗体或其片段(例如，抗原结合部分或其片段)，包括但不限于特异性识别或结合NKG2D的抗体的全部或部分。此类抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体也可以是变体抗体，如嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体和包含能够结合NKG2D的免疫球蛋白链的杂合抗体。在特定实施方案中，抗体包含单链可变片段。在特定实施方案中，抗体是16F16、16F31、MS或21F2，如美国专利第7,879,985号所列出的，所述专利以引用的方式并入本文。抗体片段可以是如本文讨论的任何合适的片段。
在某些实施方案中，异源蛋白或组合物包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子即CD16的多肽。
这种多肽可以包含结合并靶向表达于NK细胞上的分子的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段可以是特异性结合表达于NK细胞上的分子的单链抗体(scFv)。
本公开的方法和组合物可靶向多种抗原。针对这些抗原的单克隆抗体可商购或使用标准技术产生，包括用目标抗原对动物进行免疫，然后是常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature(1975)256:495的标准体细胞杂交技术，如上文所论述。可使用任何标准DNA或蛋白质测序技术对抗体或编码所述抗体的核酸进行测序。
在某些实施方案中，结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽的长度为多达或约500个、多达或约490个、多达或约480个、多达或约470个、多达或约460个、多达或约450个、多达或约440个、多达或约430个、多达或约420个、多达或约410个、多达或约400个、多达或约390个、多达或约380个、多达或约370个、多达或约360个、多达或约350个、多达或约340个、多达或约330个、多达或约320个、多达或约310个、多达或约200个、多达或约190个、多达或约180个、多达或约170个、多达或约160个、多达或约150个、多达或约140个、多达或约130个、多达或约120个、多达或约110个、多达或约100个、多达或约90个、多达或约80个、多达或约70个、多达或约60个、多达或约50个、多达或约40个、多达或约30个、多达或约20个、多达或约15个，或多达或约10个氨基酸残基。在某些实施方案中，结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽的长度为约100-200个、80-210个、80-250个、150-250个、100-30个、50-200个、150-250个、150-300个或150-190个氨基酸残基。
表达于T细胞上的分子
本公开的方面提供了靶向表达于T细胞上的分子的剂。这种剂可包含结合并靶向表达于T细胞上的分子的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段可以是特异性结合表达于T细胞上的分子的单链抗体(scFv)。
本公开的方法和组合物可靶向多种抗原。针对这些抗原的单克隆抗体可商购或使用标准技术产生，包括用目标抗原对动物进行免疫，然后是常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,Nature(1975)256:495的标准体细胞杂交技术，如上文所论述。可使用任何标准DNA或蛋白质测序技术对抗体或编码所述抗体的核酸进行测序。
在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子谱系特异性细胞表面抗原(例如，CD3)的抗原结合片段的长度为多达或约500个、多达或约490个、多达或约480个、多达或约470个、多达或约460个、多达或约450个、多达或约440个、多达或约430个、多达或约420个、多达或约410个、多达或约400个、多达或约390个、多达或约380个、多达或约370个、多达或约360个、多达或约350个、多达或约340个、多达或约330个、多达或约320个、多达或约310个、多达或约200个、多达或约190个、多达或约180个、多达或约170个、多达或约160个、多达或约150个、多达或约140个、多达或约130个、多达或约120个、多达或约110个、多达或约100个、多达或约90个、多达或约80个、多达或约70个、多达或约60个、多达或约50个、多达或约40个、多达或约30个、多达或约20个、多达或约15个，或多达或约10个氨基酸残基。在某些实施方案中，结合表达于T细胞上的分子(例如，CD3)的抗原结合片段的长度为约100-200个、80-210个、80-250个、150-250个、100-30个、50-200个、150-250个、150-300个、300-400个、200-400个、400-500个或150-190个氨基酸残基。
非天然存在的多肽结构域
本公开的方面使用一种6DMP异源二聚体方法，该方法基于四个螺旋——在一些异源二聚体设计中，每个蛋白质单体具有两个螺旋，在其他设计中，具有3对1螺旋——沿着螺旋产生四个结合网络，最终仅支持一个异源二聚体形成该网络。6DMP异源二聚化网络产生三个氢键网络和一个疏水核心。四个螺旋被分成两个蛋白质序列，每个序列构成两个螺旋。高度特异性的四螺旋结构仅在其配偶体蛋白之间形成异源二聚体。已知它可用于促进核内过程，但尚未作为细胞间相互作用的促进剂进行测试。
在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPa(SEQ IDNO:12)。在一些实施方案中，包含1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域是6DMPb(SEQ IDNO:16)。
参见Chen等人2019，其以引用的方式整体并入本文。
抗原结合片段
抗原结合片段可以是抗体片段。抗体或抗体片段可以是任何免疫球蛋白类别(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和亚类，只要它们能够结合。在某些实施方案中，抗体片段具有抗原结合部分。在某些实施方案中，抗体片段包括但不限于Fab、F(ab')2、Fab’、F(ab)’、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、二价scFv(bi-scFv)、三价scFv(tri-scFv)、Fd、dAb片段(例如，Ward等人,Nature,(1989)341:544-546)、分离的CDR、双抗体、亲和体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子。通过使用重组方法或合成接头连接抗体片段产生的单链抗体也涵盖在本公开中。Bird等人Science,(1988),242:423-426。Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1988),85:5879-5883。抗体片段仅包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。本发明所涵盖的抗体片段的实例包括：Fab片段，其具有轻链可变结构域(VL)、轻链恒定结构域(CL)、重链可变结构域(VH)和重链恒定结构域(CH)；Fab'片段，其是在CH结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；Fd片段，其具有VH和CH结构域；Fd’片段，其具有VH和CH结构域并且在CH结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基；Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；dAb片段(Ward等人,Nature(1989)341:544-546)，其由VH结构域组成；孤立的CDR区域；F(ab')2片段，在铰链区包括由二硫桥联接的两个Fab'片段的二价片段；单链抗体分子(Bird等人,Science(1988)242:423-426；和Huston等人,PNAS(1988)85:5879-5883)；具有两个抗原结合位点的双抗体，在同一多肽链中包含连接至VL结构域的VH结构域(参见，例如，Whitlow等人的WO 93/11161和Hollinger等人,PNAS(1993)90:6444-6448)；为三螺旋高亲和力肽的亲和体(参见，例如，Nygren，“FEBS Journal(2008)275:2668-2676)；和线性抗体，其包含串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)对，该区段与互补轻链多肽一起形成抗原结合区对(Zapata等人,Protein Eng.(1995)8(10):1057-1062；美国专利第5,641,870号；美国专利第8,580,755号)。
任何抗体或其抗原结合片段可用于构建靶向如本文所述的谱系特异性细胞表面抗原的剂。这种抗体或抗原结合片段可通过常规方法，例如杂交瘤技术或重组技术制备。
例如，可通过常规杂交瘤技术制备对目标谱系特异性抗原具有特异性的抗体。谱系特异性抗原(其可与载剂蛋白如KLH偶联)可用于对宿主动物进行免疫以产生与该复合物结合的抗体。宿主动物的免疫途径和时间表通常与用于抗体刺激和产生的已确立且常规的技术一致，如本文进一步描述的。用于产生小鼠抗体、人源化抗体和人抗体的一般技术是本领域已知的并且在本文中进行了描述。预期可对包括人的任何哺乳动物受试者或来自其的产生抗体的细胞进行操纵以充当产生哺乳动物，包括人杂交瘤细胞系的基础。通常，将宿主动物腹膜内、肌肉内、口服、皮下、足底和/或皮内接种一定量的免疫原，包括如本文所述的。
可使用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495-497的一般体细胞杂交技术或如Buck等人,In Vitro,(1982)18:377-381所修改的一般体细胞杂交技术从淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可用的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA的那些，可用于杂交。一般而言，所述技术包括使用融合剂如聚乙二醇或通过本领域技术人员熟知的电手段融合骨髓瘤细胞和淋巴细胞。融合后，将细胞从融合培养基中分离并在选择性生长培养基，如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基中生长，以消除未杂交的亲代细胞。补充有或没有血清的本文所述的任何培养基均可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种替代方法，EBV永生化B细胞可用于产生本文所述的TCR样单克隆抗体。如果需要，将杂交瘤扩增并亚克隆，并且通过常规免疫测定程序(例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤包括产生能够结合至谱系特异性抗原的单克隆抗体的亲代杂交瘤的所有衍生物、后代细胞。可使用已知程序在体外或体内生长产生此类抗体的杂交瘤。如果需要，可通过常规免疫球蛋白纯化程序如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱和超滤从培养基或体液中分离单克隆抗体。不合乎需要的活性(如果存在)可例如通过使制剂在由附着至固相上的免疫原制成的吸附剂上运行并使所需抗体从所述免疫原洗脱或释放来去除。用靶抗原或含有靶氨基酸序列的片段对宿主动物进行免疫可产生抗体(例如，单克隆抗体)群体，所述靶抗原或片段使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)缀合至在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质，例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
如果需要，可对目标抗体(例如，由杂交瘤产生)进行测序，并且然后可将多核苷酸序列克隆至用于表达或繁殖的载体中。编码目标抗体的序列可在宿主细胞中的载体中保持，然后可使宿主细胞扩增和冷冻以备将来使用。在替代方案中，多核苷酸序列可用于基因操纵以使抗体“人源化”或提高抗体的亲和力(亲和力成熟)或其他特性。例如，如果抗体用于人的临床试验和治疗，则恒定区可被工程化为更类似于人恒定区以避免免疫应答。可能需要对抗体序列进行基因操纵以获得对谱系特异性抗原的更大亲和力。对本领域技术人员来说显而易见的是，可对抗体进行一种或多种多核苷酸改变并且仍然保持其对靶抗原的结合特异性。
在其他实施方案中，可通过使用已被工程化为表达特定人免疫球蛋白蛋白质的市售小鼠来获得完全人抗体。被设计用于产生更合乎需要的(例如，完全人抗体)或更稳健的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。这种技术的实例是来自Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseRTM以及来自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseRTM和TC MouseTM。在另一个替代方案中，可通过噬菌体展示或酵母技术以重组方式制备抗体。参见例如，美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；和第6,265,150号；以及Winter等人,Annu.Rev.Immunol.(1994)12:433-455。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等人,Nature(1990)348:552-553)可用于从未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库在体外产生人抗体和抗体片段。
可通过常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，F(ab')2片段可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生，并且Fab片段可通过还原F(ab')2片段的二硫键桥产生。
基因工程化的抗体，如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体可通过例如常规重组技术产生。在一个实例中，编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA可使用常规程序容易地分离和测序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码所述单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当这种DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置于一种或多种表达载体中，然后转染至不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。参见例如，PCT公布第WO 87/04462号。然后可对DNA进行修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列，Morrison等人,Proc.Nat.Acad.Sci.(1984)81:6851，或者通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分共价连接至免疫球蛋白编码序列。以该方式，可制备具有靶抗原的结合特异性的基因工程化的抗体，如“嵌合”或“杂合”抗体。
经开发用于产生“嵌合抗体”的技术是本领域众所周知的。参见，例如，Morrison等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:6851；Neuberger等人Nature(1984)312:604；以及Takeda等人Nature(1984)314:452。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域众所周知的。参见例如，Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1989)86:10029-10033。在一个实例中，按照本领域已知的方法，对亲本非人抗体的VH和VL的可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析鉴定据预测对形成正确的CDR结构重要的框架氨基酸残基。并行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH和VL链。然后选择人VH和VL受体基因。
所选人受体基因内的CDR区可用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代。必要时，可使用亲本链的框架区内据预测在与CDR区相互作用中重要的残基(参见上文描述)来取代人受体基因中的相应残基。
单链抗体可通过重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。优选地，在两个可变区之间并入柔性接头。或者，描述用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号和第4,704,692号)可适于产生噬菌体或酵母scFv文库，并且可按照常规程序从文库中鉴定对谱系特异性抗原具有特异性的scFv克隆。可对阳性克隆进行进一步筛选以鉴定结合谱系特异性抗原的那些克隆。
两个氨基酸序列的“同一性百分比”是使用Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:2264-68的算法，如Karlin和AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-77中所修改的算法确定的。这种算法被并入Altschul等人J.Mol.Biol.(1990)215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)来进行，以获得与本公开的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下，可利用如Altschul等人,Nucleic AcidsRes.(1997)25(17):3389-3402中所描述的空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
核酸和载体
本公开提供了编码所公开的任何多肽、工程化蛋白或剂的核酸/多核苷酸。例如，提供了编码本文所述的任何蛋白质的多核苷酸，例如，用于重组表达和纯化。在一些实施方案中，分离的多核苷酸包含编码融合蛋白或剂的一个或多个序列。核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA/RNA杂合物。核酸可以是线性的或环状的(如质粒)。核酸可以是单链的、双链的、分支的或通过连接非核酸分子而修饰的。核酸包括通过重组技术产生的核酸。
在某些实施方案中，编码所公开的工程化蛋白的核酸是密码子优化的。用于密码子优化的方法在本领域中是已知的。
在某些实施方案中，编码aCD33-6DMPa-铰链多肽的核酸具有与SEQ ID NO:23至少70％同一的核酸序列(例如，与SEQ ID NO:23中的核酸序列70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核酸序列)。
在某些实施方案中，编码多肽ULBP1-6DMPb-铰链的核酸具有与SEQ ID NO:24至少70％同一的核酸序列(例如，与SEQ ID NO:24中的核酸序列70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核酸序列)。
在某些实施方案中，编码aCD3-6DMPb多肽的核酸具有与SEQ ID NO:25至少70％同一的核酸序列(例如，与SEQ ID NO:25中的核酸序列70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核酸序列)。
在某些实施方案中，核酸是质粒DNA，其包括所公开的多肽或剂的编码序列，以及有效引起融合多肽或剂在细胞中表达的侧翼调控序列。侧翼调控序列的实例是足以启动转录的启动子序列和足以通过终止转录或翻译而终止基因产物的终止子序列。合适的转录或翻译增强子可包含在载体中以进一步帮助融合多肽或剂的表达。
在一些实施方案中，提供了编码本文所述的任何工程化蛋白的载体，例如，用于重组表达和纯化。在一些实施方案中，载体包含或被工程化为包含分离的多核苷酸，例如本文所述的那些多核苷酸。通常，载体包含可操作地连接至启动子的编码工程化多肽或蛋白或剂的序列，使得工程化蛋白(或剂)在宿主细胞中表达。
核酸可包含在表达载体内。因此，例如，核酸序列可包含在用于表达一种或多种多肽的多个表达载体中的任一表达载体中，并且超过一种核酸可包含在一个表达载体中。或者，一个基因或核酸的部分可包含在单独的载体中。在一些实施方案中，载体包括但不限于染色体的、非染色体的和合成的DNA序列(例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA；杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，和病毒DNA的衍生物)。
本公开的载体可使用哺乳动物表达载体驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中的表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,Nature(1987)329:840)和pMT2PC(Kaufman等人,EMBO J.(1987)6:187)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由一种或多种调控元件提供。例如，通常使用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40以及本文公开和本领域已知的其他启动子。对于用于原核和真核细胞的其他合适的表达系统，参见例如，Sambrook等人,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989的第16和17章。
本公开的载体可以引导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。这种调控元件包括可以是组织特异性或类型特异性的启动子。如应用于启动子的术语“组织特异性”是指在不同类型的组织中相对不存在相同的目标核苷酸序列的表达的情况下，能够指导目标核苷酸序列针对特定组织类型的选择性表达的启动子。如应用于启动子的术语“细胞类型特异性”是指在相同组织中的不同细胞类型中相对不存在相同的目标核苷酸序列的表达的情况下，能够指导目标核苷酸序列在特定细胞类型中的选择性表达的启动子。当应用于启动子时“细胞类型特异性”也意指能够促进目标核苷酸序列在单个组织中的区域内的选择性表达的启动子。启动子的细胞类型特异性可使用本领域中众所周知的方法，例如免疫组织化学染色来评估。
常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。此类方法可用于将编码本发明的剂/多肽的核酸施用至培养物中的或受试者中的细胞。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，本文所述的载体的转录物)、裸核酸，以及与递送媒介物复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，所述病毒在递送至细胞后具有游离型或整合型基因组。
病毒载体可直接施用至患者(体内)，或者它们可用于在体外或离体操纵细胞，其中可将修饰的细胞施用至患者。在一个实施方案中，本公开利用基于病毒的系统，包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。此外，本公开提供了能够整合到宿主基因组中的载体，如逆转录病毒或慢病毒。
可将本公开的载体递送至受试者的真核细胞中。
本文所述的任何嵌合蛋白均可通过常规方法(如重组技术)制备。用于制备本文嵌合蛋白的方法涉及产生编码多肽的核酸，所述多肽包含嵌合蛋白的片段/结构域/部分的每一者，包括抗原结合片段和结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽。在一些实施方案中，使用重组技术将编码嵌合蛋白的每种组分的核酸连接在一起。
工程化蛋白的每种组分的序列可通过常规技术(例如，PCR扩增)从本领域已知的多种来源中的任一种获得。在一些实施方案中，嵌合蛋白的一种或多种组分的序列获自人细胞。或者，可合成嵌合蛋白的一种或多种组分的序列。可使用如PCR扩增或连接的方法直接或间接地(例如，使用编码肽接头的核酸序列)连接每种组分(例如，片段/结构域/部分)的序列以形成编码嵌合蛋白的核酸序列。或者，可合成编码嵌合蛋白的核酸。在一些实施方案中，核酸是DNA。在其他实施方案中，核酸是RNA。
在连接每种组分的序列之前或之后，嵌合蛋白的一种或多种组分(例如，抗原结合片段等)内的一个或多个残基的突变。在一些实施方案中，可在工程化蛋白的组分中进行一个或多个突变以调节(增加或降低)所述组分对靶标(例如，靶抗原的抗原结合片段)的亲和力和/或调节所述组分的活性。
可通过常规技术将本文所述的任何工程化蛋白引入合适的细胞中以表达。
为了表达工程化蛋白，可通过如本文所述的常规方法构建用于稳定或瞬时表达工程化蛋白的表达载体。例如，可将编码嵌合蛋白的核酸克隆到合适的表达载体中，如与合适的启动子可操作连接的病毒载体中。可在合适的条件下使核酸和载体与限制性酶接触以在每个分子上产生互补末端，所述互补末端可彼此配对并用连接酶连接。或者，合成核酸接头可连接至编码工程化蛋白的核酸的末端。合成接头可含有对应于载体中的特定限制性位点的核酸序列。表达载体/质粒/病毒载体的选择将取决于用于表达嵌合蛋白的宿主细胞的类型，但应适合于在真核细胞中整合和复制。
多种启动子可用于表达本文所述的工程化蛋白，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中早期启动子、病毒LTR(如劳斯肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)LTR、骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)LTR、脾病灶形成病毒(SFFV)LTR)、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、单纯疱疹tk病毒启动子、有或无EF1-α内含子的延伸因子1-α(EF1-α)启动子。用于表达嵌合蛋白的另外启动子包括任何组成型活性启动子。或者，可使用任何可调控的启动子，以使得可调节其表达。
此外，载体可含有例如以下中的一些或全部：选择性标记基因，如用于选择宿主细胞中的稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于mRNA稳定性和翻译效率的来自如α-珠蛋白或β-珠蛋白的高表达基因的5'和3'非翻译区；用于正确游离复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)，多功能多克隆位点；用于有义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子；在触发时导致携带载体的细胞死亡的“自杀开关”或“自杀基因”(例如，HSV胸苷激酶、诱导型半胱天冬酶如iCasp9)；以及用于评估嵌合蛋白表达的报告基因。参见下文第VI章节。合适的载体和用于产生含有转基因的载体的方法是本领域众所周知的和可获得的。制备用于表达嵌合蛋白的载体的实例可在例如US2014/0106449中找到。
在一些实施方案中，工程化蛋白或编码所述工程化蛋白的核酸是DNA分子。在一些实施方案中，编码所述工程化蛋白的核酸是DNA载体。在一些实施方案中，编码所述工程化蛋白的核酸是RNA分子。
包含编码本文所述的工程化蛋白的核酸序列的任何载体也在本公开的范围内。这种载体可通过合适的方法递送至宿主细胞中。将载体递送至细胞的方法是本领域众所周知的并且可包括DNA、RNA或转座子电穿孔、转染试剂如脂质体或纳米颗粒以递送DNA、RNA或转座子；通过机械变形递送DNA、RNA或转座子或蛋白质(参见例如，Sharei等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2013)110(6):2082-2087)；或病毒转导。在一些实施方案中，用于表达嵌合蛋白的载体通过病毒转导递送至宿主细胞。用于递送的示例性病毒方法包括但不限于重组逆转录病毒(参见例如，PCT公布第WO 90/07936号；第WO 94/03622号；第WO 93/25698号；第WO 93/25234号；第WO 93/11230号；第WO 93/10218号；第WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号和第4,777,127号；GB专利第2,200,651号；和EP专利第0 345 242号)、基于甲病毒的载体和腺相关病毒(AAV)载体(参见例如，PCT公布第WO 94/12649号；第WO93/03769号；第WO 93/19191号；第WO 94/28938号；第WO 95/11984号和第WO 95/00655号)。在一些实施方案中，用于表达的载体是逆转录病毒。在一些实施方案中，用于表达的载体是慢病毒。在一些实施方案中，用于表达的载体是腺相关病毒。
在使用病毒载体将编码工程化蛋白的载体引入宿主细胞的实例中，能够感染细胞并携带载体的病毒颗粒可通过本领域已知的任何方法产生并且可例如在PCT申请第WO1991/002805A2号、第WO 1998/009271 A1号和美国专利6,194,191中找到。病毒颗粒从细胞培养物上清液中收获并且可在使所述病毒颗粒与细胞接触之前分离和/或纯化。
治疗方法
可以将所公开的任何工程化蛋白施用至受试者以治疗如造血系统恶性肿瘤的疾患。此外，可以将编码所公开的工程化蛋白的任何核酸/多核苷酸/载体施用至受试者以治疗如造血系统恶性肿瘤的疾患。此外，可以将包含所公开的工程化蛋白或编码所公开的工程化蛋白的核酸/多核苷酸/载体中任一者的任何组合物或药物组合物施用至受试者以治疗如造血系统恶性肿瘤的疾患。如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指脊椎动物，优选哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于人灵长类动物、非人灵长类动物或鼠、牛、马、犬或猫物种。在一些实施方案中，受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人患者。
在一些实施方案中，本发明的载体、工程化蛋白或剂可与药学上可接受的载剂混合以形成药物组合物，这也在本公开的范围内。
本公开提供了适合于引发针对癌细胞的免疫应答的疫苗。还描述了通过向哺乳动物施用本发明的疫苗来抑制肿瘤生长的方法。
可递送或施用本发明的组合物以接触任何合适类型的细胞。细胞可以是真核细胞。细胞可以是哺乳动物细胞，如人细胞或非人哺乳动物细胞(例如，非人灵长类动物细胞)。这些细胞包括可从美国组织培养物保藏中心获得的许多细胞系。在某些实施方案中，细胞是肿瘤细胞。
在某些实施方案中，细胞存在于受试者(例如，哺乳动物)中。哺乳动物可以是人或非人灵长类动物。非人灵长类动物包括但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。
在某些实施方案中，细胞可以原代、次生、永生化或转化状态被去除并维持在组织培养物中。在某些实施方案中，细胞是培养的细胞或从来源(例如，组织、器官、受试者等)新鲜获得的细胞。哺乳动物细胞可以是原代的或次生的，这意味着它在从动物组织获得后在培养物中维持了相对较短的时间。
为了执行本文所述的方法，可将有效量的本发明的组合物施用至需要治疗的受试者。如本文所用，术语“有效量”可与术语“治疗有效量”互换使用，并且是指载体、工程化蛋白、剂或药物组合物在施用至有需要的受试者后足以产生所需活性的量。在本公开的上下文中，术语“有效量”是指载体、工程化蛋白、剂或药物组合物的足以延迟通过本公开的方法治疗的病症的表现、阻止所述病症的进展、缓解或缓和所述病症的至少一种症状的量。
如本领域技术人员所认识到的，有效量取决于所治疗的特定疾患、疾患的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗的持续时间、同步疗法(如果有的话)的性质、具体的施用途径以及健康从业者知识和专业技能范围内的类似因素而变化。在一些实施方案中，有效量缓和、缓解、减轻、改善、减少受试者的任何疾病或病症的症状或延迟所述疾病或病症的进展。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是患有造血系统恶性肿瘤的人患者。
在一些实施方案中，将本发明的组合物以有效使靶细胞(例如，癌细胞)的数量减少至少20％，例如50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍的量施用至受试者。
在一个实施方案中，将本发明的组合物作为初始剂量施用至受试者(例如，人患者)。可在前一次施用后以15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天的间隔向患者提供本发明组合物的一次或多次后续施用。每周可向受试者施用超过一个剂量的本发明组合物，例如，所述剂的2、3、4或更多次施用。受试者每周可接受超过一个剂量的本发明组合物，随后一周不施用所述剂，并且最后接着是一个或多个另外剂量的本发明组合物(例如，每周施用本发明组合物超过一次)。本发明的组合物可每隔一天施用一次，每周施用3次，持续两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在本公开的上下文中，就其涉及本文所述的任何疾病疾患而言，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等意指缓解或缓和与这种疾患相关的至少一种症状，或减缓或逆转这种疾患的进展。在本公开的含义内，术语“治疗”还表示停止、延迟的发作(即，疾病的临床表现之前的时期)和/或降低疾病发展或恶化的风险。例如，与癌症有关的术语“治疗”可意味着消除或降低患者的肿瘤负荷，或预防、延迟或抑制转移等。
在一些实施方案中，本发明的工程化蛋白融合物识别(结合)表达细胞表面谱系特异性抗原的靶细胞以进行靶向杀伤。
本发明的治疗方法的功效可通过本领域已知的任何方法来评估并且对于熟练的医疗专业人员来说将是显而易见的。例如，可通过受试者的存活率或受试者或其组织或样本中的癌症负荷来评估所述疗法的功效。在一些实施方案中，通过定量属于特定细胞群体或谱系的细胞的数量来评估所述疗法的功效。在一些实施方案中，通过定量呈递细胞表面谱系特异性抗原的细胞的数量来评估所述疗法的功效。
本发明的组合物可与第二疗法组合施用至受试者。本发明的组合物可在第二疗法施用之前施用。在一些实施方案中，在施用第二疗法之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间施用本发明的组合物。
在一些实施方案中，第二疗法在施用本发明的组合物之前施用。在一些实施方案中，在施用本发明的组合物之前至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间施用第二疗法。
在一些实施方案中，本发明的组合物和第二疗法基本上同时施用。在一些实施方案中，施用本发明的组合物，并且评估患者一段时间，之后施用第二疗法。在一些实施方案中，施用第二疗法，并且评估患者一段时间，之后施用本发明的组合物。
本发明组合物的多次施用(例如，剂量)也在本公开的范围内。在一些实施方案中，将本发明的组合物向受试者施用一次。在一些实施方案中，将本发明的组合物向受试者施用超过一次(例如，至少2次、3次、4次、5次或更多次)。在一些实施方案中，将本发明的组合物以规则的间隔时间，例如每六个月施用至受试者。
在一些实施方案中，受试者是患有造血系统恶性肿瘤或血液系统赘生物的人受试者。如本文所用，造血系统恶性肿瘤是指涉及造血细胞(例如，血细胞，包括祖细胞和干细胞)的恶性异常。造血系统恶性肿瘤的实例包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病或多发性骨髓瘤。白血病包括急性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或慢性成淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。
血液系统恶性肿瘤或赘生物包括但不限于骨髓恶性肿瘤、淋巴恶性肿瘤、恶性组织细胞增生症和肥大细胞白血病。
造血系统恶性肿瘤可以是骨髓恶性肿瘤，其中骨髓恶性肿瘤包括但不限于骨髓增殖性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生异常/骨髓增殖性病症(MD/MPD)和急性骨髓性白血病(AML)。
在某些实施方案中，骨髓恶性肿瘤是指与造血细胞增殖缺陷相关的疾患。在某些实施方案中，骨髓恶性肿瘤是指影响骨髓血谱系的克隆性血液系统疾病，包括慢性和急性疾患。骨髓恶性肿瘤包括骨髓增殖性赘生物、骨髓增生异常综合征和急性骨髓性白血病。骨髓增殖性赘生物可以是原发性骨髓纤维化(PMF)或特发性血小板增多症(ET)。骨髓增生异常综合征可以是伴有环形铁粒幼细胞的难治性贫血和血小板增多症(RARS-T)。骨髓恶性肿瘤包括但不限于骨髓增殖性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生异常/骨髓增殖性病症(MD/MPD)和急性骨髓性白血病(AML)。
淋巴恶性肿瘤包括但不限于：T/NK细胞肿瘤、B细胞肿瘤和霍奇金病。
在一些实施方案中，白血病是急性骨髓性白血病(AML)。AML被表征为异质性、克隆性、肿瘤性疾病，其起源于转化细胞，所述转化细胞逐渐获得了破坏关键分化和生长调控通路的关键遗传变化。(Dohner等人2015)。CD33糖蛋白在大多数骨髓性白血病细胞以及正常骨髓细胞和单核细胞前体上表达，并且一直被认为是AML治疗的有吸引力的靶标(Laszlo等人,Blood Rev.(2014)28(4):143-53)。虽然使用基于抗CD33单克隆抗体的疗法的临床试验表明，当与标准化学疗法组合时，一部分AML患者的存活率有所提高，但这些效果也伴随着安全性和功效问题。
或者或此外，本文所述的方法可用于治疗非造血系统癌症，包括但不限于肺癌；耳鼻喉癌；结肠癌；黑素瘤；胰腺癌；乳腺癌；前列腺癌；乳癌；卵巢癌；基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；乳癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；结缔组织癌症；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌；上皮内赘生物；肾癌；喉癌；肝癌；纤维瘤，成神经细胞瘤；口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；肾癌；呼吸系统癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌；泌尿系统癌症，以及其他癌和肉瘤。
癌是上皮起源的癌症。意图用本公开的方法治疗的癌包括但不限于腺泡癌、腺泡状癌、肺泡腺癌(也称为腺样囊性癌、腺上皮癌、筛状癌和圆柱瘤)、腺瘤癌、腺癌(adenocarcinoma)、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌(也称为细支气管癌、肺泡细胞肿瘤和肺腺瘤病)、基底细胞癌、基底上皮细胞癌(也称为基底细胞瘤或基底细胞癌和发母质癌)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、乳腺癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌(也称为胆管瘤和胆管癌)、绒毛膜癌、胶样癌(colloid carcinoma)、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬膜癌、胚胎性癌、髓样癌、眼球上癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatiniform carcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(gigantocellulare)、腺癌(gland ular carcinoma)、粒层细胞癌、发母质癌、多血癌、肝细胞癌(也称为肝细胞瘤、恶性肝细胞瘤和肝癌)、许特耳细胞癌、透明细胞癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、侵蚀性溃疡癌(Krompecher’s carcinoma)、库尔契茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticul are)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、乳腺炎性癌、髓样癌(carcinomamedullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌(carcinoma melanodes)、黑色素癌(melanotic carcinoma)、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinom a)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、黑色素癌(carcinoma nigrum)、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、卵巢癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前期癌、前列腺癌、肾的肾细胞癌(也称为肾腺癌和hypemephoroid癌)、储备细胞癌、肉瘤样癌、施耐德氏癌(scheinderiancarcinoma)、硬癌(scirr hous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌(solanoid carcinoma)、球状细胞癌、梭形细胞癌、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞癌、鳞状细胞癌、串癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telan giectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌、绒毛状癌。
肉瘤是发生在骨和软组织中的间充质赘生物。已识别了不同类型的肉瘤，并且这些包括：脂肪肉瘤(包括粘液样脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性周围神经鞘膜瘤(也称为恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤或神经源性肉瘤)、尤文氏肿瘤(包括尤文氏骨肉瘤、骨外(即非骨)尤文氏肉瘤和原始神经外胚层肿瘤[PNET])、滑膜肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、淋巴管肉瘤、卡波济氏肉瘤、血管内皮瘤、纤维肉瘤、硬纤维瘤(也称为侵袭性纤维瘤病)、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、恶性纤维组织细胞瘤(MFH)、血管外皮细胞瘤、恶性间质瘤、腺泡状软组织肉瘤、上皮样肉瘤、透明细胞肉瘤、促结缔组织增生性小细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)(也称为胃肠道间质肉瘤)、骨肉瘤(称为骨源性肉瘤)-骨骼和骨骼外以及软骨肉瘤。
在一些实施方案中，待治疗的癌症可以是难治性癌症。如本文所用，“难治性癌症”是对指定的护理标准具有抗性的癌症。这些癌症可能最初对治疗有应答(然后复发)，或者它们可能对治疗完全无应答。普通护理标准将根据癌症类型和受试者的进展程度而有所不同。它可以是化学疗法、或手术、或放射或它们的组合。本领域普通技术人员了解此类护理标准。因此，根据本公开针对难治性癌症治疗的受试者可能已经暴露于针对他们的癌症的另一种治疗。或者，如果癌症可能是难治性的(例如，鉴于对受试者的癌细胞或病史的分析)，则受试者可能尚未暴露于另一种治疗。难治性癌症的实例包括但不限于白血病、黑素瘤、肾细胞癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、非霍奇金淋巴瘤和肺癌。
本文所述的任何本发明载体、工程化蛋白或剂可在药学上可接受的载剂或赋形剂中作为药物组合物施用。
如与本公开的组合物和/或细胞结合使用的短语“药学上可接受的”是指此类组合物的分子实体和其他成分在生理上是可耐受的并且当施用至哺乳动物(例如，人)时通常不会产生不良反应。优选地，如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出，以用于哺乳动物动物并且更具体地为用于人。“可接受”是指载剂与组合物的活性成分(例如，核酸、载体、细胞或治疗性抗体)相容，并且不会对施用所述一种或多种组合物的受试者产生不利影响。待用于本发明方法中的任何药物组合物和/或细胞可包含呈冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。
药学上可接受的载剂(包括缓冲剂)是本领域众所周知的，并且可包括磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸；疏水性聚合物；单糖；双糖；和其他碳水化合物；金属络合物；和/或非离子表面活性剂。参见例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins编辑K.E.Hoover。
药盒
也在本公开的范围内的是用于使用本发明的工程化蛋白、剂、载体和/或组合物的药盒。此类药盒可包括一个或多个容器，其中包含本发明的工程化蛋白、剂、载体和/或组合物。
本公开的一些方面提供了包括本发明的工程化蛋白或剂的药盒。在一些实施方案中，药盒包括编码本发明的工程化蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，药盒包括用于重组蛋白表达的载体，其中所述载体包含编码本发明的工程化蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，药盒包括细胞，所述细胞包含用于表达本发明的工程化蛋白的基因构建体。在一些实施方案中，药盒包括赋形剂和用于使用所述药盒的说明。在一些实施方案中，赋形剂是药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，药盒可包括针对在本文所述的任何方法中的使用的说明。所包括的说明可包括将药物组合物施用至受试者以在受试者中实现预期活性的描述。药盒还可以包括基于鉴定受试者是否需要治疗来选择适合于治疗的受试者的描述。在一些实施方案中，说明包括将药物组合物施用至需要治疗的受试者的描述。
与本文所述的药物组合物的使用有关的说明通常包括有关预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本公开的药盒中提供的说明通常是标签或包装插页上的书面说明。标签或包装插页指示所述药物组合物用于治疗受试者的疾病或病症、延迟受试者的疾病或病症的发作，和/或缓和受试者的疾病或病症。
本文提供的药盒处在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、软包装等。还考虑了用于与特定装置(如吸入器、经鼻施用装置或输注装置)组合使用的包装。药盒可具有无菌入口(例如，容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内注射溶液袋或小瓶)。容器还可具有无菌入口。
在一些实施方案中，本公开提供了包含上述药剂盒的内容物的制品。
在一些实施方案中，制剂的各个组分可以在一个容器中提供。或者，可能需要在两个或更多个容器中分别提供制剂的组分。例如，根据药盒提供的说明，可以组合不同的组分。可根据本文所述的方法组合组分，例如，以制备和施用药物组合物。
本发明的工程化蛋白、剂、载体或组合物可以任何形式，例如，以液体、干燥或冻干形式提供。
实施例
通过参考以下非限制性实施例可以更好地理解本发明，提供这些实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方案。它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实施例1-工程化异源二聚体蛋白的构建
首先，将pcDNA3.1表达载体用于aCD33-ULBP1工程化异源二聚体蛋白。所有构建体均利用N末端IL-2分泌信号触发完全蛋白质输出到细胞上清液，并利用C末端myc标签和6xHis标签促进纯化和标记。在两个构建体中，ULBP1紧跟在IL-2信号之后，接着是接头，然后是aCD33的VH和VL区。在另一构建体中，aCD33在ULBP1之前，以确定一个方向是否有利。此外，已经单独针对aCD33-scFV或ULBP1开发了构建体。
在将转染的HEK-293T细胞上清液中的6xHis标记的蛋白质纯化并对细胞蛋白进行Myc探测后，通过蛋白质印迹探测Myc，证实经由Mirus TransIT-293转染试剂的表达。参见实施例2和图12。
6DMPa单体与抗CD33、GFP和上面列出的相关标签(6xHis和myc)融合。6DMPb单体与UPBP1、RFP、6xHis和FLAG标签融合，以促进独立于6DMPa-myc的纯化(并允许单独的共免疫沉淀实验)。
还产生了pcDNA3.1质粒，用于编码将抗CD3附接至6DMPb的工程化蛋白，其标签与ULBP1-6DMPb构建体的标签相匹配(图10)。在该方法中，CD3+T细胞替代NK细胞作为相关效应细胞，因此附接6DMPb以将抗CD3促进剂结合至抗CD33靶向部分。抗CD3序列取自AmgenCD3-CD19 BiTE贝林妥欧单抗(blinotumomab)，并通过之前使用的相同接头融合至6DMPb(Kufer等人2017)。将其与aCD33-6DMPa共表达并进行免疫共沉淀以验证异源二聚化。将该构建体克隆到细菌或慢病毒载体中，以产生如上所述的高产量蛋白质表达方法。
这些设计的最新修改包括IgG2的铰链区。四个半胱氨酸残基在12个总残基的长度内形成四个二硫桥，因此在基于6DMP的嵌合体的C末端添加铰链区有望增强异源二聚体的结合并防止解离(Wypych等人2008)。因此，将同一的IgG2铰链添加到每个构建体中，处于6DMPa/b之后和纯化标签之前(图1和图10)。已经设计了直接添加此铰链或在短接头后添加此铰链的构建体。
所有构建体均从具有氨苄青霉素抗性的pcDNA3.4-TOPO载体表达，针对在灰仓鼠(Cricetulus griseus)(中国仓鼠)中表达进行了密码子优化。参见图11。
为了表达多肽/蛋白质，将氨基酸序列反向翻译以获得DNA序列，然后对该序列进行密码子优化(SEQ ID NO:23-25)。
使用Lipofectamine 3000根据制造商方案的修改版本表达蛋白质。
·将aCD33-6DMPa-铰链与aCD3-6DMPb-铰链或ULBP1-6DMPb-铰链在同一培养皿中共表达
·在15cm组织培养处理的培养皿中CHO-K1细胞产生蛋白质
在转染前一天培养10-12x106个细胞，37℃5％CO2
每板试剂体积如下：
135uL Lipofectamine 3000
40ug各质粒(aCD33-6DMPa-铰链和aCD3-6DMPb-铰链)
160ug P3000试剂(2uL/ug DNA)
转染后3-4天收集上清液
·使用TALON Metal Affinity Reason(TaKaRa Bio)纯化细胞培养上清液中含His标签的蛋白质(aCD33-6DMPa-铰链和aCD3-6DMPb-铰链)
每20mL上清液使用400uL悬浮树脂(200uL团块状树脂)
通常，一次使用5个板，产生两个50mL批次，每个批次接收500uL洗涤和平衡树脂
遵循制造商方案，使用以下缓冲液替代HisTALON缓冲液：
洗涤缓冲液：TBST-Tris 20mM，NaCl 150mM，0.1％Tween-20；
平衡缓冲液：Tris 20mM，NaCl 150mM，5mM咪唑，1mM PMSF；
洗脱缓冲液：NaCl 150mM，1mM KH2PO4，3mM Na2HPO4-7H2O，150mM咪唑
洗涤和洗脱前，将上清液和树脂在4℃下旋转30min
·将500uL二聚体结合珠用洗脱缓冲液洗脱3次至最终体积为约7.5mL
将7.5mL含蛋白质的洗脱缓冲液用PBS稀释至20mL最终体积
遵循制造商方案，使用Pierce蛋白浓缩管PES(30k MWCO，5-20mL大小)将20mL含蛋白质的缓冲液浓缩
浓缩后，将样品再次用PBS稀释至10-20mL，然后再次浓缩
30k MWCO截止值足够大，可以将大多数二聚体保留在上腔室中，但允许大多数较小的单体传递到下腔室并被丢弃
·使用Bio-Rad蛋白测定对浓缩蛋白进行定量
将样品用PBS稀释至0.5mg/mL，并冷冻于-20C直至使用
使用上述方案，使用图3和图23A以及图5和图23B所示的构建体制备第三工程化异源二聚体蛋白。
实施例2-工程化异源二聚体蛋白的表达
使用以下方案测试293T细胞中抗CD33-ULBP1工程化异源二聚体蛋白的表达。将293T细胞模拟转染(无质粒)或用抗CD33-ULBP1嵌合体1和2质粒转染(如实施例1中所述)，将细胞团块在2X SDS凝胶上样缓冲液中溶解。将溶解物上样到SDS-PAGE凝胶上，并将分离的蛋白质转移到尼龙膜上。用抗MYC抗体探测膜以检测CD33-ULBP1，以及用抗β-肌动蛋白探测以检测肌动蛋白(上样对照物)。还用荧光染料缀合的二抗探测膜(红色检测抗MYC；绿色检测抗β-肌动蛋白)以检测一抗。
如图12A所示，载有来自转染细胞的溶解物的泳道具有可检测的myc蛋白，指示异源二聚体蛋白。
还使用了以下方案测试293T细胞上清液中抗CD33-ULBP1工程化异源二聚体蛋白的表达。使用Talon珠粒对模拟转染(无质粒)或用抗CD33-ULBP1嵌合体1和2质粒转染的293T细胞的上清液进行亲和纯化。然后在SDS-PAGE凝胶上分离输入、流过物和纯化的蛋白质(洗脱液)并转移到尼龙膜上。用抗MYC抗体探测膜以进行检测。还用荧光染料缀合的二抗探测膜(红色检测抗MYC)以检测一抗。再次如图12B所示，载有来自转染细胞的上清液的泳道具有可检测的myc蛋白，指示异源二聚体蛋白。
将来自用实施例1中列出和描述的嵌合体转染的CHO-K1细胞的自TALON树脂的细胞培养物上清液或洗脱液添加到2X SDS上样缓冲液中，加热，并在SDS Page凝胶上跑胶。将蛋白质转移到PVDF膜上，并用抗myc抗体探测以检测抗CD33-6DMPa-铰链-MycHis，用抗FLAG抗体探测以检测ULBP1-6DMPb-铰链-FLAGHis或抗CD3-6DMPb-铰链-FLAGHis。荧光染料缀合的二抗用于探测抗Myc和抗FLAG抗体(分别为绿色和红色)。
如图13所示，细胞具有可检测的myc或标签蛋白，指示异源二聚体蛋白。
实施例3-结合实验
使用以下方案测试工程化异源二聚体蛋白的结合：
将50k个细胞重悬于50uL FACS缓冲液中
加入50uL工程化异源二聚体蛋白，孵育30分钟
洗涤
重悬于抗MYC-FITC或抗FLAG-PE中，孵育30分钟
结果显示，在与纯化的工程化异源二聚体蛋白一起孵育然后与抗FLAG FITC抗体一起孵育的HL60细胞中，两种构建体均有结合(图14A)。当HL60细胞与构建体一起孵育然后与抗MYC FITC抗体一起孵育时，对于每个构建体以及单独的CD33构建体均观察到超过99％的结合，表明CD33构建体与细胞表面CD33结合良好，且未被CD3或ULBP缀合物破坏(图14B)。
图15至图17总结了工程化蛋白与HL60细胞、Jurkat细胞和PMBC结合的类似结果。
实施例4-工程化异源二聚体蛋白的细胞毒活性
使用以下通用方案评价工程化异源二聚体蛋白的NK和CD3体外细胞毒活性：
1.使用REAlease CD3微珠试剂盒(Miltenyi)从冷冻的人PBMC中选择CD3+细胞毒性T细胞。之后立即使用Dynabeads人T活化剂CD3/CD28以活化T细胞，持续一周。
2.选择和活化一周后，从T细胞中去除Dynabeads。
3.计数MOLM14-dTomato-荧光素酶细胞(AML细胞系)和T细胞(参见上文)。在RPMI(+20％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)中以1:5(10,000个MOLM14细胞与50,000个T细胞)的比率共同培养。
4.将新鲜解冻的嵌合蛋白添加到每个孔中(例如，各种浓度的抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体)
5.在37℃，5％CO2下培养过夜。
6.旋转板(500rpm，5min)，去除上清液。
7.用200uL FACS缓冲液(PBS加：1％FBS，1mM EDTA)洗涤
8.旋转板(500rpm，5min)，去除上清液
9.重悬于100uL FACS缓冲液中，加入DAPI至最终浓度为0.1ug/mL
10.进行FACS分析；针对单一细胞门控，靶细胞经鉴定为PE+DAPI+(PE通道中MOLM14 AML细胞中的dTomato，DAPI通道中的死细胞)参见图18A。
11.比较T细胞+二聚体组中PE+细胞中的DAPI+细胞％，以含有MOLM14和T细胞(无二聚体)的孔为基线。根据以下公式，将细胞死亡％针对具有共孵育的T细胞和MOLM14细胞而无二聚体治疗的对照组进行归一化：
[(T细胞加二聚体中的死亡)–(单独T细胞中的死亡)]/[100–(单独T细胞中的死亡)]*100
在一项实验中，将MOLM14-dTomato细胞与不同数量的抗CD33-抗CD3异源二聚体(10ng、100ng、1μg和10μg)和5:1T细胞(效应物)，以及对照物(无异源二聚体，无T细胞)和仅10μg异源二聚体孵育和仅5:1T细胞一起孵育，持续24小时。
如图18B所示，与对照物、单独二聚体或单独T细胞相比，针对具有T细胞(效应细胞)的异源二聚体的所有剂量均观察到细胞毒性，并且抗CD33-抗CD3异源二聚体以剂量依赖性方式增强效应T细胞对表达CD33的靶细胞(MOLM14)的杀伤。
在使用上述方案的进一步实验中，在存在三种浓度的抗CD33-抗CD3异源二聚体的情况下，将从PBMC中选择的活化T细胞(CD3+)与表达CD33的CellTrace Violet HL-60靶细胞共孵育16小时。孵育后，用7-AAD活力染料对细胞进行染色，并使用流式细胞术进行分析。参见图19A。根据以下公式，将细胞死亡百分比(％)针对具有共孵育的T细胞和HL-60细胞而无二聚体治疗的对照组进行归一化：
[(T细胞加二聚体中的死亡)–(单独T细胞中的死亡)]/[100–(单独T细胞中的死亡)]*100
如图19B所示，抗CD33-抗CD3异源二聚体以剂量依赖性方式增强效应T细胞对表达CD33的靶细胞(HL60)的杀伤。
如下执行另外的细胞毒性测定：将AML细胞(HL-60)与CD3或CD33单体或与抗CD33-抗CD33异源二聚体在有和无T细胞的情况下共孵育24小时，并使用所描述的利用7AAD的活/死染色和流式细胞术测量活力。图20中的结果显示异源二聚体而非单体增强了效应细胞(T细胞)对AML细胞的细胞毒活性。
如下执行另外的剂量依赖性细胞毒性测定：将AML细胞(HL-60)与指定量的抗CD3-抗CD33异源二聚体(3、30、300或30000ng异源二聚体)在有或无T细胞的情况下共孵育24小时，并使用所描述的利用7AAD的活/死染色和流式细胞术测量活力。
观察到异源二聚体对AML细胞的效应细胞细胞毒活性的剂量依赖性增强。3和3000ng之间的单独抗CD33-抗CD3异源二聚体(无T细胞)的细胞毒性没有明显增加，表明抗CD33-抗CD3异源二聚体本身不显示细胞毒性，细胞毒性作用是通过T细胞功能的增强介导的。参见图21。
如下执行另一剂量依赖性细胞毒性测定：将AML细胞(HL-60)与300ng抗CD33-抗CD3异源二聚体和不同比率的T细胞(效应物)(1:1、2:1、5:1和10:1效应物:靶标)一起孵育24小时，并使用所描述的利用7AAD的活/死染色和流式细胞术测量活力。
使用300ng异源二聚体时，效应物与靶标的比率达到5:1时，观察到细胞毒性呈剂量依赖性增加。在效应物与靶标的比率为5:1与10:1之间时，细胞毒性没有明显增加，可能是因为达到了最大的细胞毒性。参见图22。
所有上述数据表明异源二聚体具有功能活性并增强了T细胞对AML细胞的细胞毒性功能。所述数据还表明，在表现出更高CD33表达的细胞(如MOLM14细胞)中，异源二聚体的细胞毒性增加。参见图18B与图19B。
实施例5-工程化异源二聚体蛋白的体内抗肿瘤活性
使用以下方案测试抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白在小鼠中的体内活性。所有小鼠均接受2x105个MOLM14-dTomato-荧光素酶细胞(AML细胞系)，然后在第2天并遵循以下时间表，一组不接受治疗，一组接受未载荷T细胞(“未载荷T细胞”)，且一组接受载荷抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白(Bite)的T细胞(“载荷T细胞”)。
第2天：1000万个T细胞，有或无100ugr抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白；
第6天和第11天：2000万个T细胞，有或无200ugr抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白；
第15天和第20天：4000万个T细胞，有或无400ugr抗CD33-抗CD3工程化异源二聚体蛋白。
在第7天、第17天和第24天通过生物发光成像(BLI)监测FFluc-dtomato转导的MOLM14的生长。参见图24A。
当观察到一种或多种白血病相关症状(如佝背、体重显著减轻、皮毛褶皱和肢体麻痹)时，撤除小鼠并进行分析。
如图24B和图24C所示，经载荷T细胞治疗的小鼠在第7天和第17天具有较低的肿瘤负荷。
此外，经载荷T细胞治疗的小鼠与2个对照组(未治疗或未载荷T细胞)相比具有更好的存活率。绘制Kaplan-Meier存活图，起始日期为注射MOLM14的日期，结束日期为死亡/撤除的日期。参见图24D。
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序列表
<110> 纽约市哥伦比亚大学理事会(The Trustees of Columbia University inthe City of New York)
<120> 多功能性正交蛋白嵌合体
<130> 01001/008810-WO0
<140> 随同提交
<141> 2021-07-06
<150> 63/047,938
<151> 2020-07-03
<150> 63/050,346
<151> 2020-07-10
<150> 63/145,083
<151> 2021-02-03
<150> 63/189,412
<151> 2021-05-17
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化蛋白
<400> 1
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Val Phe Phe Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Ile Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr
100 105 110
Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp
195 200 205
Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp
210 215 220
Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
225 230 235 240
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe
245 250 255
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Ser
260 265 270
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Arg Gln Arg Lys Ile Ile Glu Arg
290 295 300
Ala Gln Glu Ile His Arg Arg Gln Gln Glu Ile Leu Glu Glu Leu Glu
305 310 315 320
Arg Ile Ile Arg Lys Pro Gly Ser Ser Glu Glu Ala Met Lys Arg Met
325 330 335
Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Leu Arg Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu
340 345 350
Leu Ser Glu Glu Ser Ala Gln Leu Leu Tyr Glu Gln Arg Glu Arg Lys
355 360 365
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化蛋白
<400> 3
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1 5 10 15
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35 40 45
Val Phe Phe Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Ile Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr
100 105 110
Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala
145 150 155 160
Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
165 170 175
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro
180 185 190
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp
195 200 205
Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp
210 215 220
Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
225 230 235 240
Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe
245 250 255
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Ser
260 265 270
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Arg Gln Arg Lys Ile Ile Glu Arg
290 295 300
Ala Gln Glu Ile His Arg Arg Gln Gln Glu Ile Leu Glu Glu Leu Glu
305 310 315 320
Arg Ile Ile Arg Lys Pro Gly Ser Ser Glu Glu Ala Met Lys Arg Met
325 330 335
Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Leu Arg Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu
340 345 350
Leu Ser Glu Glu Ser Ala Gln Leu Leu Tyr Glu Gln Arg Glu Arg Lys
355 360 365
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
385 390 395 400
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
405 410 415
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
420 425 430
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
435 440 445
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
450 455 460
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
465 470 475 480
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
485 490 495
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
500 505 510
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu
515 520 525
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
530 535 540
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
545 550 555 560
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
565 570 575
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
580 585 590
Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His
595 600 605
His
<210> 5
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化蛋白
<400> 5
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Trp Val Asp Thr His Cys Leu Cys Tyr Asp Phe Ile
20 25 30
Ile Thr Pro Lys Ser Arg Pro Glu Pro Gln Trp Cys Glu Val Gln Gly
35 40 45
Leu Val Asp Glu Arg Pro Phe Leu His Tyr Asp Cys Val Asn His Lys
50 55 60
Ala Lys Ala Phe Ala Ser Leu Gly Lys Lys Val Asn Val Thr Lys Thr
65 70 75 80
Trp Glu Glu Gln Thr Glu Thr Leu Arg Asp Val Val Asp Phe Leu Lys
85 90 95
Gly Gln Leu Leu Asp Ile Gln Val Glu Asn Leu Ile Pro Ile Glu Pro
100 105 110
Leu Thr Leu Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu His Glu Ala His Gly His
115 120 125
Gly Arg Gly Ser Trp Gln Phe Leu Phe Asn Gly Gln Lys Phe Leu Leu
130 135 140
Phe Asp Ser Asn Asn Arg Lys Trp Thr Ala Leu His Pro Gly Ala Lys
145 150 155 160
Lys Met Thr Glu Lys Trp Glu Lys Asn Arg Asp Val Thr Met Phe Phe
165 170 175
Gln Lys Ile Ser Leu Gly Asp Cys Lys Met Trp Leu Glu Glu Phe Leu
180 185 190
Met Tyr Trp Glu Gln Met Leu Asp Pro Thr Lys Pro Pro Ser Leu Ala
195 200 205
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Thr Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu Ala Glu Arg Ala His Arg Glu
225 230 235 240
Gln Lys Glu Ile Ile Lys Lys Ala Gln Glu Leu His Arg Arg Leu Glu
245 250 255
Glu Ile Val Arg Gln Ser Gly Ser Ser Glu Glu Ala Lys Lys Glu Ala
260 265 270
Lys Lys Ile Leu Glu Glu Ile Arg Glu Leu Ser Lys Arg Ser Leu Glu
275 280 285
Leu Leu Arg Glu Ile Leu Tyr Leu Ser Gln Glu Gln Lys Gly Ser Leu
290 295 300
Val Pro Arg Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala
305 310 315 320
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
325 330 335
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
340 345 350
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
355 360 365
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
370 375 380
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp
385 390 395 400
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
405 410 415
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg
420 425 430
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
435 440 445
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
450 455 460
Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
465 470 475 480
Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
485 490 495
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
500 505 510
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
515 520 525
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His
530 535 540
His His His His His
545
<210> 6
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 工程化蛋白
<400> 6
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala
20 25 30
Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
65 70 75 80
Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp
145 150 155 160
Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Gly
165 170 175
Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp
195 200 205
Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp
225 230 235 240
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe
245 250 255
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu
275 280 285
Ala Glu Arg Ala His Arg Glu Gln Lys Glu Ile Ile Lys Lys Ala Gln
290 295 300
Glu Leu His Arg Arg Leu Glu Glu Ile Val Arg Gln Ser Gly Ser Ser
305 310 315 320
Glu Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys Lys Ile Leu Glu Glu Ile Arg Glu
325 330 335
Leu Ser Lys Arg Ser Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ile Leu Tyr Leu Ser
340 345 350
Gln Glu Gln Lys Gly Ser Leu Val Pro Arg Glu Arg Lys Cys Cys Val
355 360 365
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
370 375 380
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
385 390 395 400
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
405 410 415
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
420 425 430
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
435 440 445
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
450 455 460
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
465 470 475 480
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
485 490 495
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
500 505 510
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
515 520 525
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
530 535 540
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
545 550 555 560
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
565 570 575
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Tyr
580 585 590
Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His His His
595 600
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 10
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Ser Ala
115 120
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Gly Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Arg Gln Arg Lys Ile Ile Glu Arg
1 5 10 15
Ala Gln Glu Ile His Arg Arg Gln Gln Glu Ile Leu Glu Glu Leu Glu
20 25 30
Arg Ile Ile Arg Lys Pro Gly Ser Ser Glu Glu Ala Met Lys Arg Met
35 40 45
Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Leu Arg Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu
50 55 60
Leu Ser Glu Glu Ser Ala Gln Leu Leu Tyr Glu Gln Arg
65 70 75
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 15
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Trp Val Asp Thr His Cys Leu Cys Tyr Asp Phe Ile Ile Thr Pro Lys
1 5 10 15
Ser Arg Pro Glu Pro Gln Trp Cys Glu Val Gln Gly Leu Val Asp Glu
20 25 30
Arg Pro Phe Leu His Tyr Asp Cys Val Asn His Lys Ala Lys Ala Phe
35 40 45
Ala Ser Leu Gly Lys Lys Val Asn Val Thr Lys Thr Trp Glu Glu Gln
50 55 60
Thr Glu Thr Leu Arg Asp Val Val Asp Phe Leu Lys Gly Gln Leu Leu
65 70 75 80
Asp Ile Gln Val Glu Asn Leu Ile Pro Ile Glu Pro Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ala Arg Met Ser Cys Glu His Glu Ala His Gly His Gly Arg Gly Ser
100 105 110
Trp Gln Phe Leu Phe Asn Gly Gln Lys Phe Leu Leu Phe Asp Ser Asn
115 120 125
Asn Arg Lys Trp Thr Ala Leu His Pro Gly Ala Lys Lys Met Thr Glu
130 135 140
Lys Trp Glu Lys Asn Arg Asp Val Thr Met Phe Phe Gln Lys Ile Ser
145 150 155 160
Leu Gly Asp Cys Lys Met Trp Leu Glu Glu Phe Leu Met Tyr Trp Glu
165 170 175
Gln Met Leu Asp Pro Thr Lys Pro Pro Ser Leu Ala Pro Gly
180 185 190
<210> 16
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Thr Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu Ala Glu Arg Ala His Arg Glu Gln
1 5 10 15
Lys Glu Ile Ile Lys Lys Ala Gln Glu Leu His Arg Arg Leu Glu Glu
20 25 30
Ile Val Arg Gln Ser Gly Ser Ser Glu Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys
35 40 45
Lys Ile Leu Glu Glu Ile Arg Glu Leu Ser Lys Arg Ser Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Arg Glu Ile Leu Tyr Leu Ser Gln Glu Gln Lys Gly Ser Leu Val
65 70 75 80
Pro Arg
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr
50 55 60
Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
85 90 95
Leu Glu Leu Lys
100
<210> 19
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
His His His His His His
1 5
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 23
<211> 1188
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
gccccatgta cagaatgcag ctgctgagct gtatcgccct gtctctggcc ctggtcacca 60
actctgagat cgtgctgaca cagagccctg gcagcctggc tgtttctcct ggcgagcgag 120
tgaccatgag ctgcaagtct agccagagcg tgttcttcag cagcagccag aagaactacc 180
tggcctggta tcagcagatc cccggacagt ctccccggct gctgatctat tgggccagca 240
caagagaaag cggcgtgccc gatagattca caggctctgg cagcggcacc gacttcaccc 300
tgacaatcag tagcgtgcag cccgaggacc tggccatcta ctactgtcac cagtacctga 360
gcagccggac ctttggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gagaggcagc acaagcggca 420
gcggaaagcc tggatctggc gagggctcta caaaaggcca ggttcagctg caacagcctg 480
gcgccgaagt tgtgaaacct ggcgcctctg tgaagatgtc ctgcaaggcc agcggctaca 540
ccttcaccag ctactacatc cactggatca agcagacccc aggccaaggc ctggaatggg 600
tcggagtgat ctaccccggc aacgacgaca tcagctacaa ccagaagttc cagggcaaag 660
ccacactgac cgccgacaag tccagcacca cagcctacat gcagctgtcc agcctgacca 720
gcgaagatag cgccgtgtac tactgcgcca gagaagtgcg gctgcggtac tttgatgtgt 780
ggggccaggg aaccaccgtg accgtttcta gctcatcttc tgctggcggc ggaggaagcg 840
gaggcggagg ttctggtggt ggtggctctg gaacaaaaga ggacatcctg gaacggcaga 900
ggaagatcat cgagcgggcc caagagatcc acagacggca gcaagagatt ctggaagaac 960
tggaacggat catcagaaag cccggcagca gcgaagaggc catgaagaga atgctgaagc 1020
tgctggaaga gagcctgaga ctgctgaaag aactgctgga actgagcgag gaaagcgccc 1080
agctgctgta cgagcagagg gaaagaaagt gctgcgtgga atgccctcct tgtcctgagc 1140
agaagctgat ctccgaagag gacctgcach caccatcacc accactga 1188
<210> 24
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
gccaccatgt acagaatgca gctgctgagc tgtatcgccc tgtctctggc cctggtcacc 60
aatagctggg tcgacaccca ctgcctgtgc tacgacttca tcatcacccc taagagcaga 120
cccgagcctc agtggtgcga agtgcaagga ctggtggacg agaggccctt cctgcactac 180
gattgcgtga accacaaggc caaggccttt gccagcctgg gcaagaaagt gaacgtgacc 240
aagacctggg aagaacagac cgagacactg cgcgacgtgg tggattttct gaagggccag 300
ctgctggaca tccaggtgga aaatctgatc cccatcgagc ccctgacact gcaggccaga 360
atgtcttgtg aacacgaggc ccacggccac ggcagaggat cttggcagtt cctgttcaac 420
ggccagaagt tcctgctgtt cgacagcaac aaccggaagt ggaccgctct gcatcctggc 480
gccaagaaaa tgaccgagaa gtgggagaag aaccgggacg tgaccatgtt cttccagaag 540
atctccctgg gcgactgcaa gatgtggctg gaagagttcc tgatgtactg ggagcagatg 600
ctggacccca ccaagcctcc atctcttgca cctggcggag gcggaggatc tggtggcgga 660
ggaagcggtg gcggcggatc tacagaaaag cggctgctgg aagaagccga gagagcccac 720
agagagcaga aagagatcat caagaaggcc caagagctgc accgcagact ggaagagatt 780
gtgcggcaga gcggcagctc tgaggaagcc aagaaagagg ccaagaagat cctcgaagag 840
atccgcgagc tgagcaagcg gagtctggaa ctgctgagag agatcctgta cctgagccaa 900
gaacagaaag gcagcctggt gcctagaggc ggcggtggaa gtggcggtgg tggatcaggc 960
ggcggaggct ctgagagaaa gtgctgcgtt gagtgccctc cttgtcctga ctacaaggac 1020
gacgacgaca agcaccacca ccatcaccac tga 1053
<210> 25
<211> 1121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
gccaccatgt acagaatgca gctgctgagc tgtatcgccc tgtctctggc cctggtcacc 60
aacagcgata tcaagctgca gcagtctggc gccgaactgg ctagacctgg cgcctctgtg 120
aagatgagct gcaagaccag cggctacacc ttcaccagat acaccatgca ctgggtcaag 180
cagaggccag gccaaggact gggactcgag tggatcggct acatcaaccc csagcagagg 240
ctacaccaac tacaaccaga agttcaagga caaggccaca ctgacctacc gacaagagca 300
gcagcacagc ctacatgcag ctgagcagcc tgaccagcga agatagcgcc gtgtactact 360
gcgcccggta ctacgacgat cactactgcc tggattactg gggccagggc acaaccctga 420
cagtgtcatc tgtggaaggc ggctctggtg gcagcggagg ttctggtgga tctggcggag 480
tggacgacat ccagctgaca cagagccctg ccatcatgtc tgctagccct ggcggcaaag 540
tgaccatgac ctgtagagcc agcagcagcg tgtcctacat gaactggtat cagcagaagt 600
ccggcacaag ccccaagcgg tggatctacg atacaagcaa ggtggccagc ggcgtgccct 660
acagattttc tggctctggc agcggcacca gctactccct gacaatcagc agcatggaag 720
ccgaggatgc cgccacctac tactgccagc agtggtccag caatcccctg acatttggag 780
ccggcaccaa gctggaactg aaaggcggcg gaggaagcgg aggcggagga tccggtggtg 840
gcggatctac agagaagaga ctgctggaag aggccgagag agcccacaga gagcagaaag 900
agatcatcaa gaaggcccaa gagctgcacc gcagactgga agagattgtg cggcagagcg 960
gcagctctga ggaagccaag aaagaggcca agaagatcct cgaagagatc cgcgagctga 1020
gcaagcggag tctggaactg ctgagagaga tcctgtacct gagccaagaa cagaaaggca 1080
gcctggtgcc tcgggactac aaggacgacg acgacaagtg a 1121
<210> 26
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
20 25 30
Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
85 90 95
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu
145 150 155 160
Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg
165 170 175
Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
195 200 205
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
210 215 220
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu
275 280 285
Ala Glu Arg Ala His Arg Glu Gln Lys Glu Ile Ile Lys Lys Ala Gln
290 295 300
Glu Leu His Arg Arg Leu Glu Glu Ile Val Arg Gln Ser Gly Ser Ser
305 310 315 320
Glu Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys Lys Ile Leu Glu Glu Ile Arg Glu
325 330 335
Leu Ser Lys Arg Ser Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ile Leu Tyr Leu Ser
340 345 350
Gln Glu Gln Lys Gly Ser Leu Val Pro Arg Glu Arg Lys Cys Cys Val
355 360 365
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His
370 375 380
His His His His
385
<210> 27
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
20 25 30
Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
85 90 95
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu
145 150 155 160
Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg
165 170 175
Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn
195 200 205
Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly
210 215 220
Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala
225 230 235 240
Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe
245 250 255
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu
275 280 285
Ala Glu Arg Ala His Arg Glu Gln Lys Glu Ile Ile Lys Lys Ala Gln
290 295 300
Glu Leu His Arg Arg Leu Glu Glu Ile Val Arg Gln Ser Gly Ser Ser
305 310 315 320
Glu Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys Lys Ile Leu Glu Glu Ile Arg Glu
325 330 335
Leu Ser Lys Arg Ser Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ile Leu Tyr Leu Ser
340 345 350
Gln Glu Gln Lys Gly Ser Leu Val Pro Arg Glu Arg Lys Cys Cys Val
355 360 365
Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
370 375 380
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
385 390 395 400
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
405 410 415
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
420 425 430
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
435 440 445
Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
450 455 460
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
465 470 475 480
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
485 490 495
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
500 505 510
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
515 520 525
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
530 535 540
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
545 550 555 560
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
565 570 575
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Tyr
580 585 590
Lys Asp Asp Asp Lys His His His His His His
595 600
<210> 28
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Arg
115
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Gly
100 105
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20

Claims (24)

1.一种工程化异源二聚体蛋白，所述工程化异源二聚体蛋白包含：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和
(b)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域；并且
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述共价二聚化结构域共价结合。
2.如权利要求1所述的工程化异源二聚体蛋白，其中表达于NK细胞上的所述分子是NKG2D，并且其中结合表达于NK细胞上的分子的所述多肽是ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA、MICB，或它们的突变体或片段。
3.如权利要求2所述的工程化异源二聚体蛋白，其中结合表达于NK细胞上的分子的所述多肽是ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5、ULBP6、MICA或MICB的胞外结构域。
4.如权利要求1所述的工程化异源二聚体蛋白，其中表达于NK细胞上的所述分子是CD16，并且其中结合表达于T细胞上的分子的多肽是CD16的单克隆抗体。
5.一种工程化异源二聚体蛋白，所述工程化异源二聚体蛋白包含：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第一共价二聚化结构域；和
(b)第二多肽，所述第二多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域和第二共价二聚化结构域；并且
其中所述第一多肽和所述第二多肽通过所述共价二聚化结构域共价结合。
6.如权利要求5所述的工程化异源二聚体蛋白，其中表达于T细胞上的所述分子是CD3，并且其中结合表达于T细胞上的分子的所述多肽是CD3的单克隆抗体。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工程化异源二聚体蛋白，其中所述第一二聚化结构域和/或所述第二二聚化结构域包含IgG2铰链结构域。
8.如权利要求7所述的工程化异源二聚体蛋白，其中所述第一二聚化结构域和/或所述第二二聚化结构域还包含IgG2 Fc结构域。
9.如权利要求1-8中任一项所述的工程化异源二聚体蛋白，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的所述非天然存在的多肽结构域分别包含6DMPa和6DMPb。
10.如权利要求1-8中任一项所述的工程化异源二聚体蛋白，其中所述第一多肽和所述第二多肽中的包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的所述非天然存在的多肽结构域分别包含6DMPb和6DMPa。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化异源二聚体蛋白，其中所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化异源二聚体蛋白，其中所述抗原结合片段是单链抗体片段(scFv)。
13.一种组合物，所述组合物包含至少一种编码权利要求1-12所述的工程化异源二聚体蛋白的载体。
14.一种药盒，所述药盒包含权利要求13所述的组合物。
15.一种治疗受试者的造血系统恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求13所述的组合物。
16.一种工程化异源三聚体蛋白，所述工程化异源三聚体蛋白包含：
(a)第一多肽，所述第一多肽包含结合表达于T细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(a1)和第一共价二聚化结构域；
(b)第二多肽，所述第二多肽包含结合谱系特异性细胞表面抗原的抗原结合片段、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(b1)和第二共价二聚化结构域；
(c)第三多肽，所述第三多肽包含结合表达于自然杀伤(NK)细胞上的分子的多肽、包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域(c1)和第三共价二聚化结构域；和
(d)第四多肽，所述第四多肽包含三个包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的非天然存在的多肽结构域，其中每个结构域是a1、b1和c1的结合结构域(a2、b2和c2)，以及第四、第五和第六共价二聚化结构域；
其中所述第一多肽和所述第二多肽和所述第三多肽和所述第四多肽通过所述共价二聚化结构域共价结合。
17.如权利要求16所述的工程化异源三聚体蛋白，其中表达于T细胞上的所述分子是CD3，并且其中结合表达于T细胞上的分子的所述多肽是CD3的单克隆抗体，其中所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33，并且其中表达于NK细胞上的所述分子是NKG2D。
18.如权利要求16所述的工程化异源三聚体蛋白，其中表达于T细胞上的所述分子是CD3，并且其中结合表达于T细胞上的分子的所述多肽是CD3的单克隆抗体，其中所述谱系特异性细胞表面抗原是CD33，并且其中表达于NK细胞上的所述分子是CD16，并且其中结合表达于NK细胞上的分子的所述多肽是CD16的单克隆抗体。
19.如权利要求16-18中任一项所述的工程化异源三聚体蛋白，其中所述第一二聚化结构域和/或所述第二二聚化结构域和/或所述第三二聚化结构域和/或所述第四二聚化结构域和/或所述第五二聚化结构域和/或所述第六二聚化结构域包含IgG2铰链结构域。
20.如权利要求19所述的工程化异源三聚体蛋白，其中所述第一二聚化结构域和/或所述第二二聚化结构域和/或所述第三二聚化结构域和/或所述第四二聚化结构域和/或所述第五二聚化结构域和/或所述第六二聚化结构域还包含IgG2 Fc结构域。
21.如权利要求16-20中任一项所述的工程化异源三聚体蛋白，其中所述第一多肽和所述第二多肽和所述第三多肽和所述第四多肽中的包含由氨基酸接头连接的1-5个α螺旋的所述非天然存在的多肽结构域选自由6DMPa和6DMPb组成的组。
22.一种组合物，所述组合物包含至少一种编码权利要求16-21所述的工程化异源三聚体蛋白的载体。
23.一种药盒，所述药盒包含权利要求22所述的组合物。
24.一种治疗受试者的造血系统恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求22所述的组合物。
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