CN116236614A

CN116236614A - 一种催化释放CO的TiO2纳米管材料、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN116236614A
Application number: CN202211570724.0A
Authority: CN
Inventors: 潘长江; 杨敏慧; 马文富; 张秋阳; 陈洁
Original assignee: Huaiyin Institute of Technology
Current assignee: Huaiyin Institute of Technology
Priority date: 2022-12-08
Filing date: 2022-12-08
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2042-12-08
Also published as: CN116236614B

Abstract

本发明涉及生物医用纳米材料与植入器械领域，公开了一种催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法及其应用，通过在纯钛表面制备规整的二氧化钛纳米管阵列，然后在自组装氨基硅烷的基础上在纳米管表面共价接枝海藻酸钠/羧甲基壳聚糖复合高分子(SA/CS涂层)，最后在材料表面接枝CO释放分子（CORM‑401），从而获得催化释放CO的TiO₂纳米管材料。本发明制备的催化释放CO的TiO₂纳米管材料不仅呈现出优异的亲水性能，而且在催化释放CO的情况下，释放的CO气体分子不仅可以增强材料的抗凝血性能，还能促进血管内皮细胞的粘附、生长以及功能表达，在血液接触等植入性生物材料或医疗器械的表面改性中获得应用。

Description

一种催化释放CO的TiO2纳米管材料、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用纳米材料与植入器械领域，具体涉及一种催化释放CO的TiO₂纳米管材料、其制备方法及应用。

背景技术

钛及其合金具有低弹性模量、较好的耐生理腐蚀性和高比强度等优异的物理化学性能，在血液接触医疗器械中（如、血管支架、心脏瓣膜、血栓滤器等）具有广泛的应用。钛长期置于人体内依然能保持其化学稳定性，同时也基本不会引起人体的免疫排斥反应，但长期或永久留置于人体内时，其较差的血液相容性容易诱发血栓形成而导致植入失败。此外，对血管内植入材料或器械，也经常由于内皮化延迟愈合导致损伤的血管不易修复而引发一系列的临床副反应。尽管采用口服抗凝剂的方法可以预防因材料血液相容性差导致的人体内血栓，但这种方法通常需要患者终生服用抗凝剂并且会增加患者出血风险，并且并不能有效促进损伤内皮的快速愈合。由于材料植入人体后，人体血液和内皮细胞(ECs)首先与材料的表面接触，因此，通过表面改性提高材料的抗凝血性能并促进损伤血管内皮的修复再生，对钛基血液接触材料的临床应用具有十分重要的意义。

研究表明，材料的生物相容性与其表面拓扑结构、表面润湿性以及表面生物活性分子等存在很大关系。一般来说，具有特定的空隙几何形状、亲水性较好的材料表面能够诱导细胞的黏附与增殖，同时也呈现出较好的血液相容性。阳极氧化是一种工艺简单、成本低廉的表面改性技术。对钛进行阳极氧化处理可以原位得到具有独特微纳结构的二氧化钛纳米管阵列（TNT）。TNT呈现出多孔、粗糙、亲水性高的形貌特性，有利于细胞的黏附与增殖以及血液相容性的提高。另外，TNT独特的纳米管结构以及尺寸可控的孔隙率为负载生物活性分子或药物以进一步增强其表面生物活性提供了很好的平台。如，通过多巴胺共沉积将庆大霉素负载到TNT表面，药物的释放时间可以长达30天以上，并起到有效抗菌进而改善生物相容性的作用。为了预防炎症以及炎症可能带来的并发症，在TNT表面螯合铜、锌、银等金属离子是有效的方法之一。另外，在TNT表面共价接枝海藻酸钠（SA）、羧甲基壳聚糖（CS）等具有很好生物活性的物质，可以有效改善TNT表面的生物相容性。

近年来的研究发现，CO在心血管疾病治疗方面表现出巨大的潜力，CO作为一种内源性气体信号分子，可以通过活化可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)增加环磷酸鸟苷(cGMP)水平来抑制血栓形成和内膜增生，从而有助于血管内皮再生。另外，CO还可以抑制由HO-1（血红素氧合酶-1）缺乏导致的内皮损伤和单核细胞的聚集以及血管平滑肌细胞(SMCs)的增殖和迁移，因此，CO不仅本身具有促进血管内皮修复与再生的作用，而且还表现出良好的抗凝血性能。然而，直接吸入的CO气体可能引发潜在的毒性反应。研究发现，CO能够与一些过渡金属元素（如Mn, Ru）通过特殊的配位键形成CO释放分子（CORMs）。但是，由于缺乏足够的还原剂，CORMs在血液环境中的CO释放量很低，对心血管微环境来说，研究表明，含有巯基的半胱氨酸可以作为还原剂催化CORMs释放CO，而人体细胞内含有大量的巯基化合物，这些化合物由于在人体血液中的浓度很低而无法催化CORMs释放CO，因此CORMs应用于心血管材料时在血液中具有足够的稳定性，不会引发毒性反应，但在细胞生理环境中可以催化释放CO，从而促进材料表面的内皮修复。由此可见，将CORMs引入到钛合金表面，利用体内血管ECs生长的生理微环境和植入物周围组织的细胞生理微环境可催化释放CO，提高材料的抗凝血性能和促进血管内膜的修复再生。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种催化释放CO的TiO₂纳米管材料、其制备方法及应用，在阳极氧化制得的TiO₂纳米管(TNT)的基础上，首先通过自组装氨基硅烷在纳米管表面引入氨基基团，进一步原位同时固定海藻酸钠/壳聚糖的复合物，最后将CO释放分子（CORM401）固定在材料表面，从而构建一种催化释放CO的TiO₂纳米管材料。本发明制备的催化释放CO的TiO₂纳米管材料不仅呈现出优异的亲水性能，而且在催化释放CO的情况下，释放的CO气体分子不仅可以增强材料的抗凝血性能，还能促进血管内皮细胞的粘附、生长以及功能表达，在血液接触等植入性生物材料或医疗器械的表面改性中获得应用。

技术方案：本发明提供了一种催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、通过阳极氧化法在钛表面原位制备TiO₂纳米管；

步骤二、对步骤一所得材料物进行硅烷化处理，得硅烷改性TiO₂纳米管；

步骤三、在所述硅烷改性TiO₂纳米管表面共价接枝海藻酸钠/羧甲基壳聚糖复合高分子；

步骤四、在步骤三所得的纳米管表面共价接枝CO释放分子，得催化释放CO的TiO₂纳米管材料。

进一步地，步骤四是将步骤三所得的纳米管浸没在CORM-401溶液中，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应2~5小时后清洗、干燥，得催化释放CO的TiO₂纳米管材料。

优选地，所述CORM-401溶液浓度为0.05-1mg/mL；

和/或，所述碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3~6：1。

进一步地，步骤一是将超声清洗并干燥后的钛片放入含有0.2~1%wt NH₄F、2~10mL去离子水和200~300mL乙二醇溶液的电解液中阳极氧化0.5~2小时，将阳极氧化后的所得物用无水乙醇和去离子水超声清洗、吹干后在空气中450℃高温退火2~4小时，得所述TiO₂纳米管。

进一步地，步骤二是将所述步骤一所得材料物浸入3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中，振荡反应10~24小时后，60~100℃加热8~12小时，将加热处理后的所得物用无水乙醇清洗、吹干，得所述硅烷改性TiO₂纳米管；

进一步地，所述3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液浓度为5~15mM。

进一步地，步骤三是将所述硅烷改性TiO₂纳米管浸没到海藻酸钠和羧甲基壳聚糖的混合溶液中，再在所述混合溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应10~14小时后，将所得纳米管用去离子水清洗、吹干。

优选地，所述海藻酸钠溶液浓度为1~10mg/mL；

和/或，所述羧甲基壳聚糖溶液浓度均为1~10mg/mL；

和/或，所述海藻酸钠溶液与所述羧甲基壳聚糖溶液的体积比为1：1；

和/或，所述碳二亚胺与所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3~6：1。

本发明还提供一种如上述任一项所述的方法制备的催化释放CO的TiO₂纳米管材料在制备催化诱导CO释放的人工血管移植物材料中的应用。

本发明还提供一种如上述任一项所述的方法制备的催化释放CO的TiO₂纳米管材料在制备催化诱导CO释放的血管支架涂层中的应用。

本发明中催化释放CO的TiO₂纳米管材料的理论基础可由如下过程表示：

本发明中，CO在心血管疾病治疗中的巨大潜力是已被理论和实验证实了的，CO不仅本身具有促进血管内皮修复与再生的作用，而且还表现出良好的抗凝血性能，但直接吸入CO由于可以与血红蛋白发生强烈结合而产生潜在的毒性作用。研究发现，CO能够与一些过渡金属元素（如Mn, Ru）通过特殊的配位键形成CO释放分子（CORMs），且含有巯基的半胱氨酸可以作为还原剂催化CORMs释放CO。而人体细胞内含有大量的巯基化合物，这些巯基化合物在人体细胞内大量存在，在人体血液中浓度却很低，这可以保证当CORMs应用于心血管材料时，CORMs可以在细胞生理环境中被巯基化合物催化释放CO，从而促进材料表面的内皮修复，而在血液中，却因为缺乏足够的巯基化合物作为还原剂而表现出足够的稳定性，不会被催化释放出CO，引发潜在的毒性反应。由此可见，将CORMs引入到钛合金表面，利用体内血管ECs生长的生理微环境和植入物周围组织的细胞生理微环境可催化释放CO，提高材料的抗凝血性能和促进血管内膜的修复再生。

有益效果：和现有技术相比，本发明具有以下显著优势：

（1）采用的TiO₂纳米管具有很强的亲水性，采用的3-氨丙基三甲氧基硅烷是很好的交联耦合剂，采用的海藻酸钠和羧甲基壳聚糖具有良好的抗凝血性能和抑菌作用，采用的CORM-401在加入半胱氨酸后可催化释放出CO，降低血小板的黏附与活化，改善材料溶血率，促进内皮细胞的增殖与粘附以及VEGF与NO的表达方面表现出更好的效果。

（2）本发明的技术路线反应条件温和，材料来源易得，反应不需要特殊设备，表面固定生物活性分子以及接枝CORMs在常温下即可进行，因此，工艺成本较低，可控制性强，效果显著。并且本发明采用的物质都具有良好的生物相容性，因此作为纳米材料或者纳米药物不会引发细胞毒性，具有良好的生物安全性和生物相容性。

（3）本发明所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料应用广泛，具有优异的抗凝血性能和释放CO的功能，不仅可以用于人工血管移植物材料的制备，也可以应用于血管内植入器械(如血管支架、心脏起搏器)的表面涂层制备，用于提高器械的抗凝血性能和促内皮修复性能。

附图说明

图1为本发明中电镜扫描下TNT的表面特征；

图2为本发明中电镜扫描下TNTA的表面特征；

图3为本发明中电镜扫描下TNTA-A的表面特征；

图4为本发明中电镜扫描下TNTA-SC的表面特征；

图5为本发明中电镜扫描下TNTA-CO的表面特征；

图6为本发明中TNTA表面主要元素的XPS高分辨率光谱图；

图7为本发明中TNTA-A表面主要元素的XPS高分辨率光谱图；

图8为本发明中TNTA-SC表面主要元素的XPS高分辨率光谱图；

图9为本发明中TNTA-CO表面主要元素的XPS高分辨率光谱图；

图10为本发明中TNTA-CO的CO释放含量图；

图11为本发明中电镜扫描下Ti的血小板黏附图；

图12为本发明中电镜扫描下TNT的血小板黏附图；

图13为本发明中电镜扫描下TNTA的血小板黏附图；

图14为本发明中电镜扫描下TNTA-A的血小板黏附图；

图15为本发明中电镜扫描下TNTA-SC的血小板黏附图；

图16为本发明中电镜扫描下TNTA-CO的血小板黏附图；

图17为本发明中电镜扫描下TNTA-C的血小板黏附图；

图18为本发明中荧光显微镜下Ti第一天（左）及第三天（右）的细胞黏附图；

图19为本发明中荧光显微镜下TNT第一天（左）及第三天（右）的细胞黏附图；

图20为本发明中荧光显微镜下TNTA第一天（左）及第三天（右）的细胞黏附图；

图21为本发明中荧光显微镜下TNTA-A第一天（左）及第三天（右）的细胞黏附图；

图22为本发明中荧光显微镜下TNTA-SC第一天（左）及第三天（右）的细胞黏附图；

图23为本发明中荧光显微镜下TNTA-CO第一天（左）及第三天（右）的细胞黏附图；

图24为本发明中荧光显微镜下TNTA-C第一天（左）及第三天（右）的细胞黏附图；

图25为本发明中实施方式1催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细的介绍。

实施方式1：

（1）纯钛箔（TA2，0.2毫米厚，纯度99.6%）首先被切割成70毫米×50毫米的钛片，然后用丙酮和无水乙醇中超声清洗10分钟，去离子水冲洗并在空气中吹干，记为Ti。将清洗后的钛片浸入250 mL电解质（含有0.5%wt NH₄F、5mL去离子水和245mL乙二醇溶液）中，在45 V下用钛片作为阳极进行1h氧化，样品用无水乙醇和去离子水充分清洗，干燥后命名为TNT。为了将阳极氧化后的TiO₂纳米管转变为锐钛矿型结构，将TNT在450℃空气中处理3小时，记为TNTA。

（2）首先将清洗干净的TNTA浸入50mL浓度为10mM的3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）的乙醇溶液中，振荡反应12小时后，将样品取出放入到60℃烘箱中加热处理12小时，之后用无水乙醇清洗并吹干，得到3-氨丙基三甲氧基硅烷改性的TiO₂纳米管，记为TNTA-A。

（3）将TNTA-A浸没到海藻酸钠（SA）（25mL，10mg/mL）和壳聚糖（CS）（25mL，10mg/mL）的混合溶液中，并且加入N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)0.5751g和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)0.1150g，搅拌反应14小时，用去离子水冲洗干净并在室温下吹干，得到共价接枝了海藻酸钠/羧甲基壳聚糖复合高分子的TiO₂纳米管，命名为TNTA-SC。

（4）为了接枝CORMs（CORM-401），将TNTA-SC浸没到20mL浓度为0.1mg/mL的CORM-401溶液中，加入EDC0.2300g和NHS0.0460g，在常温下反应4小时后，用去离子水清洗并在室温吹干，得到催化释放CO的TiO₂纳米管材料，记为TNTA-CO。

本实施方式的制备方法如图25所示。

实施方式2：

（3）将TNTA-A浸没到海藻酸钠（SA）（25mL，10mg/mL）和壳聚糖（CS）（25mL，10mg/mL）的混合溶液中，并且加入 N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.5751g和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)0.1150g，搅拌反应14小时，用去离子水冲洗干净并在室温下吹干，得到共价接枝了海藻酸钠/羧甲基壳聚糖复合高分子的3-氨丙基三甲氧基硅烷改性的TiO₂纳米管，命名为TNTA-SC。

实施方式3：

（4）为了接枝CORMs（CORM-401），将TNTA-SC浸没到20mL浓度为1mg/mL的CORM-401溶液中，加入EDC0.2300g和NHS0.0460g，在常温下反应4小时后，用去离子水清洗并在室温吹干，得到催化释放CO的TiO₂纳米管材料，记为TNTA-CO。

将实施方式1获得的TNT、TNTA、TNTA-A、TNTA-SC、TNTA-CO通过扫描电子显微镜（SEM，FEI Quanta 250）观察样品的表面形貌：

图1-5显示了经不同表面改性处理的二氧化钛纳米管阵列的SEM图像。可以看出，阳极氧化在钛表面获得了规整的纳米管阵列结构。经过不同的表面改性处理，表面纳米管结构仍然能保持其完整性。阳极氧化后形成的纳米管阵列内径在60-80nm之间、外径约为105nm，如图1。450℃退火处理后，纳米管直径向外扩展约5nm，同时伴随着管壁变厚，如图2。这是因为450℃退火处理使阳极氧化后无定形的纳米管转变成锐钛矿结构，锐钛矿晶粒的尺寸在其形成阶段会随着温度的升高而增大从而引发纳米管尺寸的扩展。与TNTA相比，固定APTMS使得纳米管阵列表面更为粗糙、内径减少3-5nm，如图3，表明氨基硅烷自组装部分填充了纳米管内壁而减小了纳米管的内径尺寸。而在表面共价接枝SA/CS后，壁厚持续增加，内径继续减小约5nm，部分纳米管被封孔，如图4，表明SA/CS复合物在碳二亚胺偶联剂的作用下成功固定在硅烷改性的纳米管阵列中。最后在表面接枝CORM-401后，尽管纳米管内径尺寸变化不大，但表面粗糙度进一步增加，如图5。固定的CORM-401在细胞生理环境下可以催化释放CO气体信号分子，从而增强材料的抗凝血性能以及促进内皮细胞的粘附与增殖。

将实施方式1获得的TNT、TNTA、TNTA-A、TNTA-SC、TNTA-CO通过X射线光电子能谱（XPS，VG科学，英国）测量不同改性样品的表面原子的结合状态，结果如图6-9所示：

图6为TNTA表面主要元素的XPS高分辨率光谱图，TNTA表面主要由Ti、O元素构成，O、Ti原子含量比大约为2：1，表明阳极氧化后主要形成的是TiO₂。Ti2p光谱中的两个双峰主要是因为Ti-O键以及少量Ti=O键的存在。类似地，在O1s光谱中结合能为529.92 eV和531.29eV的两个峰主要归因于到氧化物TiO₂。图7为TNTA-A表面主要元素的XPS高分辨率光谱图，对TNTA-A样品，C1s光谱可以拟合为3个峰：结合能284.80eV（C-H/C-C/Si-C）、C-O-Si中的286.36eV（C-O）以及288.14eV（C-N）。高分辨率的N1s XPS光谱在结合能397.09 eV、399.88eV和401.58eV处显示出强峰，这分别归因于N-C键和N-H键。图8为TNTA-SC表面主要元素的XPS高分辨率光谱图，共价接枝SA/CS后，TNTA-SC中C1s峰（286.45eV）得到增强，峰面积从2542.95增加到4699.01，这与SA、CS中含有大量C-O键相符。此外，由于聚合物CS中存在大量的-NH2，N1s峰（397.40eV）也有所增强，峰面积从156.70增至556.35。图9为TNTA-CO表面主要元素的XPS高分辨率光谱图，接枝CORM-401后，由于原有表面被覆盖，N1s峰（397.29eV）被减弱（峰面积从556.35减至274.83）。这些结果证明成功合成了目标高分子材料。

利用肌红蛋白测定法测定CO的释放行为：

首先用PBS配置浓度为2mg/mL的肌红蛋白(Mb)溶液15mL，通入N₂鼓泡脱气30分钟，之后加入20mg连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₃)使其转化为脱氧肌红蛋白(DeoMb)，取1mL DeoMb溶液加入过量CORM-401和0.5mg半胱氨酸使DeoMb全部转化为碳氧血红蛋白（Mb-CO），并记录Mb-CO在500-600nm的吸光度。然后向DeoMb溶液加入实施方式1获得的样品TNTA-CO，分别测量在添加和未添加半胱氨酸的情况下的溶液吸光度（500-600nm）的变化，以此来表征CO的释放行为，添加半胱氨酸的样品记为TNTA-C。计算公式如下：

其中OD₅₄₀是Mb-CO溶液在540nm处的吸光度，ΔOD₅₄₀等于540nm处加入样品TNTA-CO和半胱氨酸（或无半胱氨酸）后溶液的吸光度变化，ΔOD_iso510是510nm处等吸收点吸光度的变化，ε=15.4 mM^-1cm^-1是 Mb-CO的消光系数。

结果如图10所示，图10为TNTA-CO的CO释放含量图。未加入半胱氨酸作为CO催化剂的TNTA-CO中仍有CO释放，这是因为残留的Na₂S₂O₃也会催化CO的释放，但在加入半胱氨酸后，CO释放量明显提高，证明半胱氨酸起到了催化CORM-401释放CO的作用。TNTA-C会在12h内快速释放CO，并在12h后CO释放速度逐渐下降并趋于稳定，之后CO释放会有一个持续到7天的稳定阶段，这表明TNTA-C中CO的释放可以超过7天。

将实施方式1获得的TNTA-CO样品分别在未加CO催化剂和添加10μL CO催化剂（0.5mg/mL的半胱氨酸溶液）的情况下，以Ti、TNT、TNTA、TNTA-A、TNTA-SC为对照材料，进行体外血小板粘附实验：

将新鲜健康人全血(淮安市第二人民医院提供)以1500 r/min离心10分钟，以获得富含血小板的血浆（PRP）。将200μL PRP完全覆盖在每个样品表面，并在37°C孵箱中孵育3小时，然后用生理盐水清洗样品2遍。贴壁血小板用2.5%戊二醛溶液（生理盐水配制）在4℃下固定12小时，然后用生理盐水清洗样品1-2遍。将样品依次用50%、70%、90%和100%的乙醇溶液梯度脱水，每次15分钟，并在空气中干燥。在表面喷金后，通过SEM（FEI Quanta 250）观察血小板的形态，结果如图11-17所示。

图11-17为Ti、TNT、TNTA、TNTA-A、TNTA-SC、TNTA-CO的血小板黏附图，从图11可以看出，Ti表面黏附了大量血小板，粘附的血小板呈铺展状态，伪足延伸，说明血小板可能已被激活，这也表明未改性的空白钛的抗凝血性能较差。从图12可以看出，阳极氧化后，TNT表面血小板黏附数量有所减少。经过阳极氧化获到的表面纳米管形貌具有优良的亲水性和独特的微纳结构，可以减少血小板的粘附和聚集。从图13可以看出，退火后，TNTA表面亲水性进一步提高，同时表现出对白蛋白更强的选择性吸附，所以TNTA表面血小板黏附量进一步减少，血小板形态也更加完整，表明血液相容性得到进一步的提高。从图14可以看出，固定APTMS使TNTA-A表面血小板黏附量略有增加，这是由于TNTA-A表面同时促进了白蛋白和纤维蛋白原的吸附，并且对纤维蛋白原具有更强的吸附，在一定程度上促进了血小板的黏附与聚集。CS是一种良好的生物相容性材料，SA中的羧酸盐基团可以螯合血液中的钙离子以中断凝血级联反应从而起到抗凝血的作用，所以接枝SA/CS后，TNTA-SC表面血小板黏附量明显减少，血小板也呈现出更加规整的圆球形状态，如图15。从图16可以看出，进一步接枝CO释放分子后，TNTA-CO表面血小板黏附数量显著下降，可能是因为血液中巯基等还原性基团催化CORM-401释放了CO，但血液中的还原性基团含量较少，不能完全催化CORM-401，所以加入CO催化剂（半胱氨酸）后，TNTA-C表面血小板黏附数量进一步有所降低，并且未发现聚集和激活血小板，如图17。说明本发明制备的催化释放CO的TiO₂纳米管材料经半胱氨酸催化刺激后释放了CO，而CO也具有一定的抗凝血作用。

将实施方式1获得的TNTA-CO样品分别在未加CO催化剂和添加10μL CO催化剂（0.5mg/mL的半胱氨酸溶液）的情况下，以Ti、TNT、TNTA、TNTA-A、TNTA-SC为对照材料，进行内皮细胞黏附实验：

将样品放在24孔培养板中，在超净台上对样品使用紫外灯进行灭菌，然后在每个样品表面加0.5mL的内皮细胞(5×10⁴个细胞/mL，ECV304，购自重庆比欧赛因生物科技发展有限公司)悬液和1.5mL细胞培养液。37℃，5％CO₂环境下分别培养1和3天后，用生理盐水洗涤样品3次。每个样品表面加入200μL的罗丹明的PBS溶液(10µg/mL)染色20min，再用生理盐水洗涤样品3次。最后加入200μL的4 ',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)( 500 ng/mL)到样品表面，染色10min，用生理盐水洗涤样品3次。染色后的样品采用荧光显微镜(Zeiss，invertedA2)观察细胞的数量和形态，结果如图18-24所示。

图18-24为Ti、TNT、TNTA、TNTA-A、TNTA-SC、TNTA-CO的细胞黏附图，从第一天到第三天各样品表面内皮细胞黏附数量普遍有所增加。此外还可以看到，Ti片上细胞黏附较少，且基本为圆形，如图18，说明内皮细胞未能很好黏附在其表面，并且粘附的细胞的铺展性能较差，表明Ti片细胞迁移和增殖能力不足。从图19可以看出，阳极氧化后出现的纳米管结构与亲水性的提高都利于细胞的黏附。但TNT表面黏附量略有减少，这与纳米管表面残留的氟等杂质元素有关。从图20可以看出，退火后，纳米管阵列孔隙率进一步增加、杂质得到有效去除、表面更为粗糙，多孔粗糙的表面结构可以增加TNTA与内皮细胞的有效接触面积，进而改善内皮细胞在TNTA表面的黏附。从图21可以看出，自组装3-氨丙基三甲氧基硅烷后，内皮细胞在其表面表现出较好的黏附效果。从图22可以看出，接枝SA/CS涂层后，TNTA-SC表面内皮细胞黏附数量更多，细胞的铺展性能得到改善。从图23可以看出，进一步接枝CORM-401后，内皮细胞在其表面的粘附有所减弱、细胞多呈现圆形。但是，加入半胱氨酸催化CO释放后，TNTA-C表面内皮细胞黏附效果最好，如图24所示，说明表面催化释放的CO可以显著促进内皮细胞的粘附与增殖。

综上，本发明在阳极氧化制得的TiO₂纳米管的基础上，首先通过自组装氨基硅烷在纳米管表面引入氨基基团，进一步原位同时固定海藻酸钠/壳聚糖的复合物，最后将CO释放分子（CORM401）固定在材料表面，从而构建一种催化释放CO的TiO₂纳米管材料TNTA-CO，通过CO的体内持续催化释放提高材料的生物相容性。与Ti、TNT、TNTA、TNTA-A及TNTA-SC相比，TNTA-CO在催化释放CO的情况下，抗凝血性能更强，可以进一步促进血管内皮细胞的粘附、生长以及功能表达，不仅可以用于人工血管移植物材料的制备，也可以应用于血管内植入器械(如血管支架、心脏起搏器)的表面涂层制备，用于提高器械的抗凝血性能和促内皮修复性能。

上述实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、通过阳极氧化法在钛表面原位制备TiO₂纳米管；

步骤二、对步骤一所得材料进行硅烷化处理，得硅烷改性TiO₂纳米管；

2.根据权利要求1所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，步骤四是将步骤三所得的纳米管浸没在CORM-401溶液中，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应2~5小时后清洗、干燥，得催化释放CO的TiO₂纳米管材料。

3.根据权利要求2所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，所述CORM-401溶液浓度为0.05-1mg/mL；

4.根据权利要求1所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，步骤一是将超声清洗并干燥后的钛片放入含有0.2~1%wt NH₄F、2~10mL去离子水和200~300mL乙二醇溶液的电解液中阳极氧化0.5~2小时，将阳极氧化后的所得物用无水乙醇和去离子水超声清洗、吹干后在空气中450℃高温退火2~4小时，得所述TiO₂纳米管。

5.根据权利要求1所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，步骤二是将所述步骤一所得材料物浸入3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中，振荡反应10~24小时后，60~100℃加热8~12小时，将加热处理后的所得物用无水乙醇清洗、吹干，得所述硅烷改性TiO₂纳米管。

6.根据权利要求5所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，所述3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液浓度为5~15mM。

7.根据权利要求1所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，步骤三是将所述硅烷改性TiO₂纳米管浸没到海藻酸钠和羧甲基壳聚糖的混合溶液中，再在所述混合溶液中加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应10~14小时后，将所得纳米管用去离子水清洗、吹干。

8.根据权利要求7所述的催化释放CO的TiO₂纳米管材料的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液浓度为1~10mg/mL；

和/或，所述羧甲基壳聚糖溶液浓度均为1~10mg/mL；

9.一种根据权利要求1至8中任一项所述的方法制备的催化释放CO的TiO₂纳米管材料在制备催化诱导CO释放的人工血管移植物材料中的应用。

10.一种根据权利要求1至8中任一项所述的方法制备的催化释放CO的TiO₂纳米管材料在制备催化诱导CO释放的血管支架涂层中的应用。