CN116218893A - 一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法 - Google Patents
一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116218893A CN116218893A CN202310295970.8A CN202310295970A CN116218893A CN 116218893 A CN116218893 A CN 116218893A CN 202310295970 A CN202310295970 A CN 202310295970A CN 116218893 A CN116218893 A CN 116218893A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- short
- recombinant plasmid
- primer
- repeat
- pcr amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 43
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 42
- 101000730493 Homo sapiens Phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 16
- 101001053339 Homo sapiens Inositol polyphosphate 4-phosphatase type II Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 102100032538 Phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 48
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 32
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 claims description 24
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims description 11
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims description 10
- 102100024366 Inositol polyphosphate 4-phosphatase type II Human genes 0.000 claims description 9
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 claims description 8
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims description 7
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 6
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000001914 Fragile X syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims 1
- 230000003274 myotonic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 claims 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 abstract description 25
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009758 senescence Effects 0.000 abstract 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 5
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108091092919 Minisatellite Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 101001121408 Homo sapiens L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 101150077958 INPP4B gene Proteins 0.000 description 2
- 102100026388 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101150025660 GPLD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 101000827703 Homo sapiens Polyphosphoinositide phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108050004784 Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010068871 Myotonic dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100023591 Polyphosphoinositide phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101100012902 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FIG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100233916 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) KAR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009193 crawling Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03066—Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate 4-phosphatase (3.1.3.66)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
- C12Y301/0405—Glycosylphosphatidylinositol phospholipase D (3.1.4.50)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法。本发明方法先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对引导重组质粒的后续PCR扩增。本发明方法成功地在重组质粒的GPLD1及INPP4B基因上生成了短片段串联重复序列。本发明方法实施简便、无需复杂的克隆操作，阳性克隆比率高。所生成的串联重复序列具有如下特征：(1)重复单位方向一致、拷贝数可变。(2)重复单位连接区之间不存在碱基突变，不改变编码基因阅读框。本发明方法适合在重组质粒上的任意编码基因上生成短片段串联重复序列，为阐明串联重复序列与细胞衰老、肿瘤发生及多种神经退行性疾病的发病关系提供了新型研究工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对引导重组质粒的后续PCR扩增，以重组质粒上编码基因的20-100bp片段为重复单位，体外生成短片段串联重复序列的方法，属于生物技术领域。
背景技术
在人类基因组中重复序列约占50％以上，并分散于整个基因组中。重复序列可分为串联重复序列、分散重复序列两大类。根据串联重复序列的重复单位长度又可分为：微卫星DNA(microsatellite DNA)、小卫星DNA(minisatellite DNA)。小卫星DNA的重复单位长度为几十至几百bp、重复次数通常为几十到数百。因此又称为拷贝数可变的短片段串联重复序列。小卫星DNA在人群中因为重复次数不同而呈现高度多态性，其在生命科学和医学领域中有着愈来愈重要的作用。
短片段串联重复序列在维护人类基因组的稳定性及一些遗传病的发生上具有重要作用。人类染色体端粒DNA序列由5’-TTAGGG-3’高度重复组成，对于保护染色体以及控制细胞生长具有重要意义。在肿瘤细胞中端粒长度明显缩短、端粒酶活性明显升高，说明端粒的长度与肿瘤的发生有相关性。三核苷酸重复是生物体内常见的重复序列，其拷贝数目变化与多种神经肌肉和神经退行性疾病有关。如亨廷顿舞蹈症病人中，其致病基因IT15的CAG三核苷酸重复序列拷贝数增高会导致该病发病年龄提前、病情加重。其他常见疾病还有肌强制性营养不良、脆性X染色体综合征，其发病机制均与三核苷酸重复序列的拷贝数增多相关。研究推测在编码区重复序列会导致编码蛋白呈现细胞毒性或免疫原性，在非编码区出现的重复序列会导致编码区转录和翻译异常。因此在体外建立重复序列创建模型，阐明DNA重复序列发生机制是揭示上述神经退行性疾病发病机理的重要途径，并且为开发相关治疗药物提供理论基础。
目前认为，体内的串联重复序列产生机制主要有滑动复制、滚环复制及端粒复制三种生成模型。(1)复制滑动机制是目前研究比较多的短片段串联重复序列产生机制。在DNA复制过程中，滑动复制滞后链的复制会先形成冈崎片段，缺口再连接。经历DNA聚合酶的去组装与再组装。期间新合成的DNA链与模板链会随DNA聚合酶脱离，此时模板链或滞后链形成一个loop环，就会导致短片段串联重复序列拷贝数的减少或增加。但是该复制模型不能解释短片段串联重复序列在基因组中连续出现、大量扩增的现象及短片段串联重复序列连接区之间存在基因突变。(2)滚环复制是噬菌体DNA、部分质粒DNA的复制方式，其可以在短时间内大量扩增DNA，供生物体利用。但该机制是建立在噬菌体和质粒DNA整体复制的基础上，不能完美解释基因组局部小片段DNA复制的过程。(3)染色体端粒的爬行复制机制是目前研究比较清楚的串联重复序列生成机制。然而端粒复制是独特的复制机制，需要端粒酶活性及短RNA为复制模板。
鉴于重复序列在维护基因组稳定性及神经性退行性疾病中的重要作用，人们一直在研发体外生成串联重复序列，特别是短片段串联重复序列的体外生成方法。目前比较成熟的方法有无模板PCR扩增和长迭代核苷酸合成(简称SLIP)。(1)无模板PCR法应用一对互补片段作为重复单位，由于互补片段可以形成错位互补，因此在每个PCR循环后均有可能延长重复片段的长度，该方法后续需要复杂的克隆及亚克隆基因操作，才能获得所需要的短片段重复序列。(2)SLIP虽然是在质粒上合成短片段串联重复序列，但是需要重复序列两端均含有不同的限制性内切酶位点，重组质粒通过两种限制性内切酶分别酶切，酶切产物混合并退火，可能形成有错位互补的质粒，再以DNA聚合酶填补缺口区域导致重复序列增加长度，再转化感受态大肠杆菌，提取转化质粒即可获得重复片段延长的质粒。为增加重复单位长度，每个重复单位延长循环均需要重复上述步骤。因此，该方法虽然不需要基因克隆操作，但生成方法十分繁琐，费时费力。
鉴于上述体外生成短片段串联重复序列方法均存在较大缺陷，本发明建立了双拷贝互补引物对引导法，该方法通过体外扩增重组质粒，制备短片段串联重复序列。本方法的关键在于先以一条半重复单位单链起始引物引导，进行重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对引导，进行重组质粒的后续PCR扩增。本方法实施简便、无需复杂的克隆及亚克隆操作。生成短片段的质粒克隆阳性率高(约40％)。所生成的重复序列具有如下特征：(1)重复单位方向一致、拷贝数可变。(2)重复单位连接区之间不存在碱基突变，适合编码基因中重复序列的创建。(3)本方法适合于克隆于质粒上任意编码基因的20-100bp的短片段串联重复序列创建，为阐明重复序列与细胞衰老、肿瘤发生及神经退行性疾病的发病关系和开发相关治疗提供新型研究工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法，其包括以下步骤：
(1)构建含有目的编码基因的重组质粒，作为体外PCR扩增的起始模板；
(2)先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过一对双拷贝互补引物对进行后续PCR扩增，其中，所述的短片段，即重复单位，长度为20-100bp，所述的双拷贝互补引物对中的正向和反向引物分别含有两拷贝的短片段重复单位，所述的半重复单位单链起始引物为一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的单链引物；
(3)使用限制性内切酶DpnI对PCR产物进行酶切，去除起始重组质粒模板；
(4)酶切产物转化大肠杆菌感受态细胞；
(5)菌落接种培养基，进行扩大培养；
(6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。
其中，优选的，所述的重组质粒为含有任意编码基因的pcDNA3.1(-)。
其中，优选的，所述的双拷贝互补引物对中含有的两拷贝的短片段重复单位为野生型序列或者为含有突变位点的序列。
其中，优选的，所述的编码基因为与神经性退行性疾病相关的致病基因。
其中，优选的，所述的神经性退行性疾病包括亨廷顿舞蹈症、强直性肌营养不良以及脆性X染色体综合征。
在本发明的一个具体实施例中，为了研究磷脂酶GPLD1在抗衰老方面的作用，我们以重组质粒pcDNA3.1(-)-GPLD1为基础，对其上编码基因GPLD1的磷脂酶活性区31bp片段进行了重复序列的制备，成功制备了GPLD1编码区上原本不存在的短片段串联重复序列。具体包括以下步骤：
(1)构建含有目的编码基因的重组质粒；
将抗衰老基因GPLD1克隆到pcDNA3.1(-)载体中，得到重组质粒pcDNA3.1(-)-GPLD1，作为体外PCR扩增的起始模板；
(2)DF-62与DR-62是以GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段为模板设计的完全互补引物，分别含有两拷贝31bp短片段重复单位，为了方便后续测序鉴定，将DF-62中GGA突变为AAA，DR-62中的TCC突变为TTT，Short-15是一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的长度为15bp的半重复单位单链起始引物，与野生型相比，半重复单位单链起始引物Short-15存在AA两个突变位点，以便于测序结果分析，Seq-F与SR-31配对用于转化克隆的菌液PCR鉴定，Seq-F亦作为Sanger法DNA测序的测序引物，具体引物序列如下所示：
首先，以半重复单位单链起始引物Short-15引导pcDNA3.1(-)-GPLD1重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过双拷贝互补引物对DF-62与DR-62进行后续PCR扩增；
(3)Dpn I酶切PCR混合物，去除起始重组质粒模板；
(4)转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；
(5)菌落接种培养基，进行扩大培养；
(6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。
该重复序列具有如下特征：(1)重复单位方向一致、拷贝数可变。(2)重复单位连接区之间不存在碱基突变，适合编码基因中的重复序列创建。(3)本方法适合于克隆于质粒上任意编码基因的20-100bp的短片段串联重复序列创建。
本方法的关键在于先以一条半重复单位单链起始引物引导，进行重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对引导，进行重组质粒后续PCR扩增。先以半重复单位单链起始引物Short-15引导重组质粒pcDNA3.1(-)-GPLD1体外PCR扩增15循环，以生成5‘和3’两端均含有部分重复单位序列的单链质粒DNA，然后加入双拷贝互补引物对DF-62和DR-62进行后续30循环PCR扩增(生成过程示意图见图1A和1B)。Dpn I酶切PCR混合物后转化大肠杆菌TOP10。选取克隆接种培养及菌液PCR鉴定后(鉴定引物为Seq-F和SR-31，详见表1。代表性琼脂糖电泳鉴定图详见图2)，将出现多条带的细菌克隆送检Sanger法测序。该双拷贝互补引物对引导法成功制备了以该31bp片段为重复单位的短片段串联重复序列。该双拷贝互补引物对引导法生成的阳性克隆比率约为40％(图3A)，重复单位拷贝数可变(2-23拷贝)，以含11-15拷贝的阳性克隆比率最高(33.3％)(图3B)。该法创建的重复单位的连接区之间均为平末端连接，连接区之间不存在碱基突变。图4A所显示的是一个含有23拷贝短片段串联重复序列阳性克隆的Sanger法测序结果。
为了验证我们建立双拷贝互补引物引导法的通用性，我们又采用另一种重组质粒pcDNA3.1(-)-INPP4B作为扩增模板，试图在肿瘤抑制基因INPP4B磷酸酶活性区生成短片段串联重复序列。我们设计了一对双拷贝互补引物对(命名DF-58、DR-58)及一条起始于DF-58引物中部，终止于DF-58引物3’末端，长度为14bp的半重复单位单链起始引物(命名Short-14)。先以半重复单位单链起始引物Short-14引导重组质粒pcDNA3.1(-)-3xFlag-INPP4B体外PCR扩增15循环，以生成5‘和3’两端均含有部分重复单位序列的单链质粒DNA，然后加入双拷贝互补引物对DF-58和DR-58进行后续30循环PCR扩增。Dpn I酶切PCR混合物后转化大肠杆菌TOP10。选取克隆接种培养及菌液PCR鉴定后，进行Sanger法DNA测序。送检10个克隆测序，结果发现4个克隆的INPP4B基因含有短片段串联重复序列。其中一个代表性序列如图4B所示。注意该克隆重复单位的方向一致、连接区也不存在碱基突变。该结果表明我们建立的双拷贝互补引物引导法具有通用性，适合在重组质粒上任意编码基因上生成短片段串联重复序列。具体包括以下步骤：
(1)构建含有目的编码基因的重组质粒；
将肿瘤抑制基因INPP4B克隆到pcDNA3.1(-)载体中，得到重组质粒pcDNA3.1(-)-INPP4B，作为体外PCR扩增的起始模板；
(2)DF-58与DR-58是以INPP4B磷酸酶活性区29bp短片段为模板设计的完全互补引物，分别含有两拷贝29bp短片段重复单位；Short-14是一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的长度为14bp的半重复单位单链起始引物；Seq-F2与SR-29配对用于转化克隆的菌液PCR鉴定，Seq-F2亦作为Sanger法DNA测序的测序引物；具体引物序列如下所示：
首先，以半重复单位单链起始引物Short-14引导pcDNA3.1(-)-INPP4B重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过双拷贝互补引物对DF-58与DR-58进行后续PCR扩增；
(3)Dpn I酶切PCR混合物，去除起始重组质粒模板；
(4)转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；
(5)菌落接种培养基，进行扩大培养；
(6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。
总之，我们以pcDNA3.1(-)-GPLD1重组质粒为模板，通过双拷贝互补引物对引导法成功在体外创建GPLD1编码基因磷脂酶活性区的31bp片段的串联重复序列，又在重组质粒pcDNA3.1(-)-INPP4B上验证了该方法的通用性。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明方法以PCR体外扩增重组质粒为基础，简便易行，阳性率高(约40％)。能够在体外实现对任意编码基因的任意局部20-100bp区域建立短片段串联重复序列。所生成的串联重复序列具有如下特征：(1)重复单位方向一致、拷贝数可变。(2)重复单位连接区之间不存在碱基突变，不改变编码基因阅读框。
本发明方法适合在重组质粒上的任意编码基因上生成短片段串联重复序列，为阐明串联重复序列与细胞衰老、肿瘤发生及多种神经退行性疾病的发病关系提供了新型研究工具，具有重大的经济和社会效益。
附图说明
图1为以重组质粒pcDNA3.1(-)-GPLD1的GPLD1磷脂酶活性区31bp为重复单位创建拷贝数可变的短片段串联重复序列示意图；
其中，(A)重组质粒pcDNA3.1(-)-GPLD1结构示意简图；左侧显示为重组质粒示意图，右侧显示为重复单位及所生成的串联重复单位结构示意图。重复单位和所用引物的名称、位置及限制性内切酶位点和氨苄青霉素、新霉素抗性基因均以不同形状和阴影标注在重组质粒的相应位置；(B)双拷贝互补引物对引导法生成拷贝数可变的短片段串联重复序列示意图；先以半重复单位单链起始引物Short-15引物引导重组质粒进行起始PCR扩增15循环，然后加入DF-62及DR-62互补引物对进行后续30循环PCR扩增。PCR产物经Dpn I酶切后，转化大肠杆菌TOP10。转化菌落经菌液PCR鉴定及Sanger法测序以确定短片段串联重复序列在重组质粒上成功制备；
图2为克隆菌落菌液PCR鉴定短片段串联重复序列生成的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M泳道为DNA分子量标志物，泳道1、3、5、6、7、8为单拷贝克隆，泳道2、4、9、10为含多拷贝串联重复序列的克隆；其中泳道9和10对应克隆经Sanger法测序鉴定，是一个含23拷贝串联重复序列的阳性克隆；
图3为双拷贝互补引物对引导法制备的短片段串联重复的特点；
其中，(A)短片段串联重复序列阳性克隆的比率是对100个重组质粒克隆菌落进行菌液PCR鉴定所统计出的结果；串联重复序列是指含2拷贝及2拷贝以上重复单位的序列；(B)是对Sanger法测序后100个重组质粒克隆的拷贝数变化分析的结果总结；
图4为双拷贝互补引物对引导法在抗衰老基因GPLD1和肿瘤抑制基因INPP4B两种基因上所制备的短片段串联重复序列的Sanger法DNA测序结果展示；
其中，(A)序列为双拷贝互补引物对引导法在GPLD1基因上制备的23拷贝短片段串联重复序列，其中22个连接区均为平末端连接，连接区之间没有碱基突变。序列两端的阴影区为与重复单位相邻的非重复序列；(B)序列为双拷贝互补引物对引导法在INPP4B基因上制备的8拷贝短片段串联重复序列，其中7个连接区均为平末端连接，连接区之间没有碱基突变；序列两端的阴影区为与重复单位相邻的非重复序列。
具体实施方式
下面结合具体实施实例来进一步描述本发明，本发明的优点及特点将随着实验描述而更为清楚，本实施案例是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域相关技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下，可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例一：双拷贝互补引物对引导法制备抗衰老基因GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段串联重复序列
材料方法：
原核细胞：大肠杆菌感受态TOP10，购自Invitrogen公司。
主要生化试剂：
PCR相关试剂：
Taq DNA聚合酶及PCR反应混合物：购自北京庄盟生物基因科技有限公司引物合成：安徽通用生物股份有限公司
PCR扩增仪：GeneAmp PCR system 9700
DNA浓度测量仪：Nanodrop
37℃水浴锅：天津市泰新特仪器有限公司
Dpn I限制性内切酶：美国NEB公司
LB肉汤及琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司
氨苄青霉素：北京赛文创新科技有限公司
37℃温育孵箱：Thermo公司
超净工作台：LABCONCO公司
琼脂糖凝胶电泳系统：美国BIO-RAD
凝胶成像扫描仪：美国BIO-RAD
Sanger法DNA测序：由北京睿博兴科生物科技有限公司完成
DNA序列分析软件：SnapGene(美国加州SnapGene公司)
统计学数据分析软件：SPSS 17.0版本(美国芝加哥SPSS Inc公司)
重组质粒：pcDNA3.1(-)-GPLD1，实验室自备
以重组质粒pcDNA3.1(-)-GPLD1的GPLD1磷脂酶活性区31bp为重复单位创建拷贝数可变的短片段串联重复序列示意图如图1所示。
(1)引物设计
DF-62与DR-62是以GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段为模板设计的完全互补引物，分别含有两拷贝31bp短片段重复单位，为了方便后续测序鉴定，将DF-62中GGA突变为AAA，DR-62中的TCC突变为TTT。Short-15是一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的长度为15bp的半重复单位单链起始引物。与野生型相比，半重复单位单链起始引物Short-15存在AA两个突变位点，以便于测序结果分析。这些碱基突变不影响后续GPLD1的功能研究，对于其他通用研究，可以直接采用目的基因的野生型序列。Seq-F与SR-31配对用于转化克隆的菌液PCR鉴定。Seq-F亦作为Sanger法DNA测序的测序引物。具体引物序列如表1所示：
表1：体外创建抗衰老基因GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段串联重复序列所用引物序列表
(2)半重复单位单链起始引物Short-15引导pcDNA3.1(-)-GPLD1重组质粒的起始PCR扩增。
2.1PCR反应体系：
2.2起始PCR反应运行条件：
95℃5min预变性、95℃30s变性、52℃30s退火、72℃8min延伸、循环数为15。
(3)双拷贝互补引物对引导pcDNA3.1(-)-GPLD1重组质粒的后续PCR扩增。
3.1PCR反应体系：
3.2后续PCR反应运行条件：
95℃5min预变性、95℃30s变性、62℃30s退火、72℃8min延伸、循环数为30。
(4)Dpn I酶切PCR混合物，按照下列比例在1.5毫升离心管中加样，混匀离心，37℃水浴过夜酶切。
(5)转化大肠杆菌TOP10感受态细胞
5.1从-80℃冰箱取出TOP10感受态细胞与上述10微升Dnp I酶切反应混合物，分别放置于冰上10min。
5.2将10微升Dnp I酶切反应混合物加在50微升感受态细胞中，轻轻弹匀后，冰上静置5min。
5.3将混合物置于提前准备好的42℃水浴锅中，热休克55s。
5.4将热休克后的混合物冰上静置3min。
5.5将混合物中加入1毫升LB肉汤后，37℃恒温摇床培养1h。
5.6取上述培养物200μL，平铺在含有氨苄青霉素抗性LB琼脂板上，倒置放置在37℃孵箱中过夜。
(6)菌落接种及菌液PCR鉴定。
6.1在10ml离心管中加入5ml LB肉汤氨苄青霉素(100μg/mL)溶液。将单克隆菌落接种其中，保持空气通畅，37℃恒温摇床过夜。
6.2次日上午，取2微升LB菌液置于PCR反应管中，并放置于95℃金属浴10min后，按如下比例配制菌液PCR反应体系。
6.3菌液PCR反应运行条件：
95℃5min预变性、95℃30s变性、55℃30s退火、72℃30s延伸。循环数为25。
6.4 2％琼脂糖TBE凝胶电泳鉴定菌液PCR产物。
称取2g琼脂糖，溶解在100ml的0.5xTBE中，微波炉加热溶解、稍凉后加入10微升核酸染料superRed(10000x)混匀，倾倒在胶架内。自然冷却凝固备用。
6.5分别取DL2000 DNAmarker 8μL及菌液PCR产物8μL/每管，注入凝胶加样孔内，以恒压80V，电泳40min后，在BOI-RED凝胶成像扫描仪观察PCR产物条带并扫描存图。含单拷贝重复单位的重组质粒PCR产物长度为420bp。含多拷贝重复单位的重组质粒PCR产物呈现阶梯形条带，分子量逐渐增加，结果如图2所示。
(7)Sanger法DNA测序。
挑选菌液PCR出现多条带的阳性克隆，各取新鲜菌液2ml送检、所用测序引物为Seq-F。
(8)Sanger法DNA测序结果分析。
我们使用SnapGene软件进行测序结果分析，特别注意重复单位的拷贝数目以及重复单位连接区之间是否有核苷酸突变。分析总结重复序列出现的阳性比率、重复单位的拷贝数变化，并进行统计学显著性差异比较，结果如图3所示。
图4A为双拷贝互补引物对引导法在抗衰老基因GPLD1上所制备的短片段串联重复序列的Sanger法DNA测序结果展示。
实施例二：双拷贝互补引物引导法制备肿瘤抑制基因INPP4B磷酸酶活性区29bp短片段串联重复序列。
材料方法：
原核细胞：大肠杆菌感受态TOP10，购自Invitrogen公司。
主要生化试剂：
PCR相关试剂：
TaqDNA聚合酶及PCR反应混合物：购自北京庄盟生物基因科技有限公司引物合成：安徽通用生物股份有限公司
PCR扩增仪：GeneAmp PCR system 9700
DNA浓度测量仪：Nanodrop
37℃水浴锅：天津市泰新特仪器有限公司
Dpn I限制性内切酶：美国NEB公司
LB肉汤及琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司
氨苄青霉素：北京赛文创新科技有限公司
37℃温育孵箱：Thermo公司
超净工作台：LABCONCO公司
琼脂糖凝胶电泳系统：美国BIO-RAD
凝胶成像扫描仪：美国BIO-RAD
Sanger法DNA测序：由北京睿博兴科生物科技有限公司完成
DNA序列分析软件：SnapGene(美国加州SnapGene公司)
统计学数据分析软件：SPSS 17.0版本(美国芝加哥SPSS Inc公司)
重组质粒：pcDNA3.1(-)-INPP4B，实验室自备
(1)引物设计
DF-58与DR-58是以INPP4B磷酸酶活性区29bp短片段重复单位为模板设计的完全互补引物，分别含有两拷贝29bp短片段重复单位。Short-14是一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的长度为14bp的半重复单位单链起始引物。Seq-F2与SR-29配对用于转化克隆的菌液PCR鉴定。Seq-F2亦作为Sanger法DNA测序的测序引物。具体引物序列如表2所示：
表2：体外创建肿瘤抑制基因INPP4B磷酸酶活性区29bp短片段串联重复序列所用引物序列表
(2)半重复单位单链起始引物Short-14引导pcDNA3.1(-)-INPP4B重组质粒的起始PCR扩增。
2.1PCR反应体系：
2.2起始PCR反应运行条件：
95℃5min预变性、95℃30s变性、52℃30s退火、72℃8min延伸、循环数为15。
(3)双拷贝互补引物对引导pcDNA3.1(-)-INPP4B重组质粒的后续PCR扩增。
3.1PCR反应体系：
3.2后续PCR反应运行条件：
95℃5min预变性、95℃30s变性、62℃30s退火、72℃8min延伸、循环数为30。
(4)Dpn I酶切PCR混合物，按照下列比例在1.5毫升离心管中加样，混匀离心，37℃水浴过夜酶切。
(5)转化大肠杆菌TOP10感受态细胞
5.1从-80℃冰箱取出TOP10感受态细胞与上述10微升Dnp I酶切反应混合物，分别放置于冰上10min。
5.2将10微升Dnp I酶切反应混合物加在50微升感受态细胞中，轻轻弹匀后，冰上静置5min。
5.3将混合物置于提前准备好的42℃水浴锅中，热休克55s。
5.4将热休克后的混合物冰上静置3min。
5.5将混合物中加入1毫升LB肉汤后，37℃恒温摇床培养1h。
5.6取上述培养物200μL，平铺在含有氨苄青霉素抗性LB琼脂板上，倒置放置在37℃孵箱中过夜。
(6)菌落接种及菌液PCR鉴定
6.1在10ml离心管中加入5ml LB肉汤氨苄青霉素(100μg/mL)溶液。将单克隆菌落接种其中，保持空气通畅，37℃恒温摇床过夜。
6.2次日上午，取2μL LB菌液置于PCR反应管中，并放置于95℃金属浴10min后，按如下比例配制菌液PCR反应体系。
6.3菌液PCR反应运行条件
95℃5min预变性、95℃30s变性、55℃30s退火、72℃30s延伸、循环数为25。
6.42％琼脂糖TBE凝胶电泳鉴定菌液PCR产物。
称取2g琼脂糖，溶解在100ml的0.5xTBE中，微波炉加热溶解、稍凉后加入10微升核酸染料superRed(10000x)混匀，倾倒在胶架内。自然冷却凝固备用。
6.5分别取DL2000 DNAmarker 8μL及菌液PCR产物8μL/每管，注入凝胶加样孔内，以恒压80V，电泳40min后，在BOI-RED凝胶成像扫描仪观察PCR产物条带并扫描存图。含单拷贝重复单位的重组质粒PCR产物长度为509bp。含多拷贝重复单位的重组质粒PCR产物呈现阶梯形条带，分子量逐渐增加。
(7)Sanger法DNA测序。
挑选菌液PCR出现多条带的阳性克隆，各取新鲜菌液2ml送检、所用测序引物为Seq-F2。
(8)Sanger法DNA测序结果分析。
我们使用SnapGene软件进行测序结果分析，特别注意重复单位的拷贝数目以及重复单位连接区之间是否有碱基突变。分析总结重复序列出现的阳性比率、重复单位的拷贝数变化，并进行统计学显著性差异比较。
图4B为双拷贝互补引物对引导法在肿瘤抑制基因INPP4B上所制备的短片段串联重复序列的Sanger法DNA测序结果展示。
Claims (7)
1.一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有目的编码基因的重组质粒，作为体外PCR扩增的起始模板；
(2)先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过一对双拷贝互补引物对进行后续PCR扩增，其中，所述的短片段，即重复单位，长度为20-100bp，所述的双拷贝互补引物对中的正向和反向引物分别含有两拷贝的短片段重复单位，所述的半重复单位单链起始引物为一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的单链引物；
(3)使用限制性内切酶DpnI对PCR产物进行酶切，去除起始重组质粒模板；
(4)酶切产物转化大肠杆菌感受态细胞；
(5)菌落接种培养基，进行扩大培养；
(6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒为含有任意编码基因的pcDNA3.1(-)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的编码基因为与神经性退行性疾病相关的致病基因。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双拷贝互补引物对中含有的两拷贝的短片段重复单位为野生型序列或者为含有突变位点的序列。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的神经性退行性疾病包括亨廷顿舞蹈症、强直性肌营养不良以及脆性X染色体综合征。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的短片段串联重复序列为抗衰老基因GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段串联重复序列，所述的方法包括以下步骤：
(1)构建含有目的编码基因的重组质粒；
将抗衰老基因GPLD1克隆到pcDNA3.1(-)载体中，得到重组质粒pcDNA3.1(-)-GPLD1，作为体外PCR扩增的起始模板；
(2)DF-62与DR-62是以GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段为模板设计的完全互补引物，分别含有两拷贝31bp短片段重复单位，为了方便后续测序鉴定，将DF-62中GGA突变为AAA，DR-62中的TCC突变为TTT，Short-15是一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的长度为15bp的半重复单位单链起始引物，与野生型相比，半重复单位单链起始引物Short-15存在AA两个突变位点，以便于测序结果分析，Seq-F与SR-31配对用于转化克隆的菌液PCR鉴定，Seq-F亦作为Sanger法DNA测序的测序引物，具体引物序列如下所示：
首先，以半重复单位单链起始引物Short-15引导pcDNA3.1(-)-GPLD1重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过双拷贝互补引物对DF-62与DR-62进行后续PCR扩增；
(3)Dpn I酶切PCR混合物，去除起始重组质粒模板；
(4)转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；
(5)菌落接种培养基，进行扩大培养；
(6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的短片段串联重复序列为肿瘤抑制基因INPP4B磷酸酶活性区29bp短片段串联重复序列，所述的方法包括以下步骤：
(1)构建含有目的编码基因的重组质粒；
将肿瘤抑制基因INPP4B克隆到pcDNA3.1(-)载体中，得到重组质粒pcDNA3.1(-)-INPP4B，作为体外PCR扩增的起始模板；
(2)DF-58与DR-58是以INPP4B磷酸酶活性区29bp短片段为模板设计的完全互补引物，分别含有两拷贝29bp短片段重复单位；Short-14是一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3’末端的长度为14bp的半重复单位单链起始引物；Seq-F2与SR-29配对用于转化克隆的菌液PCR鉴定，Seq-F2亦作为Sanger法DNA测序的测序引物；具体引物序列如下所示：
首先，以半重复单位单链起始引物Short-14引导pcDNA3.1(-)-INPP4B重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过双拷贝互补引物对DF-58与DR-58进行后续PCR扩增；
(3)Dpn I酶切PCR混合物，去除起始重组质粒模板；
(4)转化大肠杆菌TOP10感受态细胞；
(5)菌落接种培养基，进行扩大培养；
(6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310295970.8A CN116218893A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310295970.8A CN116218893A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116218893A true CN116218893A (zh) | 2023-06-06 |
Family
ID=86575154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310295970.8A Pending CN116218893A (zh) | 2023-03-24 | 2023-03-24 | 一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116218893A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025073267A1 (zh) * | 2023-10-07 | 2025-04-10 | 深圳瑞吉生物科技有限公司 | 一种构建含有串联重复序列的质粒的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997020948A1 (en) * | 1995-12-05 | 1997-06-12 | Koch Joern Erland | A cascade nucleic acid amplification reaction |
| WO2003064615A2 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | University Of Utah | Amplifying repetitive nucleic acid sequences |
| CN1624148A (zh) * | 2003-12-02 | 2005-06-08 | 中国农业科学院作物育种栽培研究所 | 构建串联重复顺式作用元件的方法及其专用引物与应用 |
| CN102154269A (zh) * | 2011-01-06 | 2011-08-17 | 湖南农业大学 | 基于pcr的串联重复序列快速构建法和专用引物对及应用 |
| US20140127696A1 (en) * | 2012-10-15 | 2014-05-08 | Life Genetics Lab, LLC, | Method for genetic detection using interspersed genetic elements: a multiplexed dna analysis system |
| GB201617353D0 (en) * | 2016-04-21 | 2016-11-30 | Q-Linea Ab | Detecting and characterising a microorganism |
| CN116083550A (zh) * | 2022-07-20 | 2023-05-09 | 四川大学 | 一种短串联重复序列的检测方法、引物组、试剂盒和应用 |
-
2023
- 2023-03-24 CN CN202310295970.8A patent/CN116218893A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997020948A1 (en) * | 1995-12-05 | 1997-06-12 | Koch Joern Erland | A cascade nucleic acid amplification reaction |
| WO2003064615A2 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | University Of Utah | Amplifying repetitive nucleic acid sequences |
| CN1639352A (zh) * | 2002-01-31 | 2005-07-13 | 犹他州大学 | 扩增重复核酸序列 |
| CN1624148A (zh) * | 2003-12-02 | 2005-06-08 | 中国农业科学院作物育种栽培研究所 | 构建串联重复顺式作用元件的方法及其专用引物与应用 |
| CN102154269A (zh) * | 2011-01-06 | 2011-08-17 | 湖南农业大学 | 基于pcr的串联重复序列快速构建法和专用引物对及应用 |
| US20140127696A1 (en) * | 2012-10-15 | 2014-05-08 | Life Genetics Lab, LLC, | Method for genetic detection using interspersed genetic elements: a multiplexed dna analysis system |
| GB201617353D0 (en) * | 2016-04-21 | 2016-11-30 | Q-Linea Ab | Detecting and characterising a microorganism |
| CN116083550A (zh) * | 2022-07-20 | 2023-05-09 | 四川大学 | 一种短串联重复序列的检测方法、引物组、试剂盒和应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| BUTLER, JM等: "Quality control of PCR primers used in multiplex STR amplification reactions", 《FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL》, 1 June 2001 (2001-06-01), pages 87 - 96, XP055508994 * |
| EUN YOUNG LEE等: "A multiplex PCR system for 13 RM Y-STRs with separate amplification of two different repeat motif structures in DYF403S1a", 《FORENSIC SCI INT GENET》, 27 October 2016 (2016-10-27), pages 85 - 90, XP029845290, DOI: 10.1016/j.fsigen.2016.10.019 * |
| JI-REN CHEN等: "Construction of Tandem Repeats of DNA Fragments by a Polymerase Chain Reaction-Based Method", 《DNA AND CELL BIOLOGY》, 13 April 2012 (2012-04-13) * |
| 刘宏: "24个Y-STR基因座荧光标记复合检测体系的建立及其法医学应用", 《CNKI》, 15 April 2013 (2013-04-15), pages 1 - 94 * |
| 胡灏等: "1 万方，摘要:("串联重复") and 摘要:("扩增") and 摘要:("引物") and 摘要:("双拷贝")", 《郑州大学学报（医学版）》, 7 September 2011 (2011-09-07) * |
| 荣媛: "孕妇血浆中胎儿游离核酸Y染色体STR复合扩增的应用", 《武汉大学学报(医学版)》, 15 March 2012 (2012-03-15), pages 206 - 210 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025073267A1 (zh) * | 2023-10-07 | 2025-04-10 | 深圳瑞吉生物科技有限公司 | 一种构建含有串联重复序列的质粒的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hietpas et al. | Fitness analyses of all possible point mutations for regions of genes in yeast | |
| Jechlinger et al. | Altered temperature induction sensitivity of the lambda p R/cI857 system for controlled gene E expression in Escherichia coli | |
| Zhang et al. | A high-efficiency method for site-directed mutagenesis of large plasmids based on large DNA fragment amplification and recombinational ligation | |
| Zhou et al. | Molecular analysis of silver crucian carp (Carassius auratus gibelio Bloch) clones by SCAR markers | |
| Dong et al. | A functional recT gene for recombineering of Clostridium | |
| Amoasii et al. | In vivo non-invasive monitoring of dystrophin correction in a new Duchenne muscular dystrophy reporter mouse | |
| Ravin et al. | Bidirectional replication from an internal ori site of the linear N15 plasmid prophage | |
| CN108517360A (zh) | 一种循环肿瘤游离dna突变检测质控品及其制备方法 | |
| CN116218893A (zh) | 一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法 | |
| Volke et al. | Rapid genome engineering of Pseudomonas assisted by fluorescent markers and tractable curing of plasmids | |
| CN113151412B (zh) | 用于检测mdck细胞残留dna含量的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr试剂盒 | |
| Egger et al. | Fast and antibiotic free genome integration into Escherichia coli chromosome | |
| Levano-Garcia et al. | Mapping transposon insertion sites by touchdown PCR and hybrid degenerate primers | |
| CN110760511A (zh) | 一种用于治疗杜氏肌营养不良症的gRNA、表达载体、CRISPR-Cas9系统 | |
| Koo et al. | Single molecule mtDNA fiber FISH for analyzing numtogenesis | |
| Hammelmann et al. | Optimized generation of vectors for the construction of Haloferax volcanii deletion mutants | |
| Gerlach et al. | Rapid oligonucleotide-based recombineering of the chromosome of Salmonella enterica | |
| Grozdanov et al. | Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1α promoter using Gibson assembly | |
| CN105087517B (zh) | 一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法 | |
| Zheng et al. | A novel universal multiplex PCR improves detection of AZFc Y-chromosome microdeletions | |
| CN109402274A (zh) | 一种鉴别a型和b型牛源多杀性巴氏杆菌的荧光定量rt-pcr方法 | |
| EP4578951A1 (en) | Multi-fragmented polya polynucleotide stably existing in host cell and use thereof | |
| Nash et al. | Manipulation of murine mitochondrial DNA heteroplasmy with mtZFNs | |
| Ribeiro et al. | High frequency plasmid recombination mediated by 28 bp direct repeats | |
| Zhang et al. | The integrase of genomic island GI sul2 mediates the mobilization of GI sul2 and IS CR-related element CR2-sul2 unit through site-specific recombination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |