CN116200488B - LncRNA RPAR在胶质瘤诊治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供lncRNA RPAR在胶质瘤诊治中的应用，属于生药医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究分析发现lncRPAR在脑胶质瘤组织中表达量明显高于正常脑组织。同时本发明利用RNA pulldown结合Mass Spec技术检测与RPAR结合的蛋白质，发现人60S核糖体蛋白RPL5可与RPAR结合，RNA正反pulldown也验证了这一现象。进一步研究发现RPL5可影响MDM2‑P53通路，最终通过肿瘤抑制因子p53影响细胞周期和细胞凋亡，进而影响胶质瘤的发生发展。本发明最终证实lncRPAR可通过RPL5‑MDM2‑P53通路促进胶质瘤的发生发展，并有望成为胶质瘤诊断及治疗中的新靶点。

Description

LncRNA RPAR在胶质瘤诊治中的应用

技术领域

本发明属于生药医药和分子生物学技术领域，具体涉及lncRNA RPAR在胶质瘤诊治中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

脑胶质瘤是成人最常见的颅内原发恶性肿瘤，侵袭性强、预后差，其发病率和死亡率正逐年上升。目前临床上以手术切除、术后放化疗为主要治疗手段，但由于胶质瘤浸润性生长及脑的器官特殊性，肿瘤手术切除率在68％-96％，最大安全范围的手术切除也无法保证清除全部肿瘤细胞，这导致了胶质瘤高达90％的复发率，低级别胶质瘤复发后17％-73％进展为更高级别的胶质瘤，复发后肿瘤细胞生长速度更快，侵袭性更强，放化疗敏感性明显降低。脑胶质瘤的病理进展快及治疗方式单一是困扰临床医生多年的医学难题，因此全面深入地了解胶质瘤的发生发展机制，寻找精准有效的诊断及治疗方法，对改善预后、提高患者生活质量具有重要意义。

长链非编码RNA(long-noncoding RNA，lncRNA)为非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)的一种，长度大于200nt，由于其结构复杂、作用方式多样，且功能强大，已经成为肿瘤领域的研究热点。脑胶质瘤中异常表达的功能性lncRNA不断被发现，如lncRNA HIF1A-AS2、lncRNA-P21等可通过募集信号蛋白、干扰泛素化修饰等方式促进“Warburg”效应。因此研究lncRNA在胶质瘤中的作用机制有望开发新的诊断及治疗靶点。

P53是一种关键的肿瘤抑制因子，在癌症和癌症治疗的发展中发挥着基本和多方面的作用。P53可以通过影响肿瘤细胞的癌基因表达、DNA损伤、代谢功能障碍等调节靶基因的表达，从而诱导细胞周期停滞、凋亡、衰老、DNA修复和代谢变化。P53活性的控制是通过复杂的翻译后修饰系统实现的，包括磷酸化、乙酰化和泛素化，这些修饰会影响p53与其他靶基因的作用以及其参与的生物学过程。而MDM2作为一种经典的E3泛素连接酶，可以在翻译后水平泛素化修饰p53，进而导致其被位于细胞质的蛋白酶体降解，从而影响了p53蛋白的稳定性，最终影响了p53相关的一系列生物过程。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供lncRNA RPAR在胶质瘤诊治中的应用。本发明首次发现lncRNA RPAR的表达量与脑胶质瘤紧密相关，同时研究证实lncRPAR可以通过RPL5-MDM2-P53通路促进胶质瘤的发生发展。因此，lncRNA RPAR作为脑胶质瘤的预测诊断标志物和潜在治疗靶点。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供lncRNA作为标志物在制备脑胶质瘤诊断或辅助诊断产品中的应用。

其中，所述lncRNA包括lncRNA RPAR。

本发明胶质瘤组织芯片分析发现，lncRNA NONHSAT145950.2在脑胶质瘤组织中表达量明显高于正常脑组织，且组织qRT-PCR结果也证实了这一现象，并将其命名为lncRPAR，因此lncRPAR可作为脑胶质瘤的诊断标志物。

本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含用于检测上述lncRNA的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断脑胶质瘤。

其中，检测lncRNA的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。

所述产品包括但不限于检测待测样本中所述lncRNA表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。

所述待测样本可为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者(脑)胶质(瘤)细胞和/或(脑)胶质(瘤)组织。

本发明的第三个方面，提供一种用于诊断或辅助诊断脑胶质瘤的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述lncRNA表达水平的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述lncRNA表达水平判断所述受试者是否患有脑胶质瘤；

所述步骤ii)评估单元具体评估流程包括：

与参照相比，所述受试者的待测样品中的lncRNA表达水平上调，则所述受试者为或候选为脑胶质瘤患者；反之，则所述受试者不为或不候选为脑胶质瘤患者。

本发明的第四个方面，提供一种诊断或辅助诊断脑胶质瘤的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述lncRNA表达水平，以及；

c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；

其中，与参照中的水平相比，样品中表达水平的上调，则所述受试者为或候选为脑胶质瘤患者；反之，则所述受试者不为或不候选为脑胶质瘤患者。

本发明的第五个方面，提供所述lncRNA作为靶点在脑胶质瘤治疗和/或筛选脑胶质瘤药物中的应用。

本发明的第六个方面，提供抑制所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(a2)抑制胶质瘤细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)促进胶质瘤细胞凋亡；

(a4)激活RPL5-MDM2-P53信号通路；

(a5)抑制胶质瘤生长；

(a6)提高受试者生存率；

(a7)预防和/或治疗脑胶质瘤。

本发明的第七个方面，提供一种产品，其活性成分包括抑制所述lncRNA的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(a2)抑制胶质瘤细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)促进胶质瘤细胞凋亡；

(a4)激活RPL5-MDM2-P53信号通路；

(a5)抑制胶质瘤生长；

(a6)提高受试者生存率；

(a7)预防和/或治疗脑胶质瘤。

上述第六至第七方面中的产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂可供基础研究使用。

本发明的第八个方面，提供一种治疗脑胶质瘤的方法，所述方法包括：向受试者施用上述抑制所述lncRNA的表达水平的物质。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次发现lncRPAR的表达量与脑胶质瘤紧密相关，进一步研究证实了lncRPAR与脑胶质瘤中肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡机制相关，并且阐明了lncRPAR通过直接调节下游蛋白RPL5，对P53的降解进行间接调节，提供了完整的通路研究。最后，本发明通过对lncRPAR的敲除证实了敲除lncRPAR对胶质瘤的治疗切实有效，有望开发为新型的治疗药物，弥补目前替莫唑胺等药物的不足。

综上，lncRPAR作为脑胶质瘤的预测诊断标志物和潜在治疗靶点，从而在脑胶质瘤的诊断、治疗中发挥重要作用，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例中胶质瘤细胞及组织中lncRPAR表达情况；

其中，图1A为芯片分析示胶质瘤组织、癌旁组织、正常组织中差异表达lncRNA簇；

图1B为RNA-ISH示lncRPAR在WHO II-IV级胶质瘤组织中的表达情况；

图1C为qRT-PCR示lncRPAR在不同级别胶质瘤组织中的表达情况；

图1D为qRT-PCR示lncRPAR在NHA正常人脑胶质细胞系和U87、U251、T98G胶质瘤细胞系中的表达情况；

图1E为FISH示lncRPAR在U87和U251胶质瘤细胞中的定位；

图2为实施例中lncRPAR促进胶质瘤细胞的增殖、迁移的结果图；

其中，图2A为CCK-8实验评估lncRPAR对细胞增殖能力的影响；

图2B为Edu评估lncRPAR对细胞增殖能力的影响；

图2C为细胞划痕实验评估lncRPAR对细胞增殖的影响；

图3D为Transwell评估lncRPAR对细胞迁移及侵袭的影响；

图2E为裸鼠荷瘤实验评估lncRPAR促进裸鼠脑内胶质瘤的生长；

图2F为裸鼠荷瘤实验评估lncRPAR降低裸鼠生存率；

图3为实施例中lncRPAR通过与RPL5和PSMB2结合，促进RPL5降解；

其中，图3A RNA pull down实验证实lncRPAR与RPL5结合；

图3B RIP实验验证RPL5与lncRPAR结合；

图3C为过表达及敲除lncRPAR后RPL5蛋白水平；

图3D为过表达lncRPAR后RPL5 mRNA水平；

图3E为lncRPAR对RPL5半衰期的影响；

图3F为过表达lncRPAR后RPL5泛素化水平；

图3G为过表达lncRPAR后RPL5与PSMB2结合水平；

图3H为RPL5和PSMB2在胶质瘤细胞中的免疫荧光共定位；

图4为实施例中lncRPAR促进RPL5降解导致P53泛素化降解；

其中，图4A为过表达和敲除lncRPAR后P53蛋白水平；

图4B为过表达和敲除lncRPAR后P53 mRNA水平；

图4C为lncRPAR对P53半衰期的影响；

图4D为过表达lncRPAR后P53泛素化水平；

图4E为过表达RPL5后lncRPAR对P53蛋白水平的影响；

图5为实施例中lncRPAR作用于RPL5-MDM2-P53通路；

其中，图5A为CO-IP实验验证RPL5与MDM2、MDM2与P53结合；

图5B为免疫荧光验证RPL5与MDM2、MDM2与P53结合；

图5C为过表达lncRPAR后RPL5和MDM2的核浆蛋白水平。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

本领域中已知的有数种lncRNA的序列，应理解，以下所示的各个lncRNA的数据库登录号是人来源的mRNA。然而，这些数据库条目还提供了例如以下不同来源的各自lncRNA的数据库登录号：例如任何哺乳动物、爬行动物、或鸟类来源的lncRNA，例如选自实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)的lncRNA的那些。

术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。

术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。

术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。

术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。

在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定lncRNA的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。

如本发明所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。

如本发明所使用的术语“系统”涉及至少包含有效地互相联系以允许进行诊断的上述装置的装置系统。在上文结合本发明的方法公开了优选的用于确定基因产物之甲基化状态或量的装置和用于进行比较的装置。如何以操作方式联系装置将取决于设备中包括的装置的类型。例如，在应用用于自动化确定基因产物的甲基化状态或量的装置的情况下，可以通过例如计算机程序来处理由所述自动化操作装置获得的数据以建立诊断。优选地，在这种情况下，装置包含在单设备中。因此，所述设备可以包括用于确定样品中基因产物的甲基化状态或量的分析单元以及用于处理所得数据用于诊断的评估单元。在上文结合涉及本发明方法的实施方案公开了优选的检测装置。在这种情况下，使装置有效地连接，使得系统的使用者由于手册中给出的说明和解释将量的确定结果及其诊断值结合在一起。在这样的实施方案中装置可以呈现为单独的设备并且优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将了解如何联系装置而无需进一步的创造性技能。优选的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，优选地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或上文根据本发明方法提及的评估单元/设备。

本发明的一个具体实施方式中，用于lncRNA作为标志物在制备脑胶质瘤诊断或辅助诊断产品中的应用。

其中，所述lncRNA包括lncRNA RPAR。本发明胶质瘤组织芯片分析发现，lncRNANONHSAT145950.2在脑胶质瘤组织中表达量明显高于正常脑组织，且组织qRT-PCR结果也证实了这一现象，并将其命名为lncRPAR，因此lncRPAR可作为脑胶质瘤的诊断标志物。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含用于检测上述lncRNA的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断脑胶质瘤。

其中，检测lncRNA的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。

所述产品包括但不限于检测待测样本中所述lncRNA表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。

所述待测样本可为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者(脑)胶质(瘤)细胞和/或(脑)胶质(瘤)组织。同时，通过配合其他脑胶质瘤标志物的联合使用，从而进一步提高检测的特异性和灵敏度。

更进一步的，所述除上述lncRNA生物标志物之外，所述产品还可以包括目前适于检测脑胶质瘤的其他生物标志物及其组合的物质。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断或辅助诊断脑胶质瘤的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述lncRNA表达水平的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述lncRNA表达水平判断所述受试者是否患有脑胶质瘤。

本发明的又一具体实施方式中，以上所述待测样品包括受试者(脑)胶质(瘤)细胞和/或(脑)胶质(瘤)组织。

本发明的又一具体实施方式中，以上所述检测物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述评估单元具体评估流程包括：

与参照相比，所述受试者的待测样品中的lncRNA表达水平上调，则所述受试者为或候选为脑胶质瘤患者；反之，则所述受试者不为或不候选为脑胶质瘤患者。

其中，“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有脑胶质瘤相关症状并且没有异常的生理及病理学发现，参照也可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出脑胶质瘤之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自若干健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有脑胶质瘤症状，也没有相关生理及病理学发现。

本发明的用于诊断或辅助诊断脑胶质瘤的系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述分析单元以及评估单元的功能即可。所述的分析单元可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等；所述评估单元可以是任何可以实现对分析单元的检测结果进行分析处理而得出脑胶质瘤患病风险评估状况的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将各种可能的检测结果与对应的患病风险情况制定相应的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出脑胶质瘤发病风险评估结果。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诊断或辅助诊断脑胶质瘤的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述lncRNA表达水平，以及；

c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；

与参照中的水平相比，样品中表达水平的上调，则所述受试者为或候选为脑胶质瘤患者；反之，则所述受试者不为或不候选为脑胶质瘤患者。

其中，“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有脑胶质瘤相关症状并且没有异常的生理及病理学发现，参照也可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出脑胶质瘤之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自若干健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有脑胶质瘤症状，也没有相关生理及病理学发现。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述lncRNA作为靶点在脑胶质瘤治疗和/或筛选脑胶质瘤药物中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述脑胶质瘤药物为预防和/或治疗脑胶质瘤的药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述筛选脑胶质瘤药物的方法包括：

1)采用候选物质处理表达和/或含有所述lncRNA的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；

2)完成步骤1)后，检测体系中所述lncRNA的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述DNA的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的脑胶质瘤药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述体系可为细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

本发明的又一具体实施方式中，所述细胞体系中的细胞可以为脑胶质(瘤)细胞；

本发明的又一具体实施方式中，所述组织体系中的组织可以为脑胶质(瘤)组织；

本发明的又一具体实施方式中，所述器官体系中的器官可以为脑；

本发明的又一具体实施方式中，所述动物体系中的动物可以为非人哺乳动物，包括但不限于大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猴、猩猩等。

本发明的又一具体实施方式中，提供抑制所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(a2)抑制胶质瘤细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)促进胶质瘤细胞凋亡；

(a4)激活RPL5-MDM2-P53信号通路；

(a5)抑制胶质瘤生长；

(a6)提高受试者生存率；

(a7)预防和/或治疗脑胶质瘤。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括抑制所述lncRNA的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制胶质瘤细胞增殖；

(a2)抑制胶质瘤细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)促进胶质瘤细胞凋亡；

(a4)激活RPL5-MDM2-P53信号通路；

(a5)抑制胶质瘤生长；

(a6)提高受试者生存率；

(a7)预防和/或治疗脑胶质瘤。

本发明的又一具体实施方式中，所述抑制lncRNA的表达水平的物质可以以上述lncRNA为靶序列且能够抑制所述lncRNA表达的干扰分子，具体可包括shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)，dsRNA、微小RNA、反义核酸，或，能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA，dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；还可以包括化合物类小分子抑制剂。

本发明的又一具体实施方式中，上述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂可供基础研究使用。

当所述产为药物时，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。

所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肤、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

所述药物还可与其他预防和/或治疗脑胶质瘤的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。

本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗脑胶质瘤的方法，所述方法包括：向受试者施用上述抑制所述lncRNA的表达水平的物质；所述lncRNA为lncRNA RPAR。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1.材料及方法

1.1临床标本

实验所用87例原发性胶质瘤组织标本均取材于山东省千佛山医院(中国，济南)。已获山东大学医学伦理委员会批准。通过RNA原位杂交试验检测LncRPAR在不同级别胶质瘤组织中的表达差异。

1.2细胞培养

实验所用胶质瘤细胞系U87和U251购自普诺赛(中国武汉)，细胞培养于37℃，5％CO₂细胞培养箱，培养基配方：DMEM高糖培养基(Vivacell，中国上海)：FBS胎牛血清(普诺赛，中国武汉)：链霉素-青霉素联合抗生素(BI,以色列)为100：10：1。所有操作均在细胞间超净工作台内进行。

1.3提取细胞和组织RNA

为防止RNA降解，全程操作在冰上进行。取出呈对数增长的细胞，弃培养基，用不含RNA酶的冰PBS冲洗细胞，重复一次；对于组织，在液氮下用研杵研磨至粉末状。每5×10⁶个细胞加入1mL Trizol(全式金，中国上海)，静置5min，用移液器反复吹打细胞，待细胞裂解后，移入提前标记好的无RNA酶的EP管内。每1mL Trizol加入20μL氯仿，盖紧EP管并充分震荡混匀，直到液体呈现粉红色。4℃，12000r离心15min，可以看到液体分成上中下三层。取上层水相记录体积，此层含有RNA，千万不要触碰到中间层DNA和下层有机相以免造成RNA污染。加入和上清等体积的异丙醇，轻柔混匀，冰上静置5min。4℃，12000r离心15min，可看到EP管底部有白色沉淀，就是总RNA。弃上清，加入和异丙醇等体积的75％乙醇，轻轻吹打清洗RNA沉淀，4℃，12000r离心3min。重复此步骤一次。弃去上清，打开EP管，将RNA晾干。加入适量DEPC水将RNA沉淀彻底溶解。使用NanoDrop2000分光光度计测RNA浓度，标记好，存放于-80℃。

1.4 qRT-PCR

cDNA的合成采用PrimeScript RT试剂盒(Takara)。qRT-PCR使用的试剂和仪器设备：SYBR Green PCR kit(Applied Takara，Japan)，ABI 7300(Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)。按两步法PCR扩增程序进行qRT-PCR。预变性反应：单一循环为95℃30sec；PCR反应：95℃5sec-60℃20sec，循环数：40。数据处理。根据各样本CT值，取三个复孔平均数为该样品CT值。计算△CT＝CT(目的)-CT(内参)，△△CT＝SCT(实验组)-△CT(对照组)。计算目的基因相对量，然后按照相对表达量结果运用t检验分析，以P<0.05为有统计学意义。

1.5荧光原位杂交实验(FISH)

将细胞爬片铺至24孔板底部，培养适量细胞，使细胞密度达到60％-70％进行实验，实验所用试剂盒和探针均来自锐博生物(中国广东)。弃去细胞培养基PBS清洗1次，加入4％多聚甲醛室温固定10min后PBS清洗3次，加入通透液4℃静置10min后PBS清洗3次。每孔加入200ul预杂交液，37℃封闭30min，弃去预杂交液，避光条件下加入100ul含有2.5ullncRPAR探针的杂交液37℃杂交过夜。过夜后弃去杂交液，分别用42℃杂交洗液I、II、III清洗1次，PBS清洗一次后加入DAPI进行DNA染色，PBS冲洗三次后封片在共聚焦显微镜下观察。

1.6过表达及敲除lncRPAR

取生长状态良好的细胞，种入6孔板中，待细胞密度达到50％-70％后进行转染。先将细胞培养基换成1750ul不含血清的高糖培养基继续培养30min。配置转染试剂体系，每孔配置250μL无血清高糖培养基+空载质粒/lncRPAR质粒(smart-NC/smart-lncRPAR)+5μLLipofectamine 2000转染试剂，配好后静置20min。将转染试剂体系加入到6孔板中，缓慢摇匀并标记好转染内容，继续培养6h后弃转染试剂，换成正常培养基，继续培养细胞72h后qRT-PCR验证效率。

1.7细胞划痕实验

先用marker笔在6孔板背后用直尺均匀划出横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线，在每孔中加入约5×10⁵个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入细胞培养箱培养，按0、6、12、24小时取样拍照。

1.8 Edu实验

取对数生长期细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。用含10％FBS的DMEM高糖培养基制备50μL Edu培养基。每孔加100μL配制好的培养基，放回孵箱孵育2小时，吸除培养基。1×PBS洗3次，每次5分钟。用50μL 4％多聚甲醛的PBS室温孵育15分钟，弃废液。每孔加入50μL 2mg/mL glycine solution，孵育5分钟，弃废液。每孔加入100u L PBS，5分钟，弃PBS。每孔加入100μL含0.5％TritonX100的PBS溶液脱色摇床孵育10分钟，1xPBS清洗5分钟。在避光条件下加入100μL的1x Apollo染色反应液到每个反应孔，用锡箔纸包裹96孔板，在室温条件下.脱色摇床孵育30分钟，弃废液。每空加100μL渗透剂脱色摇床清洗10分钟重复三次，弃渗透剂；每孔加入50μL DAPI染液，用锡箔纸再次包住96孔板，脱色摇床孵育10分钟后，弃染色液。每孔每次加入100μL PBS清洗3次。每孔滴上15μL防荧光淬灭剂，用荧光显微镜观察并记录。

1.9 CCK-8实验

取4个96孔板分别接种细胞，37℃，5％CO₂预培养。加入每孔加10μL CCK-8试剂(Vazyme，中国江苏)，继续培养2h。分别于24h、48h、72h用酶标仪检测450nm处的吸光度。收集数据并分析细胞增殖情况。

1.10 Transwell细胞迁移侵袭实验

细胞撤血清饥饿12h，制备细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵。取200μL细胞悬液种于提前处理好的Transwell小室上室。下室加入500μL含血清的完全培养基。继续常规培养细胞8h。弃掉上、下层培养基，用棉签擦去基质胶和上层的细胞，PBS冲洗两遍，用0.1％的结晶紫染色10min，弃掉结晶紫，PBS洗10min二遍。取出小室，倒置显微镜下拍照。

1.11流式细胞术

U87及U251细胞以2×10⁵/孔的密度接种于六孔板中。转染48h后，用0.08％胰蛋白酶消化细胞，冰冻PBS洗涤3次。之后用抗体标记细胞，并使用FACS Calibur细胞仪(BeckmanCoμLter，KBB，CA，USA)测量分析。

1.12小鼠体内成瘤实验

不同转染处理后的人U87细胞常规培养传代，在细胞生长处于对数生长期大约80％时，以0.25％胰酶消化、收集、洗涤、重悬细胞待接种，接种的细胞量配制成5×10⁵/10μl备用。立体定向裸鼠脑内接种细胞，异氟烷吸入麻醉后，立体定向架固定，头部去毛，常规消毒后沿中线纵向切开头皮，暴露前囟，前囟中点前1mm，矢状缝旁开3mm处用磨钻钻一骨孔。微量注射器抽取细胞悬液10μl(约5×10⁵个细胞)，垂直固定于立体定向架上，经骨孔处进针硬脑膜下6mm，后退1mm，于10min内将细胞悬液注完，再静止3min，使细胞充分沉积，再缓慢拔针，缝合头皮，常规饲养。所有动物模型均由同一人完成以减少实验误差。术后分别在6、12、24天时通过小动物活体光学成像系统监测肿瘤生长情况。

1.13蛋白提取

搜集贴壁细胞后PBS重悬清洗一次，离心后加入适量RIPA细胞及组织裂解液，并加入1％体积蛋白酶抑制剂，冰上裂解30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清用BCA法(Vazyme，中国江苏)测蛋白浓度，剩余上清加入上样缓冲液金属浴98℃加热10min，放入-20℃冰箱备用。

1.14 Western blot

提取细胞总蛋白，取10％凝胶配置试剂，用1.0mm的玻璃板配置电泳所需凝胶，待胶凝固好后放置于电泳槽内，加入电泳液，拔掉梳子，加入蛋白Marker和待测样品。甲醇中浸泡20秒来激活PVDF膜，按照Marker指示条带切取所需凝胶片段，按照黑胶白膜的标准放置于转膜的夹子上，把激活的PVDF膜覆盖于凝胶上，300mA转膜。将转好的PVDF膜用1xTBST摇床洗3min，用5％的脱脂牛奶封闭，室温摇床孵育1.5h。根据说明书配置一抗(PSMB2,RPL5,MDM2,P53一抗按照1：1000稀释，抗体均来自Abcam,美国；GAPDH一抗按照1：1000稀释，来自Cell Signaling Technology，美国)，加入配置好的一抗于4℃摇床孵育过夜。用1xTBST清洗PVDF膜，室温摇床洗5min重复3次。按1：1000的比例用5％的牛奶配置一抗相对应来源的二抗，室温摇床孵育1h。弃掉二抗，1xTBST洗，5min重复3次。按1:1的比例配置ECL发光液，每张膜有蛋白的一面均匀加上200μL发光液，将PVDF膜放入凝胶成像仪内进行成像并记录。

1.15蛋白半衰期测定

培养细胞至70％密度以上时，弃去完全培养基，加入无血清DEME及CHX(selleck，美国)使其浓度为100ug/ml，间隔适当时间段搜集细胞提取蛋白做western blot分析，测定蛋白半衰期。

1.16 RNA-pull down

将含有lncRPAR正义及反义序列质粒的甘油菌转入LB培养基中，摇菌过夜后提取质粒，用相应的限制性内切酶(Thermo Fisher Scientific，美国)线性化，制备用于体外转录的模板DNA，并用DNA纯化试剂盒(TIANGEN,中国北京)纯化，纯化后使用T7体外转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)37℃孵育过夜，过夜后在RNA 3’末端连接生物素(3’末端生物素连接试剂盒，Thermo Fisher Scientific，美国)。体外转录的RNA与细胞裂解液进行pull down实验(pull down试剂盒，Thermo Fisher Scientific，美国)，提取洗脱液用于蛋白印迹分析。

1.17 RNA免疫共沉淀(RIP)

本实验使用的RIP试剂盒来源于吉赛生物(中国广东)。首先将磁珠预处理后，加入5ug IgG及相应蛋白抗体(IP级别)，在4℃旋转混匀孵育2h，期间提取细胞蛋白，1ml buffer裂解后分为input组100ul、IgG组450ul和RIP组450ul，IgG和RIP组裂解液加入结合了一抗的磁珠中，4℃旋转混匀孵育过夜，过夜后弃掉上清，清洗去除非特异性结合RNA，用洗脱液洗脱后过柱提取RNA，保存于-80℃备用。

1.18免疫共沉淀(Co-IP)

细胞转染后24～48h收蛋白，将细胞培养皿放于冰上，用预冷PBS洗三次。加入适量IP细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解10min。用细胞刮轻轻刮下细胞，用移液枪将细胞裂解液转移至干净EP管中，冰上轻轻吹打，避免气泡产生。然后于4℃13000g离心10min后取上清。取少量裂解液转移至干净EP管中，以备Western blot分析。剩余裂解液加40μL相应的带有抗体的琼脂糖珠加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜。免疫沉淀反应后，在4℃以1000g速度离心5min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，管底的琼脂糖珠用预冷PBS洗三次。然后加入50μL裂解缓冲液，最后加入12.5μL的5×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟,以游离抗原、抗体、珠子。4℃离心机，最大转速离心10min，取上清，并进行蛋白免疫印迹实验。

1.19免疫荧光

将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次,用多聚甲醛固定后的细胞，在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3min,重复5次。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。加入稀释好的一抗(PSMB2,RPL5,MDM2,P53一抗按照1：200稀释，抗体均来自Abcam,美国)室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

1.20蛋白核浆分离实验

取5-10×10⁶个细胞，4℃，500g离心3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。4℃，500g离心5分钟。在细胞沉淀中加入400μL冷的提取液A(碧云天。中国上海)，涡旋振荡混匀或吹打混匀，置冰上振荡20-30分钟。细胞数量根据实验情况调整，每次的提取液用量并不是一定的，大约为细胞体积的5-10倍。每400μL提取液A中加入4μL蛋白酶抑制剂。4℃，1200g离心5分钟。将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到胞浆组分，请置冰箱保存备用或直接用于下游实验。沉淀用PBS重悬，然后4℃，2000g离心5分钟，弃上清。沉淀为细胞核组分，将沉淀用200μL保存液B重悬后保存备用或直接用于下游实验。

1.21统计分析

利用GraphPad Prism 8软件使用学生t检验(双尾)进行数据分析。所有数据均以三个独立实验的平均值±标准误差表示。p<0.05被认为具有统计学意义。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)

2.1在胶质瘤组织中lncRPAR呈高表达状态并主要定位在细胞浆中；

测序结果表明GBM、癌旁和正常组织样本中lncRNA的差异表达簇。后缀n-signal、e-signal和t-signal分别代表正常组织样本、癌旁信号和GBM组织样本。红色表示上调的lncRNA，绿色表示下调的lncRNA(图1A)。在所有差异表达的lncRNA中，本实施例分析并筛选出具有明显差异表达的其中一个lncRNA，即NONHSAT145950.2；其序列信息如下：

AGGGCCTGGCGCACATAAGGTGTGACCTTTTCATTCCCGTTGTTATGGAGGGCCACATCTGCCAGAGCCTGGAGTCTGCGAAGGCCGGGACCCGGTTCCCCGGCCCACAGTGGGGGTGTGCAAACCCGAGAGAACTGGGTAAGTTGGGGTCGGCTTGCAGTTTGGGGTACCCCGAGGGCGGTGTACGTCGGTAAGATTGTAACAGTATTACTGGAAGACTTATTCGACTGTCCTGATGATACTTGTAATAGGAAGTGCCGTCAGAAGCGATAACTGACGACGTCTAATGTCTATCTGACCGCAGTCGCTGAAACCTCTACAACTTAGTTGACCGTAACTGCCAGAGCCCTGCCCTGAATTCCTGTCCTTACTCCCTCTTTAAGATTGCGTACCCACTGCAGAGTGCTGAAGACGGGGTAGCCACGAGGTGAGAGGCTCTCTGGTGTAGGGTTTAACATGGAACGTAGTTTTGTCACTTGAATGCACGGAAATTGGCGTTTTGACAGTTTTCTACGTTTAGGTGTTTTATACACTTTAGGGTAACGTTATCATGTCATTGCATAGGGTGGAACTTAAATAGAAACTGGAGATGGCTGCTTCAGCCACAGTCCTAACCTAGAACTGCATTTAAAGCAAACTGATAATGCAGAAACAAACTCCTTCGTTAAGAAATGTCTCCAGTAGCAGGGTTAGCTTAAGTTTCAGGTAGGGTCTAGATCTGCGGTTGGAACAGTACTGGAGGGTTGTGAGGTGCTTGACTGCTCTGATGAAATCACTAATAGGAAGTGCCGTCAGAAGCGATAACTGACGAAGACTACTCCTGTCTGATTGCAGTCAAGTCTTCACCACTTGCTGGTTCCCAGGAGTAAACTTGTTTGAACGGTGACCTAATTGCTATATTCACCTAGGTTGCAAATTCGTGAAGAATCAGCATCATGTTTGGCAGCTGAGTATTGGAGCCAGGAGCCTGCCATGAGGTTTTGAGAACAGAGTGCTGTTTTAGAGCTGGCAGCAGCATCTCAGCCCAAGAGAAGGTTATATTCCCAGAGGATGTCAGTCCCAAGGACCAGTAGCTGCCATCAGTTTGGATTCTGAAAACTAACTGGCATCAACACTGGGTGTAGAAACATGCTTGCCTTATGTATCAGAGGACATGCTCAGCAGATCCAAGAGATATATTTGGCAACTTTTTCTAGAAAAGGCACATTGGGTATCATTCATTACATTCTTGAGTTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGACAGTCTTGCTGTATTGCCCAGGCTGGAGTGTGGTGGCACAATCACAGCTCATTGCATCCTCAATCACCCAGGCCTAAGCAATCCTCCCACCTTGTAGCTGGGACTACAGCTCACAGCACACCTGGCTAAAATTTTTTTTTTGTTGAGACGGATTCTCTATGTTGCCCAGGCTGGTCTCAGGCTCCTGGGCTCAGATGGTCCTCCTGCCTCAGCTTCCAAAGGCACAGGCCAAGTTGTAGCTTTGTCCCTTGCCATCATGCCCAACAAGAGGTTCTATACCTTTTAATGAATTGACTTTCATAAATTGGTTATGTTGGTGGGCAAAGTTCTTTAAGCTGGAAATTGTAAATTCCTCCTGAAATGTTTTTTCATGCAGTTACCATGAACTAATACTACAA，SEQ ID NO.1，将其命名为lncRPAR(long noncoding RPL5 and P53 Associated RNA)。随后进行了RNA原位杂交试验，表明lncRPAR在高级别胶质瘤(WHO IV)中的表达水平显著高于低级别胶质瘤(WHO II-III)(图1B)。随后在正常脑组织和胶质瘤组织中提取RNA并进行qRT-PCR实验，使用针对lncRPAR序列设计合成的特异性引物，结果表明相比于正常脑组织，lncRPAR在胶质瘤组织中表达明显增高，其表达水平和胶质瘤级别呈正相关(图1C)。同时，本实施例也通过qRT-PCR实验在人脑正常胶质细胞系NHA和人脑胶质瘤细胞系U87、U251、T98G中也进行了lncRPAR表达水平的验证，发现胶质瘤细胞系中lncRPAR表达水平明显高于NHA细胞系(图1D)。通过FISH实验发现lncRPAR的亚细胞定位，可同时位于胶质瘤细胞系U87、U251的细胞浆和细胞核，但以细胞浆为主(图1E)。综上这些结果初步表明lncRPAR在胶质瘤中表达有显著差异，并同时定位于细胞浆和细胞核。

2.2 lncRPAR促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移，抑制胶质瘤细胞凋亡为了验证lncRPAR是否影响胶质瘤发生发展，本实施例使用lncRNA smart silencer(lncRNA smartsilencer为siRNA、ASO的混合物，其中包含的siRNA和ASO序列为：

GTCCTAACCTAGAACTGCA，SEQ ID NO.2；

CAAACTCCTTCGTTAAGAA，SEQ ID NO.3；

GGTGGAACTTAAATAGAAA，SEQ ID NO.4；

CCACAGTCCTAACCTAGAAC，SEQ ID NO.5；

GCAGAAACAAACTCCTTCGT SEQ ID NO.6；

CCTTCGTTAAGAAATGTCTC，SEQ ID NO.7)和过表达质粒转染胶质瘤细胞U87、U251、T98G从而构建了lncRPAR低表达和高表达的胶质瘤细胞，并进行了一些表型实验。CCK-8和EdU实验表明过表达lncRPAR促进胶质瘤细胞增殖，敲低后抑制了胶质瘤细胞的增殖(图2A-B)，而细胞划痕实验和Transwell实验表明敲低lncRPAR后，胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力被抑制(图2C-D)。同时，用载有pcDNA3.1-lncRPAR质粒的腺病毒构建了lncRPAR持续过表达的胶质瘤细胞，将其种植到裸鼠脑部，观察其存活天数，并分别在第6天、第12天、第24天通过小动物活体成像仪观察裸鼠脑内肿瘤生长的体积，结果表明相比于被植入阴性对照胶质瘤细胞的裸鼠，lncRPAR过表达后，裸鼠脑内肿瘤体积随着生存天数的增加而有显著增长，然而裸鼠的总体生存率呈下降趋势(图2E-F)。以上体内外实验结果表明，lncRPAR可以促进胶质瘤增殖、侵袭、迁移等能力从而影响胶质瘤的发生发展。

2.3 lncRPAR通过与RPL5和PSMB2结合，促进RPL5降解；

为了验证lncRPAR下游靶蛋白，本实施例利用RNApull down实验联合质谱分析筛选出其下游结合蛋白RPL5，并利用蛋白印迹实验进行验证(图3A)，RNA免疫共沉淀实验同样证明了两者可相互结合(图3B)。接下来，本实施例进一步验证lncRPAR对RPL5蛋白水平的影响，蛋白印迹显示过表达lncRPAR后RPL5水平明显下降(图3C)，而qRT-PCR实验显示RPL5mRNA水平无明显变化(图3D),进一步验证RPL5的降解速率，加入CHX抑制蛋白合成后，过表达lncRPAR可明显加快RPL5的降解速度，缩短其半衰期(图3E)，因此推测lncRPAR可促进RPL5降解，但是RPL5的泛素化实验结果显示lncRPAR不会影响其泛素化水平(图3F)。质谱结果显示lncRPAR可以结合蛋白酶体亚基PSMB2，通过蛋白免疫共沉淀实验证实过表达lncRPAR可以促进RPL5与PSMB2的结合(图3G)，进而导致RPL5与蛋白酶体的结合促进其降解，蛋白免疫荧光实验也证实了RPL5与PSMB的结合(图3H)。

2.4 lncRPAR通过促进RPL5降解导致P53泛素化降解；

已知RPL5对P53通路具有调节作用，故本实施例依此验证lncRPAR对P53通路的影响，通过过表达lncRPAR后发现P53蛋白水平明显降低(图4A)，而其mRNA水平无明显变化(图4B)，CHX抑制实验显示P53蛋白半衰期明显缩短(图4C)。P53泛素化实验显示过表达lncRPAR后P53蛋白泛素化水平明显升高(图4D)，蛋白泛素化修饰是其通过蛋白酶体途径降解的必要条件，而过表达lncRPAR可增加P53泛素化水平进而促进其降解。本实施例进一步验证RPL5为这一过程的媒介，过表达RPL5后lncRPAR促进P53降解的趋势得到回复(图4E)，证实lncRPAR通过下调RPL5的水平促进P53的泛素化降解。

2.5 lncRPAR作用于RPL5-MDM2-P53通路促进P53降解；

在P53蛋白泛素化修饰过程中，MDM2作为其特异性E3泛素化连接酶，可以结合P53蛋白并促进其泛素化修饰，P53的泛素化修饰发生在细胞核中，而泛素化修饰后的P53转运至细胞质中在蛋白酶体的作用下快速降解。本实施例通过蛋白免疫共沉淀实验证实了RPL5与MDM2、MDM2与P53可互相结合(图5A)，蛋白免疫荧光共定位同样证实了这一现象(图5B)，过表达lncRPAR后蛋白核浆分离实验显示胶质瘤细胞核中MDM2明显升高，而细胞浆中明显降低(图5C)，证明lncRPAR可以促进MDM2核移位而促进P53泛素化修饰，证明lncRPAR通过促进RPL5的降解导致MDM2向核内移位，最终促进P53的泛素化降解。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.lncRNA RPAR作为标志物在制备脑胶质瘤诊断或辅助诊断产品中的应用；

其中，所述lncRPAR RPAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.抑制lncRNA RPAR的表达水平的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

（a1）抑制胶质瘤细胞增殖；

（a2）抑制胶质瘤细胞的侵袭和/或迁移；

其中，所述lncRNA RPAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。