CN116194589A - 用于转座酶可及染色质的单细胞测定 - Google Patents
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Abstract
本文的公开内容包括用于标记DNA(例如，开放染色质相关gDNA)的系统、方法、组合物和试剂盒。方法可以包括使双链DNA(dsDNA)(诸如gDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端。转座体可以包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。第一5’突出端可以包含珠寡核苷酸的靶结合区的互补物。第一5’突出端可以包含偶联序列。第二5’突出端可以包含通用序列。在一些实施方案中，提供了包含5’偶联序列的互补物和3’珠寡核苷酸的靶结合区的互补物的偶联寡核苷酸。
Description
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年7月31日提交的美国临时专利申请系列第63/059,715号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
背景
领域
本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如使用分子条形码化(molecularbarcoding)确定开放染色质区域。
对相关技术的描述
当前的技术允许通过在每个细胞与条形码化试剂珠在隔室(compartment)中共定位时将细胞特异性寡核苷酸条形码附接至来自个体细胞的多(A)mRNA分子而以大规模并行的方式(例如，>10000个细胞)测量单细胞的基因表达。对用于标记和鉴定单细胞基因组的开放染色质区域的系统和方法存在需求。
概述
本文的公开内容包括用于标记DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及使用第一多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化，以产生多于一个条形码化DNA片段，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，并且其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与多于一个dsDNA片段中的至少一个的第一5’突出端杂交的第一靶结合区。在一些实施方案中，使用第一多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：使dsDNA片段的第一链的第一5’突出端与第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第一靶结合区杂交；以及使所述dsDNA片段的第二链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码。方法可以包括：在将第二链连接到寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第二链和所述杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。在一些实施方案中，使第二链连接到寡核苷酸条形码使用DNA连接酶来进行。在一些实施方案中，第一5’突出端包含第一靶结合区的互补物。
本文的公开内容包括用于标记DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子，并且其中第一5’突出端包含偶联序列；提供包含5’偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物的偶联寡核苷酸；以及使用第二多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化以产生多于一个条形码化DNA片段，其中第二多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第二靶结合区。在一些实施方案中，使用第二多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：使dsDNA片段的第一链的偶联序列与偶联寡核苷酸的5’偶联序列的互补物杂交；使偶联寡核苷酸的3’第二靶结合区的互补物与第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第二靶结合区杂交；以及使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码并延伸所述第一链；和/或使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸并延伸所述第二链。方法可以包括：在使第一链连接到寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第一链和杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。方法可以包括：在使第二链连接到偶联寡核苷酸之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第二链和偶联寡核苷酸之间的缺口。在一些实施方案中，使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码和/或使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸用DNA连接酶来进行。
偶联寡核苷酸可以是单链寡核苷酸。在一些实施方案中，偶联寡核苷酸包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，偶联序列包含至少4个核苷酸。在一些实施方案中，多于一个dsDNA片段包含一个或更多个缺口。方法可以包括：用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充一个或更多个缺口。在一些实施方案中，第一5’突出端和/或第二5’突出端包含至少4个核苷酸。在一些实施方案中，第二5’突出端包含第二通用序列。在一些实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子包含转座子的DNA末端序列。
在一些实施方案中，使dsDNA与转座体接触包括使细胞透化和/或分离细胞的细胞核，其中细胞包含dsDNA。在一些实施方案中，细胞包括单细胞。在一些实施方案中，dsDNA包括基因组DNA(gDNA)。在一些实施方案中，多于一个dsDNA片段包含开放染色质相关gDNA。在一些实施方案中，透化包括化学透化或物理透化。在一些实施方案中，透化包括使细胞与去污剂和/或表面活性剂接触。在一些实施方案中，透化包括通过声处理使细胞透化。方法可以包括：使细胞中的细胞核透化以产生透化的细胞核。方法可以包括：在使细胞核透化之前固定包含细胞核的细胞。在一些实施方案中，转座酶包括Tn5转座酶。
方法可以包括：获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据。方法可以包括：基于获得的测序数据中多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列确定与gDNA相关的信息。在一些实施方案中，确定与gDNA相关的信息包括基于获得的测序数据中多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列确定gDNA的染色质可及性。在一些实施方案中，确定gDNA的染色质可及性包括：比对多于一个条形码化DNA片段的序列与gDNA的参考序列；以及鉴定对应多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段末端具有高于阈值的可及性的gDNA区域。在一些实施方案中，确定gDNA的染色质可及性包括：比对多于一个条形码化DNA片段的序列与gDNA的参考序列；以及基于测序数据中多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的数目，确定对应多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的末端的gDNA区域的可及性。在一些实施方案中，确定与gDNA相关的信息包括基于获得的测序数据中多于一个条形码化DNA片段的序列确定gDNA的甲基化组信息。方法可以包括：消化与双链gDNA关联的核小体。方法可以包括：对多于一个dsDNA片段或其产物的胞嘧啶碱基进行化学转化和/或酶促转化，以产生具有尿嘧啶碱基的多于一个转化的dsDNA片段，其中化学转化包括亚硫酸氢盐处理，并且其中酶促转化包括APOBEC介导的转化。在一些实施方案中，对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括对多于一个转化的dsDNA片段或其产物进行条形码化。在一些实施方案中，确定甲基化组信息包括：确定测序数据中多于一个条形码化DNA片段具有胸腺嘧啶碱基的位置以及gDNA的参考序列中具有胞嘧啶碱基的相应位置以确定gDNA中具有5-甲基胞嘧啶(5mC)碱基和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)碱基的相应位置。
在一些实施方案中，细胞包含核酸靶的拷贝。方法可以包括：使第三多于一个寡核苷酸条形码与核酸靶的拷贝接触以进行杂交，其中第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、能够与核酸靶的拷贝杂交的第三靶结合区和分子标记；使与核酸靶的拷贝杂交的第三多于一个寡核苷酸条形码延伸，以产生多于一个条形码化核酸分子，每个条形码化核酸分子包含与核酸靶的至少一部分互补的序列；以及获得多于一个条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定细胞中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，确定细胞中核酸靶的拷贝数包括基于与多于一个条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。
方法可以包括：使随机引物与多于一个条形码化核酸分子接触，其中随机引物中的每一个包含第三通用序列或其互补物；以及使与多于一个条形码化核酸分子杂交的随机引物延伸以产生多于一个延伸产物。方法可以包括：使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增多于一个延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个延伸产物。方法可以包括：基于与第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。
方法可以包括：使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增第一多于一个条形码化扩增子，从而产生第二多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，扩增第一多于一个条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到第一多于一个条形码化扩增子。方法可以包括：基于与第二多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，第一多于一个条形码化扩增子和/或第二多于一个条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。
方法可以包括：使用多于一个条形码化核酸分子作为模板合成第三多于一个条形码化扩增子以产生第三多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，合成第三多于一个条形码化扩增子包括对多于一个条形码化核酸分子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，合成第三多于一个条形码化扩增子包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和靶特异性引物进行的PCR扩增。方法可以包括：获得第三多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。在一些实施方案中，获得序列信息包括将测序衔接子附接到第三多于一个条形码化扩增子或其产物。方法可以包括：基于与第三多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。
在一些实施方案中，核酸靶包括核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合。在一些实施方案中，使第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使多于一个寡核苷酸条形码延伸。在一些实施方案中，DNA聚合酶包括Klenow片段。在一些实施方案中，逆转录酶包括病毒逆转录酶(例如，鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)。在一些实施方案中，第一靶结合区、第二靶结合区和/或第三靶结合区包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。
在一些实施方案中，获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到多于一个条形码化DNA片段或其产物。方法可以包括：使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个条形码化DNA片段，从而产生第四多于一个条形码化DNA片段。在一些实施方案中，扩增多于一个条形码化DNA片段包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个条形码化DNA片段。在一些实施方案中，获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据包括获得第四多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。
在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第一通用序列。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列是相同的。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列是不同的。在一些实施方案中，第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。在一些实施方案中，测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。
在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含分子标记。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的第一分子标记序列。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码的每种分子标记包含至少6个核苷酸。
在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码与固体支持物关联。在一些实施方案中，与同一固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含相同的样品标记。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码的每种样品标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含细胞标记。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码的每种细胞标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，与同一固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记。在一些实施方案中，与不同固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。
在一些实施方案中，固体支持物包括合成颗粒、平坦表面或其组合。方法可以包括：使包含第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码的合成颗粒与细胞关联。方法可以包括：在将合成颗粒与细胞关联后裂解细胞。在一些实施方案中，裂解细胞包括加热细胞、使细胞与去污剂接触、改变细胞的pH或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒和单细胞在同一分区(partition)中。在一些实施方案中，分区是孔或液滴。
在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被固定或部分地固定在合成颗粒上，或者第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被包封或部分地包封在合成颗粒中。在一些实施方案中，合成颗粒是可破坏的(例如，可破坏的水凝胶颗粒)。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠。在一些实施方案中，珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠，或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮，以及其任何组合。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含接头官能团。在一些实施方案中，合成颗粒包含固体支持物官能团。在一些实施方案中，支持物官能团和接头官能团彼此关联。在一些实施方案中，接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：转座体，其包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及第一多于一个寡核苷酸条形码，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与第一5’突出端杂交的第一靶结合区。
本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：转座体，其包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子，其中第一5’突出端包含偶联序列；以及偶联寡核苷酸，其包含5’偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物。
试剂盒可以包含：第二多于一个寡核苷酸条形码，其中第二多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第二靶结合区。在一些实施方案中，偶联寡核苷酸是单链寡核苷酸。在一些实施方案中，偶联寡核苷酸包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，偶联序列包含至少4个核苷酸。在一些实施方案中，第一5’突出端和/或第二5’突出端包含至少4个核苷酸。在一些实施方案中，第二5’突出端包含第二通用序列。在一些实施方案中，第一衔接子和/或第二衔接子包含转座子的DNA末端序列。试剂盒可以包含：缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶。在一些实施方案中，其中DNA聚合酶包括Klenow片段。试剂盒可以包含：逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录酶包括病毒逆转录酶(例如，鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)。试剂盒可以包含：连接酶。试剂盒可以包含：去污剂和/或表面活性剂。试剂盒可以包含：缓冲液、筒(cartridge)或两者。试剂盒可以包含：一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。在一些实施方案中，转座酶包括Tn5转座酶。
试剂盒可以包含：第三多于一个寡核苷酸条形码，其中第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第三靶结合区。在一些实施方案中，第一靶结合区、第二靶结合区和/或第三靶结合区包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含分子标记。在一些实施方案中，分子标记包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码与固体支持物关联。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含细胞标记。在一些实施方案中，与同一固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记。在一些实施方案中，与不同固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。
在一些实施方案中，固体支持物包括合成颗粒、平坦表面或其组合。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被固定或部分地固定在合成颗粒上，或者第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被包封或部分地包封在合成颗粒中。在一些实施方案中，合成颗粒是可破坏的(例如，可破坏的水凝胶颗粒)。在一些实施方案中，合成颗粒包括珠。在一些实施方案中，珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠，或其任何组合。在一些实施方案中，合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含接头官能团。在一些实施方案中，合成颗粒包含固体支持物官能团。在一些实施方案中，支持物官能团和接头官能团彼此关联。在一些实施方案中，接头官能团和支持物官能团单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮，以及其任何组合组成的组。
附图简述
图1图示了非限制性示例性条形码。
图2示出条形码化和数字计数的非限制性示例性工作流程。
图3是示出用于从多于一个靶产生在3’末端条形码化的靶的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。
图4A-图4B是本文公开的用于标记单细胞中的DNA(例如，gDNA)的组合物和方法的非限制性示意图。
图5A-图5D示出了用于标记单细胞中的DNA(例如，gDNA)的非限制性示例性工作流程的示意图。
图6A-图6D示出了用于标记单细胞中的DNA(例如，gDNA)的非限制性示例性工作流程的示意图。
详述
以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确设想并且构成本公开内容的一部分。
本文提及的所有专利、公开的专利申请、其他出版物和来自GenBank的序列，以及其他数据库关于相关技术通过引用以其整体并入。
对少量核酸(例如信使核糖核苷酸(mRNA)分子)进行定量对于确定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因是临床上重要的。然而，确定核酸分子(例如，mRNA分子)的绝对数目也可以是非常具有挑战性的，尤其是当分子数目非常小时。确定样品中分子的绝对数目的一种方法是数字聚合酶链式反应(PCR)。理想地，PCR在每个循环中产生相同拷贝的分子。然而，PCR可具有缺点，使得每个分子以随机概率复制，且此概率根据PCR循环和基因序列而变化，这导致扩增偏倚和不准确的基因表达测量。具有独特分子标记(molecular labels，也称为分子索引(molecular indexes，MI))的随机条形码可以用于计数分子数目和校正扩增偏倚。诸如PreciseTM测定(Cellular Research,Inc.(Palo Alto,CA))和RhapsodyTM测定(Becton,Dickinson and Company(Franklin Lakes,NJ))的随机条形码化可以通过使用分子标记(ML)在逆转录(RT)期间标记mRNA来纠正由PCR和文库制备步骤引起的偏倚。
PreciseTM测定可以利用具有在多(T)寡核苷酸上的大量(例如6561种至65536种)独特分子标记序列的随机条形码的非耗尽性池(non-depleting pool)，以在RT步骤期间与样品中的所有多(A)-mRNA杂交。随机条形码可以包含通用PCR引发位点。在RT期间，靶基因分子与随机条形码随机反应。每一种靶分子可以与随机条形码杂交，导致产生随机条形码化的互补核糖核苷酸(cDNA)分子。在标记后，可以将来自微孔板微孔的随机条形码化cDNA分子汇集到单个管中用于PCR扩增和测序。可以分析原始测序数据以产生读段的数目、具有独特分子标记序列的随机条形码的数目以及mRNA分子的数目。
本文的公开内容包括用于标记DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及使用第一多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化，以产生多于一个条形码化DNA片段，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，并且其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与多于一个dsDNA片段中的至少一个的第一5’突出端杂交的第一靶结合区。在一些实施方案中，使用第一多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：使dsDNA片段的第一链的第一5’突出端与第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第一靶结合区杂交；以及使所述dsDNA片段的第二链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码。方法可以包括：在将第二链连接到寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第二链和所述杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。在一些实施方案中，使第二链连接到寡核苷酸条形码使用DNA连接酶来进行。在一些实施方案中，第一5’突出端包含第一靶结合区的互补物。
本文的公开内容包括用于标记DNA的方法。在一些实施方案中，方法包括：使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子，并且其中第一5’突出端包含偶联序列；提供包含5’偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物的偶联寡核苷酸；以及使用第二多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化以产生多于一个条形码化DNA片段，其中第二多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第二靶结合区。在一些实施方案中，使用第二多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：使dsDNA片段的第一链的偶联序列与偶联寡核苷酸的5’偶联序列的互补物杂交；使偶联寡核苷酸的3’第二靶结合区的互补物与第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第二靶结合区杂交；以及使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码并延伸所述第一链；和/或使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸并延伸所述第二链。方法可以包括：在使第一链连接到寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第一链和杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。方法可以包括：在使第二链连接到偶联寡核苷酸之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第二链和偶联寡核苷酸之间的缺口。在一些实施方案中，使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码和/或使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸用DNA连接酶来进行。
本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：转座体，其包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及第一多于一个寡核苷酸条形码，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与第一5’突出端杂交的第一靶结合区。
本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：转座体，其包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子，其中第一5’突出端包含偶联序列；以及偶联寡核苷酸，其包含5’偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见，例如，Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。
如本文使用的，术语“衔接子”是指可以促进关联的核酸的扩增或测序的序列。关联的核酸可以包括靶核酸。关联的核酸可以包括空间标记、靶标记、样品标记、索引标记或条形码序列(例如，分子标记)中的一种或更多种。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子(pre-adenylated adaptors)。衔接子可以是双链或单链的。一种或更多种衔接子可以位于核酸的5’末端或3’末端。当衔接子在5’末端和3’末端包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’末端和/或3’末端的衔接子可以能够与固定在表面上的一种或更多种寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两种或更多种核酸分子共有的核苷酸序列的区域。两种或更多种核酸分子也可以具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可以包含相同和/或通用核酸序列，并且3’衔接子可以包含相同和/或通用序列。可以存在于多于一个核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单种通用引物复制或扩增多于一个不同序列。类似地，可以存在于核酸分子的集合中的不同成员中的至少一种、两种(例如，一对)或更多种通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一种、两种(例如，一对)或更多种单一通用引物复制或扩增多于一个不同序列。因此，通用引物包含可与此类通用序列杂交的序列。可以修饰具有靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)附接到不同靶核酸序列的一个末端或两个末端。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以提供通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一种或更多种通用引物可以彼此相同或不同。
如本文使用的，术语“关联”或“与...关联”意指两个或更多个物质可以被鉴定为在某个时间点共定位。关联可以意指，两个或更多个物质在或曾经在相似的容器内。关联可以是信息学关联。例如，关于两个或更多个物质的数字信息可以被存储并且可以用于确定一种或更多种物质在某个时间点共定位。关联也可以是物理关联。在一些实施方案中，两个或更多个关联的物质彼此“拴系”、“附接”或“固定”或与共同的固体或半固体表面“拴系”、“附接”或“固定”。关联可以指用于将标记与固体或半固体支持物(诸如珠)附接的共价或非共价方式。关联可以是靶与标记之间的共价键。关联可以包括两个分子(诸如靶分子和标记)之间的杂交。
如本文使用的，术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸在给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸形成氢键，则这两个核酸被认为在该位置处是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在全部互补性时它可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“互补物”。如果第一核苷酸序列和与第二序列相反的序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则第一核苷酸序列可以被称为第二序列的“反向互补物”。如本文使用的，“互补”序列可以指序列的“互补物”或“反向互补物”。从本公开内容理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以与其所杂交的分子互补或部分互补。
如本文使用的，术语“数字计数”是指用于估计样品中靶分子数目的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶关联的独特标记的数目的步骤。这种方法(其本质上可以是随机的)将计数分子的问题从相同分子的定位和鉴定之一转化为有关检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。
如本文使用的，术语“一个标记(label)”或“多于一个标记(labels)”是指与样品中的靶关联的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的连接处，例如天然和非天然序列的连接处。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在多种实施方案中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶。
如本文使用的，术语“非耗尽性储库(non-depleting reservoir)”是指由许多不同标记组成的条形码(例如，随机条形码)的池。非耗尽性储库可以包括大量不同的条形码，使得当非耗尽性储库与靶池关联时，每种靶可能与独特条形码关联。每种标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计来确定，并且取决于与标记的多样性相比在集合中相同的靶分子的拷贝数。所得的标记的靶分子的集合的大小可以通过条形码化处理的随机性质来确定，并且然后对检测到的条形码的数目的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数与独特条形码的数目的比率低时，标记的靶分子是高度独特的(即，多于一个靶分子被给定标记标记的概率非常低)。
如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如，改变的主链、糖或核酸碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、非天然核酸(xeno nucleic acid)、吗啉代核酸(morpholinos)、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。
核酸可以包括一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、主链修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而，此线性聚合化合物的各端可以进一步连接而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以称为形成核酸的核苷间主链。连键(linkage)或主链可以是3’到5’磷酸二酯连键。
核酸可以包括修饰的主链和/或修饰的核苷间连键。修饰的主链可以包括那些在主链中保留磷原子的主链和那些在主链中没有磷原子的主链。合适的其中含磷原子的修饰的核酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯诸如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)(包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷酸二酰胺酯(phosphorodiamidates)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates))、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼磷酸酯，具有正常3’-5’连接、2’-5’连接的类似物以及具有反向极性的类似物(其中一个或更多个核苷酸间连接是3’至3’、5’至5’或2’至2’连接)。
核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间连键，混合杂原子，和烷基或环烷基核苷间连键，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间连键形成的多核苷酸主链。这些可以包括具有吗啉代(morpholino)连键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他的那些。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以意图包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间连键二者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可以称为糖替代物(surrogate)。可以维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖主链可以被含酰胺的主链替代，特别是被氨基乙基甘氨酸主链替代。核苷酸可以被保留，并且直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的主链可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使得PNA具有含酰胺的主链。杂环碱基部分可以直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
核酸可以包括吗啉代主链结构。例如，核酸可以包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷酸二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间连键可以替代磷酸二酯连键。
核酸可以包括具有附接至吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(例如，吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白可以具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代类别内的各种化合物可以使用不同的连接基团来连接。另外类别的多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。使用亚磷酰胺化学可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸酯可以与核酸互补物形成复合体，具有与天然复合体相似的稳定性。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团与糖环的4’碳原子连接，从而形成2’-C,4’-C-氧亚甲基连键，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-CH2-)，桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以显示与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3’-外切核酸酶降解的稳定性和良好的溶解性。
核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))，以及嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶(5-halouracil)和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳(G-clamps)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如本文使用的，术语“样品”是指包含靶的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。
如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”是指可以取样品的切片和/或将所述切片放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片格栅和/或超薄切片机。
如本文使用的，术语“固体支持物”是指可以附接多于一个条形码(例如，随机条形码)的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座(bearing)、圆柱体或由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成的其他类似配置，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。珠的形状可以是非球形的。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。
如本文使用的，术语“随机条形码”是指本公开内容的包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
如本文使用的，术语“基因特异性随机条形码”是指包含标记和基因特异性的靶结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。
如本文使用的，术语“随机条形码化”是指核酸的随机标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来关联并对与靶关联的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“随机进行标记”互换使用。
如本文使用的，术语“靶”是指可与条形码(例如，随机条形码)关联的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微RNA、tRNA等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶可以是蛋白、肽或多肽。在一些实施方案中，靶是脂质。如本文使用的，“靶”可以与“物质(species)”互换使用。
如本文使用的，术语“逆转录酶”是指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的一组酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒(retroplasmid)逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II组内含子衍生的逆转录酶，及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II组内含子逆转录酶。II组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LI.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，尤其是逆转录子、II组内含子、以及多样性产生型逆转录元件)。
术语“通用衔接子引物”、“通用引物衔接子”或“通用衔接子序列”在本文中可互换地使用，以指可以用于与条形码(例如，随机条形码)杂交以产生基因特异性条形码的核苷酸序列。通用衔接子序列可以例如是在本公开内容的方法中使用的遍及所有条形码通用的已知序列。例如，当使用本文公开的方法标记多于一个靶时，每一种靶特异性序列可以连接到相同的通用衔接子序列。在一些实施方案中，多于一个通用衔接子序列可以用于本文公开的方法中。例如，当使用本文公开的方法标记多于一个靶时，至少两种靶特异性序列连接到不同的通用衔接子序列。通用衔接子引物及其互补物可以被包括在两种寡核苷酸中，其中的一种寡核苷酸包含靶特异性序列且另一种寡核苷酸包含条形码。例如，通用衔接子序列可以是包含靶特异性序列的寡核苷酸的一部分以产生与靶核酸互补的核苷酸序列。包含条形码和通用衔接子序列的互补序列的第二寡核苷酸可与核苷酸序列杂交并产生靶特异性条形码(例如，靶特异性随机条形码)。在一些实施方案中，通用衔接子引物具有与本公开内容的方法中使用的通用PCR引物不同的序列。
条形码
条形码化，诸如随机条形码化，已描述于以下中：例如，Fu等人,Proc Natl AcadSci U.S.A.,2011May 31；108(22):9026-31；美国专利申请公布第US2011/0160078号；Fan等人,Science,2015February 6,347(6222):1258367；美国专利申请公布第US2015/0299784号和PCT申请公布第WO2015/031691号；这些中的每一个的内容，包括任何支持或补充信息或材料，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，所述随机条形码可以是可以用于对靶进行随机标记(例如，条形码化、加标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或这些值中的任何两个值之间的数字或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。如果随机条形码的不同条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现数目的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。
条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或前空间标记(pre-spatial label)。图1图示了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可以包含可以将条形码与固体支持物108连接的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以变化。例如，如图1中所示，通用标记可以是最5’侧的标记(5’-most label)，且分子标记可以是最3’侧的标记(3’-most label)。空间标记、维度标记和细胞标记可以处于任何顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记处于任何顺序。条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包含可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸隔开。
标记(例如，细胞标记)可以包含一组独特的定义长度的核酸子序列，例如每一种七个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的比特数目)，其可被设计成提供错误校正能力。可以设计包含七个核苷酸序列的错误校正子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组错误校正子序列可被设计成展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于标记的靶核酸分子的序列数据组中的错误校正序列的审查(在下文更详细地描述)可允许人们检测或校正扩增错误或测序错误。在一些实施方案中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。
条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。靶可以是以下或包括以下：核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有多(A)尾的RNA或其任何组合。在一些实施方案中，多于一个靶可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。
在一些实施方案中，靶结合区可以包括可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡(dT)序列。条形码的一种或更多种标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔区(spacer)与条形码的另一种或两种剩余标记隔开。间隔区可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记中没有一个标记被间隔区隔开。
通用标记
条形码可以包含一种或更多种通用标记。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记对于附接至给定固体支持物的条形码组中的所有条形码可以是相同的。在一些实施方案中，一种或更多种通用标记对于附接至多于一个珠的所有条形码可以是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序引物或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可以用于引发条形码转录的序列。通用标记可以包括可以用于延伸条形码或条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被裂解下来。
维度标记
条形码可以包含一种或更多种维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括提供关于标记(例如，随机标记)发生的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于靶被条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间关联。维度标记可以在标记的时间被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶、靶的组和/或样品被条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的G0期可以将细胞的群体条形码化。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)对细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用条形码对细胞再次进行脉冲处理，等等。每次脉冲(例如，细胞周期的每个时期)时的条形码可以包含不同的维度标记。以这种方式，维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以探询许多不同的生物学时间。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一个实例中，样品(例如，细胞、细胞的群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的响应。
维度标记可以是可激活的。可激活的维度标记可以在特定时间点被激活。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，可激活的维度标记可以被打开和关闭)。维度标记可以被例如可逆地激活至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。维度标记可以被可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解，连接另一种分子，添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化(sumoylate)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光罩(photocaging))以及引入非天然的核苷酸将维度标记激活。
在一些实施方案中，维度标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特维度标记序列。维度标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。维度标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。维度标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
空间标记
条形码可以包含一种或更多种空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包含提供关于与条形码关联的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标关联。坐标可以是固定的坐标。例如，坐标可以相对于基底固定。空间标记可以参考二维或三维网格。坐标可以相对于界标(landmark)固定。界标可在空间中被鉴定。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，诸如具有可鉴定标识(identifiable identifier)(诸如色码、条形码、磁特性(magnetic property)、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)关联。在一些实施方案中，将多于一个空间标记一起用于编码空间中的一个或更多个位置。
空间标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是至少或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特空间标记序列。空间标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少以下或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。空间标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
细胞标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包含提供用于确定哪种靶核酸来源于哪种细胞的信息的核酸序列。在一些实施方案中，细胞标记对于附接至给定固体支持物(例如，珠)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，同一固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，同一固体支持物上至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一个实例，同一固体支持物上至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。
多于一个固体支持物(例如，珠)中可以呈现多达106种或更多种独特细胞标记序列。细胞标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。作为另一个实例，细胞标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。作为又另一个实例，细胞标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。
条形码序列
条形码可以包含一种或更多种条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器(例如，提供粗略估计)的核酸序列。
在一些实施方案中，将一组相异的(diverse)条形码序列附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下或可以有约以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。例如，多于一个条形码可以包括约6561种具有不同序列的条形码序列。作为另一个实例，多于一个条形码可以包括约65536种具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，可以有至少以下或可以有至多以下的独特条形码序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种。独特分子标记序列可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，独特分子标记序列被颗粒(例如水凝胶珠)部分或全部包含。
在不同实施方式中，条形码的长度可以是不同的。例如，条形码的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。作为另一个实例，条形码的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
分子标记
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种分子标记。分子标记可以包含条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器的核酸序列。
在一些实施方案中，将一组相异的分子标记附接至给定固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下或可以有约以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。例如，多于一个条形码可以包括约6561种具有不同序列的分子标记。作为另一个实例，多于一个条形码可以包括约65536种具有不同序列的分子标记。在一些实施方案中，可以有至少以下或可以有至多以下的独特分子标记序列：102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种或109种。具有独特分子标记序列的条形码可以附接至给定固体支持物(例如，珠)。
对于使用多于一个随机条形码进行的条形码化(例如，随机条形码化)，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比例是至少以下或是至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。
分子标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。
靶结合区
条形码可以包含一个或更多个靶结合区，诸如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区可以与感兴趣的靶杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包含与靶(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)特异性杂交(例如，与特定基因序列特异性杂交)的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含可以附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含能够与限制性酶位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。
在一些实施方案中，靶结合区可以包含非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指可以独立于靶核酸的特定序列结合多于一个靶核酸的序列。例如，靶结合区可以包含随机多聚体序列、多(dA)序列、多(dT)序列、多(dG)序列、多(dC)序列或其组合。例如，靶结合区可以是与mRNA分子上的多(A)尾杂交的寡(dT)序列。随机多聚体序列可以是，例如，随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的所有条形码，靶结合区是相同的。在一些实施方案中，对于附接至给定珠的多于一个条形码，靶结合区可以包括两种或更多种不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。例如，可以使用逆转录酶诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括具有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换到条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子在该cDNA分子3’末端上含有条形码序列(诸如分子标记)。
在一些实施方案中，靶结合区可以包含寡(dT)，所述寡(dT)可以与包含多腺苷酸化末端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5-30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶结合区时，条形码在本文中可以称为基因特异性条形码。
定向特性(Orientation Property)
随机条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种可以用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包含不同的等电聚焦点。当将这些条形码引入样品中时，样品可以经历等电聚焦，以便于将条形码定向成已知的方式。以这种方式，定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的映射。示例性定向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导率和/或自组装。例如，具有自组装的定向特性的条形码激活时可以自组装成特定的定向(例如，核酸纳米结构)。
亲和特性(Affinity Property)
条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包含亲和特性。亲和特性可以包括可以促进条形码与另一种实体(例如，细胞受体)结合的化学部分和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体，例如，对样品上的特定部分(例如，受体)特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处和/或特定细胞类型或分子附近的靶可以被标记(例如，被随机标记)。在一些实施方案中，亲和特性可以提供空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。
抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合性)部分(如抗体片段)。
抗体片段可以是例如抗体的一部分，诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、与细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)结合的抗体和治疗性抗体。
通用衔接子引物
条形码可以包含一种或更多种通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(诸如基因特异性随机条形码)可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指遍及所有条形码的通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是5-30个核苷酸。
接头
当条形码包含多于一个类型的标记(例如，多于一个细胞标记或多于一个条形码序列，诸如一个分子标记)时，标记之间可以散布有接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。在一些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包括错误校正(例如，汉明)码。
固体支持物
在一些实施方案中，本文公开的条形码(诸如随机条形码)可以与固体支持物关联。固体支持物可以是例如合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物上的多于一个条形码(例如，第一多于一个条形码)的一些或所有条形码序列(诸如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)相差至少一个核苷酸。同一固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同的固体支持物上的条形码的细胞标记可以相差至少一个核苷酸。例如，第一固体支持物上的第一多于一个条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多于一个条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以相差至少一个核苷酸。细胞标记可以是例如约5-20个核苷酸长。条形码序列可以是例如约5-20个核苷酸长。合成颗粒可以是例如珠。
珠可以是例如硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。珠可以包括材料诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。
在一些实施方案中，珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合物珠(例如可变形珠或凝胶珠)(诸如来自10X Genomics(San Francisco,CA)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶珠。
在一些实施方案中，颗粒可以是可破坏的(例如，可溶解的、可降解的)。例如，聚合物珠可以例如在期望的条件下溶解、熔化或降解。所期望的条件可以包括环境条件。所期望的条件可以导致聚合物珠以受控方式溶解、熔化或降解。凝胶珠可以由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任何组合而溶解、熔化或降解。
例如，分析物和/或试剂(诸如寡核苷酸条形码)可以偶联/固定至凝胶珠的内表面(例如，经由寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散而可及的内部)和/或凝胶珠的外表面或本文描述的任何其他微胶囊。偶联/固定可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，本文描述的试剂与凝胶珠或任何其他微胶囊的偶联/固定可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定型部分(例如，经由化学交联物，包括本文描述的化学交联物)。在施加刺激后，不稳定型部分可以被裂解并释放所固定的试剂。在一些实施方案中，不稳定型部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定至凝胶珠的情况下，使二硫键暴露于还原剂可以裂解二硫键并从珠释放寡核苷酸条形码。不稳定型部分可以作为凝胶珠或微胶囊的一部分、作为将试剂或分析物与凝胶珠或微胶囊连接的化学接头的一部分和/或作为试剂或分析物的一部分被包括。在一些实施方案中，多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在颗粒上、被部分固定在颗粒上、被包封在颗粒中、被部分包封在颗粒中或其任何组合。
在一些实施方案中，凝胶珠可以包括宽范围的不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(双烯丙基二甲基-氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(poly(pyrolle)，PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PPA)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。
许多化学刺激可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。这些化学改变的实例可以包括但不限于pH介导的珠壁改变、经由交联键的化学裂解使珠壁崩解、珠壁的触发解聚和珠壁转换反应。批量(bulk)改变也可以用于触发珠的破坏。
通过各种刺激对微胶囊的批量或物理改变在设计胶囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生批量或物理改变，其中珠破裂是由刺激引起的机械-物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化或珠壁的孔隙率的改变。
生物刺激也可以用于触发珠的破坏、溶解或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多实例使用生物分子或生命系统中常见的分子，诸如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，珠可以包含具有对特定蛋白酶的裂解敏感的肽交联的聚合物。更特别地，一个实例可以包括包含GFLGK肽交联的微胶囊。在添加生物触发物(诸如蛋白酶组织蛋白酶B)后，壳壁的肽交联被裂解并且珠的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一个实例中，珠包括包含纤维素的壳壁。壳聚糖水解酶的添加用作纤维素键裂解、壳壁解聚及其内部内容物释放的生物触发物。
还可以在施加热刺激后诱导珠释放其内容物。温度的改变可以引起珠的各种改变。热量的变化可以引起珠熔化，使得珠壁崩解。在其他情况下，热量可以增加珠的内部组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。在又其他的情况下，热量可以使珠转化成收缩的脱水状态。热量还可以作用于珠壁内的热敏聚合物，从而引起珠的破坏。
将磁性纳米颗粒包括在微胶囊的珠壁中可以允许珠的触发破裂以及将珠引导成阵列。本公开内容的装置可以包括用于任一目的的磁珠。在一个实例中，将Fe3O4纳米颗粒掺入含聚电解质的珠中在存在振荡磁场刺激的情况下触发破裂。
珠也可以由于电刺激的结果被破坏、溶解或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒类似，电敏珠可以允许珠的触发破裂以及其他功能，诸如电场中的对齐、电导率或氧化还原反应。在一个实例中，含电敏材料的珠在电场中对齐，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在珠壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。
也可以使用光刺激来破坏珠。许多光触发物是可能的，并且可以包括使用各种分子(诸如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的系统。例如，金属氧化物涂层可以用作胶囊触发物。涂覆有SiO2的聚电解质胶囊的UV照射可以导致珠壁的崩解。在又另一个实例中，可以将可光切换材料(诸如偶氮苯基团)掺入珠壁中。在施加UV或可见光后，诸如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式至反式异构化。在此方面，掺入光子开关(photon switch)产生在施加光触发物后可以崩解或变得更多孔的珠壁。
例如，在图2中图示的条形码化(例如，随机条形码化)的非限制性实例中，在框208处将细胞(诸如单细胞)引入微孔阵列的多于一个微孔上之后，在框212处可以将珠引入微孔阵列的多于一个微孔上。每个微孔可以包含一个珠。珠可以包含多于一个条形码。条形码可以包含附接至珠的5’胺区域。条形码可以包含通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区或其任何组合。
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。与固体支持物关联的条形码可各自包含选自以下组的条形码序列，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物关联的不同条形码可以包含具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码的一定百分比包含相同的细胞标记。例如，所述百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。作为另一个实例，所述百分比可以是至少以下或可以是至多以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的条形码可以具有选自以下组的不同的细胞标记，该组包括至少100种或1000种具有独特序列的细胞标记。
本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。在一些实施方案中，可以用包括与多于一个条形码关联的多于一个合成颗粒的固体支持物将样品中的多于一个靶条形码化。在一些实施方案中，固体支持物可以包括与多于一个条形码关联的多于一个合成颗粒。不同固体支持物上的多于一个条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。固体支持物可以例如在二维或三维包括多于一个条形码。合成颗粒可以是珠。珠可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/琼脂糖凝胶珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。固体支持物可以包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施方案中，固体支持物可以包埋到半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物关联。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可以与基底关联。
如本文使用的，术语“拴系的”、“附接的”和“固定的”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价方式。可以将各种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于条形码的原位固相合成。
在一些实施方案中，固体支持物是珠。珠可以包括一种或更多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)的其他类似配置。珠可以由例如塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任何组合构成。珠可以是或包括球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形的。
珠可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任何组合。
在一些实施方案中，珠(例如，标记所附接的珠)是水凝胶珠。在一些实施方案中，珠包括水凝胶。
本文公开的一些实施方案包括一个或更多个颗粒(例如，珠)。每个颗粒可以包含多于一个寡核苷酸(例如，条形码)。多于一个寡核苷酸中的每一个可以包含条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记和靶结合区(例如，寡(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体或其组合)。多于一个寡核苷酸的每一个的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实施方式中，不同细胞标记序列的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109、这些值中的任何两个值之间的数字或范围或更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。在一些实施方案中，多于一个颗粒中的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个颗粒包括具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包括具有相同细胞序列的寡核苷酸的多于一个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多于一个颗粒全都不具有相同的细胞标记序列。
在每个颗粒上的多于一个寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是至少以下或可以是至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。例如，多于一个寡核苷酸中的至少100种包含不同的条形码序列。作为另一个实例，在单个颗粒中，多于一个寡核苷酸中的至少100种、500种、1000种、5000种、10000种、15000种、20000种、50000种、这些值中的任何两个值之间的数字或范围或更多种包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多于一个包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数目)的比例可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更高。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸的每一个还包含样品标记、通用标记或二者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微米颗粒。
珠的尺寸可以不同。例如，珠的直径范围可以为从0.1微米至50微米。在一些实施方案中，珠的直径可以是以下或可以是约以下：0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。
珠的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短以下或者约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。珠的直径可以与细胞(例如，被基底的孔捕获的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短以下或约以下：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。
珠可以附接至基底和/或包埋到基底中。珠可以附接至凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质和/或包埋到凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠在基底(例如凝胶、基质、支架或聚合物)中的空间位置可以使用珠上的条形码上存在的空间标记来鉴定，该空间标记可以用作位置地址。
珠的实例可以包括但不限于链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、
、
微珠、抗体缀合的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白A缀合的珠、蛋白G缀合的珠、蛋白A/G缀合的珠、蛋白L缀合的珠、寡(dT)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMagTM羧基封端磁珠。
珠可以与量子点或荧光染料关联(例如，用量子点或荧光染料浸渍)，以使其在一个荧光光学通道或多于一个光学通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬关联，使其成为顺磁性或铁磁性。珠可以是可鉴定的。例如，可以使用照相机对珠成像。珠可以具有与珠关联的可检测代码。例如，珠可以包含条形码。珠可以改变尺寸，例如由于在有机溶液或无机溶液中溶胀。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。
固体支持物(例如，珠)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支持物(例如，珠)可以蚀刻有标识符(例如，数字)。标识符可以通过对珠成像来可视化。
固体支持物可以包括可溶性、半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、构建模块(building block)或其他与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少这种与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以以溶液中游离，诸如在微量滴定孔中的形式；以流通形式，诸如在柱中；或以浸量尺(dipstick)使用。
固体支持物可以包括膜、纸(paper)、塑料、涂覆表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何配置的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微米颗粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)，和/或晶片、梳、针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)或珠，平坦表面诸如晶片(例如，硅晶片)的凹陷或纳升孔阵列，具有凹陷的晶片(具有或不具有过滤器底部)。
固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送到整个循环系统。
基底和微孔阵列
如本文使用的，基底可以指固体支持物类型。基底可以指可以包含本公开内容的条形码或随机条形码的固体支持物。基底可以例如包括多于一个微孔。基底可以例如是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包括定义体积的小的反应室。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个固体支持物。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个固体支持物。在一些实施方案中，微孔捕获单细胞和单个固体支持物(例如，珠)。微孔可以包含本公开内容的条形码试剂。
条形码化的方法
本公开内容提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中不同位置处的不同靶的数目的方法。该方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)紧密接近样品放置，裂解样品，将不同的靶与条形码关联，对靶进行扩增和/或对靶进行数字计数。该方法还可以包括对从条形码上的空间标记获得的信息进行分析和/或将所述信息可视化。在一些实施方案中，该方法包括使样品中的多于一个靶可视化。将多于一个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在将样品中的多于一个靶条形码化(例如，随机条形码化)之前或之后产生二维映射图和三维映射图。将样品中的多于一个靶可视化可以包括将多于一个靶映射到样品的映射图上。将多于一个靶映射到样品的映射图上可以包括产生样品的二维映射图或三维映射图。可以在对样品中的多于一个靶进行条形码化之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在一些实施方案中，可以在裂解样品之前或之后产生二维映射图和三维映射图。在产生二维映射图或三维映射图之前或之后裂解样品可以包括加热样品、使样品与去污剂接触、改变样品的pH或其任何组合。
在一些实施方案中，将多于一个靶条形码化包括将多于一个条形码与多于一个靶杂交以产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)。将多于一个靶条形码化可以包括产生条形码化靶的索引文库。产生条形码化靶的索引文库可以用包含多于一个条形码(例如，随机条形码)的固体支持物来进行。
使样品和条形码接触
本公开内容提供了用于使样品(例如，细胞)与本公开内容的基底接触的方法。可以使包括例如细胞、器官或组织薄切片的样品与条形码(例如，随机条形码)接触。细胞可以例如通过重力流来接触，其中可以使细胞沉淀并且产生单层。样品可以是组织薄切片。可以将薄切片放置于基底上。样品可以是一维的(例如，形成平坦表面)。可以使样品(例如，细胞)分散遍及基底，例如，通过在基底上生长/培养细胞。
当条形码紧密接近靶时，靶可以与条形码杂交。条形码可以按不可耗尽的比例接触，使得每一种不同的靶可以与本公开内容的不同条形码关联。为了确保靶与条形码之间的有效关联，可以将靶与条形码交联。
细胞裂解
在细胞和条形码的分配之后，可以将细胞裂解以释放靶分子。细胞裂解可以通过各种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解的手段。可以通过添加包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)、有机溶剂(例如，甲醇或丙酮)或消化酶(例如，蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶与条形码的关联，可以通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。
在一些实施方案中，可以使用滤纸来裂解样品。可以在滤纸上部用裂解缓冲液浸泡滤纸。可以将滤纸用压力施加至样品，这可以促进样品的裂解以及样品的靶与基底的杂交。
在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解来进行。化学裂解可以包括使用消化酶，诸如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过将裂解缓冲液添加至基底来进行。裂解缓冲液可以包含Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至少约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至多约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH是约7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如，LiCl)。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至少约0.1M、0.5M或1M或更高。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至多约0.1M、0.5M或1M或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的盐浓度是约0.5M。裂解缓冲液可以包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、triton X、tween和NP-40)。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的去污剂浓度是约1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可以取决于所使用的去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，EDTA和EGTA)。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的螯合剂浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇和DTT)。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的还原剂浓度是约5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl，约pH 7.5，约0.5M LiCl，约1％十二烷基硫酸锂，约10mM EDTA和约5mM DTT。
裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或20分钟或更多分钟。裂解的细胞可以包括至少约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。裂解的细胞可以包括至多约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。
将条形码附接至靶核酸分子
在细胞裂解和核酸分子从细胞释放之后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的条形码随机关联。关联可以包括使条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，条形码的寡(dT)可以与靶的多(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。在一些实施方案中，可以将从裂解的细胞释放的核酸分子与基底上的多于一个探针关联(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包含寡(dT)时，可以将mRNA分子与探针杂交并且逆转录。寡核苷酸的寡(dT)部分可以充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框216处，mRNA分子可以与珠上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。
附接还可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包含可以能够与限制性位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如，EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接两个片段。
例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框220处，随后可以将来自多于一个细胞(或多于一个样品)的标记的靶(例如，靶-条形码分子)汇集至例如管中。标记的靶可以通过例如回收(retrieving)条形码和/或附接靶-条形码分子的珠来汇集。
可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实现附接的靶-条形码分子的基于固体支持物的集合的回收。汇集靶-条形码分子后，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括，例如，逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不先汇集来自多于一个细胞的标记的靶核酸分子。
逆转录或核酸延伸
本公开内容提供了使用逆转录(例如，在图2的框224处)或核酸延伸来产生靶-条形码缀合物的方法。靶-条形码缀合物可以包含条形码以及靶核酸的全部或一部分的互补序列(即，条形码化的cDNA分子，诸如随机条形码化的cDNA分子)。关联的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而发生。逆转录引物可以是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡(dT)引物的长度可以是12-18个核苷酸或可以是约12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’末端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，mRNA分子向标记的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物而发生。在一些实施方案中，逆转录引物是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡(dT)引物的长度是12-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’末端的内源多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。
在一些实施方案中，靶是cDNA分子。例如，可以使用逆转录酶诸如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶逆转录mRNA分子，以产生具有多(dC)尾的cDNA分子。条形码可以包括具有多(dG)尾的靶结合区。在条形码的多(dG)尾和cDNA分子的多(dC)尾之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从细胞RNA分子转换到条形码，并继续向条形码的5’末端复制。通过这样做，得到的cDNA分子在该cDNA分子3’末端上含有条形码序列(诸如分子标记)。
逆转录可以重复地发生以产生多于一个标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次逆转录反应。该方法可以包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次逆转录反应。
扩增
可以进行一个或更多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228处)以产生标记的靶核酸分子的多于一个拷贝。扩增可以以多重化方式进行，其中多于一个靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或这些值中的任何两个值之间的范围或数字。该方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶-条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。
在一些实施方案中，扩增可以使用聚合酶链式反应(PCR)来进行。如本文使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重化PCR、数字PCR以及组装PCR。
标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本公开内容的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶(例如，随机标记的靶)的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶的3’末端或5’末端。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的靶的内部区域。内部区域可以与多于一个标记的靶的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。
一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶或其任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总标记靶的子集。一种或更多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的标记的核酸。两种或更多种不同的标记的核酸可以对应于一种或更多种基因。
可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一种方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增附接至珠的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以使PCR产物变成Illumina测序文库。使用150bp×2测序的测序可以揭示读段1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读段2上的基因以及索引1读段上的样品索引。
在一些实施方案中，可以使用化学裂解将核酸从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或经修饰的碱基可以用于促进将核酸从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，通过限制性内切核酸酶消化可以将核酸从基底去除。例如，用尿嘧啶-d-糖苷酶(UDG)处理含dUTP或ddUTP的核酸可以用于将核酸从基底去除。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)内切核酸酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可光裂解基团以及光将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底去除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、Ig蛋白A、光不稳定型接头、酸或碱不稳定型接头基团或适配体。
当探针是基因特异性时，可以将分子与探针杂交，并且逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，核酸可以被扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多种靶核酸序列同时扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。
在一些实施方案中，可以例如用桥接扩增在基底上进行扩增。cDNA可以加同聚物尾，以便产生相容末端，用于使用基底上的寡(dT)探针进行桥接扩增。在桥接扩增中，与模板核酸的3’末端互补的引物可以是共价地附接至固体颗粒的每对引物中的第一引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延长以形成双链体分子，所述双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子并且留下通过第一引物附接至颗粒的互补DNA链。在随后的退火和延长步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段互补。这种杂交可导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥，通过共价键连接第一引物并通过杂交连接第二引物。在延长阶段，通过在同一反应混合物中添加核苷酸，第二引物可以在反向方向上延长，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子具有的一个末端分别经由第一引物和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在这第二个循环的退火和延长步骤中，每条链可以与同一颗粒上先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个先前未使用的引物延长从而将两个新的桥转换成双链桥。
扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。
标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的指数式扩增。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重化PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR以及组装PCR。
在一些实施方案中，标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和/或分支延伸扩增(RAM)。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。可选地，扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。
在一些实施方案中，方法包括反复扩增标记的核酸以产生多于一个扩增子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次扩增反应。可选地，方法包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次扩增反应。
扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至一个或更多个包含多于一个核酸的样品中。扩增还可以包括将一种或更多种对照核酸添加至多于一个核酸。对照核酸可以包含对照标记。
扩增可以包括使用一种或更多种非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定型和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。
进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括一种或更多种寡核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含至少约7-9个核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包含少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的3’末端和/或5’末端。一种或更多种引物可以退火至多于一个标记的核酸的内部区域。内部区域可以与多于一个标记的核酸的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种管家基因引物。一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或其产物。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶核酸。靶核酸可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是与本公开内容的阵列附接的探针。
在一些实施方案中，将样品中的多于一个靶条形码化(例如，随机条形码化)还包括产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)或靶的条形码化片段的索引文库。不同的条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。产生条形码化靶的索引文库包括从样品中的多于一个靶产生多于一个索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以相差以下、相差约以下、相差至少以下或相差至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，产生条形码化靶的索引文库包括使多于一个靶(例如mRNA分子)与包含多(T)区和标记区的多于一个寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cDNA分子(每一种包含cDNA区和标记区)，其中多于一个靶包括至少两种不同序列的mRNA分子，且多于一个寡核苷酸包括至少两种不同序列的寡核苷酸。产生条形码化靶的索引文库还可以包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子；以及对双链标记的cDNA分子进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，方法可以包括产生衔接子标记的扩增子。
条形码化(例如，随机条形码化)可以包括使用核酸条形码或标签以标记个体核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施方案中，其包括在从mRNA产生cDNA分子时将DNA条形码或标签添加至cDNA分子。可以进行巢式PCR以使PCR扩增偏倚最小化。可以添加用于测序(例如下一代测序(NGS))使用的衔接子。例如在图2的框232处，可以使用测序结果来确定靶的一个或更多个拷贝的细胞标记、分子标记和核苷酸片段的序列。
图3是示出了产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库，诸如条形码化的mRNA或其片段的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。如步骤1中示出的，逆转录过程可以用独特分子标记序列、细胞标记序列和通用PCR位点对每个mRNA分子进行编码。具体地，通过将一组条形码(例如，随机条形码)310与RNA分子302的多(A)尾区308杂交(例如，随机杂交)，可以将RNA分子302逆转录以产生标记的cDNA分子304(包括cDNA区306)。条形码310中的每一个可以包括靶结合区，例如多(dT)区312、标记区314(例如，条形码序列或分子)和通用PCR区316。
在一些实施方案中，细胞标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，分子标记序列可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，多于一个随机条形码中的每一个还包括通用标记和细胞标记中的一种或更多种，其中通用标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包含3个至20个核苷酸。
在一些实施方案中，标记区314可以包含条形码序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施方案中，标记区314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一种或更多种。条形码序列或分子标记318的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码可以是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的。维度标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。
在一些实施方案中，标记区314可以包括以下、可以包括约以下、可以包括至少以下或可以包括至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同标记，诸如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每一种标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码310可以含有以下、可以含有约以下、可以含有至少以下或可以是至多以下：10种、20种、40种、50种、70种、80种、90种、102种、103种、104种、105种、106种、107种、108种、109种、1010种、1011种、1012种、1013种、1014种、1015种、1020种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的条形码或随机条形码310。并且条形码或随机条形码310的组可以例如，各自包含独特标记区314。标记的cDNA分子304可以进行纯化以去除过量的条形码或随机条形码310。纯化可以包括Ampure珠纯化。
如步骤2中示出的，来自步骤1中的逆转录过程的产物可以汇集至1支管中，并且用第1PCR引物池和第1通用PCR引物进行PCR扩增。因为独特标记区314，汇集是可能的。特别地，可以将标记的cDNA分子304扩增以产生巢式PCR标记的扩增子322。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括以单一反应体积用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施方案中，在单一反应体积中，多重PCR扩增可以利用、利用约、利用至少或利用至多10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的多重引物。扩增可以包括使用包括靶向特定基因的定制引物326A-C的第1PCR引物池324和通用引物328。定制引物326可以与标记的cDNA分子304的cDNA部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与标记的cDNA分子304的通用PCR区域316杂交。
如图3的步骤3中示出的，来自步骤2中的PCR扩增的产物可以用巢式PCR引物池和第2通用PCR引物扩增。巢式PCR可以使PCR扩增偏倚最小化。特别地，巢式PCR标记的扩增子322可通过巢式PCR进行进一步扩增。巢式PCR可以包括在单个反应体积中用巢式PCR引物332a-c的巢式PCR引物池330和第2通用PCR引物328’进行的多重PCR。巢式PCR引物池330可以包含以下、可以包含约以下、可以包含至少以下或可以包含至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同的巢式PCR引物332。巢式PCR引物332可以包含衔接子334，并与标记的扩增子322的cDNA部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以包含衔接子336，并与标记的扩增子322的通用PCR区域316杂交。由此，步骤3产生衔接子标记的扩增子338。在一些实施方案中，巢式PCR引物332和第2通用PCR引物328’可以不包含衔接子334和衔接子336。而是，衔接子334和衔接子336可以连接至巢式PCR的产物以产生衔接子标记的扩增子338。
如步骤4中示出的，可以使用文库扩增引物将来自步骤3的PCR产物进行PCR扩增用于测序。特别地，可以使用衔接子334和衔接子336对衔接子标记的扩增子338进行一个或更多个另外的测定。衔接子334和衔接子336可以与引物340和引物342杂交。一种或更多种引物340和引物342可以是PCR扩增引物。一种或更多种引物340和引物342可以是测序引物。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于衔接子标记的扩增子338的进一步扩增。一种或更多种衔接子334和衔接子336可以用于对衔接子标记的扩增子338测序。引物342可以包含板索引344，使得使用同一组条形码或随机条形码310产生的扩增子可以使用下一代测序(NGS)在一个测序反应中测序。
用于标记DNA的方法和组合物
本文的公开内容包括使用ATAC-seq(转座酶可及染色质测定-seq)鉴定单细胞中可及DNA区域的方法和组合物。这些方法和组合物可适于各种单细胞分析平台，诸如例如BDRhapsody系统。ATAC-seq是一种广泛使用的鉴定基因组的开放染色质区域的表观基因组学工具。但是单细胞ATAC-Seq(scATAC-Seq)不是当前可用的单细胞RNAseq平台诸如BDRhapsody系统的一部分。在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，采用Tn5转座酶以进行标签片段化(tagmentation)(例如，在开放染色质区域上切割DNA)，并且片段化的DNA可以通过以下来捕获：(i)通过固体支持物(例如，Rhapsody珠)通过对ATACseq DNA片段特异的寡核苷酸(例如，如图5A-5D中示出的)来捕获，和/或(ii)通过偶联到包含具有捕获序列的寡核苷酸的固体支持物(例如，Rhapsody珠)的偶联寡核苷酸(例如，SPLINT寡核苷酸)(例如，如图6A-图6D中示出的)来捕获，所述捕获序列与用于捕获mRNA的寡核苷酸的捕获序列相同或不同。
本文提供的组合物和方法以比当前可用的方法高得多的通量实现scATAC-Seq。例如，当在BD Rhapsody平台上使用时，本文公开的组合物和方法可以实现高达每筒约20,000个细胞或细胞核。这一通量水平远远高于，例如，C1 Fluidigm平台能够完成的每次运行仅800个细胞，或者10X Chromium的最多10,000个细胞核。此外，10X chromium ATAC-Seq仅分析DNA序列，而本文提供的方法和组合物能够同时实现DNA和RNA(例如，mRNA)的分析。在一些实施方案中，提供了可以捕获DNA信息和RNA信息两者的固体支持物(例如，Rhapsody捕获珠)，诸如例如装载了具有捕获mRNA的dT序列和捕获由ATAC-Seq产生的DNA片段的特异性序列的寡核苷酸的珠。
用于标记gDNA和确定与gDNA相关的信息的方法和组合物已在美国专利申请公布第2019/0338357号和2020年7月21日提交的题为“SINGLE CELL CHROMATINIMMUNOPRECIPITATION SEQUENCING ASSAY”的美国专利申请第16/934,530号中描述；这些申请中每一项的内容通过引用以其整体并入本文。
本文描述的方法和系统可以与使用与寡核苷酸关联(例如，与寡核苷酸附接或缀合)的抗体(本文也称为AbO或AbOligo)的方法和系统一起使用。使用AbO来确定单细胞中的蛋白表达谱(profile)和追踪样品来源的实施方案已在美国专利申请第15/715,028号(公布为美国专利申请公布第2018/0088112号)和美国专利申请第15/937,713号(公布为美国专利申请公布第2018/0346970号)中描述；每一项的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，提供了用于转座酶可及染色质(scATAC)-Seq的单细胞测定。本文提供的方法和组合物能够标记和鉴定单细胞DNA(例如，开放染色质相关gDNA)。图4A-图4B是本文提供的用于标记单细胞中的DNA(例如，gDNA)的组合物和方法的非限制性示意图。单细胞402可以经历透化步骤。单细胞可以包含质膜404和核膜406。质膜404和/或核膜406可以被透化。细胞透化可以使用毛地黄皂苷进行。在一些实施方案中，工作流程包括细胞核分离。单细胞可以包含gDNA。gDNA可以与组蛋白408关联形成封闭染色质410。gDNA可以包含开放染色质412(例如，不与核小体关联)。在一些实施方案中，提供了转座体414。转座体414可以包含同源二聚体或异源二聚体。转座体可以包含转座酶。转座酶可以包括Tn5转座酶。Tn5转座酶可以包含第一和第二转座酶单体416。转座体414可以包含具有第一5’突出端的第一衔接子418a和具有第二5’突出端的第二衔接子418b。工作流程可包括将转座体引入400a到透化的细胞和/或细胞核中(在一些实施方案中，其是分离的)，从而产生其中转座体与开放染色质关联并随后产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端的细胞和/或细胞核420。工作流程可以包括批量加标签，或者可以包括对分区中的单细胞和/或单细胞核加标签。产生的多于一个dsDNA片段可以根据本文公开的方法被条形码化。加标签步骤可以包括在约37℃的温度孵育约30分钟。工作流程可以包括将多于一个固体支持物和多于一个单细胞和/或单细胞核分区到多于一个分区(例如，包括多于一个微孔的微孔阵列)中，如图4B中示出的。例如，多于一个分区(例如，微孔阵列)中的第一分区422a(例如，微孔)可以包含第一固体支持物424a和第一单细胞420a。第一单细胞420a可以包含由转座体产生的多于一个dsDNA片段。第一固体支持物424a可以包含第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码426a。多于一个分区中的第二分区422b可以包含第二固体支持物424b和第二单细胞420b。第二单细胞420b可以包含由转座体产生的多于一个dsDNA片段。第二固体支持物406b可以包含第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码426b。寡核苷酸条形码中的每一个可以包含细胞标记序列。位于同一分区中的多于一个寡核苷酸条形码的细胞标记可以包括相同的细胞标记序列。位于不同分区中的多于一个寡核苷酸条形码的细胞标记序列可以彼此不同。工作流程可以包括细胞裂解和多于一个dsDNA片段的释放。来自单细胞和/或单细胞核的片段化DNA可以被寡核苷酸条形码426捕获。细胞裂解可以包括在65℃使细胞与SDS和/或蛋白酶K接触。
图5A-图5D是用于标记单细胞中的DNA(例如，gDNA)的非限制性示例性工作流程的示意图。在一些实施方案中，提供转座体，该转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。第一5’突出端可以包含第一靶结合区的互补物。第二5’突出端可以包含通用序列(例如，第二通用序列)。在一些实施方案中，工作流程包括使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端。多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段可以包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链。在一些实施方案中，多于一个dsDNA片段可以包含三个种类，这三个种类由于由包含以下的转座体产生而在其突出端不同：(i)第一衔接子的两个拷贝，(ii)第一衔接子的一个拷贝和第二衔接子的一个拷贝，或(iii)第二衔接子的两个拷贝。例如，多于一个dsDNA片段可以包含：(i)包含侧翼为Tn5转座酶识别序列(例如，镶嵌末端(Mosaic End)(ME 528))的gDNA序列526的dsDNA片段524a，其中dsDNA片段524a包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，所述第一5’突出端包含第一靶结合区的互补物516rc，所述第二5’突出端包含第一靶结合区的互补物516rc；(ii)包含侧翼为Tn5转座酶识别序列(例如，镶嵌末端(ME 528))的gDNA序列526的dsDNA片段524b，其中dsDNA片段524b包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，所述第一5’突出端包含第一靶结合区的互补物516rc，所述第二5’突出端包含第二通用序列530；以及(iii)包含侧翼为Tn5转座酶识别序列(例如，镶嵌末端(ME 528))的gDNA序列526的dsDNA片段524c，其中dsDNA片段524c包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，所述第一5’突出端包含第二通用序列530，所述第二5’突出端包含第二通用序列530。在一些实施方案中，dsDNA片段524a将由于抑制性PCR而不被扩增。在一些实施方案中，dsDNA片段524b被包含在ATAC-Seq文库中。在一些实施方案中，dsDNA片段524c将不被寡核苷酸条形码捕获。在一些实施方案中，如果在两个末端添加相同的seq标签，可能有ATAC-Seq文库的二级发夹结构形成的问题。在一些实施方案中，本文公开的突出端和/或PCR引物设计可以消除这个问题。第一通用序列506和第二通用序列530可以是不同的(例如，包含不同的Illumina引物序列、其互补物和/或其部分)。ME 528的长度可以为约19个核苷酸。多于一个dsDNA片段可以包含缺口525。缺口525的长度可以为约9个核苷酸。5’突出端的长度可以是约14个核苷酸。
在一些实施方案中，工作流程可以包括同时的ATAC-Seq和RNAseq。工作流程可以包括细胞裂解以释放Tn5片段(例如，在优化以保存mRNA的条件下，诸如例如，72℃孵育5分钟)和mRNA，并通过dT寡核苷酸用珠(例如Rhapsody珠)捕获。工作流程可以包含一种或更多种RNA酶抑制剂以保护mRNA。条形码(例如，随机条形码、第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码、寡核苷酸条形码504)可以包含第三靶结合区512(例如，多(dT))，第三靶结合区可以经由多(dA)尾522与核酸靶(例如，多腺苷酸化RNA转录物518或其它核酸靶，诸如例如，结合试剂寡核苷酸，无论是与结合试剂关联的还是与结合试剂解离的)结合，或与其他核酸靶结合，用于标记或条形码化(例如，独特标记)。第三靶结合区512可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体(random multimer)或其任何组合。寡核苷酸条形码504还可以包含多个标记。寡核苷酸条形码504可以包含分别用于标记转录物和追踪RNA转录物(或核酸靶，诸如例如抗体寡核苷酸，无论是与抗体关联的还是已与抗体解离的)的样品来源的分子标记(ML)510和样品标记(例如，分区标记、细胞标记(CL)508)，以及用于后续反应的位于每种寡核苷酸条形码504的分子标记510/细胞标记508区域侧翼的一个或更多个另外的序列，诸如例如，第一通用序列506(例如，读段1序列)。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码504与固体支持物(例如，颗粒502)关联。寡核苷酸条形码504可以经由其5’末端与颗粒502关联。多于一个条形码504可以与颗粒502关联。条形码(例如，随机条形码、第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码、寡核苷酸条形码514)可以包含第一靶结合区516(例如，多(dT))，第一靶结合区可以与dsDNA片段的第一链的第一5’突出端516rc结合。第一靶结合区516可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体、任何预定序列或其任何组合。寡核苷酸条形码514还可以包含多个标记。寡核苷酸条形码514可以包含分别用于标记转录物和/或追踪dsDNA片段的样品来源的分子标记(ML)510和样品标记(例如，分区标记、细胞标记(CL)508)，以及用于后续反应的位于每个寡核苷酸条形码514的分子标记510/细胞标记508区域侧翼的一个或更多个另外的序列，诸如例如，第一通用序列506(例如，读段1序列)。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码514与固体支持物(例如，颗粒502)关联。寡核苷酸条形码514可以经由其3’末端与颗粒502关联。多于一个条形码514可以与颗粒502关联。
在一些实施方案中，颗粒是珠。珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合珠，例如可变形的珠或凝胶珠(诸如来自10X Genomics,San Francisco,CA的水凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生水凝胶珠。
将寡核苷酸固定到固体基底的方法已经很好地建立。多种化学修饰可以用于将核酸经由其5’末端和/或3’末端与固体支持物(例如，珠)共价偶联(直接或经由接头)。为允许核酸分子的结合，固体支持物可以被官能化以暴露亲核基团，亲核基团可以与核酸上的反应性基团反应。可选地，可以将反应性基团引入固体支持物以与核酸中存在的亲核体反应。合适的基团或部分包括羟基、硫醇、氨基和活化的羧酸基团，而能够与这些反应的基团包括二氯三嗪基、烷基环氧基、马来酰亚胺、溴乙酰基等。将核酸经由其5’末端和/或3’末端偶联到不同类型的固体支持物(例如，官能化的固体支持物)的策略在以下中描述：例如，Gosh和Musso(Nuc.acid Res.,15(13),5353-5372,1987)；“Strategies for AttachingOligonucleotides to Solid Supports”,Technical Bulletin,Integrated DNATechnologies,2014(v6)；Hermanson,Bioconjugate Techniques,第二版(AcademicPress,2008)；Chrisey等人.Covalent attachment of synthetic DNA to self-assembled monolayer films(1996)Nucleic Acids Research,vol.24,No.15 3031-3039.；Guo等人,Nucleic Acids Res.22:5456-5465(1994)；Pease等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(11):5022-5026(1994)；Khrapko等人,Mol Biol(Mosk)(USSR)25:718-730(1991)；Stimpson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6379-6383(1995)；Fodor等人的美国专利第5,871,928号；Brenner的美国专利第5,654,413号；Pease等人的美国专利第5,429,807号和美国专利第5,599,695号；每一项的内容通过引用以其整体并入本文。根据固体支持物和核酸分子上反应性或亲核基团的存在，偶联可以直接进行或用双官能试剂或交联剂进行。双官能和偶联试剂是本领域熟知的，并且可从商业来源诸如Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、ProteoChem等获得。
工作流程可以包括dsDNA片段524b和寡核苷酸条形码514的杂交500a。工作流程可以包括多腺苷酸化RNA转录物518和寡核苷酸条形码504杂交500a。在一些实施方案中，延伸反应500b可以包括使与多腺苷酸化RNA转录物518杂交的寡核苷酸条形码504延伸以产生条形码化核酸分子532，所述条形码化核酸分子包含cDNA 520c(RNA序列520r的反向互补序列)。
在一些实施方案中，工作流程可以包括在将dsDNA片段524b的第二链连接到寡核苷酸条形码514之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充dsDNA片段524b的第二链和杂交的寡核苷酸条形码514b之间的缺口527(例如，通过Klenow延伸500b)。在一些实施方案中，工作流程可以包括用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充一个或更多个缺口525(例如，通过Klenow延伸500b)。工作流程可以包括使用寡核苷酸条形码514对dsDNA片段524b进行条形码化以产生条形码化DNA片段536(例如，工作流程可以包括将dsDNA片段524b的第二链连接500b到杂交的寡核苷酸条形码514)。
在一些实施方案中，工作流程可以包括使用寡核苷酸条形码514对dsDNA片段524a进行条形码化以产生条形码化DNA片段534(例如，工作流程可以包括将dsDNA片段524a的第二链连接500b到杂交的寡核苷酸条形码514)。在一些实施方案中，条形码化DNA片段534经历一个或更多个下游延伸、扩增和/或测序反应(例如，使用与506以及516rc或其互补物杂交的引物扩增)。
工作流程可以包括变性500c(例如，使用加热和/或化学品)。工作流程可以包括条形码化DNA片段536和/或条形码化核酸分子532的下游500d引物延伸、扩增和/或测序。条形码化DNA片段536和/或条形码化核酸分子532可以用作一个或更多个延伸反应(例如，随机引发和延伸)和/或扩增反应(例如，PCR)的模板。例如，条形码化核酸分子532可以与随机引物540和可以退火到第一通用序列506(或其互补物)的引物538接触。例如，条形码化DNA片段536可以经历使用可以分别退火到第一通用序列和第二通用序列(或其互补物)的扩增引物538和542的第一轮扩增(“PCR1”)，从而产生第四多于一个条形码化DNA片段。在一些实施方案中，扩增多于一个条形码化DNA片段包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个条形码化DNA片段。在一些实施方案中，获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据包括获得第四多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。
图6A-图6D是用于标记单细胞中的DNA(例如，gDNA)的非限制性示例性工作流程的示意图。在一些实施方案中，提供了转座体，所述转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子。第一5’突出端可以包含第二靶结合区的互补物。第二5’突出端可以包含通用序列(例如，第二通用序列)。在一些实施方案中，工作流程包括使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端。多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段可以包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链。在一些实施方案中，提供了包含5’偶联序列的互补物630rc和3’第二靶结合区的互补物616rc的偶联寡核苷酸634。在一些实施方案中，多于一个dsDNA片段可以包含三个种类，这三个种类由于由包含以下的转座体产生而在其突出端不同：(i)第一衔接子的两个拷贝，(ii)第一衔接子的一个拷贝和第二衔接子的一个拷贝，或(iii)第二衔接子的两个拷贝。例如，多于一个dsDNA片段可以包含：(i)包含侧翼为Tn5转座酶识别序列(例如，镶嵌末端(ME 628))的gDNA序列626的dsDNA片段624a，其中dsDNA片段624a包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，所述第一突出端包含偶联序列630，所述第二5’突出端包含偶联序列630；(ii)包含侧翼为Tn5转座酶识别序列(例如，镶嵌末端(ME 628))的gDNA序列626的dsDNA片段624b，其中dsDNA片段624b包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，所述第一突出端包含偶联序列630，所述第二5’突出端包含第二通用序列632；以及(iii)包含侧翼为Tn5转座酶识别序列(例如，镶嵌末端(ME 628))的gDNA序列626的dsDNA片段624c，其中dsDNA片段624c包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，所述第一5’突出端包含第二通用序列632，所述第二5’突出端包含第二通用序列632。在一些实施方案中，dsDNA片段624a将由于抑制性PCR而不被扩增。在一些实施方案中，dsDNA片段624b被包含在ATAC-Seq文库中。在一些实施方案中，dsDNA片段624c将不被寡核苷酸条形码捕获。在一些实施方案中，如果在两个末端添加相同的seq标签，可能有ATAC-Seq文库的二级发夹结构形成的问题。在一些实施方案中，本文公开的突出端和/或PCR引物设计可以消除这个问题。第一通用序列606和第二通用序列632可以是不同的(例如，包含不同的Illumina引物序列、其互补物和/或其部分)。ME 628的长度可以为约19个核苷酸。多于一个dsDNA片段可以包含缺口625。缺口625的长度可以为约9个核苷酸。5’突出端的长度可以是约14个核苷酸。
工作流程可以包括同时的ATAC-Seq和RNAseq。工作流程可以包括细胞裂解以释放Tn5片段(例如，在优化以保存mRNA的条件下，诸如例如，72℃孵育5分钟)和mRNA，并通过dT寡核苷酸用珠(例如Rhapsody珠)捕获。工作流程可以包含一种或更多种RNA酶抑制剂以保护mRNA。条形码(例如，随机条形码、第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码、寡核苷酸条形码604)可以包含第三靶结合区612(例如，多(dT))，第三靶结合区可以经由多(dA)尾622与核酸靶(例如，多腺苷酸化RNA转录物618或其它核酸靶，诸如例如，结合试剂寡核苷酸，无论是与结合试剂关联的还是与结合试剂解离的)结合，或与其他核酸靶结合，用于标记或条形码化(例如，独特标记)。第三靶结合区612可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。寡核苷酸条形码604还可以包含多个标记。寡核苷酸条形码604可以包含分别用于标记转录物和追踪RNA转录物(或核酸靶，诸如例如抗体寡核苷酸，无论是与抗体关联的还是已与抗体解离的)的样品来源的分子标记(ML)610和样品标记(例如，分区标记、细胞标记(CL)608)，以及用于后续反应的位于每种寡核苷酸条形码604的分子标记610/细胞标记608区域侧翼的一个或更多个另外的序列，诸如例如，第一通用序列606(例如，读段1序列)。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码604与固体支持物(例如，颗粒602)关联。寡核苷酸条形码604可以经由其5’末端与颗粒602关联。多于一个条形码604可以与颗粒602关联。条形码(例如，随机条形码、第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码、寡核苷酸条形码614)可以包含第二靶结合区616(例如，多(dT))，第二靶结合区可以与偶联寡核苷酸634的3’第二靶结合区的互补物616rc结合。第二靶结合区616可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体、任何预定序列或其任何组合。寡核苷酸条形码614还可以包含多个标记。寡核苷酸条码614可以包含分别用于标记转录物和/或追踪dsDNA片段的样品来源的分子标记(ML)610和样品标记(例如，分区标记、细胞标记(CL)608)，以及用于后续反应的位于每个寡核苷酸条形码614的分子标记610/细胞标记608区域侧翼的一个或更多个另外的序列，诸如例如，第一通用序列606(例如，读段1序列)。在一些实施方案中，寡核苷酸条形码614与固体支持物(例如，颗粒602)关联。寡核苷酸条形码614可以经由其5’末端与颗粒602关联。多于一个条形码614可以与颗粒602关联。在一些实施方案中，颗粒是珠。珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合珠，例如可变形的珠或凝胶珠(诸如来自10X Genomics,San Francisco,CA的水凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。凝胶珠可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生水凝胶珠。
工作流程可以包括dsDNA片段624b的第一链的偶联序列与偶联寡核苷酸634的5’偶联序列的互补物630rc的杂交600a。工作流程可以包括偶联寡核苷酸634的3’第二靶结合区的互补物616rc与寡核苷酸条形码614的第二靶结合区616的杂交600a。工作流程可以包括使多腺苷酸化RNA转录物618和寡核苷酸条形码604杂交600a。
在一些实施方案中，延伸反应600b可以包括使与多腺苷酸化RNA转录物618杂交的寡核苷酸条形码604延伸以产生条形码化核酸分子640，所述条形码化核酸分子包含cDNA620c(RNA序列620r的反向互补序列)。在一些实施方案中，工作流程可以包括在将dsDNA片段624b的第一链连接到寡核苷酸条形码614之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充dsDNA片段624b的第一链和杂交的寡核苷酸条形码614之间的缺口627(例如，通过Klenow延伸600b)。
工作流程可以包括使用寡核苷酸条形码614对dsDNA片段624b进行条形码化以产生条形码化DNA片段638a和/或条形码化DNA片段638b。在一些实施方案中，工作流程可以包括在将dsDNA片段624b的第二链连接到偶联寡核苷酸634之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充dsDNA片段624b的第二链和偶联寡核苷酸634之间的缺口629(例如，通过Klenow延伸600b)。工作流程可以包括将dsDNA片段624b的第一链连接600b到杂交的寡核苷酸条形码614和/或将dsDNA片段624b的第二链连接600b到偶联寡核苷酸634(例如，用DNA连接酶)。在一些实施方案中，工作流程可以包括用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充一个或更多个缺口625(例如，通过Klenow延伸600b)。工作流程可以包括dsDNA片段624b的第一链和/或第二链的延伸600b。
工作流程可以包括使用寡核苷酸条形码614对dsDNA片段624a进行条形码化以产生条形码化DNA片段636a和/或条形码化DNA片段636b，如图6A-图6D中示出的。在一些实施方案中，条形码化DNA片段636a和/或条形码化DNA片段636b经历一个或更多个下游延伸、扩增和/或测序反应(例如，使用与606以及630rc或其互补物杂交的引物扩增)。
工作流程可以包括变性600c(例如，使用加热和/或化学品)。工作流程可以包括条形码化核酸分子640、条形码化DNA片段638a和/或条形码化DNA片段638b的下游600d引物延伸、扩增和/或测序。条形码化核酸分子640、条形码化DNA片段638a和/或条形码化DNA片段638b可以用作一个或更多个延伸反应(例如，随机引发和延伸)和/或扩增反应(例如，PCR)的模板。例如，条形码化核酸分子640可以与随机引物644和可以退火到第一通用序列606(或其互补物)的引物642接触。例如，条形码化DNA片段638a和/或条形码化DNA片段638b可经历使用可以分别退火到第一通用序列和第二通用序列(或其互补物)的扩增引物642和646的第一轮扩增(“PCR1”)，从而产生第四多于一个条形码化DNA片段。在一些实施方案中，扩增多于一个条形码化DNA片段包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个条形码化DNA片段。在一些实施方案中，获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据包括获得第四多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。
在一些实施方案中，提供了用于标记DNA(例如，开放染色质相关gDNA)的组合物和方法。在一些实施方案中，方法包括：使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及使用第一多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化，以产生多于一个条形码化DNA片段，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，并且其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与多于一个dsDNA片段中的至少一个的第一5’突出端杂交的第一靶结合区。在一些实施方案中，使用第一多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：使dsDNA片段的第一链的第一5’突出端与第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第一靶结合区杂交；以及使所述dsDNA片段的第二链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码。方法可以包括：在将第二链连接到寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第二链和所述杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。使第二链连接到寡核苷酸条形码可以使用DNA连接酶来进行。第一5’突出端可以包含第一靶结合区的互补物。
在一些实施方案中，提供了用于标记DNA(例如，开放染色质相关gDNA)的组合物和方法。在一些实施方案中，该方法包括：使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有第一5’突出端的第一链和含有第二5’突出端的第二链，其中转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子，并且其中第一5’突出端包含偶联序列；提供包含5’偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物的偶联寡核苷酸；以及使用第二多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化以产生多于一个条形码化DNA片段，其中第二多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第二靶结合区。在一些实施方案中，使用第二多于一个寡核苷酸条形码对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：使dsDNA片段的第一链的偶联序列与偶联寡核苷酸的5’偶联序列的互补物杂交；使偶联寡核苷酸的3’第二靶结合区的互补物与第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第二靶结合区杂交；以及使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码并延伸所述第一链；和/或使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸并延伸所述第二链。方法可以包括：在使第一链连接到寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第一链和杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。方法可以包括：在使第二链连接到偶联寡核苷酸之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充第二链和偶联寡核苷酸之间的缺口。使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码和/或使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸可以用DNA连接酶来进行。
偶联寡核苷酸可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。偶联寡核苷酸的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。偶联序列的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。多于一个dsDNA片段可以包含一个或更多个缺口。一个或更多个缺口的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。一个或更多个缺口的长度可以是约9个核苷酸。方法可以包括：用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充一个或更多个缺口。第一5’突出端和/或第二5’突出端的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。第一5’突出端和/或第二5’突出端可以包含约14个核苷酸。第二5’突出端可以包含第二通用序列。第一衔接子和/或第二衔接子可以包含转座子的DNA末端序列(例如，ME)。
细胞可以包含dsDNA。使dsDNA与转座体接触可以包括使细胞透化和/或分离包含dsDNA的细胞的细胞核。细胞可以包括单细胞。dsDNA可以包括基因组DNA(gDNA)。多于一个dsDNA片段可以包含开放染色质相关gDNA。透化可以包括化学或物理透化。透化可以包括使细胞与去污剂和/或表面活性剂接触。透化可以包括通过声处理使细胞透化。方法可以包括：使细胞中的细胞核透化以产生透化的细胞核。方法可以包括：在使细胞核透化之前固定包含细胞核的细胞。
转座酶和/或转座体可以变化。例如，转座酶可以包括Tn5转座酶。转座酶可以是例如Tn转座酶(例如，Tn3、Tn5、Tn7、Tn10、Tn552、Tn903)、MuA转座酶、Vibhar转座酶(例如，来自哈维氏弧菌(Vibrio harveyi))、Ac-Ds、Ascot-1、Bs1、Cin4、Copia、En/Spm、F元件、hobo、Hsmar1、Hsmar2、IN(HIV)、IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS6、IS10、IS21、IS30、IS50、IS51、IS150、IS256、IS407、IS427、IS630、IS903、IS911、IS982、IS1031、ISL2、L1、Mariner、P元件、Tam3、Tc1、Tc3、Tel、THE-1、Tn/O、TnA、Tn3、Tn5、Tn7、Tn10、Tn552、Tn903、Tol1、Tol2、Tn10、Ty1、任何原核生物转座酶，或与以上列出的转座酶相关和/或衍生自其的任何转座酶。在一些实施方案中，与亲本转座酶相关和/或来源于自亲本转座酶的转座酶可以包含与亲本转座酶的相应肽片段具有至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％氨基酸序列同源性的肽片段。肽片段的长度可以是至少约10个、约15个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约250个、约300个、约400个或约500个氨基酸。例如，来源于Tn5的转座酶可以包含长度为50个氨基酸并且与亲本Tn5转座酶中的相应片段约80％同源的肽片段。在一些情况下，可以通过添加一种或更多种阳离子来促进和/或触发插入。阳离子可以是二价阳离子，诸如例如，Ca2+、Mg2+和Mn2+。
方法可以包括：获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据。方法可以包括：基于获得的测序数据中多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列确定与gDNA相关的信息。确定与gDNA相关的信息可以包括基于获得的测序数据中多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列确定gDNA的染色质可及性。在一些实施方案中，确定gDNA的染色质可及性包括：比对多于一个条形码化DNA片段的序列与gDNA的参考序列；以及鉴定对应多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的末端具有高于阈值的可及性的gDNA区域。在一些实施方案中，确定gDNA的染色质可及性包括：比对多于一个条形码化DNA片段的序列与gDNA的参考序列；以及基于测序数据中多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的数目，确定对应多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的末端的gDNA区域的可及性。
确定与gDNA相关的信息可以包括基于获得的测序数据中多于一个条形码化DNA片段的序列确定gDNA的甲基化组信息。方法可以包括：消化与双链gDNA关联的核小体。方法可以包括：对多于一个dsDNA片段或其产物的胞嘧啶碱基进行化学转化和/或酶促转化，以产生具有尿嘧啶碱基的多于一个转化的dsDNA片段，其中化学转化包括亚硫酸氢盐处理，并且其中酶促转化包括APOBEC介导的转化。对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化可以包括对多于一个转化的dsDNA片段或其产物进行条形码化。在一些实施方案中，确定甲基化组信息包括：确定测序数据中多于一个条形码化DNA片段具有胸腺嘧啶碱基的位置以及gDNA的参考序列中具有胞嘧啶碱基的相应位置以确定gDNA中具有5-甲基胞嘧啶(5mC)碱基和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)碱基的相应位置。
细胞可以包含核酸靶的拷贝。在一些实施方案中，方法包括使第三多于一个寡核苷酸条形码与核酸靶的拷贝接触以进行杂交，其中第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、能够与核酸靶的拷贝杂交的第三靶结合区和分子标记；使与核酸靶的拷贝杂交的第三多于一个寡核苷酸条形码延伸，以产生多于一个条形码化核酸分子，每个条形码化核酸分子包含与核酸靶的至少一部分互补的序列；以及获得多于一个条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定细胞中核酸靶的拷贝数。确定细胞中核酸靶的拷贝数可以包括基于与多于一个条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。
在一些实施方案中，方法包括使随机引物与多于一个条形码化核酸分子接触，其中随机引物中的每一种包含第三通用序列或其互补物；以及使与多于一个条形码化核酸分子杂交的随机引物延伸以产生多于一个延伸产物。在一些实施方案中，方法包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子。扩增多于一个延伸产物可以包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个延伸产物。
在一些实施方案中，方法包括基于与第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。在一些实施方案中，方法包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第三通用序列或其互补物杂交的引物扩增第一多于一个条形码化扩增子，从而产生第二多于一个条形码化扩增子。扩增第一多于一个条形码化扩增子可以包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到第一多于一个条形码化扩增子。在一些实施方案中，方法包括基于与第二多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。第一多于一个条形码化扩增子和/或第二多于一个条形码化扩增子可以包含全转录组扩增(WTA)产物。
在一些实施方案中，方法包括：使用多于一个条形码化核酸作为模板合成第三多于一个条形码化扩增子以产生第三多于一个条形码化扩增子。合成第三多于一个条形码化扩增子可以包括对多于一个条形码化核酸分子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。合成第三多于一个条形码化扩增子可以包括使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物以及靶特异性引物进行的PCR扩增。方法可以包括：获得第三多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。获得序列信息可以包括将测序衔接子附接到第三多于一个条形码化扩增子或其产物。本文提供的方法可以包括基于与第三多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定细胞中核酸靶的拷贝数。核酸靶可以包括核酸分子。核酸分子可以包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合。
在一些实施方案中，使第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使多于一个寡核苷酸条形码延伸。DNA聚合酶可以包括Klenow片段。逆转录酶可以包括病毒逆转录酶(例如，鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)。第一靶结合区、第二靶结合区和/或第三靶结合区可以包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列、任何长度和组成的预定序列或其任何组合。获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列信息可以包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到多于一个条形码化DNA片段或其产物。
方法可以包括：使用能够与第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个条形码化DNA片段，从而产生第四多于一个条形码化DNA片段。扩增多于一个条形码化DNA片段可以包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到多于一个条形码化DNA片段。获得多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据可以包括获得第四多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。
确定与gDNA相关的信息可以包括基于获得的测序数据中第四多于一个条形码化扩增子或其产物的序列确定gDNA的染色质可及性。在一些实施方案中，确定gDNA的染色质可及性包括：比对第四多于一个条形码化扩增子(或其产物)的序列与gDNA的参考序列；以及鉴定对应第四多于一个条形码化扩增子(或其产物)中的条形码化扩增子(或其产物)的末端具有高于阈值的可及性的gDNA区域。在一些实施方案中，确定gDNA的染色质可及性包括：比对第四多于一个条形码化扩增子(或其产物)的序列与gDNA的参考序列；以及基于测序数据中第四多于一个条形码化扩增子(或其产物)中的条形码化扩增子(或其产物)的数目，确定对应第四多于一个条形码化扩增子(或其产物)中的条形码化扩增子(或其产物)的末端的gDNA区域的可及性。
确定与gDNA相关的信息可以包括基于获得的测序数据中第四多于一个条形码化扩增子(或其产物)的序列确定gDNA的甲基化组信息。方法可以包括：消化与双链gDNA缔合的核小体。方法可以包括：对多于一个dsDNA片段或其产物的胞嘧啶碱基进行化学转化和/或酶促转化，以产生具有尿嘧啶碱基的多于一个转化的dsDNA片段，其中化学转化包括亚硫酸氢盐处理，并且其中酶促转化包括APOBEC介导的转化。对多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化可以包括对多于一个转化的dsDNA片段或其产物进行条形码化。在一些实施方案中，确定甲基化组信息包括：确定测序数据中多于一个条形码化DNA片段具有胸腺嘧啶碱基的位置以及gDNA的参考序列中具有胞嘧啶碱基的相应位置以确定gDNA中具有5-甲基胞嘧啶(5mC)碱基和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)碱基的相应位置。
第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码可以包含第一通用序列。第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列可以是相同的。第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列可以是不同的。第一通用序列、第二通用序列和/或第三通用序列可以包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。测序衔接子可以包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。测序引物可以包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自可以包含分子标记。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个可以包含不同的分子标记序列。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每一种分子标记可以包含至少6个核苷酸。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码可以与固体支持物关联。与同一固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自可以包含相同的样品标记。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每一种样品标记可以包含至少6个核苷酸。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自可以包含细胞标记。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每一种细胞标记可以包含至少6个核苷酸。与同一固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码可以包含相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码可以包含不同的细胞标记。
固体支持物可以包括合成颗粒、平坦表面，或其组合。方法可以包括：使包含第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码的合成颗粒与细胞关联。方法可以包括：在将合成颗粒与细胞关联后裂解细胞。裂解细胞可以包括加热细胞、使细胞与去污剂接触、改变细胞的pH或其任何组合。合成颗粒和单细胞可以在同一分区中。分区可以是孔或液滴。
第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码可以被固定或部分地固定在合成颗粒上，或者第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码可以被包封或部分地包封在合成颗粒中。合成颗粒可以是可破坏的(例如，可破坏的水凝胶颗粒)。合成颗粒可以包括珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。合成颗粒可以包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码可以包含接头官能团。合成颗粒可以包含固体支持物官能团。支持物官能团和接头官能团可以彼此关联。接头官能团和支持物官能团可以单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。
试剂盒
本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：转座体，其包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及第一多于一个寡核苷酸条形码，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，其中第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与第一5’突出端杂交的第一靶结合区。
本文的公开内容包括试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：转座体，其包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子，其中第一5’突出端包含偶联序列；以及偶联寡核苷酸，其包含5’偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物。
试剂盒可以包含：第二多于一个寡核苷酸条形码，其中第二多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第二靶结合区。偶联寡核苷酸可以是单链寡核苷酸。偶联寡核苷酸可以包含至少6个核苷酸。偶联序列可以包含至少4个核苷酸。第一5’突出端和/或第二5’突出端可以包含至少4个核苷酸。第二5’突出端可以包含第二通用序列。第一衔接子和/或第二衔接子可以包含转座子的DNA末端序列。试剂盒可以包含：缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以包括Klenow片段。试剂盒可以包含：逆转录酶。逆转录酶可以包括病毒逆转录酶(例如，鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶)。试剂盒可以包含：连接酶。试剂盒可以包含：去污剂和/或表面活性剂。试剂盒可以包含：缓冲液、筒或两者。试剂盒可以包含：一种或更多种用于逆转录反应和/或扩增反应的试剂。转座酶可以包括Tn5转座酶。
试剂盒可以包含：第三多于一个寡核苷酸条形码，其中第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码可以包含第三靶结合区。第一靶结合区、第二靶结合区和/或第三靶结合区可以包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自可以包含分子标记。分子标记可以包含至少6个核苷酸。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个可以包含不同的分子标记序列。
第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码可以与固体支持物关联。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码各自可以包含细胞标记。与同一固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码可以包含相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码可以包含不同的细胞标记。固体支持物可以包括合成颗粒、平坦表面，或其组合。
在一些实施方案中，第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被固定或部分地固定在合成颗粒上，或者第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被包封或部分地包封在合成颗粒中。合成颗粒可以是可破坏的(例如，可破坏的水凝胶颗粒)。合成颗粒可以包括珠。珠可以包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。合成颗粒可以包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。第一、第二和/或第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码可以包含接头官能团。合成颗粒可以包含固体支持物官能团。支持物官能团和接头官能团可以彼此关联。接头官能团和支持物官能团可以单独地选自由C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合组成的组。
术语
在至少一些先前描述的实施方案中，一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
本领域的技术人员将理解，对于本文公开的这个和其他过程和方法，在该过程和方法中执行的功能可以以不同的顺序实现。此外，所概述的步骤和操作仅作为示例提供，并且该步骤和操作中的一些可以是任选的，组合成较少的步骤和操作，或者扩展成另外的步骤和操作，而不偏离所公开的实施方案的本质。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于上下文和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，并且尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中的术语，通常意在作为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”，等等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在这种陈述不存在的情况下，不存在这种意图。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制为包含仅一种此类陈述的实施方案，甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，此类陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意在为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到，本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括该范围的任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所陈述的数字，并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
从前述内容，应当理解，本文出于说明的目的已经描述了本公开内容的各种实施方案，并且可以在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案并不旨在进行限制，真正的范围和精神由以下权利要求来指示。
Claims (99)
1.一种标记DNA的方法，所述方法包括：
使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中所述多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有所述第一5’突出端的第一链和含有所述第二5’突出端的第二链，其中所述转座体包含转座酶、具有所述第一5’突出端的第一衔接子和具有所述第二5’突出端的第二衔接子；以及
使用第一多于一个寡核苷酸条形码对所述多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化以产生多于一个条形码化DNA片段，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，并且其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与所述多于一个dsDNA片段中的至少一个的第一5’突出端杂交的第一靶结合区。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用第一多于一个寡核苷酸条形码对所述多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：
使dsDNA片段的第一链的第一5’突出端与所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第一靶结合区杂交；以及
使所述dsDNA片段的第二链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括在使所述第二链连接到所述寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充所述第二链和所述杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中使所述第二链连接到所述寡核苷酸条形码使用DNA连接酶来进行。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一5’突出端包含第一靶结合区的互补物。
6.一种标记DNA的方法，所述方法包括：
使双链脱氧核糖核酸(dsDNA)与转座体接触以产生多于一个dsDNA片段，每个dsDNA片段包含第一5’突出端和第二5’突出端，其中所述多于一个dsDNA片段中的每个dsDNA片段包含含有所述第一5’突出端的第一链和含有所述第二5’突出端的第二链，其中所述转座体包含转座酶、具有所述第一5’突出端的第一衔接子和具有所述第二5’突出端的第二衔接子；并且其中所述第一5’突出端包含偶联序列；
提供包含5’所述偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物的偶联寡核苷酸；以及
使用第二多于一个寡核苷酸条形码对所述多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化以产生多于一个条形码化DNA片段，其中所述第二多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含所述第二靶结合区。
7.根据权利要求6所述的方法，其中使用第二多于一个寡核苷酸条形码对所述多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括：
使dsDNA片段的第一链的偶联序列与所述偶联寡核苷酸的5’偶联序列的互补物杂交；
使所述偶联寡核苷酸的3’第二靶结合区的互补物与所述第二多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码的第二靶结合区杂交；以及
使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码并延伸所述第一链；和/或
使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸并延伸所述第二链。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法包括在使所述第一链连接到所述寡核苷酸条形码之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充所述第一链和所述杂交的寡核苷酸条形码之间的缺口。
9.根据权利要求7-8中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述第二链连接到所述偶联寡核苷酸之前，用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充所述第二链和所述偶联寡核苷酸之间的缺口。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中使所述dsDNA片段的第一链连接到所述杂交的寡核苷酸条形码和/或使所述dsDNA片段的第二链连接到所述偶联寡核苷酸用DNA连接酶来进行。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述偶联寡核苷酸是单链寡核苷酸，任选地所述偶联寡核苷酸包含至少6个核苷酸。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的方法，其中所述偶联序列包含至少4个核苷酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述多于一个dsDNA片段包含一个或更多个缺口，所述方法包括用缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶填充所述一个或更多个缺口。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第一5’突出端和/或所述第二5’突出端包含至少4个核苷酸。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第二5’突出端包含第二通用序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子和/或所述第二衔接子包含所述转座子的DNA末端序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中使dsDNA与转座体接触包括使细胞透化和/或分离细胞的细胞核，其中所述细胞包含dsDNA。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞包括单细胞。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述dsDNA包括基因组DNA(gDNA)。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述多于一个dsDNA片段包含开放染色质相关gDNA。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述透化包括：
(i)化学或物理透化；
(ii)使所述细胞与去污剂和/或表面活性剂接触；和/或
(iii)通过声处理使所述细胞透化。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法，所述方法包括使所述细胞中的细胞核透化以产生透化的细胞核。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述细胞核透化前固定包含所述细胞核的细胞。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述转座酶包括Tn5转座酶。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据。
26.根据权利要求25所述的方法，所述方法包括基于获得的所述测序数据中所述多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列确定与所述gDNA相关的信息。
27.根据权利要求26所述的方法，其中确定与所述gDNA相关的信息包括基于获得的所述测序数据中所述多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列确定所述gDNA的染色质可及性。
28.根据权利要求27所述的方法，其中确定所述gDNA的染色质可及性包括：
比对所述多于一个条形码化DNA片段的序列与所述gDNA的参考序列；以及
鉴定对应所述多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的末端具有高于阈值的可及性的gDNA区域。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中确定所述gDNA的染色质可及性包括：
比对所述多于一个条形码化DNA片段的序列与所述gDNA的参考序列；以及
基于所述测序数据中所述多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的数目，确定对应所述多于一个条形码化DNA片段中的条形码化DNA片段的末端的gDNA区域的可及性。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中确定与所述gDNA相关的信息包括基于获得的所述测序数据中所述多于一个条形码化DNA片段的序列确定所述gDNA的甲基化组信息。
31.根据权利要求30所述的方法，所述方法包括消化与所述双链gDNA关联的核小体。
32.根据权利要求30-31中任一项所述的方法，所述方法包括对所述多于一个dsDNA片段或其产物的胞嘧啶碱基进行化学转化和/或酶促转化，以产生具有尿嘧啶碱基的多于一个转化的dsDNA片段，其中化学转化包括亚硫酸氢盐处理，并且其中酶促转化包括APOBEC介导的转化。
33.根据权利要求32所述的方法，其中对所述多于一个dsDNA片段或其产物进行条形码化包括对所述多于一个转化的dsDNA片段或其产物进行条形码化。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中确定所述甲基化组信息包括：
确定所述测序数据中所述多于一个条形码化DNA片段具有胸腺嘧啶碱基的位置以及所述gDNA的参考序列中具有胞嘧啶碱基的相应位置以确定所述gDNA中具有5-甲基胞嘧啶(5mC)碱基和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)碱基的相应位置。
35.根据权利要求17-34中任一项所述的方法，其中所述细胞包含核酸靶的拷贝，所述方法还包括：
使第三多于一个寡核苷酸条形码与所述核酸靶的拷贝接触以进行杂交，其中所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第一通用序列、能够与所述核酸靶的拷贝杂交的第三靶结合区和分子标记；
使与所述核酸靶的拷贝杂交的所述第三多于一个寡核苷酸条形码延伸以产生多于一个条形码化核酸分子，每个条形码化核酸分子包含与所述核酸靶的至少一部分互补的序列；以及
获得所述多于一个条形码化核酸分子或其产物的序列信息，以确定所述细胞中所述核酸靶的拷贝数。
36.根据权利要求35所述的方法，其中确定所述细胞中所述核酸靶的拷贝数包括基于与所述多于一个条形码化核酸分子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定所述细胞中所述核酸靶的拷贝数。
37.根据权利要求35-36中任一项所述的方法，所述方法包括：
使随机引物与所述多于一个条形码化核酸分子接触，其中所述随机引物中的每一个包含第三通用序列或其互补物；以及
使与所述多于一个条形码化核酸分子杂交的所述随机引物延伸以产生多于一个延伸产物。
38.根据权利要求37所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补物杂交的引物来扩增所述多于一个延伸产物，从而产生第一多于一个条形码化扩增子。
39.根据权利要求38所述的方法，其中扩增所述多于一个延伸产物包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述多于一个延伸产物。
40.根据权利要求38-39中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第一多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定所述细胞中所述核酸靶的拷贝数。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第三通用序列或其互补物杂交的引物来扩增所述第一多于一个条形码化扩增子，从而产生第二多于一个条形码化扩增子。
42.根据权利要求41所述的方法，其中扩增所述第一多于一个条形码化扩增子包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述第一多于一个条形码化扩增子。
43.根据权利要求41-42中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第二多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定所述细胞中所述核酸靶的拷贝数。
44.根据权利要求38-43中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个条形码化扩增子和/或所述第二多于一个条形码化扩增子包含全转录组扩增(WTA)产物。
45.根据权利要求38-44中任一项所述的方法，所述方法包括使用所述多于一个条形码化核酸分子作为模板合成第三多于一个条形码化扩增子以产生第三多于一个条形码化扩增子。
46.根据权利要求45所述的方法，其中合成第三多于一个条形码化扩增子包括对所述多于一个条形码化核酸分子进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。
47.根据权利要求45-46中任一项所述的方法，其中合成第三多于一个条形码化扩增子包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和靶特异性引物进行的PCR扩增。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，所述方法包括获得所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息，并且任选地获得所述序列信息包括将测序衔接子附接到所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，所述方法包括基于与所述第三多于一个条形码化扩增子或其产物关联的具有不同序列的分子标记的数目，确定所述细胞中所述核酸靶的拷贝数。
50.根据权利要求35-49中任一项所述的方法，其中所述核酸靶包括核酸分子，任选地所述核酸分子包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、包含多(A)尾的RNA、样品索引寡核苷酸、细胞组分结合试剂特异性寡核苷酸或其任何组合。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中使所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码、和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码延伸包括使用逆转录酶和/或缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶使所述多于一个寡核苷酸条形码延伸。
52.根据权利要求3-51中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶包括Klenow片段。
53.根据权利要求51-52中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，任选地其中所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述第一靶结合区、所述第二靶结合区和/或所述第三靶结合区包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。
55.根据权利要求25-54中任一项所述的方法，其中获得所述多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列信息包括将测序衔接子和/或测序引物、其互补序列和/或其部分附接到所述多于一个条形码化DNA片段或其产物。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，所述方法包括使用能够与所述第一通用序列或其互补物杂交的引物和能够与所述第二通用序列或其互补物杂交的引物扩增多于一个条形码化DNA片段，从而产生第四多于一个条形码化DNA片段。
57.根据权利要求56所述的方法，其中扩增所述多于一个条形码化DNA片段包括将测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分的序列添加到所述多于一个条形码化DNA片段。
58.根据权利要求56-57中任一项所述的方法，其中获得所述多于一个条形码化DNA片段或其产物的序列数据包括获得所述第四多于一个条形码化扩增子或其产物的序列信息。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第一通用序列。
60.根据权利要求59所述的方法，其中：
(i)所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列是相同的；和/或
(ii)所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列是不同的。
61.根据权利要求59-60中任一项所述的方法，其中所述第一通用序列、所述第二通用序列和/或所述第三通用序列包含测序引物的结合位点和/或测序衔接子、其互补序列和/或其部分。
62.根据权利要求39-61中任一项所述的方法，其中所述测序衔接子包括P5序列、P7序列、其互补序列和/或其部分。
63.根据权利要求39-62中任一项所述的方法，其中所述测序引物包括读段1测序引物、读段2测序引物、其互补序列和/或其部分。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含分子标记，任选地所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码的每种分子标记包含至少6个核苷酸。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码与固体支持物关联。
67.根据权利要求66所述的方法，其中与同一固体支持物关联的所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含相同的样品标记，任选地所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码的每种样品标记包含至少6个核苷酸。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含细胞标记，任选地所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码的每种细胞标记包含至少6个核苷酸。
69.根据权利要求68所述的方法，其中与同一固体支持物关联的所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记，任选地与不同的第一固体支持物关联的所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包括合成颗粒、平坦表面或其组合。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，所述方法包括使包含所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码的合成颗粒与所述细胞关联。
72.根据权利要求71所述的方法，所述方法包括在使所述合成颗粒与所述细胞关联后将所述细胞裂解，任选地将所述细胞裂解包括加热所述细胞、使所述细胞与去污剂接触、改变所述细胞的pH或其任何组合。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒和所述单细胞在同一分区中，并且任选地所述分区是孔或液滴。
74.根据权利要求70-73中任一项所述的方法，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被固定或部分地固定在所述合成颗粒上，或者所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被包封或部分地包封在所述合成颗粒中。
75.根据权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒是可破坏的，任选地所述合成颗粒是可破坏的水凝胶颗粒。
76.根据权利要求70-75中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒包括珠，任选地所述珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。
77.根据权利要求70-76中任一项所述的方法，其中所述合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。
78.根据权利要求70-77中任一项所述的方法，
其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含接头官能团，
其中所述合成颗粒包含固体支持物官能团，并且
其中所述支持物官能团和所述接头官能团彼此关联，并且任选地所述接头官能团和所述支持物官能团单独地选自由以下组成的组：C6、生物素、链霉抗生物素蛋白、一种或更多种伯胺、一种或更多种醛、一种或更多种酮及其任何组合。
79.一种试剂盒，包含：
转座体，所述转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子；以及
第一多于一个寡核苷酸条形码，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的3’末端与固体支持物关联，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码的5’末端包含能够与所述第一5’突出端杂交的第一靶结合区。
80.一种试剂盒，包含：
转座体，所述转座体包含转座酶、具有第一5’突出端的第一衔接子和具有第二5’突出端的第二衔接子，其中所述第一5’突出端包含偶联序列；以及
偶联寡核苷酸，所述偶联寡核苷酸包含5’所述偶联序列的互补物和3’第二靶结合区的互补物。
81.根据权利要求80所述的试剂盒，所述试剂盒包含第二多于一个寡核苷酸条形码，其中所述第二多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含所述第二靶结合区。
82.根据权利要求80-81中任一项所述的试剂盒，其中所述偶联寡核苷酸是单链寡核苷酸，任选地所述偶联寡核苷酸包含至少6个核苷酸，还任选地所述偶联序列包含至少4个核苷酸。
83.根据权利要求79-82中任一项所述的试剂盒，其中所述第一5’突出端和/或所述第二5’突出端包含至少4个核苷酸。
84.根据权利要求79-83中任一项所述的试剂盒，其中所述第二5’突出端包含第二通用序列。
85.根据权利要求79-84中任一项所述的试剂盒，其中所述第一衔接子和/或所述第二衔接子包含所述转座子的DNA末端序列。
86.根据权利要求79-85中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)缺乏5’至3’外切核酸酶活性和3’至5’外切核酸酶活性中的至少一种的DNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶包括Klenow片段；
(ii)逆转录酶，任选地其中所述逆转录酶包括病毒逆转录酶，并且任选地所述病毒逆转录酶是鼠白血病病毒(MLV)逆转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶；
(iii)连接酶；
(iv)去污剂和/或表面活性剂；
(v)缓冲液；
(vi)筒；和/或
(vii)用于逆转录反应和/或扩增反应的一种或更多种试剂。
87.根据权利要求79-86中任一项所述的试剂盒，其中所述转座酶包括Tn5转座酶。
88.根据权利要求79-87中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒包含第三多于一个寡核苷酸条形码，其中所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含第三靶结合区。
89.根据权利要求79-88中任一项所述的试剂盒，其中所述第一靶结合区、所述第二靶结合区和/或所述第三靶结合区包括多(dA)区、多(dT)区、随机序列、基因特异性序列或其任何组合。
90.根据权利要求79-89中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含分子标记，任选地所述分子标记包含至少6个核苷酸。
91.根据权利要求79-90中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少10个包含不同的分子标记序列。
92.根据权利要求79-91中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码与固体支持物关联。
93.根据权利要求79-92中任一项所述的试剂盒，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码各自包含细胞标记，任选地与同一固体支持物关联的所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记，还任选地与不同固体支持物关联的所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的寡核苷酸条形码包含不同的细胞标记。
94.根据权利要求92-93中任一项所述的试剂盒，其中所述固体支持物包括合成颗粒、平坦表面或其组合。
95.根据权利要求94所述的试剂盒，其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被固定或部分地固定在所述合成颗粒上，或者所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的至少一种寡核苷酸条形码被包封或部分地包封在所述合成颗粒中。
96.根据权利要求94-95中任一项所述的试剂盒，其中所述合成颗粒是可破坏的，任选地所述合成颗粒是可破坏的水凝胶颗粒。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的试剂盒，其中所述合成颗粒包括珠，任选地所述珠包括琼脂糖凝胶珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。
98.根据权利要求94-97中任一项所述的试剂盒，其中所述合成颗粒包含选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。
99.根据权利要求94-98中任一项所述的试剂盒，
其中所述第一多于一个寡核苷酸条形码、所述第二多于一个寡核苷酸条形码和/或所述第三多于一个寡核苷酸条形码中的每个寡核苷酸条形码包含接头官能团，
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