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CN116194132A - 肽佐剂对于其在病毒和肿瘤疫苗开发以及癌症免疫疗法和自身免疫性疾病诊断和治疗中的治疗应用 - Google Patents

肽佐剂对于其在病毒和肿瘤疫苗开发以及癌症免疫疗法和自身免疫性疾病诊断和治疗中的治疗应用 Download PDF

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CN116194132A
CN116194132A CN202180054917.8A CN202180054917A CN116194132A CN 116194132 A CN116194132 A CN 116194132A CN 202180054917 A CN202180054917 A CN 202180054917A CN 116194132 A CN116194132 A CN 116194132A
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CN
China
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peptide
ncl
seq
arg
gly
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CN202180054917.8A
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路金华
吴珊
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National University of Singapore
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National University of Singapore
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Abstract

本发明涉及分离的肽以及包含所述肽和抗原或货物分子的组合物以用于疫苗开发、免疫疗法和/或将核酸和蛋白质递送到细胞中，所述分离的肽包含以下项或由以下项组成：具有警报素和/或细胞穿透活性的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域、其生物活性片段或突变体。此外，本发明提供了使用这些肽的检测方法，以及生产所述肽的过程。

Description

肽佐剂对于其在病毒和肿瘤疫苗开发以及癌症免疫疗法和自 身免疫性疾病诊断和治疗中的治疗应用
发明领域
本发明涉及分离的肽以及包含所述肽和抗原或货物分子的组合物以用于疫苗开发、免疫疗法和/或将核酸、蛋白质和其他货物递送到细胞中，所述分离的肽包含以下项或由以下项组成：具有警报素和/或细胞穿透活性的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域、其生物活性片段或突变体。此外，本发明提供了使用这些肽的检测方法，以及生产所述肽的过程。
背景技术
多重耐受机制保护B细胞发育和激活免受自身抗原影响[Theofilopoulos,A.N.,Kono,D.H.和Baccala,R.Nat Immunol 18:716-724(2017)；Nemazee,D.Nat Rev Immunol17:281-294(2017)]。然而，与核抗原反应的多反应性幼稚B细胞在初始库中并不罕见[Wardemann,H.等人,Science 301:1374-1377(2003)]。核仁通常被这些多反应性B细胞抗原受体(BCR)靶向[Wardemann,H.等人,Science 301:1374-1377(2003)]。在患有狼疮、类风湿性关节炎、舍格伦综合征以及其他全身性和慢性自身免疫性疾病的患者中，这些多反应性B细胞可经历免疫球蛋白类别转换并产生致病性IgG自身抗体[Mietzner,B.等人,ProcNatl Acad Sci US A 105:9729-9732(2008)]。自身反应性B细胞产生的另一途径被认为是通过生发中心中的体细胞超变而发生[Zhang,J.等人,J Autoimmun 33:270-274(2009)]。核仁可以是被患者自身抗体靶向的主要或唯一的核区域[Beck,J.S.Lancet 1:1203-1205(1961)；Nakamura,R.M.和Tan,E.M.Hum Pathol 9:85-91(1978)]。在全部ANA阳性患者中，10％-15％主要产生抗核仁自身抗体(ANoA)[Vermeersch,P.和Bossuyt,X.Autoimmun Rev12:998-1003(2013)]。核仁中的蛋白质主要参与rRNA转录和加工以及核糖体组装，并且许多是自身抗原[Welting,T.J.,Raijmakers,R.和Pruijn,G.J.,Autoimmunity Reviews 2:313-321(2003)；de la Cruz,J.,Karbstein,K.和Woolford,J.L.Jr.,Annu Rev Biochem84:93-129(2015)]。尚不清楚是什么赋予核仁强自身免疫原性，但不可避免地涉及B和T细胞耐受性的破坏以及内源性或外源性佐剂。一些自身抗原是核糖核蛋白(RNP)的组分，其中RNA组分通过激活Toll样受体(TLR)展现出佐剂活性[Suurmond,J.和Diamond,B.,J ClinInvest 125:2194-2202(2015)]。已报道ANoA特异性B细胞克隆接种原代自身免疫生发中心，其中其他自身反应性B细胞扩增以产生更宽的自身抗体特异性[Degn,S.E.等人,Cell170:913-926 2017]。
哺乳动物免疫系统包括捕获和感应常见病原体相关分子模式(PAMP)的先天臂和描绘相同微生物中的抗原表位的适应性臂。病原体如何激活先天臂从根本上影响适应性臂如何处理和响应表位，从而产生定制的B和T细胞免疫和免疫记忆[Pulendran,B.和Ahmed,R.,Cell 124:849-863(2006)]。细胞外细菌和真菌感染诱导抗体，从而激活补体和Fc受体以杀死和根除这些病原体。细胞内病毒感染与细胞外和细胞内抗原呈递均相关，导致抗体产生和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活，其分别阻断病毒感染和通过杀死感染细胞来根除病毒[Blum,J S.,Wearsch,P.A.和Cresswell,P.,Annu Rev Immunol 31:443-473(2013)]。癌细胞积累新表位，这些新表位是免疫监视的特异性靶标，并且这些新表位最有效地被CTL靶向[Hollingsworth,R E.和Jansen,K.NPJ Vaccines 4:7(2019)；Chen,F.等人J Clin Invest 129:2056-2070(2019)]。
已经将数十种病原体减毒、灭活或分离为病原体模拟物或疫苗，并根据经验优化以诱导免疫应答和免疫记忆而不引起病原体通常引起的疾病(https://www.cdc.gov/vaccines/vpd/vaccines-list.html)。然而，生产和安全问题已将许多病原体排除在传统疫苗生产之外。在本文中，病毒表面蛋白通常含有足够的MHC I类和II类表位，其可以引发针对病原体如SARS-CoV2的保护性T细胞和B细胞激活[Grifoni,A.等人,Cell HostMicrobe 27:670-680(2020)；Ahmed,S.F.,Quadeer,A.A.和McKay,M.R.,Viruses 12(2020)]。天然病毒感染产生细胞质抗原，其通过MHC I呈递以将CD8 T细胞激活为CTL[Blum,J S.,Wearsch,P.A.和Cresswell,P.,Annu Rev Immunol 31:443-473(2013)]。活病毒还含有通过一种或多种先天免疫受体如Toll样受体(TLR)激活APC的佐剂[Duthie,M S.,Windish,H.P.,Fox,C.B.和Reed,S.G.,Immunol Rev 239:178-196(2011)；Steinhagen,F.,Kinjo,T.,Bode,C.和Kinman,D.M.,Vaccine 29:3341-3355(2011)]。在病毒环境之外，单个病毒蛋白疫苗抗原缺乏细胞质通路并且不知道具有内在佐剂信号。癌抗原是最有效地通过MHC I呈递并被CTL最佳靶向的细胞内抗原[Blum,J S.,Wearsch,P.A.和Cresswell,P.,Annuv Rev Immunol 31:443-473(2013)]。在疫苗的经验制备中，这些通常通过在疫苗组合物中包含替代佐剂来补偿。用于病毒病原体和癌症的有效重组蛋白疫苗的缺乏强调了对使这些蛋白抗原能够显示其抗原性的创新佐剂的需求[Coffman,R L.,Sher,A.和Seder,R.A.,Immunity 33:492-503(2010)；Lee,S.和Nguyen,M T.,Immune Netw 15:51-57(2015)]。
在此我们报道了一组具有警报素和/或细胞穿透活性的肽，其可以用作疫苗中的佐剂和/或用作进入细胞的货物分子的载体。
发明内容
本发明提供具有警报素和/或细胞穿透活性的肽，其用于疫苗开发、免疫疗法、药物递送和炎症诊断。警报素引起抗原呈递细胞如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的激活。核仁素(NCL)是展现出TLR7多态性升高的严重SLE患者、尤其是男性患者中最突出的蛋白自身抗原[Wang,T.等人,Front Immunol 10:1243 2019]，并且还已知在易患狼疮的小鼠中早期诱导自身抗体，然后它们发展出其他自身抗体和狼疮样疾病[Hirata,D.等人,ClinImmunol 97:50-58(2000)]。我们的假设是一些自身抗原具有自身免疫原性，因为它们携带警报素活性。因此，我们检测了NCL是否也含有警报素活性，并发现了其中的警报素肽。然后我们进一步发现，所述肽及其突变变体还展现出细胞穿透活性。因此，我们发现了一组含有警报素和/或细胞穿透活性的相关肽。
根据第一方面，本发明提供了一种分离的肽，所述分离的肽包含具有警报素和/或细胞穿透活性的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域或由其组成。
在一些实施方案中，所述肽的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域包含选自下组的多个氨基酸三聚体，所述组包含RGG、GGR、FGG和GGF。
在一些实施方案中，所述肽的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域还包含选自下组的四聚体，所述组包含RGGG、GGGR、FGGG和GGGF；和/或选自下组的间插氨基酸，所述组包含RG、GR、FR和GDR。
在一些实施方案中，所述肽选自下组，所述组包含以下项或由以下项组成：NCL(SEQ ID NO:1)、FBRL(SEQ ID NO:2)、GAR1(SEQ ID NO:3)或其警报素活性和/或细胞穿透片段或突变体。
在一些实施方案中，所述肽包含下组所示的氨基酸序列或由下组所示的氨基酸序列组成，所述组包含以下项或由以下项组成：
NCL-GAR/RGG:
GGFGGRGGGRGGFGGRGGGRGGRGGFGGRGRGGFGGRGGFRGGRGGGG(SEQ ID NO:4)；
FBRL-GAR/RGG:RGGGFGGRGGFGDRGGRGGRGGFGGGRGRGGGFRGRGRGG(SEQ ID NO:5)；
GAR1-GAR/RGG：RGGGRGGRGGGRGGGGRGGGRGGGFRGGRGGGGGGFRGGRGGG(SEQ ID NO:6)，和
NCL(698)-HA，其中所述GAR\RGG包含：GGFGGRGGGRGGFGGRGGGRGGRGGFGGRGRGGFGGRGGFRGGRGGGG(SEQ ID NO:47)，
或其警报素活性和/或细胞穿透片段或突变体。
在一些实施方案中，肽突变体包含一个或多个氨基酸添加或缺失，如添加一个或多个“G”残基。有利地，所述突变体肽包含在所述GAR/RGG区域内插入一个或多个“G”残基以完成三联体，如“RGRGG”变为“RGGRGG”或“RGGFRGG”变为“RGGFGGRGG”。
在一些实施方案中，所述肽包含下组所示的氨基酸序列或由下组所示的氨基酸序列组成，所述组包含以下项或由以下项组成：
NCL-P1:GGFGGRGGGRGGFGGRGGGRGGRGGFGGRGRG(SEQ ID NO:7)；
NCL-P2:GGFGGRGGGRGGRGGFGGRGRGGFGGRGGFRGGRGG(SEQ ID NO:8)；
NCL-P6:RGGFGGRGGGRGGRGGFGGRG(SEQ ID NO:9)；
FBRL-P1：RGGGFGGRGGFGDRGGRGGRGG(SEQ ID NO:10)，以及
FBRL-P2：RGGFGGGRGRGGGFRGRGRGG(SEQ ID NO:11)
在一些实施方案中，所述突变体肽包含下组所示的氨基酸序列或由下组所示的氨基酸序列组成，所述组包含以下项或由以下项组成：
NCL-P2+G:GGFGGRGGGRGGRGGFGGRGGRGGFGGRGGFRGGRGG(SEQ ID NO:12)；
NCL-P2+3G:GGFGGRGGGRGGRGGFGGRGGRGGFGGRGGFGGRGGRGG(SEQ ID NO:13),
NCL-P2+2G:GGFGGRGGRGGFGGRGGRGGFGGRGGRGGFGGRGGRGG(SEQ ID NO:14).
NCL-P2R/K:GGFGGKGGGKGGKGGFGGKGKGGFGGKGGFKGGKGG(SEQ ID NO:20),
NCL-P2F/R:GGRGGRGGGRGGRGGRGGRGRGGRGGRGGRRGGRGG(SEQ ID NO:21),
NCL-P2R/F:GGFGGFGGGFGGFGGFGGFGFGGFGGFGGFFGGFGG(SEQ ID NO:22),NCL-P2F/Y:GGYGGRGGGRGGRGGYGGRGRGGYGGRGGYRGGRGG(SEQ ID NO:23)
NCL-P2F/W:GGWGGRGGGRGGRGGWGGRGRGGWGGRGGWRGGRGG(SEQ ID NO:24)；
NCL-P2+G(F/I):GGIGGRGGGRGGRGGIGGRGGRGGIGGRGGIRGGRGG(SEQ ID NO:53)；
NCL-P2+G(F/L):GGLGGRGGGRGGRGGLGGRGGRGGLGGRGGLRGGRGG(SEQ ID NO:54)；
NCL-P2+G(G/A)：GGFGARGGARGARGGFGARGARGGFGARGGFRGARGA(SEQ IDNO:55)；以及
NCL-P2+G(G/P)：GGFGPRGGPRGPRGGFGPRGPRGGFGPRGGFRGPRGP(SEQ ID NO:56)。
在一些实施方案中，所述肽或其突变体具有警报素活性和细胞穿透活性。
在一些实施方案中，具有警报素活性和细胞穿透活性的所述肽由下组所示的氨基酸序列组成，所述组包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:53和SEQ ID NO:54。
在一些实施方案中，所述肽具有细胞穿透活性和减弱的警报素活性。所述肽突变体NCL-P2F/R(SEQ ID NO:21)、NCL-P2F/Y(SEQ ID NO:23)和NCL-P2F/W(SEQ ID NO:24)具有细胞穿透活性，但没有显著的警报素活性，并且可用作货物分子的载体。
所述肽可以具有佐剂和/或载体功能。具有警报素活性的肽也用作佐剂，这些术语在本发明的上下文中可互换使用。
在一些实施方案中，将本发明的肽与抗原或货物分子融合。
抗原与具有佐剂活性的肽的融合有利于疫苗开发。本发明的肽与肽(如肽抗原)的融合可以描述为融合多肽。
应当理解，融合包括将本发明的肽和肽突变体分别与抗原或货物分子缀合或连接的已知手段。这种融合可以通过重组DNA方法、肽合成或化学缀合产生。
在一些实施方案中，所述肽可以穿透细胞并携带抗原或货物分子进入所述细胞。在一些实施方案中，所述肽和抗原不是融合在一起，而是混合在组合物中。优选地，所述细胞是树突状细胞或其他抗原呈递细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述至少一种抗原是病原体如细菌、真菌、寄生虫或病毒或者癌细胞所特有的。在一些实施方案中，所述至少一种抗原是病毒蛋白。
在一些实施方案中，所述货物分子是药物或标记分子。
根据第二方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含：
a)本发明任何方面的分离的肽和至少一种抗原；或
b)本发明任何方面的分离的融合多肽；或
c)灭活的癌细胞和本发明任何方面的肽，
以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体或其混合物。
在先前的研究中，转染替代抗原(卵清蛋白)以在T淋巴母细胞EL4细胞(ATCC TIB-39)中表达。当将这些细胞注射到同基因小鼠中时，其在小鼠中诱导杀死EL4-OVA细胞的卵清蛋白特异性细胞毒性T淋巴细胞[Moore,M.W.等人,Cell,54(6):第777-785页(1988)]。在该研究中，尚不清楚注射的EL4-OVA细胞是起抗原呈递细胞的作用还是癌细胞的作用。不受理论的束缚，提出如果在用或不用另外的癌抗原的情况下将癌细胞转染以表达本发明的肽，然后在灭活后作为疫苗注射，则所述肽可以使这些癌细胞成为有效的癌症疫苗。可替代地，可以简单地将所述肽穿透到癌细胞中以使它们具有免疫原性(即诱导针对已在癌细胞内的抗原的免疫)。
在一些实施方案中，所述组合物是疫苗组合物。
根据第三方面，本发明提供了一种增强抗原的免疫原性的方法，其中所述抗原是病原体如细菌、真菌、寄生虫或病毒或者癌细胞所特有的，所述方法包括将本发明的肽警报素与所述抗原融合或混合。
根据第四方面，本发明提供了本发明任何方面的分离的肽、融合多肽或组合物用于制备预防或治疗疾病的药物的用途，其中所述疾病是病毒、真菌、寄生虫、细菌或癌症疾病。
在一些实施方案中，所述药物包含分离的肽，所述分离的肽含有具有选自下组的氨基酸序列的肽警报素，所述组包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:53和SEQ IDNO:54。
在一些实施方案中，所述药物包含分离的肽，所述分离的肽含有与抗原或货物分子融合的具有选自下组的氨基酸序列的肽警报素，所述组包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54。
根据第五方面，本发明提供了一种预防或治疗需要这种治疗的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
a)与抗原或货物分子融合或混合的本发明的分离的警报素肽；或
b)包含其的组合物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用与免疫检查点融合的本发明的肽警报素或靶向肿瘤细胞的其他多肽生物制剂。优选地，所述肽佐剂选自下组，所述组包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:53和SEQ ID NO:54。
本发明的肽的警报素和细胞穿透活性的一种应用是激活T细胞。这可以通过激活/穿透树突状细胞来实现，但是这些肽也可以直接引发或激活T细胞，因为它们也表达这些肽的警报素受体。例如，T细胞激活如图24所示。由于T细胞表达肽受体(图13D和图13H)，因此所述肽还可以直接刺激T细胞以在T细胞激活方面与树突状细胞协同作用。此外，根据图24，所述肽可以用于直接激活T细胞或甚至B(图24C和图24G)细胞。T细胞也可以具有抗原呈递能力。
根据第六方面，本发明提供了一种激活至少一种树突状细胞或其他抗原呈递细胞或T细胞的方法，所述方法包括将所述至少一种树突状细胞、抗原呈递细胞或T细胞暴露于本发明任何方面的分离的肽或与抗原或货物分子融合或混合的分离的肽。
根据第七方面，本发明提供了一种编码本发明任何方面的肽或融合多肽的分离的多核苷酸。
如本领域技术人员所理解的，在某些实施方案中，所述核酸可以进一步包含质粒序列。所述质粒序列可以包含例如启动子序列、选择标记物序列或基因座靶向序列中的一个或多个序列。将核酸组合物引入细胞中的方法为本领域所熟知。
根据本发明的第八方面，提供了一种克隆或表达载体，所述克隆或表达载体包含一个或多个与启动子可操作连接的编码本发明的肽或融合多肽的多核苷酸。
根据第九方面，本发明提供了一种用于生产本发明任何方面的肽或融合多肽的方法，所述方法包括培养宿主细胞或无细胞多肽制造组合物，所述无细胞多肽生产组合物包含表达载体，所述表达载体含有一个或多个与启动子可操作连接的编码本发明的所述肽或融合多肽的多核苷酸；以及分离相应的肽或融合多肽。
在一些实施方案中，所述融合多肽包含NCL-P2+G警报素/佐剂肽和抗原(如潜在的癌抗原肽IPA1E2)。在一些实施方案中，IPA1E2包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NCL-P2+G-IPA1E2融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示。
根据第十方面，本发明提供了一种用于检测受试者中含有GAR/RGG的肽的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供来自所述受试者的生物样品；
ii)测定所述生物样品中存在的含有GAR/RGG的蛋白质的水平。
在一些实施方案中，所述受试者患有自身免疫性疾病，其中高于对照水平的含有GAR/RGG的肽的水平指示所述受试者中的自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，向所述受试者施用本发明的分离的肽或融合多肽或组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括使i)中的样品与对于含有GAR/RGG的蛋白质具有特异性的抗体接触。优选地，所述抗体特异性地结合所述含有GAR/RGG的肽(如核仁素(NCL)、纤维蛋白(FBRL)或GAR1)的GAR/RGG区域或其生物活性GAR/RGG区域突变体。
在一些实施方案中，所述生物样品选自下组，所述组包含血液、脑脊液和尿液。
根据第十一方面，本发明提供了一种出于研究或疾病治疗的目的增强抗原或货物分子(如核酸或多肽试剂或治疗药物)的细胞内递送的方法，所述方法包括将本发明的肽与所述抗原或货物分子组合。
本发明人已经鉴定了由短肽及其突变体携带的有效佐剂(警报素)和/或细胞穿透活性。肽警报素是罕见的，并且具有警报素和细胞穿透两种活性的肽是独特的。所述GAR/RGG肽可以包含在含有疫苗抗原、特别是病毒或癌症疫苗抗原的组合物中以增强它们的免疫原性。
所述GAR/RGG肽不仅发现于核仁蛋白核仁素(NCL)中，而且还发现于许多其他核自身抗原中。它是一种线性和水溶性肽，且没有明显的二级结构或细胞毒性，这使得它成为一种用于多种疫苗抗原的完美的连接肽。
所述GAR/RGG肽在疫苗开发中的应用是原本有害的病理生理学现象的积极应用。本申请旨在将自身抗原的内在佐剂活性转移至疫苗，但不转移其抗原性。基于抗原性预测和使用P2+G包被板筛选SLE患者自身抗体的ELISA，NCL GAR/RGG序列没有显著贡献表位(数据未显示)。
NCL的GAR/RGG肽具有双重佐剂特性：1)它可以激活在APC和一些淋巴细胞上表达的TLR2，和2)它也可以穿透细胞膜，因此预期将疫苗抗原以融合或单独添加的形式递送到APC的细胞质中。重组蛋白抗原比减毒/灭活的完整病原体更简单和更安全，但是它们很少被制成成功的疫苗，尽管如此，最近使用mRNA疫苗生产了重组冠状病毒刺突蛋白。关键的原因是1)它们的低免疫原性/功效和2)它们不能进入APC细胞质以诱导CTL免疫，这对于针对病毒、癌症和其他细胞内病原体的有效免疫防御是必不可少的。本发明的GAR/RGG肽穿透细胞膜以及激活APC的能力可以有效地补偿在重组蛋白抗原中发现的这些弱点，并且潜在地使新一代廉价且安全的疫苗能够用于许多疾病。
包括在本说明书中的对文献、法条、材料、装置、制品等的任何讨论不应该因为其在每个所附权利要求的优先权日之前存在而被视为承认任何或所有这些内容形成现有技术基础的一部分，或者是与本公开文本相关的领域中的公知常识。
附图说明
图1A-图1J显示核仁素是激活PBMC、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)的有效警报素。A)分离核仁素和其他蛋白质以刺激血液白细胞。将HeLa细胞均质化以通过2.2M蔗糖离心分离细胞核。用名称为TxN的Triton X-100耗尽细胞核的脂质包膜。使用TxN，使用0.5M NaCl从染色质纤维提取细胞核物质，并且将这些提取的细胞核物质称为TxNE。通过亲和色谱法从TxNE分离NCL和HMGB1。还将TxNE施加到非免疫小鼠IgG1柱上，并将等效洗脱级分1-3合并作为对照(Ms IgG1)。从这些柱洗脱的级分10缺乏可检测的蛋白质，并且将它们合并作为另一个对照(E10)。将所有的刺激剂和对照包被在板上以刺激不同的细胞。LPS用作阳性对照。通过测量培养基中TNFα和IL-1β的分泌来测定细胞激活。B和C)从PBMC诱导的TNFα和IL-1β。D和E)从单核细胞诱导的TNFα和IL-1β。F和G)分别从DC和巨噬细胞诱导的TNFα。进行三次实验，并将数据以平均值±SD表示。****p<0.0001。n.d.不可检测。H-J)来自PBMC的TNFα和IL-1β诱导的动力学。用NCL(H)、HMGB1(I)或LPS(J)刺激PBMC 2.5、5.0、10、14、18和24小时。在培养基中测量TNFα和IL-1β。注意NCL和HMGB1的细胞因子诱导的类似动力学。
图2A-图2B显示了纯化的核蛋白中的内毒素水平。使用与蛋白G-琼脂糖交联的小鼠抗NCL抗体和小鼠抗HMGB1抗体亲和纯化NCL和HMGB1。使用与蛋白G-琼脂糖交联的小鼠抗HA抗体亲和纯化NCL-HA及其缺失突变体。首先将蛋白质透析到PBS中，然后稀释至40μg/ml。在包被在板上之前，使用ToxinSensor显色LAL内毒素测定试剂盒(GenScript)测量这些蛋白质中的内毒素。用本研究中使用的其他纯化蛋白质进行类似的测定。检测到的内毒素水平通常低于0.1EU/μg(A)或0.5EU/ml(B)。
图3A-图3E显示核仁素激活TLR2。A)用于检查NCL激活TLR的NF-κB萤光素酶测定的示意图。TLR的细胞外配体结合结构域含有富含亮氨酸的重复序列。TLR4以与MD2和CD14的复合物的形式起作用。TLR2以与TLR1、TLR6或TLR10的同二聚体或异二聚体的形式起作用。TLR5独立于共受体起作用。已经指出了这些TLR中每一个的已知配体。它们的细胞质结构域与MyD88相互作用以引起PI3激酶(PI3K)、MAPK和NF-κB激活，导致细胞激活和细胞因子产生。在该测定中，通过用TLR和两种萤光素酶表达质粒共转染293T细胞来测量NF-κB激活：在五个重复的NF-κB启动子序列(5XNF-κB)下控制的诱导型萤火虫萤光素酶表达作为TLR信号传导的量度，并且在CMV启动子控制下的组成型海肾萤光素酶表达用于使不同实验的细胞数目和转染效率归一化。B)TLR和炎性体在NCL激活PBMC中的作用。在用NCL、HMGB1或LPS(0.5μg/ml)培养24小时之前，将PBMC与MyD88抑制剂st-2825(30μm)、半胱天冬酶1抑制剂(10μm)或两者预孵育1小时。作为对照，在刺激前将细胞与DMSO预孵育。在培养基中测量TNFα和IL-1β。C和D)NF-κB萤光素酶测定。如所示，用NF-κB萤火虫和CMV海肾萤光素酶表达载体转染293T细胞，并用TLR2、TLR4、TLR5、MD2和CD14表达载体共转染。24小时后，收获细胞并在NCL或HMGB1包被的平板中再培养。作为对照，用LPS(0.5μg/ml)培养这些细胞。使用
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Reporter测定系统测量萤光素酶活性。在每个实验中，通过将萤火虫萤光素酶活性针对海肾萤光素酶活性归一化来获得NF-κB激活。进行三次实验，并将数据以平均值±SD表示。通过单因素方差分析进行统计。****p<0.0001；***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。E)TLR2、TLR4和TLR5在PBMC对NCL刺激的应答中的作用。将PBMC在冰上与已知阻断TLR2、TLR4或TLR5对其各自配体的应答的小鼠单克隆抗体预孵育30min，然后在用NCL或HMGB1包被的板中培养24小时，或者作为对照，在LTA(10μg/ml)、鞭毛蛋白(1μg/ml)或LPS(10ng/ml)刺激的空白板中培养。基于TNFα产生测量PBMC的激活。一式三份地进行实验并进行学生t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图4A-图4F显示了NCL(A，D)以及HMGB1(B，E)和LPS(C，F)的IL-1β依赖性和非依赖性TNFα诱导。在中和抗IL-1β抗体或非免疫小鼠IgG存在下用NCL、HMGB1和LPS刺激单核细胞。24小时后，通过ELISA测定培养物中的TNFα(A-C)和IL-1β(D-F)。一式三份地进行实验，并给出平均值和标准偏差。通过学生t检验进行统计。*p<0.05，**p<0.01。***p<0.001，****p<0.0001。
图5A-图5B显示MyD88抑制剂st-2825和半胱天冬蛋白酶1抑制剂Ac-YVAD的滴定。将单核细胞与一系列指定浓度的抑制剂预孵育1小时，然后用LPS刺激24小时。通过ELISA测量TNFα(A)和IL-1β(B)产生，并使用比色MTS测定法测定细胞活力。数据表示为相对细胞活力，取对照为1.0。一式三份地进行实验并进行学生t检验。*p<0.05，**p<0.01。
图6显示NCL的选择性TLR2激活。用NF-κB启动子调节的萤火虫和CMV启动子指导的海肾萤光素酶表达载体转染293T细胞。如所示，用TLR4/MD2/CD14、TLR2/1/6/10、TLR5或TLR3/7/8/9载体选择性共转染细胞。24小时后，收获转染的细胞并在用NCL包被的板中再培养，或者作为对照，在用来自小鼠IgG1柱(Ms IgG)的洗脱物包被的板中再培养。刺激细胞24小时，并使用Dual-Luciferase Reporter测定系统(Promega)测定NF-κB介导的萤光素酶活性。通过将每个实验中的萤火虫萤光素酶活性针对组成型海肾萤光素酶活性归一化来获得相对NF-κB激活。进行三次实验，并将数据以平均值±SD表示。通过单因素方差分析进行统计。****p<0.0001，**p<0.01。
图7A-图7F显示了NCL上TLR2反应性区域的鉴定。A)产生的具有不同结构域缺失的重组NCL。全长HMGB1和NCL各自与C末端HA标签(HMGB1-HA和NCL-HA)一起表达。NCL是710个氨基酸长度，并且参考酸性RRM1、RRM2、RRM3、RRM4和富含甘氨酸和精氨酸(GAR)或RGG的结构域的边界进行一系列C末端缺失以产生NCL突变体，其从N末端计数含有274、477、522、609、649、670和698个残基。GAR/RGG结构域含有两个串联重复(黑色框)和两个反向重复(灰色框)。还通过删除跨越残基653-698的这四个重复产生突变体。B)将纯化的NCL-HA和NCL突变体包被在板上(40μg/ml)以与分离的单核细胞一起培养。24小时后，通过ELISA测定TNFα和IL-β1产生。C)将纯化的NCL、NCL-HA、NCL(649)-HA和BSA(10μg/ml)包被在板上，然后与渐增浓度的His标记的TLR2(0.375-6.0μg/ml)孵育。使用小鼠抗His抗体(2.6μg/ml)检测结合的TLR2。D)将TLR2(2μg/ml)包被在板上，然后以渐增浓度(0-20μg/ml)与纯化的NCL、NCL-HA、NCL(649)-HA或BSA孵育。使用小鼠抗HA抗体(1μg/ml)检测结合的蛋白质。E)将TLR2(2μg/ml)包被在板上，随后与抗TLR2抗体或抗TLR4抗体(5μg/ml)孵育，然后与纯化的NCL、NCL-HA和BSA(10μg/ml)孵育。使用兔抗NCL抗体(1μg/ml)检测结合的蛋白质。F)在总结性实验中，将NCL、七种NCL-HA突变体和作为对照的BSA包被在板上(10μg/ml)。与TLR2(2μg/ml)孵育后，使用小鼠抗His抗体(2.6μg/ml)检测结合的TLR2。*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。
图8A-G显示对应于NCL中GAR/RGG结构域的合成肽(SEQ ID NO:46)被TLR2识别并通过TLR2激活单核细胞。A)基于NCL的GAR/RGG序列和N末端生物素合成了六种肽。作为对照，还合成了12个氨基酸残基的NCL C末端肽。B)将TLR2包被在板上(2μg/ml)并与NCL-P1、NCL-P2和NCL-P3孵育。NCL-P1和NCL-P2覆盖NCL的整个48个残基的GAR/RGG区域中的46个残基，并在中间的20个残基中重叠。NCL-P3对应于NCL C末端并且其缺乏TLR2结合。C)NCL-P1和NCL-P2激活TLR2介导的NF-κB激活。将293T细胞用TLR4/CD14/MD2、TLR2/TLR1/TLR6/TLR10、TLR5或TLR3/7/8/9的组合转染24小时，并用在诱导型NF-κB启动子下编码萤火虫萤光素酶的载体和在组成型活性CMV启动子下编码海肾萤光素酶的载体共转染。然后用肽(200μg/ml)刺激细胞24小时。归一化的萤火虫萤光素酶活性用于指示NF-κB激活。D)将单核细胞与三种不同浓度的NCL肽中的每一种一起培养24小时，并通过ELISA测量上清液中的TNFα产生。E)将肽在10、40和160μg/ml下包被在板上。使用板刺激单核细胞24小时。通过ELISA测定TNFα产生。n.d.，不可检测。包被的肽比可溶性肽的刺激性小。F)将TLR2包被在板上(2μg/ml)，并与不同浓度的总共5种NCL肽孵育。NCL-P2作为阳性对照。NCL-P4、NCL-P5和NCL-P6是覆盖NCL-P2内较短区域的肽。NCL-P7对应于NCL-P2的最后7个残基。BSA用作阴性对照。G)用7种不同的NCL肽刺激单核细胞24小时。将肽以50或200μg/ml添加至单核细胞培养物中，并通过ELISA测定TNFα产生。
图9显示包被的NCL-HA在单核细胞刺激中比可溶性NCL-HA更有效。将单核细胞(1×105/孔)在板中培养24小时。将NCL-HA(40μg/ml)预包被在板上或以其可溶形式添加到具有单核细胞的培养物中。此外，还在包被有1/5倍NCL(0.2×NCL-HA)的板中培养单核细胞。缓冲液对照，用缓冲液包被的孔。单独的细胞，未包被的孔。通过ELISA测定培养上清液中的TNFα和IL-1β。一式三份地进行实验，并表示为平均值±SD。通过单因素方差分析进行统计。*p<0.05，**p<0.01。***p<0.001，****p<0.0001，n.s.，不显著。
图10显示了NCL肽对单核细胞的激活。使用如图8A中详述的总共七种NCL肽以两种不同浓度(50和200μg/ml)刺激单核细胞。24小时后，通过ELISA测定培养基中的IL-1β。
图11A-图11E显示了纤维蛋白(FBRL)和GAR1的警报素活性。A)FBRL的氨基酸序列，具有以粗体突出显示的GAR/RGG序列基序。合成的三种肽还用上覆线(FBRL-P1和FBRL-P2)和下划线(FBRL-P3)表示，并且重叠残基用灰色表示。FBRL含有两个GAR区域，但只研究了靠近N末端的长GAR区域。将其删除以产生FBRL(Δ8-64)-HA突变体。B)显示了用来自两个不同献血者的PBMC获得的数据。将FBRL-HA和FBRL(Δ8-64)-HA分别包被在板(10μg/ml)上以刺激PBMC 24小时，然后用ELISA测量培养基中的TNFα。C)添加FBRL肽至50或160mg/ml后，将PBMC培养24小时。通过ELISA测量培养基中的TNFα。D)GAR1的氨基酸序列，具有以粗体突出显示的GAR基序。产生具有C末端HA标签的重组GAR1(GAR1-HA)。E)将重组GAR1-HA纯化并包被在板上以刺激PBMC。通过ELISA测定TNFα产生。对照，在没有包被的蛋白质或添加的肽的情况下培养的细胞。进行三次实验以获得平均值±SD形式的数据。通过单因素方差分析来分析数据。*p<0.05，p<0.0001，n.s.，不显著。
图12A-图12B显示了NCL的释放，并比较了分离自核提取物(TxNE)的NCL和在单核细胞激活中由UV诱导的细胞释放的NCL。A)如前所述，将HeLa细胞在150mm培养皿中培养，并在无血清培养基中UV照射(Cai等人,2017，通过引用并入本文)。UV照射后，将细胞在相同条件下培养0-24小时，并且立即(0小时)或在1、3、6、8、12或24小时后收获培养基。通过0.22μm过滤器后，通过SDS-PAGE(12.5％(w/v))和蛋白质印迹分析培养基以监测核蛋白的释放。NPM1，核磷蛋白-1。FBL，纤维蛋白(FBRL)。B)从UV照射的细胞的24小时培养基亲和纯化NCL(NCL UV sup)，并将其与从TxNE亲和纯化的NCL(NCL TxNE)比较。将蛋白质包被在板上以刺激单核细胞。作为对照，用无蛋白质洗脱级分10(E10)包被孔。还在有或没有LPS刺激的情况下，在未包被的(单独的细胞)孔中培养细胞。24小时后，通过ELISA测定TNFα和IL-1β产生。一式三份地进行实验，并表示为平均值±SD。通过单因素方差分析进行统计。**p<0.01，****p<0.0001，ns：不显著。
图13显示36-AA GAR/RGG肽(P2)与PBMC、单核细胞、B细胞和T细胞的孵育均导致4℃或37℃下的高细胞内肽池。将PBMC与生物素-P2肽在37℃下孵育1小时。最初，也在4℃下进行孵育作为对照。然后将细胞与抗CD14(单核细胞，BV711)、抗CD3(T细胞，PerCP-Cy5-5)、抗CD19(B细胞，Pacific blue)和Zombie NIR细胞活力试剂(APC-Cy7，Biolegend)一起孵育。然后将细胞与链霉亲和素Alex Fluor 488(链霉亲和素-AF488)孵育以检测表面结合的P2肽。还用Fix/Perm试剂(ThermoFisher，马萨诸塞州沃尔瑟姆)固定/透性化处理细胞，然后与链霉亲和素-AF488孵育以检测细胞内P2肽，其最初仅预期在37℃孵育。洗涤后，通过流式细胞术分析细胞。注意，尽管表面结合仅在PBMC和单核细胞上是显著的，但所有细胞均展现出类似高水平的细胞内P2肽，而与孵育温度无关。虚线直方图，在未进行膜透性化处理的情况下检测的信号(表面肽)。实线直方图，在进行膜透性化处理的情况下检测的信号(细胞内肽)。
图14显示P1和P2与PBMC在4℃下孵育后积累细胞内池，而其他较短的GAR/RGG肽(P4-P7；8-20AA)、P2的R至K突变体(P2R/K)或12个AA的非GAR/RGG肽(P3)则没有积累细胞内池。简言之，将PBMC与每种生物素标记的肽(P1-P7)或生物素-P2(R/K)突变体分别在4℃下孵育1小时。然后用Fix/Perm试剂固定/透性化处理细胞，并将其与链霉亲和素-AF488孵育。洗涤后，通过流式细胞术分析细胞。左图，细胞与7种肽中的每一种孵育后获得的直方图。右图，只显示用NCL-P1和NCL-P2肽产生的直方图。
图15显示了通过天然病毒感染诱导的免疫和通过P2融合的疫苗抗原诱导的免疫的示意图。这种融合物可以通过重组DNA方法或化学接头如EMCS(N-ε-马来酰亚胺基己酰-氧基琥珀酰亚胺酯)产生。这里“P2”或“*”表示权利要求1-13中包括的所有生物活性GAR/RGG肽。“病毒”图像代表疫苗抗原所来源的所有病原体和癌细胞。与“P2”或“*”附接的半圆图像可以是货物药物、标记以及疫苗抗原。所述附接可以是直接融合或间接混合。大的“细胞”图像可以是抗原呈递细胞或任何其他细胞类型，这取决于与“P2”肽融合的货物。TCR，T细胞抗原受体。BCR，B细胞抗原受体。TLR，Toll样受体。FcR，Fc受体。MHC，主要组织相容性复合体。CTL，细胞毒性T淋巴细胞。黑色虚线，细胞因子。
图16A-图16C显示了NCL-P2肽的八种序列变体及其佐剂活性的增加或丧失。A)NCL-P2序列变体的序列。包括NCL-P6和FBRL肽作为参考实验。在NCL-P2R/K(SEQ ID NO:20)中，所有R残基被改变为K残基。在NCL-P2F/R(SEQ ID NO:21)中，所有F残基被改变为R残基。在NCL-P2R/F(SEQ ID NO:22)中，所有R残基被改变为F残基。在NCL-P2F/Y(SEQ ID NO:23)中，所有F残基被改变为Y残基。在NCL-P2F/W(SEQ ID NO:24)中，所有F残基被改变为W残基。在NCL-P2+G(SEQ ID NO:12)中，添加另外的G残基以将“RG”序列改变为“RGG”序列。在NCL-P2+3G中，再添加两个G残基以将“FRGG”序列改变为“FGGRGG”序列。在NCL-P2+2G中，NCL-P2序列被精简为事实上具有四个重复的FGGRGGRGG序列。尽管设计了NCL-P2R/F(SEQ ID NO:22)，但尚未合成。B和C)比较NCL-P2、其变体肽和三种FBRL肽以刺激PBMC 24小时，并在培养基中测量TNFα。B和C)使用NCL-P2变体肽刺激PBMC 24小时，并在培养基中测量TNFα。
图17A-图17H显示了NCL-P2及其七种变体肽的细胞穿透肽(CPP)活性。将PBMC(100μl；3×105/ml)与每种肽(200μg/ml)在4℃下孵育1小时。将细胞在2％ FBS/PBS中洗涤两次，并与链霉亲和素-AF488(50μg/ml)和Zombie(NIR)固定活力染料-APC-Cy7在4℃下孵育30min。洗涤后，通过流式细胞术分析细胞以检测表面结合的肽(Sur-)。为了检测胞内肽，在4℃下与肽孵育后，将细胞与Zombie NIR细胞活力试剂孵育。洗涤细胞并用BD CYTOFIX/CYTOPERMTM试剂盒在4℃下透性化处理20min。洗涤后，将细胞与链霉亲和素-AF488孵育，并通过流式细胞术分析以检测细胞内肽(Int-)。在没有预先与肽孵育的情况下，将细胞与链霉亲和素-AF488孵育作为对照(阴影直方图)。(A)NCL-P2、(B)NCL-P2R/K、(C)NCL-P2F/R、(D)NCL-P2F/Y、(E)NCL-P2F/W、(F)NCL-P2+G、(G)NCL-P2+2G、和(H)NCL-P2+3G。与肽和链霉亲和素-AF488孵育的细胞显示为未填充直方图。垂直线，表面结合和细胞内NCL-P2的直方图位置。
图18A-图18B显示P2+G(P2M6)及其链霉亲和素缀合物穿透树突状细胞(DC)的动力学的显微照片。(A)将盖玻片上的DC与P2+G(200μg/ml)在冰上孵育长达1小时(1、5、15、30和60min)。将细胞在4％(w/v)多聚甲醛中固定20min，在0.1％(v/v)皂苷中透性化处理30min，并与链霉亲和素-AF488孵育1小时，并且在洗涤后，用含有DAPI的介质封固，并通过共聚焦显微术检查。(B)首先将P2+G(200μg/ml)与链霉亲和素-AF488(50μg/ml)在冰上孵育30min以产生缀合物，然后在没有预先固定或透性化处理的情况下将其与DC在盖玻片上孵育1小时。洗涤后，将细胞固定并用含有DAPI的介质封固。采集切片图像(0.36μm)。比例尺，20μm。
图19A-图19B显示P2+G(P2M6)及其链霉亲和素缀合物的浓度依赖性树突状细胞(DC)穿透的显微照片。(A)将盖玻片上的DC与10、25、50、100和200μg/ml的P2M6在冰上孵育1小时。将细胞在4％(w/v)多聚甲醛中固定20min，并在0.1％(v/v)皂苷中透性化处理30min，以与链霉亲和素-AF488(50μg/ml)一起孵育。洗涤后，将细胞用含有DAPI的介质封固并通过共聚焦显微术检查。(B)将不同浓度的P2+G(10、25、50、100和200μg/ml)与链霉亲和素-AF488在冰上孵育30min，然后将缀合物与DC孵育。洗涤后，将细胞固定并且在不进行透性化处理的情况下用含有DAPI的介质封固，并通过共聚焦显微术进行分析。采集切片图像(0.36μm)。比例尺，20μm。
图20A-图20B显示了P2+G、其P2+G(F/I)、P2+G(F/L)、P2+G(G/A)和P2+G(G/P)突变体的序列，以及它们的警报素活性。(A)用P2+G作为模板，通过将4个苯丙氨酸残基变为异亮氨酸(P2+G(F/I))或亮氨酸(P2+G(F/L))残基，或通过将其25个甘氨酸残基中的6个变为丙氨酸(P2+G(G/A))或脯氨酸(P2+G(G/P))残基，合成了另外4个突变体肽。(B)使用这四种新肽刺激PBMC 24小时，并通过ELISA测量TNFα产生。P2+G和P2R/K分别用作阳性和阴性对照。
图21A-图21B显示了其他已知的非GAR/RGG型细胞穿透肽(CPP)的警报素活性(表1)。A)在用P2+G作为阳性对照，P2F/R作为中间对照，P2R/K作为阴性对照的情况下，用七种缺乏GAR/RGG序列的已知CPP刺激PBMC。24小时后，测量培养基中的TNFα产生。B)在用P2+G作为阳性对照的情况下，用CPP4、其串联二聚体(2×CPP4)和10种突变体刺激PBMC。24小时后，通过ELISA测量TNFα产生。一式三份地进行实验。使用单因素方差分析来分析数据并将其表示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图22A-图22C显示肽P2+G和其P2+G(F/I)、P2+G(F/L)、P2+G(G/A)和P2+G(G/P)突变体的细胞穿透肽(CPP)活性的流式细胞术数据。(A)将PBMC与四种P2+G突变体肽中的每一种在4℃下孵育1小时。突变涉及P2+G中的苯丙氨酸或甘氨酸残基。将P2+G中4个苯丙氨酸残基变为异亮氨酸(P2+G(F/I))或亮氨酸(P2+G(F/L))。将P2+G中25个甘氨酸残基中的六个变为丙氨酸(P2+G(G/A))或脯氨酸(P2+G(G/P))残基。将这些肽(200μg/ml)与PBMC在4℃下孵育1小时。用链霉亲和素-AF488检测表面结合肽和细胞内肽。作为对照，将PBMC与P2+G、P2F/R或P2R/K一起孵育。通过流式细胞术分析细胞。垂直条用于指示用P2+G获得的表面(深色垂直线)和细胞内(浅色垂直线)荧光强度，将其用作其他肽的参考。(B)基于A中的流式细胞术结果，计算并比较平均荧光指数(MFI)。(C)也将PBMC与肽在37℃下孵育1小时，并通过流式细胞术类似地检测。仅显示这些实验的MFI数据。
图23显示P2+G诱导的树突状细胞(DC)成熟。从展现出CD14lo/-和CD1ahi的典型表面表型的单核细胞培养DC。将DC在LPS(0.5μg/ml)、P2+G(200μg/ml)或作为对照的PBS的存在下培养48小时。收获细胞并对CD40、CD80、CD83、CD86和MHC II类(MHC II)进行表面染色。通过流式细胞术分析细胞(未填充直方图)。作为这些抗体的对照，用相应的同种型匹配的小鼠IgG染色细胞(填充直方图)。垂直条表示在未刺激的DC(对照)上表达的MHC II和共刺激分子的峰值荧光指数。
图24显示用P2+G融合的肽抗原负载树突状细胞(DC)使DC能够激活自体CD4和CD8T细胞。从单核细胞培养DC，然后在没有进行另外的佐剂刺激的情况下将其与30个AA的肽抗原IPA1E2(SEQ ID NO:57)、P2+G肽或IPA1E2-P2+G融合肽(SEQ ID NO:58)孵育24小时。然后将这些抗原负载的DC与来自相同献血者的用CellTrace Violet标记的淋巴细胞共培养。DC:T细胞比率为1:5。2周后，将共培养的细胞用抗CD14(单核细胞，BV711)、抗CD3(T细胞，PerCP-Cy5-5)和抗CD19(B细胞，Pacific blue)抗体染色，并用Zombie NIR细胞活力试剂(APC-Cy7，BioLegend)染色。通过流式细胞术分别分析CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD19+B细胞，以测量由于增殖引起的细胞水平的CellTrace Violet减少。显示增殖细胞的百分比。数据来自三个独立的献血者并通过学生t检验分析，*p<0.05，**p<0.01。
图25A-图25B显示了检查NCL-P2、P2突变体肽和七种已知的非GAR/RGG细胞穿透肽(CPP)的细胞溶解活性的实验。A)首先用7.5ml 150mM NaCl，然后用PBS(pH7.4)以500×g离心5min来洗涤血沉棕黄层(2.5ml)。将细胞沉淀重悬于7.5ml PBS中。在96孔V型底板中，以10μl/孔一式三份地添加肽(2mg/ml)。作为对照，向孔中添加10μl PBS或20％(v/v)TritonX-100。将细胞在PBS中稀释50倍，然后以190μl/孔添加至各孔中。在37℃下孵育1小时后，将板以500×g离心5min。将上清液以100μl/孔转移至96孔平底板中并在OD405处测量。将每个孔中的溶血针对Triton X-100对照孔的平均读数(取100)进行归一化。B)首先将P2+G在PBS中从4mg/ml稀释至2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/ml。一式三份地将稀释的P2+G以10μl/孔添加至96孔V型底板中。作为对照，向孔中添加10μlPBS或20％(v/v)Triton X-100。将稀释的细胞以190μl/孔添加至每个孔中。在37℃下孵育1小时并离心后，在OD405处测量上清液，针对含有Triton的孔的平均吸光度进行归一化，并表示为溶血百分比。一式三份地进行实验。使用单因素方差分析来分析数据并将其表示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图26显示基于本文实施例的P2+G及其相关肽在疫苗开发中的一种预期应用的示意图。这里使用P2+G作为例子。P2+G可以激活TLR2以及可能激活TLR4[Wu,S.等人,CellDeath Dis 12:477(2021)]。
具体实施方式
为了方便起见，在本说明书中提到的书目参考文献在实施例的末尾列出。将此类书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。
本发明部分基于具有警报素和/或细胞穿透活性的肽及其变体的开发。细胞穿透活性不仅改善融合抗原向免疫系统的呈递，而且提供将其他分子(货物分子)如新生蛋白链、核酸或小分子转运到细胞中的机会。如本文所述，本发明的肽具有佐剂活性并且作为疫苗的组分呈现优势。
定义
为方便起见，在此收集了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式的“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述”包括复数指示物，除非上下文清楚地另外规定。
如本文所用，范围可以表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解所述特定值形成另一个实施方案。应当进一步理解，每个范围的端点相对于其他端点都是重要的，并且独立于其他端点。还应理解，本文中公开了多个值，并且除了所述值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开值“10”，则也公开“约10”。还应理解，在公开一值时，也公开“小于或等于”所述值、“大于或等于所述值”以及值之间的可能范围，如技术人员适当地理解。例如，如果公开值“10”，则也公开“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，还公开两个特定单位之间的每个单位。例如，如果公开10和15，则也公开11、12、13和14。
如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或这些中任一项的片段，以及天然存在的或合成的分子。在“氨基酸序列”在本文中叙述为是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列的情况下，“氨基酸序列”和类似术语并不意为将氨基酸序列限制为与所叙述的蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”是指一个或多个氨基酸链，其中每个链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或肽可以包含通过肽键非共价和/或共价连接在一起的多个链(所述多个链具有天然蛋白质(即由天然存在的并且特别是非重组的细胞或者由基因工程化细胞或重组细胞产生的蛋白质)的序列)，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或者具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、增加和/或取代的分子。本文所用的术语“变体”或“突变体”是指改变一个或多个氨基酸，但保留警报素和/或细胞穿透活性的氨基酸序列。变体可具有氨基酸缺失或插入、或两者。可以使用本领域熟知的计算机程序，例如
Figure BDA0004110311450000121
软件(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不破坏生物学或免疫学活性的指南。例如，与NCL-P2肽相比，向NCL-P2肽中添加“G”氨基酸残基(NCL-P2+G)使佐剂活性增加三倍。添加另外两个“G”残基没有进一步改善NCL-P2+G肽，尽管变体保留佐剂活性。“多肽”、“肽”或“蛋白质”可以包含一条(称为“单体”)或多条(称为“多聚体”)氨基酸链。
如本文所用，术语“融合多肽”应理解为与实体如肽抗原或货物分子缀合或连接的本发明肽。这种融合可以通过重组DNA方法、肽合成或化学缀合产生。在肽和抗原或货物分子之间的间隔提高融合多肽的效力的一些情况下，可以使用肽接头。此外，“融合”是指本发明肽与感兴趣的抗原肽框内连接，使得肽和抗原或货物分子连接形成融合体，其中融合不破坏肽(例如，其作为佐剂和/或穿透细胞的能力)或连接的抗原或货物分子的形成或功能。在某些实施方案中，多肽/抗原或货物分子与本发明肽的羧基末端融合。例如，根据本发明任何方面的融合多肽可以包含与肽抗原IPA1E2融合的NCL-P2+G肽，如实施例14所示。
在本发明的上下文中，术语“佐剂”可与术语“警报素”互换使用，并且是指免疫佐剂。因此，佐剂是能够增强或促进免疫系统对所关注的连接抗原的应答，从而在受试者中诱导免疫应答或一系列免疫应答的肽化合物。例如，暴露于与抗原IPA1E2融合的NCL-P2+G肽的DC引起显著增加的T细胞增殖，如实施例14所示。
如本文所用，术语“货物分子”旨在包括诸如新生蛋白链、核酸或小分子的分子，其可与肽佐剂融合并通过本发明的所述肽佐剂的细胞穿透活性而转运到细胞中。
如本文所用，术语“载体”或“载体功能”是指例如本发明的肽，其通常与货物分子融合并能够将它们携带至和/或进入细胞。优选地，这种载体肽具有细胞穿透活性。例子包括但不限于NCL-P2F/Y、NCL-P2F/W和NCL-P2F/R。
术语“活性片段”是指保留全长肽佐剂的一些或全部活性或功能(例如，生物活性或功能，如警报素/佐剂活性)的蛋白质的一部分，例如，刺激免疫系统和/或穿透细胞的能力。活性片段可以是任何大小，条件是该片段保留例如刺激免疫系统的能力。
术语“变体”和“突变体”在本发明的上下文中可互换使用，是指可以通过改变氨基酸序列来修饰以包含一个或多个天然存在的和/或非天然存在的氨基酸的肽，条件是肽类似物能够充当佐剂和/或细胞穿透肽。例如，这些术语包括含有一个或多个保守氨基酸改变的富含GAR/RGG的肽。有利地，变体/突变体包含一个或多个“G”残基的插入以完成三联体，如“RGRGG”至“RGGRGG”、或“RGGFRGG”至“RGGFGGRGG”。通过取代某些氨基酸使富含GAR/RGG的肽突变可提高或降低肽的佐剂和/或细胞穿透活性。术语“变体”/“突变体”还包括含有例如一个或多个D氨基酸的肽。这种变体具有例如蛋白酶抗性的特征。变体还包括肽模拟物，例如其中一个或多个肽键被修饰。
如本文所用，术语“核酸”是指包含多个核苷酸单体(例如，核糖核苷酸单体或脱氧核糖核苷酸单体)的聚合物。“核酸”包括例如基因组DNA、cDNA、RNA和DNA-RNA杂交分子。核酸分子可为天然存在的、重组的或合成的。
如本领域技术人员将了解，在某些实施方案中，核酸进一步包含质粒序列。所述质粒序列可以包含例如启动子序列、选择标记物序列或基因座靶向序列中的一个或多个序列。将核酸组合物引入细胞中的方法为本领域所熟知。
如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为详细说明如所提到的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。然而，在本公开内容的上下文中，术语“包含(comprising)”或“包括(including)”还包括“由......组成(consisting of)”。“包含(comprising)”一词的变体(如“comprise”和“comprises”)以及“包括(including)”(如“include”和“includes”)具有相应变化的含义。
实施例
本领域技术人员将理解，可以根据本文中给出的方法在不进行过度实验的情况下实施本发明。所述方法、技术和化学品正如在给出的参考文献中或在标准生物技术和分子生物学教科书中的方案中所述。本领域中已知并且未明确描述的标准分子生物学技术大体上遵循如Sambrook和Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringsHarbor Laboratory,New York(2001)中所述。
实施例1
材料和方法
抗体和试剂
抗NCL(ab22758)和HMGB1(ab67281)的兔多克隆抗体获自Abcam(英国剑桥)。小鼠单克隆抗NCL抗体购自Santa Cruz。脂多糖(LPS)和小鼠IgG1(M9269)购自Sigma-Aldrich。重组人TLR2-10XHis(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯)获自R&DSystems。抗HA琼脂糖树脂和链霉亲和素Alexa Fluor 488获自ThermoFisher Scientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。TLR4阻断小鼠抗体(Mabg-htlr4)、TLR5阻断人抗体(Maba-htlr5)、白细胞介素(IL)-1β阻断小鼠抗体、脂磷壁酸(LTA，tlr1-slta)、鞭毛蛋白(tlrl-stfla)和聚I:C(tlrl-picw)来自InvivoGen(加利福尼亚州圣地亚哥)。含有或不含N末端生物素Ahx的肽由ChemPeptideLtd(中国上海)合成。对于CD14(BV711)、CD3(PerCP-Cy5-5)、CD19(Pacific blue)、CD40(BV785)的小鼠抗体和Zombie NIR细胞活力试剂(APC-Cy7)获自Biolegend(加利福尼亚州圣地亚哥)。对于CD1a(PE，#145-040)、CD86(FITC，#307-040)和MHC II(FITC，#131-040)的抗体获自Ancell Co.(明尼苏达州贝波特)。对于CD14的抗体(PE，#MA1-80587)获自Invitrogen。对于CD80(PE，#557227)和CD83(PE，#556855)的抗体购自BD。
蛋白质纯化
核提取物(TxNE)如先前报道[Chen,J.等人,J Biol Chem 293:2358-2369(2018)]从HeLa细胞分离并用于亲和纯化核蛋白。简言之，首先将对NCL、HMGB1或非免疫小鼠IgG1具有特异性的抗体(60μg)与600μl蛋白G-琼脂糖珠(GE Health)结合过夜，并且将珠在洗涤后与0.2M庚二亚氨酸二甲酯(DMP)在含有三乙醇胺的PBS(pH 8-9)中孵育30min。将树脂在PBS-三乙醇胺缓冲液中洗涤三次并在含有乙醇胺(50mM)的PBS中封闭。首先使用0.1M甘氨酸(pH 2.5)洗脱树脂，然后在TBS(50mM Tris(pH 7.4)和150mM NaCl)中平衡。将树脂与TxNE孵育过夜，并且在用50ml洗涤缓冲液(0.25M蔗糖、10mM Tris、3.3mM CaCl2、0.1％(v/v)Tween 20)洗涤后，使用0.1M甘氨酸(pH 2.5)洗脱，从而收集10×0.3ml级分。基于OD280读数测定蛋白质浓度，并合并含蛋白质的级分(通常为级分1-3)。使用LAL内毒素测定法(Genscript新泽西州皮斯卡塔韦)测试内毒素污染。
为了纯化重组核蛋白，使用pcDNA3.1载体(Invitrogen,马萨诸塞州沃尔瑟姆)产生三种主表达载体，其分别编码全长NCL、FBRL和GAR1(图7A、图11)。表达NCL和FBRL缺失突变体的载体也如详述产生。所有这些重组核蛋白或突变体含有C末端HA标签。在使用磷酸钙方法转染到HEK293T细胞中之后[Cao,W.等人,Blood 107:2777-2785(2006)]，将HEK293T细胞在5％ CO2存在下在含有10％(v/v)热灭活血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素/链霉素的DMEM中培养。48小时后收获转染的细胞并均质化以将细胞核与细胞质分离，并从细胞核分离TxNE以与细胞质合并[Chen,J.等人,J Biol Chem293:2358-2369(2018)]。将该细胞裂解物在4℃下在具有0.3ml抗HA-琼脂糖(ThermoFisher Scientific)的柱中孵育过夜。在用50ml洗涤缓冲液(0.25M蔗糖，10mM Tris(pH 7.4)、250mM NaCl、3.3mM CaCl2和0.1％ Tween 20)洗涤后，使用3.5M MgCl2洗脱结合的蛋白质，收集10×0.3ml级分。使用SDS-PAGE检测洗脱的蛋白质，合并级分并在PBS中透析。然后基于OD280读数测定蛋白质浓度。
SDS-PAGE和蛋白质印迹
用二硫苏糖醇将蛋白质样品稀释至10mM并在100℃下煮沸10min，然后在12.5％(w/v)SDS-PAGE凝胶上分离。将凝胶用考马斯蓝染色以观察蛋白质。对于蛋白质印迹，将凝胶电印迹到PVDF膜上，所述PVDF膜首先用TBS-T(50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl和0.1％(v/v)Tween 20)中的5％(w/v)脱脂奶封闭1小时，然后在4℃下与特异性抗体孵育过夜。
洗涤后，将膜暴露于辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗1小时，并使用PierceSuperSignal West Pico化学发光底物(ThermoFisher Scientific)显色。
细胞分离和培养
血沉棕黄层级分是在新加坡卫生科学管理局获得机构伦理批准后从健康献血者获得的，并且使用Ficoll-Paque(GE Healthcare)分离PBMC。为了分离单核细胞，将PBMC在含有5％(v/v)BCS的RPMI培养基中重悬至1×107个细胞/ml，并在T75烧瓶(20ml/烧瓶)中孵育1小时。收获粘附的单核细胞。为了培养巨噬细胞和DC[Cao,W.等人,Blood 107:2777-2785,(2006)，通过引用并入本文]，将单核细胞重悬至1×106个细胞/ml并在6孔板(2ml/孔)中培养。通过添加M-CSF至20ng/ml培养巨噬细胞，并将DC与20ng/ml GM-CSF和40ng/mlIL-4一起培养。M-CSF、GM-CSF和IL-4获自R&D Systems(明尼苏达州明尼阿波利斯)。将细胞培养6天，每两天补充一半培养基。
细胞激活
将PBS中的纯化蛋白质(30μg/ml)在96孔板(50μl/孔)中一式三份地包被12小时，并将PBMC(3×106个细胞/ml)、单核细胞(1×106个细胞/ml)、巨噬细胞(0.5×106个细胞/ml)或DC(0.5×106个细胞/ml)重悬于含有青霉素和链霉素的巨噬细胞无血清培养基中，并在这些板中以100μl/孔培养24小时。当使用TLR配体刺激这些细胞时，将它们添加至培养基中：LPS(对于DC和巨噬细胞为500ng/ml，以及对于PMBC和单核细胞为10ng/ml，InvivoGen)、鞭毛蛋白(1μg/ml，InvivoGen)、脂磷壁酸(LTA，10μg/ml)。通过使用ELISA试剂盒(Invitrogen)测量培养基中的TNFα和IL-1β来测定细胞激活。
在一些实验中，在用TLR配体或纯化的核蛋白刺激之前，用MyD88抑制剂st-2825(MedChemExpress)或半胱天冬酶-1抑制剂Ac-YVAD(InvivoGen)预处理细胞1小时。在一些其他实验中，在刺激前将细胞与抗TLR2、TLR4和TLR5抗体(InvivoGen)预孵育1小时。最佳st-2825和Ac-YVAD浓度基于它们对细胞活力和LPS诱导的细胞因子产生的影响来确定。使用CELLTITER
Figure BDA0004110311450000151
AQueous One Solution Cell Proliferation(MTS)测定法(Promega)测定细胞活力。
在一些实验中，为了检测培养的DC上的表面蛋白，在第6天收获细胞并以1×105/ml重悬于巨噬细胞无血清培养基(Thermo Fisher Scientific，目录号12065074)中。将细胞与对CD14(PE)、CD1a(PE)具有特异性的荧光抗体或同种型匹配的IgG在冰上孵育1小时。洗涤细胞并通过流式细胞术分析。还将收获的DC以5×104/ml重悬于培养基中，并与LPS(0.5μg/ml)、P2M6(200μg/ml)或作为对照的PBS培养48小时。然后将细胞与对MHC II类、CD40、CD80、CD83、CD86具有特异性的荧光标记抗体和相应同种型对照一起孵育。通过流式细胞术分析细胞。
共聚焦显微术
收获DC并在玻璃盖玻片上培养过夜。首先将细胞与P2M6(200μg/ml)在4℃下孵育1、5、15、30或60min，然后在4％(w/v)多聚甲醛(PFA)中固定20min。将细胞在0.1％(w/v)皂苷中透性化处理30min，然后与链霉亲和素-AF488(50μg/ml)一起孵育1小时。然后将细胞封固以用于成像分析。可替代地，将P2M6与50μg/ml链霉亲和素-AF488在冰上预孵育1小时，并将肽-链霉亲和素复合物以1/10稀释度与DC在4℃下孵育1、5、15、30或60min，洗涤后，将细胞在不固定或透性化处理的情况下直接封固。
在另一个实验设置中，将DC(2×105/ml)与不同浓度(10、25、50、100或200μg/ml)的P2M6在4℃下孵育1小时。将细胞固定并透性化处理以与链霉亲和素-AF488(50μg/ml)一起孵育1小时。洗涤细胞并将其封固以用于成像分析。可替代地，将不同浓度的P2M6(100、250、500、1000或2000μg/ml)与链霉亲和素-AF488(500μg/ml)在冰上预孵育1小时。将预先形成的复合物以1/10稀释度与DC在4℃下孵育1小时。洗涤后，将细胞在不固定或透性化处理的情况下直接封固。
将所有细胞使用含有DAPI(Vector Laboratories)的VectaShield封固剂进行封固。使用装备有100×油物镜(孔径1.45)和Cool/SNAP HQ2图像采集照相机(Olympus)的FluoView FV3000共聚焦显微镜分析细胞。用FV-ASW 1.6b软件捕获图像并用Imaris软件(Bitplane AG)分析。
溶血测定
将血沉棕黄层用作红细胞(RBC)的来源。首先在10ml 150mM NaCl中洗涤血沉棕黄层(2ml)，然后通过以500g离心5min在PBS(pH 7.4)中洗涤两次。将细胞沉淀重悬于10mlPBS中作为RBC原液。将不同的肽在PBS(100μg/ml)中稀释，并且一式三份地将肽以10μl/孔添加至V型底96孔板中。作为对照，添加相同体积的PBS或20％(v/v)Triton X-100。将RBC在PBS中稀释50倍并以190μl/孔添加至板中。在37℃下孵育1小时后，将板以500g离心5min。将上清液(100μl/孔)转移至平底板并在OD405处测量吸光度。将数据针对用1％(v/v)TritonX-100获得的平均OD405读数进行归一化，并表示为溶血百分比。
TLR和NF-κB萤光素酶测定
使用Dual Luciferase Reporter测定法(Promega)测定TLR介导的NF-κB激活，其中使用两种萤光素酶报告质粒。一种质粒在诱导型NF-κB启动子的调控下表达萤火虫萤光素酶，并且另一种质粒在组成型活性CMV启动子下表达海肾萤光素酶[Zhang,H.等人.,FEBSLett 532:171-176(2002)]。除这些萤光素酶载体外，将细胞用编码人TLR的载体共转染，或在TLR4的情况下，用CD14和MD2共转染[根据Zhang,H.等人,J.FEBS Lett 532:171-176(2002)，通过引用并入本文]。使用TurboFect转染试剂(Thermo Fisher Scientific)进行转染。24小时后，收获细胞并在用纯化的蛋白质包被的96孔板中培养24小时，或作为对照在空白板中培养，但用TLR配体刺激。裂解细胞以测量萤火虫和海肾萤光素酶活性，并且在每个样品中，将萤火虫活性针对海肾萤光素酶活性进行归一化并表示为相对NF-κB激活。
TLR2结合测定
将96孔ELISA板在4℃下用纯化的核蛋白的PBS以100μl/孔(10μg/ml)一式两份地包被过夜。将板在含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS中洗涤三次，并用含有1％(w/v)牛血清白蛋白(PBS-BSA)的PBS封闭1小时。将TLR2-10xHis在PBS-BSA中连续稀释至0.375-6μg/ml(R&D Systems)，并与包被的板在4℃下孵育过夜。通过首先与小鼠抗His抗体(Sigma)孵育1小时，然后与HRP缀合的二抗(DAKO)孵育30min来检测结合的TLR2-10xHis。用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(Thermo Fisher Scientific)使板显色，并通过添加50μl 2NH2SO4终止。在450nm处测量吸光度。
与PBMC结合的肽
将重悬于100μl巨噬细胞无血清培养基(3×106/ml)中的PBMC与不同的肽(200μg/ml)一起孵育。将PBMC(100μl)与肽在37℃或4℃下孵育1小时。将细胞在2％ FBS/PBS中洗涤两次，并与链霉亲和素-AF488和Zombie(NIR)固定活力染料-APC-Cy7在4℃下孵育30min。然后将细胞用1％ PFA在室温下固定30min，并使用Fortessa分析仪(BD)进行分析。在一些实验中，在与肽孵育后，将PBMC与Zombie(NIR)固定活力染料(APC-Cy7)在4℃下孵育30min。然后将细胞用BD CYTOFIX/CYTOPERMTM试剂盒在4℃下固定并透性化处理20min，然后与链霉亲和素-AF488在4℃下孵育30min。在一些实验中，在与肽孵育后，将PBMC用对单核细胞(CD14/BV711)、T细胞(CD3/PerCP-Cy5-5)和B细胞(CD19/Pacific blue)具有特异性的荧光小鼠抗体染色。然后在有或没有膜透性化处理的情况下将细胞用Zombie(NIR)固定活力染料APC-Cy7和链霉亲和素-AF488染色。在这些实验中，分别对单核细胞、T细胞和B细胞进行门控以检测表面肽结合和细胞内肽渗透。
实施例2
核仁素是激活PBMC、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞的有效警报素
从脂质耗尽的核提取物TxNE亲和纯化核仁素以刺激外周血单个核细胞(PBMC)[Chen,J.等人,J Biol Chem 293:2358-2369(2018)，通过引用并入本文)](图1A)。将HMGB1纯化作为警报素对照(图1A)。为了制备阴性对照，还产生非免疫小鼠IgG1柱。将这些亲和树脂与TxNE一起孵育，并在洗涤后洗脱结合的蛋白质。从每个柱洗脱十个级分，并将来自多次洗脱的不含蛋白质的级分10合并以用作第二阴性对照。使用鲎变形细胞裂解物内毒素测定(GenScript，新泽西州皮斯卡塔韦)监测内毒素污染(例如图2)。
将NCL包被在板上以刺激PBMC，其一致地诱导TNFα和IL-1β产生(图1B、图1C)。这些细胞因子是从单核细胞类似地诱导的(图1D、图1E)。作为对照，来自非免疫IgG柱的洗脱物或合并的级分10都不诱导这些细胞因子，但HMGB1诱导了这些细胞因子(图1B-图1E)。NCL和HMGB1也均从树突状细胞(DC)和巨噬细胞诱导细胞因子产生(图1F、图1G)。总体而言，NCL比已知激活TLR2、TLR4和TLR5的HMGB1诱导更多的细胞因子[Sims等人,Annu Rev Immunol28:367-388(2010)；Li,J.等人,Mol Med 9:37-45(2003)]。然而，NCL与HMGB1的序列不同。
实施例3
核仁素激活TLR2
通过用HMGB1、NCL或作为对照的LPS刺激这些细胞长达24小时(在此期间在2.5、5.0、10、14、18和24小时测量TNFα和IL-1β产生)，就来自PBMC的TNFα和IL-1β诱导的动力学而言比较两种蛋白质NCL和HMGB1(图1H-图1J)。NCL和HMGB1按照类似的动力学诱导IL-1β，其迅速激增到稳定期(图1H、图1I)。TNFα也由这两种蛋白质类似地诱导，展现出线性早期增加但显著晚期激增(图1H、图I)。TNFα诱导的晚期激增最有可能是由于它们产生的IL-1β对PBMC的次级和自分泌刺激(图4)。LPS刺激的PBMC既不展现出早期IL-1β激增也不展现出晚期TNFα激增(图1J)。由NCL和HMGB1诱导的相似的细胞因子产生表明它们激活相似的受体，对于HMGB1，已知所述受体是TLR[Sims,G.P.等人,Annu Rev Immunol 28:367-388(2010)；Li,J.等人,Mol Med 9:37-45(2003)]。
然后我们检查了当MyD88被抑制时NCL是否仍然诱导细胞因子[Kawai,T.和Akira,S.,Semin Immunol 19:24-32(2007)]。本实验中使用MyD88抑制剂st-2825(图3A)。在滴定其细胞毒性和其对LPS诱导的细胞因子产生的抑制后，其最佳浓度确定为30μM(图5)。将半胱天冬酶I抑制剂Ac-YVAD类似地滴定至10μM并用于评估其他警报素感应途径的贡献(图5)。st-2825部分但显著抑制NCL从单核细胞诱导TNFα和IL-1β，并且如所预期的，它还抑制HMGB1和LPS对这些细胞因子的诱导(图3B)。Ac-YVAD有效地减少所有三种刺激物对IL-1β的诱导，并且还部分抑制TNFα诱导(图3B)。Ac-YVAD抑制TNFα产生可以通过其阻断由这些细胞产生的IL-1β导致的自分泌单核细胞激活来解释(图4)。
为了确定NCL可激活哪种TLR，采用了萤光素酶测定，其中将NF-κB指导的萤光素酶表达载体转染到人胚肾293T细胞中(图3A)[Zhang,H.等人,FEBS Lett 532:171-176(2002)，通过引用并入本文]。将TLR和(需要时)共受体以总共4种组合共转染，即TLR2/1/6/10、TLR4/CD14/MD2、TLR5或TLR3/7/8/9。使用两种萤光素酶表达载体：一种在5个重复的NF-κB基因启动子下表达萤火虫萤光素酶，以及另一种在组成型活性CMV启动子下表达海肾萤光素酶(图3A)。四种细胞内TLR(TLR3/7/8/9)的表达不赋予对NCL的可检测应答(图6)。TLR4/CD14/MD2组合的表达如所预期地引起强烈的自身激活[Zhang,H.等人,FEBS Lett532:171-176(2002)]，并且在这种高背景萤光素酶活性上，NCL引起显著但轻微的另外的NF-κB激活(图6)。在测定中没有一致地观察到NCL对TLR5的激活，但其强烈激活TLR2/TLR1/TLR6/TLR10组合(图6、图3C)。
使用该测定，在TLR2、TLR4和TLR5激活中比较了NCL和HMGB1，并且二者均引起TLR2/TLR1/TLR6/TLR10组合的显著激活(图3C)。HMGB1而非NCL还一致地激活TLR5(图3C)。两种蛋白质都在高TLR4自身激活之外引起轻微但显著的另外的TLR4激活(图3C)。然而，结果支持TLR2作为感应NCL和HMGB1的主要受体。我们接下来确定TLR1、TLR6或TLR10是否是TLR2对NCL或HMGB1的有效应答所必需的，以及TLR5是否将与TLR2在该功能中协同作用。当TLR2在没有TLR1/TLR6/TLR10共表达或与TLR5共表达的情况下表达时，其对NCL或HMGB1的应答没有显著影响(图3D)。
因此，TLR2显然是NCL以及HMGB1的感应受体。然后我们进一步分析了TLR2、TLR4和TLR5在它们的天然细胞环境中对NCL和HMGB1识别的贡献。将单核细胞与已知阻断这些TLR中每一种的抗体预孵育，然后用相应的微生物配体即脂磷壁酸(LTA)、LPS和鞭毛蛋白刺激(图3E)。所有三种抗体均显著抑制HMGB1诱导的单核细胞的TNFα产生，这表明HMGB1激活TLR2以及TLR5和TLR4，如报道的(图3E)[Sims,G.P.等人,Annu Rev Immunol 28:367-388(2010)；Das,N.等人,Cell Rep 17:1128-1140(2016)]。单核细胞对NCL的应答不受TLR5抗体的显著影响，仅受到TLR4抗体的轻微抑制(图3E)。然而，其被TLR2抗体强烈抑制(图3E)。这些结果在很大程度上与基于萤光素酶的结论一致(图3D)。表明HMGB1更易被TLR2、TLR4和TLR5识别，而NCL更易被TLR2选择性识别。NCL是710个氨基酸的蛋白质，并且有意鉴定激活TLR2的特定NCL区域。
实施例4
NCL上TLR2反应性区域的鉴定
NCL多肽(SEQ ID NO:1)含有7个结构域：特征在于酸性残基的277个残基的N末端结构域、随后是375个残基的四个串联RNA识别基序(RRM1-4)[Maris,C.,Dominguez,C.和Allain,F.H.,FEBS J 272:2118-2131(2005)]、48个残基的RGG型富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域(SEQ ID NO:4)[Thandapani,P.等人,Mol Cell 50:613-623(2013)]以及短的12个残基的C末端尾(图7A)。GAR序列通常也具有RNA结合特性[Maris,C.Dominguez,C.和Allain,F.H.,FEBS J 272:2118-2131(2005)；Thandapani,P.等人,Mol Cell50:613-623(2013)]。为了鉴定哪个结构域刺激TLR2和细胞因子产生，在293T细胞中表达具有C末端HA的NCL(NCL-HA；GAR/RGG结构域如SEQ ID NO:46所示)，并使用抗HA抗体柱进行亲和纯化。在来自单核细胞的TNFα和IL-1β诱导方面，重组NCL-HA与使用抗NCL抗体从TxNE亲和纯化的内源性NCL是不可区分的(数据未显示)。然后通过从C末端逐渐缺失产生六个NCL-HA突变体。只有NCL(698)-HA突变体(SEQ ID NO:47中所示的GAR/RGG结构域)(其中从C末端缺失12个氨基酸)继续刺激单核细胞(图7B)。如果除12个残基之外在GAR/RGG上游中另外缺失28个残基，则所得NCL(670)-HA突变体(SEQ ID NO:48中所示的GAR/RGG结构域)不再刺激单核细胞(图7A、图7B)。
NCL中48个残基的GAR/RGG区域的完整性显现出是TLR2对NCL应答所必需的(图7A)。实际上，该GAR/RGG区域内37个残基的内部缺失产生了另一种无活性的NCL(Δ652-698)-HA突变体(SEQ ID NO:49中所示的GAR/RGG结构域)(图7B)。因此，特异性TLR2配体应位于GAR/RGG区域。
接下来，我们研究了TLR2与NCL之间是否存在直接结合，更具体地，TLR2是否结合NCL的GAR/RGG区域。将纯化的NCL、NCL-HA和NCL(649)-HA突变体包被在板上，然后与His标记的TLR2一起孵育。BSA包被作为对照。使用抗6xHis抗体检测结合的TLR2，显示其以剂量依赖性和可饱和的方式结合NCL和NCL-HA，但不结合缺乏GAR/RGG区域的NCL(649)-HA突变体(图7C)。还将TLR2包被在板上，并与可溶性NCL-HA、NCL(649)-HA和NCL(522)-HA孵育，并使用抗HA抗体检测结合的NCL蛋白。虽然NCL-HA显示与TLR2的剂量依赖性和可饱和结合，但这在缺乏GAR/RGG区域的两个NCL突变体中没有观察到(图7D)。
由于NCL刺激单核细胞表面TLR2被TLR2特异性抗体阻断(图3E)，因此我们检测了该抗体是否也阻断NCL与TLR2的结合。在进一步与NCL或NCL-HA孵育之前，将TLR2包被并与兔抗TLR2抗体预孵育。作为对照，将包被的TLR2与兔抗TLR4抗体预孵育(图3E)。与抗TLR2抗体预孵育完全阻断NCL和NCL-HA与包被的TLR2的结合，但与抗TLR4抗体预孵育未显示抑制(图7E)。因此，TLR2通过GAR/RGG区域与NCL结合，这种结合激活其在单核细胞上的信号传导，导致细胞因子产生。
为了确定TLR2是否与NCL上的其他位点结合，将所有8种可用的NCL-HA突变体以及NCL-HA包被并与TLR2孵育(图7F)。如所预期的，TLR2与NCL-HA和NCL(698)-HA结合，而对于其他NCL突变体，TLR2仅显示与含有残余GAR/RGG区域的NCL(670)-HA的弱结合(图7A、图7F)。然而，这种与TLR2的弱相互作用显然不足以使NCL(670)-HA激活TLR2和细胞因子产生(图7B)。总之，结果显示TLR2与NCL上的GAR/RGG区域的特异性结合激活单核细胞产生细胞因子。
实施例5
GAR/RGG肽也可被TLR2识别并通过TLR2激活单核细胞
NCL C末端GAR/RGG区域(SEQ ID NO:46)内的48个残基的GAR/RGG结构域(即从G651至G698，SEQ ID NO:4)含有四个重复区域即两个头对尾重复(GGFGGRGGGRggfggrgggr；SEQID NO:17)和两个尾对尾重复(GGRGGFGGRgRGGFGGRGG；SEQ ID NO:18)以及一个非重复的C末端区域(FRGGRGGGG；SEQ ID NO:19)(图7A、图8A)。为了确定该GAR/RGG区域中的特定序列是否被TLR2优先识别，合成了两种重叠肽，其中肽NCL-P1(32个残基；SEQ ID NO:7)覆盖N末端三个重复以及肽NCL-P2(36个残基；SEQ ID NO:8)覆盖C末端三个重复(图8A)。还合成了覆盖GAR/RGG结构域之外的NCL的C末端12个残基的对照肽(SEQ ID NO:25)(图8A)。NCL-P1和NCL-P2被设计为在中间的两个重复上重叠。合成的所有肽均具有N末端生物素标签。
将TLR2包被在板上，并与浓度从0.64ng/ml增加至1,000ng/ml的肽一起孵育。NCL-P1和NCL-P2展现出相似的与TLR2的剂量依赖性和可饱和结合(图8B)。然而，NCL-P3(SEQ IDNO:25)未显示出与TLR2的可检测结合。还在NF-κB萤光素酶测定中测试了这三种肽。NCL-P1和NCL-P2引起类似的TLR2介导的NF-κB激活，但这在NCL-P3中未观察到(图8C)。这三种肽还用于通过以从10μg/ml增加至160μg/ml的浓度添加至培养物来刺激单核细胞。在所有浓度下，NCL-P3均未显示TNFα诱导(图8D)。在较低浓度(10和20μg/ml)下，NCL-P1和NCL-P2也诱导极少TNFα。然而，在较高浓度(80和160μg/ml)下，NCLP1和NCL-P2强烈诱导TNFα产生(图8D)。在40μg/ml下观察到NCL-P1与NCL-P2之间的差异，其中NCL-P2诱导的TNFα是NCL-P1的大约10倍(图8D)。当将两种肽包被在板上以刺激单核细胞时，NCL-P2也比NCL-P1诱导更多的细胞因子(图8E)。因此，NCL-P2比NCL-P1携带更强的警报素活性。
总之，可溶性NCL-P2和NCL-P1比固定化肽诱导更多的细胞因子(图8D、图8E)。相反，表面包被的NCL-HA比可溶性NCL-HA诱导更多的细胞因子(图9)。我们怀疑在板上包被大蛋白如NCL产生TLR2的多价GAR/RGG刺激，但包被短GAR/RGG肽可能阻碍TLR2接近这些序列。
为了进一步理解NCL上的这种新的TLR2配体区域，我们合成了一种肽(NCL-P6；SEQID NO:9)，其对应于NCL-P1与NCL-P2之间的重叠序列；和另外两种肽(NCL-P4；SEQ ID NO:26和NCL-P5；SEQ ID NO:50)，每种覆盖该共有序列的一半(图8A)。合成对应于该48个残基的GAR/RGG区域的非重复C末端的另一短肽(NCL-P7；SEQ ID NO:51)(图8A)。将包被的TLR2与渐增的浓度下的这四种肽孵育，并将NCL-P2用作阳性对照。NCL-P6在TLR2结合中大量复制NCL-P2，尽管仅在高得多的浓度(80μg/ml)下达到饱和(图8F)。对于NCL-P2，在3.2μg/ml下达到饱和结合(图8F)。NCL-4代表NCL-P6肽的N末端半部分，并且在测试的最高浓度(200μg/ml)下未显示TLR2结合。NCL-P5代表NCL-P6的C末端半部分，其在200μg/ml下展现出低水平的TLR2结合(图8A)。这表明，20个残基的NCL-P6肽位于NCL警报素活性的核心，但不是最佳的。还在从单核细胞诱导细胞因子方面比较了这7种肽。除了NCL-P1和NCL-P2之外，仅NCL-P6从单核细胞诱导TNFα(图8G)。当测定IL-1β产生时得到相同的结论(图10)。
实施例6
纤维蛋白(FBRL)和GAR1的警报素活性
GAR/RGG是在核蛋白中的异源序列和长度上发现的常见基序，所述核蛋白包括其他核仁蛋白，如自身抗原盒C/D小核仁RNP亚基纤维蛋白(FBRL)和盒H/ACA snoRNP亚基1(GAR1)[Welting,T.JJ.,Raijmakers,R.和Pruijn,G.J.,Autoimmunity Reviews 2:313-321(2003)；Thandapani,P.等人,Mol Cell 50:613-623(2013)]。基于我们关于NCL的数据，我们研究了一些其他含有GAR/RGG的自身抗原中的GAR/RGG基序是否具有警报素活性，并可能促成它们的内在自身免疫原性。这些信息有助于确定SLE和其他自身免疫性疾病中ANA诱导之下的分子机制。
FBRL是含有靠近N末端的长GAR/RGG区域(RGGGFGGRGGFGDRGGRGGRGGFGGGRGRGGGFRGRGRGG；FBRL-GAR/RGG SEQ ID NO:5)以及随后的较短的GAR/RG区域的自身抗原。产生重组FBRL以确定其是否含有警报素活性(图11A；SEQ ID NO:2)。重组FBRL强烈诱导PBMC产生TNFα(图11B)。然后我们从FBRL删除长GAR/RGG区域以产生FBRL(Δ8-64)-HA突变体，并且这减少了FBRL对TNFα的诱导，表明该GAR/RGG也是警报素基序。我们类似地合成了覆盖该GAR/RGG区域的肽，即FBRL-P1(SEQ ID NO:10)、FBRL-P2(SEQ ID NO:11)和FBRL-P3(SEQ ID NO:52)(图11C)。FBRL-P1和FBRL-P2激活PBMC而FBRL-P3不可以(图11C)。这并不令人惊讶，因为FBRL-1和FBRL-2都含有规律的RGG重复序列，但FBRL-P3主要是聚G序列(图11A)。基于这些数据，我们研究了含有靠近其C末端的长GAR/RGG序列(RGGGRGGRGGGRGGGGRGGGRGGGFRGGRGGGGGGFRGGRGGG，GAR1-GAR/RGG，SEQ ID NO:6)的GAR1(SEQ ID NO:3)是否具有警报素活性(图11D)。我们产生了重组GAR1-HA，它确实激活PBMC(图11E)。因此，我们预测，如Thandapani等人(2013)所概述，含有更多GAR/RGG的核蛋白展现出警报素活性。
我们的数据表明，NCL是含有自身免疫原性表位和佐剂信号的核蛋白的原型。我们已经证明这适用于FBRL，它是一种已知的自身抗原并含有GAR/RGG序列。还没有确定GAR1是否也是自身抗原。它们从PBMC诱导细胞因子的能力已经得到简单地证明(图11)。许多核蛋白含有GAR/RGG或类似的基序，并且如果这种警报素活性是这些基序中的一些所共有的，那么许多核蛋白是自身抗原并不令人惊讶。尚不清楚这些含有GAR/RGG的核蛋白中的全部或一些是否也携带对于自身反应性B细胞的表位。
实施例7
NCL-P1和NCL-P2将融合抗原递送到抗原呈递细胞的细胞质中以诱导细胞毒素T淋巴细胞(CTL)免疫
在传统的病毒疫苗开发中，减毒活疫苗是有利的，因为它们保留了将病毒抗原递送到抗原呈递细胞中的能力，这是有效CTL激活所需的。为了促进抗原进入细胞质，一些研究人员试图将重组疫苗抗原与合成的细胞穿透肽(CPP)融合。当我们研究NCL-P2佐剂肽如何与PBMC结合时，我们发现了NCL-P2穿透细胞膜的意想不到的特性。这使得它成为一种罕见的肽佐剂，其具有双重潜力以使得融合疫苗抗原能够激活APC上的TLR2并且还能够穿过APC的膜以将MHC I呈递至CD8 T细胞以诱导CTL免疫。NCL-P1也是CPP。
GAR/RGG肽NCL-P2具有强效CPP活性
最初，为了确定NCL-P2肽如何可以不同地结合到PBMC中的不同细胞谱系，其主要含有单核细胞、B细胞、T细胞和自然杀伤细胞，从健康人献血者分离这些细胞。将生物素标记的NCL-P2肽与PBMC在37℃下孵育1小时，然后将PBMC与分别结合单核细胞(CD14)、B细胞(CD19)或T细胞(CD3)的荧光谱系特异性抗体孵育(图13)。通过与BioLegend的Zombie细胞活力试剂(APC-Cy7)孵育鉴定死亡细胞。用链霉亲和素-AF488检测结合的NCL-P2，将细胞洗涤并通过流式细胞术分析。显然，三种细胞类型在37℃下展现出不同水平的NCL-P2的表面结合，其中NCL-P2结合至大多数单核细胞和较小部分的B和T细胞的表面(图13)。然而，当将细胞透性化处理时，在所有PBMC中检测到高得多的肽水平，表明显著的肽细胞内池。一种解释是结合的NCL-P2肽在37℃下被所有三种细胞类型快速胞吞。人们普遍认为，单核细胞比B细胞以及尤其是T细胞具有更多的胞吞作用，但是在所有三种细胞类型中检测到相似水平的细胞内NCL-P2肽，提出了肽不依赖受体、非特异性进入这些细胞的问题。
还在4℃下进行了实验，在该温度下预期不影响表面结合，但预期阻止胞吞作用(图13)。对于单核细胞，表面结合的NCL-P2肽在4℃下显著增加，这与当胞吞作用受阻时肽的表面积累一致。在较小程度上，NCL-P2也在表面T细胞上积累，但在B细胞上没有发现积累(图13)。然而，所有三种细胞类型即单核细胞、B细胞和T细胞继续展现出不能通过胞吞作用解释的类似高的肽细胞内池(图13)。这与最初关于分别在触角转录因子穿透蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK，SEQ ID NO:15)和HIV蛋白TAT(YGRKKRRQRRR，SEQ ID NO:16)中的肽所记录的细胞穿透肽(CPP)的行为是一致的[Derossi,D.等人,JBiol Chem 269:10444-10450(1994)；Vives,E.等人,J Biol Chem 272:16010-16017(1997)]。细胞膜的CPP穿透是受体非依赖性的，并且可以在4℃下发生[Derossi,D.等人,J Biol Chem269:10444-10450(1994)；Derossi,D.等人,J Biol Chem 271:18188-18193(1996)]。
一些已知的阳离子CPP的特征在于精氨酸(R)和赖氨酸(K)残基的丰度[Brock,R.,Bioconjug Chem 25:863-868(2014)；Takeuchi,T.和Futaki,S.,Chem Pharm Bull(Tokyo)64:1431-1437(2016)]。NCL-P2肽确实含有丰富的精氨酸(R)残基。为了评估在这些精氨酸残基变为赖氨酸残基后，肽是否仍保留CPP活性，我们将NCL-P2中的所有8个精氨酸突变为赖氨酸残基以产生NCL-P2(R/K)突变体(图16；SEQ ID NO:20)。令人惊讶地，该突变体肽在37℃或4℃下不再像NCL-P2一样穿透PBMC(图17B、图22)，表明NCL-P2在细胞表面结合和细胞穿透方面对其精氨酸残基的关键依赖性。
然后我们询问NCL-P1肽是否也穿透细胞膜。类似地将NCL-P1肽与PBMC孵育，并将细胞透性化处理以通过以下方法检测肽的细胞内池：在固定和透性化处理后与链霉亲和素-AF488孵育(图14)。NCL-P1和NCL-P2肽在4℃下展现出相似的细胞穿透能力(图14，右图)，因此NCL-P1肽也是CPP。然后我们类似地检查肽P3、P4、P5、P6和P7。P3是与GAR/RGG基序无关的12个AA的短肽，它未显示细胞内池(图14，左图)。NCL-P4、NCL-P5、NCL-P6和NCL-P7肽是较短的GAR/RGG肽并且都缺乏细胞穿透。这4种较短的肽中最长的是NCL-P6，其对应于NCL-P1与NCL-P2肽之间的重叠序列。它保留了较小的佐剂活性(图8G、图10)，但没有显示出显著的CPP活性。
除了结合TLR2和激活APC之外，NCL-P2和NCL-P1肽的CPP特性提供了另一种罕见的佐剂活性，这在任何其他TLR配体中都没有发现。这些佐剂肽、特别是NCL-P2与重组疫苗抗原的简单融合可以潜在地将分离的疫苗抗原转化为“分子病毒”，其：1)携带B和T细胞表位以诱导保护性抗体和T细胞，2)含有TLR2配体，其激活APC和CD4 T细胞，这有助于B和T激活，和3)“感染”APC，因此疫苗抗原可以被递送到细胞质，以用于将MHC I呈递到CD8 T细胞并产生CTL(图15)。因此，NCL-P2肽的双重佐剂特性克服了将重组病毒或癌蛋白开发成诱导体液和细胞免疫的强大疫苗(如基于活病毒的疫苗或减毒活病毒疫苗)的主要技术障碍(图15)，诱导体液和细胞免疫这一特性在灭活病毒疫苗中丧失。
实施例8
NCL-P2可以通过其序列的改变获得或丧失佐剂和CPP活性
除了NCL-P2，其他GAR/RGG序列也展现出佐剂活性(图11)。NCL-P2的R/K突变体丧失了其佐剂活性(图16)。然后我们合成了一系列突变体NCL-P2肽以确定一些氨基酸是否可以被取代以影响其佐剂活性，并发现一些改变增加其佐剂活性。图16A中列出了八种NCL-P2突变体，但没有成功合成所有精氨酸变为苯丙氨酸残基的突变体(NCL-P2R/F，SEQ ID NO:22)。通过刺激PBMC测试7种成功合成的NCL-P2突变体的佐剂活性的获得或丧失。除了高百分比的甘氨酸残基(G)，规律间隔的R和F残基是NCL-P2序列中唯一的其他残基(图16A)。如图16B所示，NCL-P2中R残基替换为最密切相关的K残基(SEQ ID NO:20)完全消除其佐剂活性，并且将F残基改变为密切相关的Y(SEQ ID NO:23)或W(SEQ ID NO:24)残基也显著降低其佐剂活性。用R残基替换所有F残基(SEQ ID NO:21)显著降低其佐剂活性。这些数据表明，NCL-P2的特定R和F组成和位置是展现佐剂活性的基本要求。
然后我们通过添加一个“G”残基将NCL-P2中的不规律“RGRGG”序列变为在肽的其余部分中发现的规律“RGGRGG”序列。与野生型NCL-P2肽相比，该NCL-P2+G(SEQ ID NO:12)突变体肽展现出佐剂活性增加3倍(图16B)。然后我们进一步尝试使NCL-P2+G突变体中的“RGGFRGG”序列成为规律的“RGGFGGRGG”序列。该NCL-P2+3G突变体肽(SEQ ID NO:13)没有显示佐剂活性的进一步改善，相反略微降低了NCL-P2+G突变体肽的高佐剂活性(图16C)。同时，我们还推测NCL-P2+G的佐剂活性增加是由于通过引入另外的“G”残基产生的更规律的FGGRGGRGG序列，因此我们将NCL-P2的序列重新组织为基本上四个重复的“FGGRGGRGG”。与野生型NCL-P2肽相比，该NCL-P2+2G突变体肽(SEQ ID NO:14)展现出降低的而不是增加的佐剂活性，表明NCL-P2中的固有序列决定簇赋予了如NCL-P2+G中那样增强的佐剂活性。
7种NCL-P2还展现出CPP活性的获得或丧失(图17)。NCL-P2R/K突变体(SEQ ID NO:20)丧失CPP以及警报素活性。NCL-P2F/R突变体(SEQ ID NO:21)获得显著CPP活性，同时丧失显著警报素活性(图17C)。NCL-P2F/Y突变体(SEQ ID NO:23)获得显著CPP活性，但其警报素活性降低(图17D)。NCL-P2F/W突变体(SEQ ID NO:24)保留了CPP活性但丧失了警报素活性(图17E)。NCL-P2+G(SEQ ID NO:12)和NCL-P2+3G(SEQ ID NO:13)都显示稍高的CPP活性，但都获得显著更高的警报素活性(分别为图17F和图17H)。NCL-P2+2G(SEQ ID NO:14)突变体在CPP活性方面与NCL-P2相似，但它具有略微降低的警报素活性(图17G)。NCL-P2R/F突变体(SEQ ID NO:22)不能被成功地合成，因此它没有被检测(图16A)。
实施例9
9.1肽P2+G可穿透树突状细胞(DC)
DC是宿主将疫苗转化为有效免疫所必需的[Steinman和Hemmi,2006]。如果P2+G肽可穿透DC，则其潜在地将疫苗抗原递送到DC细胞质中，以将MHC I类呈递到CD8 T细胞[Blum,J.S.,Wearsch,P.A.,Cresswell,P.,Annu Rev Immunol 31:443-473,(2013)]。从分离自健康献血者的单核细胞培养DC[如实施例1和Cao,W.等人,Blood 107:2777-2785(2006)中所述，将其全文并入本文]。在盖玻片上，将DC在4℃下与P2+G(200μg/ml)孵育1至60min(1、5、15、30和60min)。固定和透性化处理后，将细胞与链霉亲和素-Alexa Fluor 488(AF488)(Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)一起孵育，并且在洗涤后，用含有DAPI的介质封固并通过共聚焦显微术检查。如图18A所示，P2+G在孵育的1min内穿透DC，并且P2+G的细胞内池从5至60min逐渐增加。肽穿透核仁比穿透细胞质更快。
9.2P2+G携带链霉亲和素穿过膜进入DC细胞质
同样首先将P2+G与链霉亲和素-AF488在冰上孵育30min，以形成链霉亲和素-P2+G缀合物。然后在没有先前固定或透性化处理的情况下将这些预先形成的缀合物与DC在盖玻片上孵育。将细胞洗涤，固定并在没有透性化处理的情况下直接封固以用于共聚焦显微术分析。与对于P2+G所观察到的一样，P2+G-链霉亲和素缀合物也快速穿透DC(图19B)。链霉亲和素是约56kDa的四聚体蛋白。然而，与P2+G不同，P2+G-链霉亲和素缀合物不再集中在核仁中。相反，它们主要位于细胞质中。
还观察到，P2+G-链霉亲和素缀合物比P2+G肽更快地穿透DC，在5min内达到饱和(图18B)。P2+G肽在30min后才在DC细胞质中达到饱和(图18A)。我们认为，每个链霉亲和素结合多个P2+G肽，这可以增强P2+G与细胞膜的结合和跨细胞膜的易位。然而，P2+G可以携带货物蛋白穿过细胞膜进入细胞质。
9.3P2+G仅在较高肽浓度下有效穿透DC
P2+G肽通常是阳离子型的，这类肽的代表包括不同长度的寡精氨酸肽[Mitchell,D.J.等人,J Pept Res 56:318-325(2000)]。在机理上，已经提出寡精氨酸肽首先像CaCl2一样集中在细胞膜上，然后通过诱导的膜重组跨膜易位[Mitchell,D.J.等人,J Pept Res56:318-325,(2000)；Allolio,C.等人,Proc Natl Acad Sci U S A 115:11923-11928(2018)]。为了检查P2+G浓度是否影响其细胞穿透，然后将DC与不同浓度的P2+G(10、25、50、100或200μg/ml)一起孵育。当将P2+G与DC孵育时，在10μg/ml下检测不到穿透(图19A)。在25μg/ml P2+G下观察到低水平的DC穿透(图19)。随着肽浓度从25μg/ml增加至200μg/ml，P2+G的细胞内池增加(图19A)。
9.4与链霉亲和素结合后P2+G在低得多的肽浓度下穿透DC
当将不同浓度的P2+G(10、25、50、100和200μg/ml)与链霉亲和素-AF488(50μg/ml)在冰上结合30min然后与DC孵育时，观察到在10μg/ml下的显著DC穿透(图19B)。在该浓度下，游离P2+G未显示可检测的DC穿透(图19A)。事实上，P2+G-链霉亲和素穿透DC在10μg/mlP2+G下明显达到饱和(图19B)。将P2+G从10μg/ml增加至100μg/ml不会进一步增加其在DC中的细胞内池(图19B)。很可能在甚至更低的P2+G浓度下实现饱和DC穿透。
令人惊讶的是，当将链霉亲和素(50μg/ml)与200μg/ml的P2+G一起孵育时，缀合物不再有效地穿透DC，对此我们目前没有解释(图19B，右图)。
实施例10
具有强警报素和CPP活性的另外两种P2+G突变体肽的产生
如实施例8所示，向NCL-P2中添加一个甘氨酸，产生了警报素活性增加3倍的P2+G肽。对P2+G进行进一步修饰，以确定是否可以实现警报素或CPP活性的进一步增加。基于P2+G，通过将其4个苯丙氨酸残基变为异亮氨酸(P2+G(F/I)；SEQ ID NO:53)或亮氨酸(P2+G(F/L)；SEQ ID NO:54)残基合成两种突变体肽，并且通过将其25个甘氨酸残基中的6个变为丙氨酸(P2+G(G/A)；SEQ ID NO:55)或脯氨酸(P2+G(G/P)；SEQ ID NO:56)残基合成另外两种P2+G突变体肽(图20A)。使用这四种新肽刺激PBMC 24小时，并通过ELISA测量TNFα产生。P2+G和P2R/K用作阳性和阴性对照。两种苯丙氨酸突变体肽都展现出与P2+G可比较的警报素活性(图20B)。事实上，P2+G(F/L)显现出展现比P2+G更强的警报素活性(图20B)。相比之下，两种基于甘氨酸的突变体完全丧失了它们的警报素活性(图20B)。
实施例11
其他已知CPP的警报素活性
除了本文公开的NCL来源的CPP，在以前的研究中已经鉴定了许多其他CPP。我们询问这些其他已知CPP是否也可能展现出警报素活性。合成了七种研究最多的CPP，即CPP1-CPP7(表1)。PBMC刺激24小时随后使用ELISA测量TNFα诱导，从而将这些CPP与P2+G、P2F/R和P2R/K进行比较(图21A)。CPP1(Tat)(SEQ ID NO:28)、CPP5(pVEC)(SEQ ID NO:32)、CPP6(TP10)(SEQ ID NO:33)或CPP7(M918)(SEQ ID NO:34)未诱导大量TNFα，但CPP2(穿透蛋白)(SEQ ID NO:29)、CPP3(寡精氨酸)(SEQ ID NO:30)和CPP4(FHV)(SEQ ID NO:31)，尤其是CPP3和CPP4诱导低水平的TNFα(图21A)。CPP3是由16个精氨酸残基组成的人工肽，并且CPP4是15个残基的肽，其中11个残基是精氨酸。
CPP3和CPP4二者均是36个残基的NCL-P2和37个残基的P2+G长度的一半。在我们公开的研究中，合成了NCL-P2内的较短肽，但所有较短肽显示降低的警报素活性[Wu,S.等人,Cell Death Dis 12:477(2021)]。这些较短肽(包括21个残基的NCL-P6)也显示降低的CPP活性(图14)。
研究了通过合成两个串联CPP4重复(2×CPP4)增加CPP4的长度是否会改变其警报素活性。与CPP4相比，在2×CPP4(SEQ ID NO:35)中观察到警报素活性的极少增加(图21B)。由于NCL-P2中的突变产生具有增加的警报素活性的突变体肽，因此我们通过缺失和点突变合成了10种CPP4突变体(分别为CPP4M1-CPP4M10；SEQ ID NO:36-45)(表1)。相对于低CPP4警报素活性，这些CPP4突变体中没有一个显示出警报素活性的显著增加或降低(图21B)。因此，NCL-P2由于其显著的双重警报素和CPP活性以及可通过引入突变而分别增加的两种活性的可塑性而保持独特。
表1.选定的CPP和CPP4突变体肽
肽 序列 其他名称 SEQ ID NO:
CPP1 GRKKRRQRRRPPQ Tat 28
CPP2 RQIKIWFQNRRMKWKK 穿透蛋白 29
CPP3 RRRRRRRRRRRRRRRR 寡精氨酸 30
CPP4 RRRRNRTRRNRRRVR FHV 31
CPP5 LLIILRRRIRKQAHAHSK pVEC 32
CPP6 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL TP10 33
CPP7 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV M918 34
2xCPP4 RRRRNRTRRNRRRVRRRRRNRTRRNRRRVR n.a. 35
CPP4M1 --RRNRTRRNRRRVR n.a. 36
CPP4M2 RRRR--TRRNRRRVR n.a. 37
CPP4M3 RRRRNR--RNRRRVR n.a. 38
CPP4M4 RRRRNRTRR--RRVR n.a. 39
CPP4M5 RRRRNRTRRNRRR-- n.a. 40
CPP4M6 RRRRNRLRRNRRRLR n.a. 41
CPP4M7 RRRRLRLRRLRRRLR n.a. 42
CPP4M8 RRRRNRNRRNRRRNR n.a. 43
CPP4M9 RRRRRRTRRRRRRVR n.a. 44
CPP4M10 RRRRNRRRRNRRRRR n.a. 45
2×CPP4由两个串联CPP4序列组成，其中一个加下划线。“-”，残基缺失。n.a.，不可用。
实施例12
P2+G的两种苯丙氨酸突变体保留了CPP活性，但P2+G的两种甘氨酸突变体完全丧失了CPP活性
在检测了4种新的P2+G突变体肽的警报素活性后(图20)，还测试了它们的CPP活性。
将PBMC与四种P2+G突变体肽中的每一种分别在4℃下孵育1小时。突变涉及P2+G中的苯丙氨酸或甘氨酸残基。将P2+G中4个苯丙氨酸残基变为异亮氨酸(P2+G(F/I))或亮氨酸(P2+G(F/L))。将P2+G中25个甘氨酸残基中的六个变为丙氨酸(P2+G(G/A))或脯氨酸(P2+G(G/P))残基。将这些肽(200mg/ml)与PBMC在4℃下孵育1小时。用链霉亲和素-AF488检测表面结合肽和细胞内肽。作为对照，将PBMC与P2+G、P2F/R或P2R/K一起孵育。通过流式细胞术分析细胞(图22A)。垂直条用于指示用P2+G获得的表面和细胞内荧光强度，将其用作其他肽的参考。基于图22A中的流式细胞术结果，计算并比较平均荧光指数(MFI)(图22B)。也将PBMC与所述肽在37℃下孵育1小时，并通过流式细胞术类似地检测并计算MFI(图22C)。仅显示这些实验的MFI数据。
P2+G的两种甘氨酸突变体即P2+G(G/A)和P2+G(G/P)丧失警报素活性(图20B)，也完全丧失CPP活性(图22A-图22C)。这表明NCL-P2及其P2+G突变体中甘氨酸残基的数量和排列对它们的警报素和CPP活性是必需的。相比之下，P2+G的两种苯丙氨酸突变体即P2+G(F/I)和P2+G(F/L)保留警报素活性(图20B)，获得更高的CPP活性(图22B和图22C)。因此，P2+G(F/I)和P2+G(F/L)与P2+G和P2+3G一起构成一组用于疫苗开发的肽佐剂。在4℃(图22A和图22B)和37℃(图22A和图22C)下检查这4种P2+G突变体肽对PBMC的穿透，并获得类似的结果。
实施例13
P2+G肽可激活DC成熟
如通过TNFα诱导所判断，NCL-P2先前显示激活DC[Wu,S.等人,Cell Death Dis12:477(2021)]。P2+G是否有效地将这些细胞激活为成熟的抗原呈递细胞(APC)以进行有效的T细胞激活尚未被研究。为此，用P2+G(200μg/ml)或作为阳性对照的LPS(0.5μg/ml)刺激DC 48小时。作为阴性对照，通过添加等体积的PBS在没有特异性刺激的情况下培养DC。DC是从单核细胞培养的，并且通常是CD14lo/-CD1ahi[Cao,W.等人,Blood 107:2777-2785(2006)]。检查细胞的MHC II类、CD40、CD80、CD83和CD86的表面表达。如图23所示，P2+G有效地激活DC成熟，因为它上调DC上的所有这些分子。这表明P2+G可能是足够有效的疫苗佐剂。
实施例14
当暴露于包含P2+G和30个AA的肽抗原IPA1E2的融合多肽时，树突状细胞激活自体人CD4和CD8 T细胞
为了评估P2+G肽是否赋予对其所融合的抗原显著的佐剂活性，由ChemPeptide(中国上海)合成与30个AA的肽抗原(IPA1E2；SEQ ID NO:57)(图24)融合的P2+G。P2+G和IPA1E2也被合成为单独的肽。
从健康献血者分离PBMC，从其中分离单核细胞以培养DC，将剩余的细胞(主要是淋巴细胞)作为自体淋巴细胞的来源冷冻保存。然后将DC与P2+G、IPA1E2或IPA1E2-P2+G融合多肽(SEQ ID NO:58)在圆底96孔板(5×104个细胞/孔)中在不添加另外的佐剂的情况下孵育24小时。将冷冻的淋巴细胞复活，并在37℃下用CellTrace Violet(2.5μM)标记10min，然后以2.5×105个细胞/孔(DC:T比率＝1:5)添加至DC孔中。共培养2周后，通过流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞和CD19+B细胞的增殖。如图24所示，与单独IPA1E2或P2+G肽诱导的T细胞增殖相比，负载有IPA1E2-P2+G融合抗原的DC引起显著增加的T细胞增殖显著增加。这表明P2+G部分可能不会诱导显著的T细胞自身激活(低抗原性)，但能使IPA1E2抗原激活T细胞。
实施例15
NCL-P2及其突变体肽显示极小细胞溶解活性
为了在疫苗或药物递送中使用NCL-P2及其突变体肽，一个潜在的问题是它们是否展现出对宿主细胞的细胞毒性。这些肽的CPP活性与它们是否引起细胞溶解有明显的关系。然后我们使用基于红细胞裂解的溶血测定法测试这些肽的细胞溶解活性[Evans,B.C.等人,J Vis Exp,e50166,(2013)]。很明显，所有NCL-P2相关肽(包括其11种突变体)引起高于PBS对照的不显著的溶血(图25A)。在7种其他已知的CPP中，CPP1-4引起极小溶血，但CPP5-7明显溶血，尤其是CPP5(图25A)。
对于P2+G，也在不同肽浓度(3.125-200μg/ml)下检查溶血。在所有浓度下观察到类似的低背景溶血，表明不存在肽特异性溶血(图25B)。这表明，虽然一些其他已知的CPP确实具有溶血性或细胞溶解性，但NCL-P2及其突变体肽可有效地穿透细胞膜而不导致细胞裂解。当使用Zombie(NIR)固定活力染色APC-Cy7测定法或CELLTITER
Figure BDA0004110311450000261
AQueous OneSolution Cell Proliferation(MTS)测定法检测这些肽的细胞毒性时，在NCL-P2及其突变体肽中没有检测到显著的细胞毒性(数据未显示)。当在广泛的生物医学和临床应用中研究这些肽时，这消除了主要的安全问题。
总结
我们开始了解使核仁具有高度自身免疫原性的原因[Beck,J.S.,Lancet 1:1203(1961)；Welting,T.J.,Raijmakers,R.和Pruijn,G.J.,Autoimmunity Rev 2:313,(2003)；Cai,Y.等人,JBiol Chem 290:22570(2015)；Cai,Y.等人J Immunol 199:3981(2017)]，并且发现主要核仁自身抗原核仁素(NCL)含有有效的警报素活性[Wu,S.等人,Cell DeathDis 12:477,(2021)]。在核仁素(NCL)中，我们将警报素活性定位于其48个氨基酸长的GAR/RGG基序。该基序内的36个氨基酸的肽即NCL-P2在PBMC和其他免疫细胞的激活中复制NCL。对于NCL和NCL-P2二者，主要受体是TLR2，并且也可能涉及TLR4[Wu,S.,Teo,B.H.D.,Wee,S.Y.K.,Chen,J.和Lu,J.,Cell Death Dis 12:477,(2021)]。NCL-P2的强警报素活性使其成为疫苗的潜在佐剂。
NCL-P2的强CPP活性的惊人发现使其成为一种独特的疫苗佐剂，其可潜在地将货物抗原携带到抗原呈递细胞(APC)中，同时激活这些细胞以用于T细胞激活。将抗原递送到APC内是疫苗抗原特异性CD8 T细胞有效激活成CTL的关键。NCL-P2的广泛诱变表明，在特定的NCL-P2突变体中其警报素和CPP活性可以独立地且显著地改善，即P2F/R显示警报素活性降低但CPP活性提高约8倍。P2+G、P2+3G、P2+G(F/I)和P2+G(F/L)获得了2-5倍更高的警报素活性，同时其CPP活性也稍微增加。
在一个实施例中，显示P2+G穿透DC并携带货物蛋白链霉亲和素进入DC细胞质(图18和图19)。在另一个实施例中，P2+G携带卵清蛋白进入DC细胞质(数据未显示)。靶向细胞内病原体或癌症的大多数疫苗在疫苗抗原可被递送至DC和其他抗原呈递细胞(APC)的细胞质以将MHC I介导的CD8 T细胞激活成细胞毒性T淋巴细胞(CTL)时是最有效的。还没有对其进行测试，但是P2+3G、P2+G(F/I)、P2+G(F/L)和可能的其他已知且未研究的NCL-P1和NCL-P2突变体也穿透DC和其他APC，并且在与不同的疫苗抗原缔合的情况下，它们携带这些货物抗原进入APC。
P2F/R的强CPP但降低的警报素活性意味着其在将药物货物或标记递送至细胞期间不会引起严重的炎症应答。
在疫苗开发和药物递送中使用CPP的常见问题是当它们穿透细胞膜时它们是否引起细胞裂解。已经进行了三个系列研究来评估NCL-P2及其突变体肽的细胞毒性或细胞溶解活性，它们都缺乏可检测的细胞溶解和细胞毒性活性。这消除了对它们在疫苗、免疫疗法、药物递送等中使用的主要担忧。
总之，NCL-P2以及尤其是其已知的突变体P2+G、P2+3G、P2+G(F/I)、P2+G(F/L)和P2F/R提供了一系列的在一种肽上具有双重活性(即警报素和CPP)的强大的生物活性肽，其非常适合作为疫苗佐剂或载体用于药物或标记的细胞内递送。基于表位预测(数据未显示)和实验指示(图24)，这些肽的预期低抗原性降低了在患者中使用这些肽期间的另一个常见安全性/功效问题。
参考文献
在此说明书中对明显先前已公开的文件的任何列示或讨论都不应一定视为承认所述文件是最先进技术的一部分或者是公知常识。
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序列表
<110> 新加坡国立大学
<120> 肽佐剂对于其在病毒和肿瘤疫苗开发以及癌症免疫疗法和自身免疫性疾病诊断和治疗中的治疗应用
<130> SP102590WO
<150> SG10202006656Q
<151> 2020-07-13
<160> 58
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL
<400> 1
Met Val Lys Leu Ala Lys Ala Gly Lys Asn Gln Gly Asp Pro Lys Lys
1 5 10 15
Met Ala Pro Pro Pro Lys Glu Val Glu Glu Asp Ser Glu Asp Glu Glu
20 25 30
Met Ser Glu Asp Glu Glu Asp Asp Ser Ser Gly Glu Glu Val Val Ile
35 40 45
Pro Gln Lys Lys Gly Lys Lys Ala Ala Ala Thr Ser Ala Lys Lys Val
50 55 60
Val Val Ser Pro Thr Lys Lys Val Ala Val Ala Thr Pro Ala Lys Lys
65 70 75 80
Ala Ala Val Thr Pro Gly Lys Lys Ala Ala Ala Thr Pro Ala Lys Lys
85 90 95
Thr Val Thr Pro Ala Lys Ala Val Thr Thr Pro Gly Lys Lys Gly Ala
100 105 110
Thr Pro Gly Lys Ala Leu Val Ala Thr Pro Gly Lys Lys Gly Ala Ala
115 120 125
Ile Pro Ala Lys Gly Ala Lys Asn Gly Lys Asn Ala Lys Lys Glu Asp
130 135 140
Ser Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu Asp Asp
145 150 155 160
Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Ile Glu Pro Ala Ala Met Lys
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ser Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp
180 185 190
Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Glu Glu Asp Asp Ser Glu Glu
195 200 205
Glu Ala Met Glu Thr Thr Pro Ala Lys Gly Lys Lys Ala Ala Lys Val
210 215 220
Val Pro Val Lys Ala Lys Asn Val Ala Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu
225 230 235 240
Asp Asp Glu Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp
245 250 255
Asp Asp Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Pro
260 265 270
Val Lys Glu Ala Pro Gly Lys Arg Lys Lys Glu Met Ala Lys Gln Lys
275 280 285
Ala Ala Pro Glu Ala Lys Lys Gln Lys Val Glu Gly Thr Glu Pro Thr
290 295 300
Thr Ala Phe Asn Leu Phe Val Gly Asn Leu Asn Phe Asn Lys Ser Ala
305 310 315 320
Pro Glu Leu Lys Thr Gly Ile Ser Asp Val Phe Ala Lys Asn Asp Leu
325 330 335
Ala Val Val Asp Val Arg Ile Gly Met Thr Arg Lys Phe Gly Tyr Val
340 345 350
Asp Phe Glu Ser Ala Glu Asp Leu Glu Lys Ala Leu Glu Leu Thr Gly
355 360 365
Leu Lys Val Phe Gly Asn Glu Ile Lys Leu Glu Lys Pro Lys Gly Lys
370 375 380
Asp Ser Lys Lys Glu Arg Asp Ala Arg Thr Leu Leu Ala Lys Asn Leu
385 390 395 400
Pro Tyr Lys Val Thr Gln Asp Glu Leu Lys Glu Val Phe Glu Asp Ala
405 410 415
Ala Glu Ile Arg Leu Val Ser Lys Asp Gly Lys Ser Lys Gly Ile Ala
420 425 430
Tyr Ile Glu Phe Lys Thr Glu Ala Asp Ala Glu Lys Thr Phe Glu Glu
435 440 445
Lys Gln Gly Thr Glu Ile Asp Gly Arg Ser Ile Ser Leu Tyr Tyr Thr
450 455 460
Gly Glu Lys Gly Gln Asn Gln Asp Tyr Arg Gly Gly Lys Asn Ser Thr
465 470 475 480
Trp Ser Gly Glu Ser Lys Thr Leu Val Leu Ser Asn Leu Ser Tyr Ser
485 490 495
Ala Thr Glu Glu Thr Leu Gln Glu Val Phe Glu Lys Ala Thr Phe Ile
500 505 510
Lys Val Pro Gln Asn Gln Asn Gly Lys Ser Lys Gly Tyr Ala Phe Ile
515 520 525
Glu Phe Ala Ser Phe Glu Asp Ala Lys Glu Ala Leu Asn Ser Cys Asn
530 535 540
Lys Arg Glu Ile Glu Gly Arg Ala Ile Arg Leu Glu Leu Gln Gly Pro
545 550 555 560
Arg Gly Ser Pro Asn Ala Arg Ser Gln Pro Ser Lys Thr Leu Phe Val
565 570 575
Lys Gly Leu Ser Glu Asp Thr Thr Glu Glu Thr Leu Lys Glu Ser Phe
580 585 590
Asp Gly Ser Val Arg Ala Arg Ile Val Thr Asp Arg Glu Thr Gly Ser
595 600 605
Ser Lys Gly Phe Gly Phe Val Asp Phe Asn Ser Glu Glu Asp Ala Lys
610 615 620
Ala Ala Lys Glu Ala Met Glu Asp Gly Glu Ile Asp Gly Asn Lys Val
625 630 635 640
Thr Leu Asp Trp Ala Lys Pro Lys Gly Glu Gly Gly Phe Gly Gly Arg
645 650 655
Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly
660 665 670
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly
675 680 685
Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Asp His Lys Pro Gln Gly
690 695 700
Lys Lys Thr Lys Phe Glu
705 710
<210> 2
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FBRL
<400> 2
Met Lys Pro Gly Phe Ser Pro Arg Gly Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly
1 5 10 15
Gly Phe Gly Asp Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly
20 25 30
Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Phe Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Phe
50 55 60
His Ser Gly Gly Asn Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Lys Arg Gly Asn
65 70 75 80
Gln Ser Gly Lys Asn Val Met Val Glu Pro His Arg His Glu Gly Val
85 90 95
Phe Ile Cys Arg Gly Lys Glu Asp Ala Leu Val Thr Lys Asn Leu Val
100 105 110
Pro Gly Glu Ser Val Tyr Gly Glu Lys Arg Val Ser Ile Ser Glu Gly
115 120 125
Asp Asp Lys Ile Glu Tyr Arg Ala Trp Asn Pro Phe Arg Ser Lys Leu
130 135 140
Ala Ala Ala Ile Leu Gly Gly Val Asp Gln Ile His Ile Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ala Lys Val Leu Tyr Leu Gly Ala Ala Ser Gly Thr Thr Val Ser His
165 170 175
Val Ser Asp Ile Val Gly Pro Asp Gly Leu Val Tyr Ala Val Glu Phe
180 185 190
Ser His Arg Ser Gly Arg Asp Leu Ile Asn Leu Ala Lys Lys Arg Thr
195 200 205
Asn Ile Ile Pro Val Ile Glu Asp Ala Arg His Pro His Lys Tyr Arg
210 215 220
Met Leu Ile Ala Met Val Asp Val Ile Phe Ala Asp Val Ala Gln Pro
225 230 235 240
Asp Gln Thr Arg Ile Val Ala Leu Asn Ala His Thr Phe Leu Arg Asn
245 250 255
Gly Gly His Phe Val Ile Ser Ile Lys Ala Asn Cys Ile Asp Ser Thr
260 265 270
Ala Ser Ala Glu Ala Val Phe Ala Ser Glu Val Lys Lys Met Gln Gln
275 280 285
Glu Asn Met Lys Pro Gln Glu Gln Leu Thr Leu Glu Pro Tyr Glu Arg
290 295 300
Asp His Ala Val Val Val Gly Val Tyr Arg Pro Pro Pro Lys Val Lys
305 310 315 320
Asn
<210> 3
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GAR1
<400> 3
Met Ser Phe Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Asn Arg Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Phe Asn Arg Gly Gly Ser Ser Asn His Phe Arg Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn Phe Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly
35 40 45
Phe Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Asn Lys Gly Gln Asp Gln
50 55 60
Gly Pro Pro Glu Arg Val Val Leu Leu Gly Glu Phe Leu His Pro Cys
65 70 75 80
Glu Asp Asp Ile Val Cys Lys Cys Thr Thr Asp Glu Asn Lys Val Pro
85 90 95
Tyr Phe Asn Ala Pro Val Tyr Leu Glu Asn Lys Glu Gln Ile Gly Lys
100 105 110
Val Asp Glu Ile Phe Gly Gln Leu Arg Asp Phe Tyr Phe Ser Val Lys
115 120 125
Leu Ser Glu Asn Met Lys Ala Ser Ser Phe Lys Lys Leu Gln Lys Phe
130 135 140
Tyr Ile Asp Pro Tyr Lys Leu Leu Pro Leu Gln Arg Phe Leu Pro Arg
145 150 155 160
Pro Pro Gly Glu Lys Gly Pro Pro Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg
165 170 175
Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly
180 185 190
Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg
195 200 205
Gly Gly Gly Phe Arg Gly Arg Gly His
210 215
<210> 4
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-GAR/RGG
<400> 4
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Arg Gly
20 25 30
Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly
35 40 45
<210> 5
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FBRL-GAR/RGG
<400> 5
Arg Gly Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Asp Arg Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Phe Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly
35 40
<210> 6
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GAR1-GAR/RGG
<400> 6
Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly
35 40
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P1
<400> 7
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2
<400> 8
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg Gly
20 25 30
Gly Arg Gly Gly
35
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P6
<400> 9
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly
1 5 10 15
Phe Gly Gly Arg Gly
20
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FBRL-P1
<400> 10
Arg Gly Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Asp Arg Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Gly Arg Gly Gly
20
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FBRL-P2
<400> 11
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Phe Arg Gly
1 5 10 15
Arg Gly Arg Gly Gly
20
<210> 12
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2+G
<400> 12
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg
20 25 30
Gly Gly Arg Gly Gly
35
<210> 13
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2+3G
<400> 13
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly
20 25 30
Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly
35
<210> 14
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2+2G
<400> 14
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly
1 5 10 15
Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly
20 25 30
Arg Gly Gly Arg Gly Gly
35
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 触角转录因子穿透蛋白
<400> 15
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV蛋白TAT
<400> 16
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 48个氨基酸的NCL GAR/RGG区域中的头对尾重复
<400> 17
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Arg
20
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 48个氨基酸的NCL GAR/RGG区域中的尾对尾重复
<400> 18
Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly
1 5 10 15
Arg Gly Gly
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 48个氨基酸的NCL GAR/RGG区域的非重复C末端区
<400> 19
Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 20
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2R/K
<400> 20
Gly Gly Phe Gly Gly Lys Gly Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Lys Gly Lys Gly Gly Phe Gly Gly Lys Gly Gly Phe Lys Gly
20 25 30
Gly Lys Gly Gly
35
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2F/R
<400> 21
Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Arg Arg Gly
20 25 30
Gly Arg Gly Gly
35
<210> 22
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2R/F
<400> 22
Gly Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Phe Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Phe Phe Gly
20 25 30
Gly Phe Gly Gly
35
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2F/Y
<400> 23
Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Arg Gly
20 25 30
Gly Arg Gly Gly
35
<210> 24
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2F/W
<400> 24
Gly Gly Trp Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Trp
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Trp Gly Gly Arg Gly Gly Trp Arg Gly
20 25 30
Gly Arg Gly Gly
35
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P3
<400> 25
Asp His Lys Pro Gln Gly Lys Lys Thr Lys Phe Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P4
<400> 26
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P7
<400> 27
Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP1
<400> 28
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP2
<400> 29
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP3
<400> 30
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4
<400> 31
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP5
<400> 32
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 33
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP6
<400> 33
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 34
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP7
<400> 34
Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2xCPP4
<400> 35
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg
20 25 30
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M1
<400> 36
Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg
1 5 10
<210> 37
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M2
<400> 37
Arg Arg Arg Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg
1 5 10
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M3
<400> 38
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg
1 5 10
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M4
<400> 39
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Arg Arg Val Arg
1 5 10
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M5
<400> 40
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M6
<400> 41
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Leu Arg Arg Asn Arg Arg Arg Leu Arg
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M7
<400> 42
Arg Arg Arg Arg Leu Arg Leu Arg Arg Leu Arg Arg Arg Leu Arg
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M8
<400> 43
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Asn Arg Arg Asn Arg Arg Arg Asn Arg
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M9
<400> 44
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Val Arg
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP4M10
<400> 45
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 46
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL(WT)-HA的GAR/RGG区域
<400> 46
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Arg Gly
20 25 30
Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Asp His Lys Pro Gln Gly Lys Lys Thr Lys Phe Glu
50 55 60
<210> 47
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL(698)-HA的GAR/RGG区域
<400> 47
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Arg Gly
20 25 30
Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly
35 40 45
<210> 48
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL(670)-HA的GAR/RGG区域
<400> 48
Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg
1 5 10 15
Gly Gly Gly Arg
20
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL(652-698)-HA的GAR/RGG区域
<400> 49
Gly Gly Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Asp His Lys Pro Gln
1 5 10 15
Gly Lys Lys Thr Lys Phe Glu
20
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P5
<400> 50
Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P7
<400> 51
Phe Arg Gly Gly Arg Gly Gly
1 5
<210> 52
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FBRL-P3
<400> 52
Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Phe
<210> 53
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2+G(F/I)
<400> 53
Gly Gly Ile Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Ile
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Ile Gly Gly Arg Gly Gly Ile Arg
20 25 30
Gly Gly Arg Gly Gly
35
<210> 54
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2+G(F/L)
<400> 54
Gly Gly Leu Gly Arg Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Leu
1 5 10 15
Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Arg Gly Gly Leu Arg
20 25 30
Gly Gly Arg Gly Gly
35
<210> 55
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2+G(G/A)
<400> 55
Gly Gly Phe Gly Ala Arg Gly Gly Ala Arg Gly Ala Arg Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Ala Arg Gly Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ala Arg Gly Gly Phe Arg
20 25 30
Gly Ala Arg Gly Ala
35
<210> 56
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCL-P2+G(G/P)
<400> 56
Gly Gly Phe Gly Pro Arg Gly Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Gly Phe Gly Pro Arg Gly Gly Phe Arg
20 25 30
Gly Pro Arg Gly Pro
35
<210> 57
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IPA1E2
<400> 57
Gly Gln Gly Gln Leu Val Lys Arg Pro Lys Ile Met Arg Phe Ile Ser
1 5 10 15
His Leu Trp Leu Ala Leu Glu Ser Ala Asn Ser Glu Lys Arg
20 25 30
<210> 58
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IPA1E2-P2+G
<400> 58
Gly Gln Gly Gln Leu Val Lys Arg Pro Lys Ile Met Arg Phe Ile Ser
1 5 10 15
His Leu Trp Leu Ala Leu Glu Ser Ala Asn Ser Glu Lys Arg Gly Gly
20 25 30
Phe Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly
35 40 45
Arg Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Arg Gly Gly
50 55 60
Arg Gly Gly
65

Claims (28)

1.一种包含肽或由肽组成的分离的多肽，所述肽包含具有警报素和/或细胞穿透活性的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域或由其组成。
2.根据权利要求1所述的分离的肽，其中所述肽的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域包含选自含有RGG、GGR、FGG和GGF的组的多个氨基酸三聚体或选自含有RGGG、GGGR、FGGG和GGGF的组的四聚体或者由其组成。
3.根据权利要求2所述的分离的多肽，其中所述肽的富含甘氨酸和精氨酸(GAR/RGG)的区域还包含选自含有RGGG、GGGR、FGGG和GGGF的组的四聚体和/或选自含有RG、GR、FR和GDR的组的间插氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的肽，其中所述肽选自下组，所述组包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或其警报素活性和/或细胞穿透片段或突变体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的肽，其中所述肽包含下组所示的氨基酸序列或其警报素活性和/或细胞穿透片段或突变体或者由下组所示的氨基酸序列或其警报素活性和/或细胞穿透片段或突变体组成，所述组包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:47。
6.根据权利要求5所述的分离的肽，其中所述肽突变体包含在所述GAR/RGG区域内插入一个或多个“G”残基以完成三联体，如“RGRGG”至“RGGRGG”或“RGGFRGG”至“RGGFGGRGG”。
7.根据权利要求5或6所述的分离的肽，其中所述肽或其突变体由下组所示的氨基酸序列组成，所述组包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55和SEQ ID NO:56。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的肽，其中所述肽或其突变体具有警报素活性和细胞穿透活性二者。
9.根据权利要求8所述的分离的肽，其中所述肽由下组所示的氨基酸序列组成，所述组包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:53和SEQ IDNO:54。
10.根据权利要求8所述的分离的肽，其中所述肽具有载体功能并由下组所示的氨基酸序列组成，所述组包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
11.一种分离的融合多肽，所述分离的融合多肽包含与抗原或货物分子融合的根据权利要求1至10中任一项所述的分离的肽。
12.根据权利要求11所述的分离的融合多肽，其中所述肽可以穿透细胞并携带抗原或货物分子进入所述细胞。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的分离的融合多肽，其中所述细胞是树突状细胞或其他抗原呈递细胞。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的分离的融合多肽，其中所述至少一种抗原是病原体如细菌、真菌、寄生虫或病毒或者癌细胞所特有的。
15.根据权利要求10至13中任一项所述的分离的融合多肽，其中所述货物分子是药物或标记分子。
16.一种组合物，所述组合物包含：
a)根据权利要求1至10中任一项所述的分离的肽和至少一种抗原；或
b)根据权利要求11至15中任一项所述的分离的融合多肽，或
c)灭活的癌细胞和至少一种根据权利要求1至12或14中任一项所述的肽，
以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体或其混合物。
17.一种增强抗原的免疫原性的方法，其中所述抗原是病原体如细菌、真菌、寄生虫或病毒或者癌细胞所特有的，所述方法包括
a)将根据权利要求1至9中任一项所述的分离的警报素肽与所述抗原融合；或
b)将根据权利要求1至9中任一项所述的分离的警报素肽与所述抗原混合。
18.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的肽、根据权利要求10至15中任一项所述的融合多肽或根据权利要求16所述的组合物用于制备预防或治疗疾病的药物的用途，其中所述疾病选自下组，所述组包含病毒、真菌、寄生虫、细菌和癌症疾病。
19.一种预防或治疗需要这种治疗的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
a)与抗原或货物分子融合或混合的根据权利要求1至9中任一项所述的分离的警报素肽；或
b)根据权利要求16所述的组合物。
20.一种激活至少一种树突状细胞或其他抗原呈递细胞或T细胞或癌细胞的方法，所述方法包括将所述至少一种树突状细胞、抗原呈递细胞或T细胞或癌细胞暴露于根据权利要求1至9中任一项所述的分离的肽，或暴露于与抗原或货物分子融合或混合的所述肽。
21.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码根据权利要求1至9中任一项所述的肽，或编码根据权利要求10至14中任一项所述的融合多肽。
22.一种包含一个或多个根据权利要求21所述的多核苷酸的克隆或表达载体。
23.一种用于生产根据权利要求1至9中任一项所述的肽或根据权利要求10至14中任一项所述的融合多肽的方法，所述方法包括培养包含根据权利要求22所述的表达载体的宿主细胞或无细胞多肽制造组合物以及分离所述肽或融合多肽。
24.一种检测受试者中含有GAR/RGG的肽的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供来自所述受试者的生物样品；
ii)测定所述生物样品中存在的含有GAR/RGG的蛋白质的水平。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病，其中高于对照水平的含有GAR/RGG的肽的水平指示所述受试者中的自身免疫性疾病。
26.根据权利要求24或25所述的方法，所述方法包括使i)中的所述样品与对所述含有GAR/RGG的肽如NCL、FBRL或GAR1的GAR/RGG区域或其生物活性GAR/RGG区域突变体具有特异性的抗体接触。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自下组，所述组包含血液、脑脊液和尿液。
28.一种出于研究或疾病治疗的目的增强抗原或货物分子如核酸或多肽试剂或治疗药物的细胞内递送的方法，所述方法包括将根据权利要求1至9中任一项所述的警报素肽与所述抗原或货物分子组合。
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