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CN116178510A - 鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗及其制备和应用 - Google Patents

鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗及其制备和应用 Download PDF

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CN116178510A CN202211554357.5A CN202211554357A CN116178510A CN 116178510 A CN116178510 A CN 116178510A CN 202211554357 A CN202211554357 A CN 202211554357A CN 116178510 A CN116178510 A CN 116178510A
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newcastle disease
avian influenza
hmtp210
chicken
inactivated vaccine
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崔平
张飞
王慧
王成举
乔培壮
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Shandong Binzhou Wohua Biotech Engineering Co ltd
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Abstract

本发明公开了鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗及其制备和应用，涉及生物工程技术领域。鸡新城疫、禽流感、鸡传染性鼻炎（A、B、C三种血清型）亚单位蛋白三联灭活疫苗的制备方法与应用；包括血清B型副鸡禽杆菌亚单位蛋白表达菌株的构建、表达；鸡新城疫、H9亚型禽流感、鸡传染性鼻炎（A、B、C三种血清型）亚单位蛋白以一定的比例制备三联灭活疫苗；该三联灭活疫苗，安全性良好，可用于产蛋鸡群新城疫、H9亚型禽流感和A、B、C三种血清型副鸡禽杆菌病的预防，免疫接种不会导致产蛋率的下降，同时副鸡禽杆菌亚单位蛋白能够提升新城疫和H9禽流感的抗体水平，疫苗对A、B、C三种血清型副鸡禽杆菌的保护也能够达到100%。

Description

鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗及其制备和 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗及其制备和应用。
背景技术
新城疫作为家禽的一种主要传染病，已在世界多个地区爆发，包括美国、韩国和中国等，给家禽行业造成的严重的经济损失仅次于禽流感。常规疫苗主要有灭活疫苗和活疫苗。H9亚型禽流感为低致病性禽流感，其感染禽类会引起呼吸困难、采食下降、产蛋率下降等临床症状，且易继发其他疾病，危害极大。当前，除了早已流行的 H5N1和H7N9亚型之外，H9N2仍然是危害家禽养殖业的三种主要禽流感亚型之一，对于H9亚型禽流感的防控还是主要依靠H9亚型全灭活疫苗，抗体水平＞7log2时能够产生较好的保护。
鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的一种鸡的上呼吸道疾病，感染鸡出现脸肿、流泪、流鼻涕、产蛋下降。2015年以后，A、B、C三个血清型副鸡禽杆菌在国内均有流行。该病的灭活疫苗能够有效预防鸡传染性鼻炎的发生，三个血清型之间缺乏有效的交叉保护。
目前市场上的鸡传染性疫苗全部为全菌体灭活疫苗，分油乳剂灭活疫苗和铝胶佐剂灭活疫苗。铝胶佐剂能够吸附内毒素，安全性好，但仅能刺激产生Th2体液免疫反应，保护效果不如油乳剂疫苗且持续期短；油乳剂疫苗能够产生较高的抗体水平和刺激一定的Th1细胞免疫反应，免疫效果好，持续期长，由于油乳剂疫苗缺乏对细菌内毒素的缓释，容易造成免疫后产蛋鸡群的产蛋率下降，下降比例可达5％-20%，不适合产蛋期间的鸡群的免疫。
亚单位疫苗能够在生产过程中控制半成品内毒素含量，安全性较全菌体疫苗好。已鉴定血清A型、C型副鸡禽杆菌的外膜蛋白HMTp210具有较好的免疫原性，且大肠杆菌表达均为包涵体。现有报道和鉴定的血清B型副鸡禽杆菌的HMTp210免疫原性不好，仅能提供30-60%的保护。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗及其制备和应用，实现了同时预防鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和A、B、C三种血清型的副鸡禽杆菌感染所引起的疾病，减少免疫次数，降低免疫成本，真正起到免疫减负的效果。本发明是通过如下技术方案实现的：本发明提供了鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗及其制备和应用，包括，
一种血清B型副鸡禽杆菌保护性抗原蛋白，其具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
编码如所述的血清B型副鸡禽杆菌保护性抗原蛋白的编码基因，其编码基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.2序列。
鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗，包括，鸡新城疫LaSota株、H9亚型禽流感WD株、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白A-HMTp210、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白B-HA-C和鸡传染性鼻炎亚单位蛋白C-HMTp210。
制备权利要求3所述的鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎亚单位蛋白三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）鸡新城疫抗原和H9亚型禽流感抗原的制备，
分别将鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒WD株采用鸡胚法增殖培养，收集尿囊液抗原，添加总量0.2%-0.3%的甲醛溶液，37℃灭活24h，每隔6h摇晃一次；
（2） A、B、C三种血清型副鸡禽杆菌亚单位蛋白的制备，
分别将大肠杆菌工程菌BL21-A-HMTp210、BL21-B-HA-C和BL21-C-HMTp210接种LB培养基，以IPTG进行诱导5-6h，离心取菌泥，用原体积1/10的50mM Tris缓冲液重悬，破碎处理，硫酸铵盐析纯化和Triton X-114脱毒处理，内毒素控制＜2500EU/ml，以BCA试剂盒（thermo）进行蛋白浓度的测定，添加总量0.2%-0.3%的甲醛溶液，2-8℃灭活120h；制得目的蛋白溶液A-HMTp210、B-HA-C、C-HMTp210；
（3）三联灭活疫苗的制备，
按照每毫升疫苗中添加鸡新城疫病毒抗原、H9禽流感病毒抗原、A-HMTp210、B-HA-C、C-HMTp210的量分别为0.05ml、0.05ml、50μg、50μg、50μg，配制水相，添加水相2%-4%比例的吐温-80，PBS补齐水相，充分混匀后作为水相；6%-8%司盘80添加至Marcol 52白油中，充分溶解作为油相，高压灭菌后备用；按照油水比2:1-3:1的比例加入油相中，18-24m/S线速度剪切5min-40min，制成均匀乳液，即为鸡新城疫、H9亚型禽流感、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白（A、B、C三种血清型）三联灭活疫苗，2-8℃保存。
上述三联灭活疫苗，在预防鸡新城疫、H9亚型禽流感、副鸡禽杆菌（A、B、C三种血清型）疾病时应用。
本发明的有益效果是：
本发明研发的副鸡禽杆菌的亚单位蛋白、新城疫病毒、禽流感病毒的联苗，能够起到一针免疫，能够有效降低疫苗内毒素，安全性好，应用于产蛋鸡群不会引起产蛋率的下降，同时接种一针预防三种疾病，减少免疫次数带来的应激，降低免疫成本，真正起到免疫减负的效果；有效预防产蛋鸡群鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和三种（A、B、C）血清型的副鸡禽杆菌导致的疾病。
对鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和A、B、C三个血清型的副鸡禽杆菌感染起到有效的保护，副鸡禽杆菌亚单位蛋白还能够提升鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒的抗体水平。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1 B-HA-C基因PCR扩增图，图中，M为分子Marker，泳道1-3均为PCR产物，泳道4为阴性对照；
图2 B-HA-C表达鉴定图，图中，M为分子Marker，泳道1-3分别为全菌体、破碎上清、破碎沉淀；
图3 A-HMTp210、C-HMTp210表达鉴定图，图中，M为分子Marker，泳道1为A-HMTp210菌体破碎上清，泳道2为C-HMTp210菌体破碎上清。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
一种血清B型副鸡禽杆菌保护性抗原蛋白，其具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列；其中SEQ ID NO.1序列为：
QDTIHDAINNVLTKLISLSATEEEVVSGEPVYEPLKGAKPTVSAEANKDITGLVDVVKKANSPITVEPSTDNNKKKTFTVGLMKDIEGVNSITFDKSGQDPNQVTGRMSSAGLTFKKGDTTNGSTTTFAEDGLTIDSTTNSAQTNLVKVSRDGFSVKNGSDESKLAPTKLSIGAENAEHVEVTKSGIALKADNTSDKSRITLAQDAITLAGNATGTAIKLTGVADGNITANSKDAVNGGQLRTLLGVDSGAKIGGTEKTTISEAISDVKQALTDATLVYKADNKNGKTVKLTDGLNFTSTTNIGASVEDSGVVKFTLKDRLTGLKTIVTESLNASQNIIAGGTVTVGGETEGIVLTKSGSGNDRTLSLSGAGNAATDGIKVSGVKAGTADTDAVNKGQLDKLFKAINDALGTTDLAVTKNPNQTSIFNPINGTAPTTFKDAVDKLTTAVNTGWGSKVGILATGIDGIDAGNKKISNVADGDISPTSGDVVTGRQLYALMQKGIRVYGDEVSPTKTQTTAPTASSTQGGATTANTAGGVAPAGNVAMGDIAPTQPALPEMKTALVDDHLAVPLGGSLKIHGDHNVKTTISAGNQVGISLQPNISIENNLVIGSNKPEKAKLAAQEGNALVITNKDDGNAAMVFNNEKNMLVFSDKKAKPRAVLDGQNGALTLVGNDDSQVTLSSKKGKDIDGNDLSRLSVTTERTNADGQLEKVETSFATMDDGLKFKADGDKVINKKLNETVEIVGDENVTTSITDDNKVKVSLNKKIAIDEVKIPNTDPDAQKGDSIVINNGGIHAGNKVITGVKASDDPTSAVNRGQLNTVIDNVQNNFNQVNQRIGDLTRESRAGIAGAMATASLQNVVLPGKTTISVGTATFKGENAVAIGMSRLSDNGKVGIRLSGMSTSNGDKGAAMSVGFTF
编码如所述的血清B型副鸡禽杆菌保护性抗原蛋白的编码基因，其编码基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.2序列；其中SEQ ID NO.2序列为：
CAAGATACAATCCACGATGCGATTAATAATGTTCTCACCAAATTGATCTCGCTTTCGGCAACAGAAGAAGAAGTGGTGTCAGGGGAACCTGTCTATGAACCACTTAAAGGTGCAAAACCAACGGTTTCAGCAGAAGCCAACAAAGACATTACTGGCTTGGTGGATGTGGTGAAAAAAGCAAATTCACCGATCACAGTTGAGCCTTCTACCGATAACAACAAGAAAAAAACCTTCACTGTCGGCTTAATGAAAGACATTGAAGGGGTAAACAGCATTACCTTTGATAAGTCAGGGCAAGATCCAAATCAAGTTACGGGCAGAATGAGCAGTGCGGGTTTAACCTTCAAAAAAGGCGACACAACAAATGGTTCAACCACCACTTTTGCAGAAGATGGCTTAACCATTGATAGCACAACAAATTCTGCTCAAACAAACTTAGTGAAAGTAAGTCGTGATGGCTTCTCGGTGAAAAATGGCAGCGATGAAAGCAAATTAGCCCCGACAAAATTATCTATCGGTGCGGAAAATGCAGAACACGTTGAAGTAACTAAATCGGGCATAGCCTTAAAAGCGGATAACACCTCCGATAAATCTCGCATCACCTTAGCCCAAGATGCGATTACTCTTGCGGGGAACGCAACCGGAACGGCGATTAAATTGACTGGTGTTGCAGATGGCAACATTACGGCAAATTCAAAAGATGCGGTAAATGGGGGGCAGTTGCGTACGTTATTAGGGGTTGATAGCGGGGCTAAAATTGGCGGTACTGAGAAAACAACGATCAGTGAAGCCATTTCTGATGTGAAGCAAGCTCTTACCGATGCGACATTGGTATATAAAGCGGACAATAAAAACGGTAAAACAGTTAAATTGACTGACGGATTGAATTTTACTAGCACGACCAATATTGGCGCCTCAGTAGAAGATAGTGGTGTGGTGAAATTCACCTTAAAAGATCGATTAACAGGCTTAAAAACTATCGTAACTGAGTCTTTGAATGCTTCTCAAAACATTATTGCTGGCGGCACAGTAACCGTGGGCGGCGAGACAGAGGGCATTGTGCTAACAAAATCTGGCTCAGGAAATGACCGCACTTTATCTTTATCTGGTGCAGGCAATGCAGCAACAGATGGCATTAAAGTCTCTGGCGTGAAAGCAGGGACGGCAGACACCGATGCGGTGAATAAAGGTCAGTTAGATAAACTTTTTAAAGCGATCAATGACGCATTAGGCACAACAGATTTAGCGGTAACCAAAAATCCAAATCAAACCTCTATCTTTAATCCGATAAACGGCACGGCTCCAACCACCTTTAAAGACGCGGTGGATAAATTAACCACCGCTGTGAATACAGGTTGGGGATCAAAGGTAGGTATTTTGGCAACAGGTATTGATGGTATTGATGCTGGGAATAAGAAAATTAGTAATGTCGCCGATGGGGATATTTCTCCAACCAGTGGTGATGTAGTGACAGGTCGTCAGCTCTACGCCTTAATGCAGAAAGGTATTCGCGTGTATGGTGATGAAGTTAGTCCAACGAAGACTCAAACAACAGCACCTACAGCATCTAGCACTCAAGGTGGGGCGACAACGGCGAATACGGCGGGTGGTGTAGCACCAGCAGGTAATGTAGCAATGGGGGATATTGCGCCGACACAGCCAGCATTGCCAGAGATGAAAACGGCATTGGTTGATGATCACTTGGCTGTGCCGTTAGGTGGAAGCCTCAAGATTCACGGAGATCATAATGTGAAAACAACGATTTCTGCGGGTAATCAAGTGGGGATTTCATTACAGCCAAATATTTCTATTGAGAATAACTTGGTAATTGGTTCAAATAAGCCTGAGAAGGCAAAATTAGCCGCACAAGAAGGTAATGCTTTGGTTATCACTAACAAAGATGACGGGAATGCAGCGATGGTCTTTAATAACGAGAAAAATATGCTTGTTTTCAGTGATAAAAAGGCGAAACCAAGAGCGGTTCTTGATGGACAAAATGGGGCATTAACTTTAGTCGGCAATGATGATTCTCAAGTCACCCTTTCCTCTAAGAAAGGTAAAGATATTGATGGAAATGATTTGAGCCGTCTCTCTGTGACGACTGAAAGAACAAATGCTGATGGGCAACTTGAAAAAGTGGAAACCTCATTTGCTACAATGGATGATGGCTTGAAGTTCAAAGCCGACGGGGATAAAGTGATTAATAAGAAACTTAATGAAACCGTTGAAATTGTTGGTGATGAGAATGTGACAACATCTATTACTGATGATAATAAGGTGAAAGTTTCACTGAATAAGAAAATCGCGATTGATGAGGTTAAGATTCCAAATACAGATCCTGATGCTCAAAAGGGAGATAGCATTGTAATCAACAATGGTGGAATCCACGCAGGTAATAAAGTGATTACTGGCGTTAAAGCTAGTGATGACCCAACCAGTGCGGTGAATCGAGGTCAATTAAATACCGTGATTGATAATGTTCAAAATAATTTCAATCAAGTTAATCAACGTATTGGCGATTTAACACGGGAGTCGCGTGCAGGTATTGCAGGTGCAATGGCGACGGCAAGCCTACAAAATGTTGTTTTACCAGGGAAAACAACGATTTCCGTAGGTACAGCAACGTTCAAAGGGGAGAATGCTGTTGCAATAGGGATGTCTAGACTCTCTGATAATGGAAAAGTAGGTATCCGTTTATCTGGTATGAGTACGAGTAACGGAGATAAAGGGGCAGCAATGAGCGTTGGATTTACCTTTTAG
本发明还涉及构建重组载体，其中包含副鸡禽杆菌B型保护性抗原蛋白基因。所述重组载体包含但不限于pET32a、pET28a、pGEX-6P-1、pCold载体。将上述重组载体转入大肠杆菌BL21（DE3）当中，经PCR鉴定为阳性的克隆菌株，命名为BL21-B-HA-C作为研究用菌种。
鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗，包括，鸡新城疫LaSota株、H9亚型禽流感WD株、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白A-HMTp210、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白B-HA-C和鸡传染性鼻炎亚单位蛋白C-HMTp210。
一种副鸡禽杆菌A型保护性抗原蛋白，其具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO.3序列为：
MDGTITFTNIGGTGQATIHDAINNVLTKGIYLKADQNDPTGNQGQKVELGNAITLSATNQWANNGVNYKTNNLTTYNSQNGTILFGMREDPSVKQITAGTYNTTGDANNKNQLNNTLQQTTLEATGITSSVGSTNYAGFSLGADSVTFSKGGAGTVKLSGVSDATADTDAATLKQVKEYRTTLVGDNDITAADRSGGTSNGITYNLSLNKGTVSATEEKVVSGKTVYEAIRNAITGNIFTIGLDDTTLNKINNPADQDLSNLSESGKNAITGLVDVVKKTNSPITVEPSTDSNKKKTFTVGVDFTDTITEGDATDDKKLTTSKSVESYVTNKLANFSTDILLSDGRSGNATTANDGVGKRRLSDGFTIKSENFTLGSKQYNGSDSLGVMYDDQNGVFKLSLNMTALTTSLANTFAKLDASNLTDDSNKEKWRTALNVYSKTEVDAEIQKSKVTLTPDSGLIFATKQAGSGNNAGIDAGNKKISNVADGDISPTSGDVVTGRQLYALMQKGIRVYGDEVSPTKTQTTAPTNANPTATTAPTASSTQ
一种副鸡禽杆菌C型保护性抗原蛋白，其具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO.4序列为：
MDGTITFTNIGGTGQDTIHDAINNVLTKLISLSATEEEVVSGEAVYDALKGAKPTVSAEANKGITGLVDVVKKANSPITVEPSTDNNKKKTFTVGLMKDIEGVNSITFDKSGQDLNQVTGRMSSAGLTFKKGDTTNGSTTTFAEDGLTIDSTTNSAQTNLVKVSRDGFSVKNGSDESKLASTKLSIGAENAEHVEVTKSGIALKADNTSDKSSITLAQDAITLAGNATGTAIKLTGVADGNITVNSKDAVNGGQLRTLLGVDSGAKIGGTEKTTISEAISDVKQALTDATLAYKADNKNGKTVKLTDGLNFTSTTNIDASVEDNGVVKFTLKDKLTGLKTIATESLNASQNIIAGGTVTVGGETEGIVLTKSGSGNDRTLSLSGAGNAATDGIKVSGVKAGTADTDAVNKGQLDKLFKAINDALGTTDLAVTKNPNQTSIFNPINGTAPTTFKDAVDKLTTAVNTGWGSKVGILATGIDGIDAGNKKISNVADGDISPTSGDVVTGRQLYALMQKGIRVYGDKVSPTKTQTTAPTASSTQG
利用构建B型研究用菌种的方式分别构建A型和C型研究用菌种：BL21-A-HMTp210和BL21-C-HMTp210。
制备鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎亚单位蛋白三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）鸡新城疫抗原和H9亚型禽流感抗原的制备，
分别将鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒WD株采用鸡胚法增殖培养，收集尿囊液抗原，添加总量0.2%-0.3%的甲醛溶液，37℃灭活24h，每隔6h摇晃一次；
（2） A、B、C三种血清型副鸡禽杆菌亚单位蛋白的制备，
分别将大肠杆菌工程菌BL21-A-HMTp210、BL21-B-HA-C和BL21-C-HMTp210接种LB培养基，以IPTG进行诱导5h-6h，离心取菌泥，用原体积1/10的50mM Tris缓冲液重悬，破碎处理，硫酸铵盐析纯化和Triton X-114（上海生工）脱毒处理，内毒素控制＜2500EU/ml，以BCA试剂盒（thermo）进行蛋白浓度的测定，添加总量0.2%-0.3%的甲醛溶液，2-8℃灭活120h；制得纯度较高的目的蛋白溶液A-HMTp210、B-HA-C、C-HMTp210，以下简称p-A、p-B、p-C；
（3）三联灭活疫苗的制备，
按照每毫升疫苗中添加鸡新城疫病毒抗原、H9禽流感病毒抗原、A-HMTp210、B-HA-C、C-HMTp210的量分别为0.05ml、0.05ml、50μg、50μg、50μg，配制水相，添加水相2%-4%比例的吐温-80，PBS补齐水相，充分混匀后作为水相；6%-8%司盘80添加至Marcol 52白油中，充分溶解作为油相，高压灭菌后备用；按照油水比2:1-3:1的比例加入油相中，18-24m/S线速度剪切5-40min，制成均匀乳液，即为鸡新城疫、H9亚型禽流感、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白（A、B、C三种血清型）三联灭活疫苗，2-8℃保存。
二联疫苗的配制：
按照每毫升疫苗中新城疫病毒抗原、H9禽流感病毒抗原加量为0.05ml、0.05ml的添加量配制水相，添加水相2-4%比例的吐温-80，充分混匀后制成水相；与上述三联灭活疫苗制备相同的油相制备和乳化工艺，制成均匀乳液即为鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗，分装后置于2-8℃备用，以下简称“新流二联灭活疫苗”。
上述三联灭活疫苗，在预防鸡新城疫、H9亚型禽流感、副鸡禽杆菌（A、B、C三种血清型）疾病时应用。
实施例一：
1、副鸡禽杆菌B型蛋白菌株的构建
（1）引物的设计
设计如下表1所示的引物序列，表达副鸡禽杆菌血清B型Spross株血凝素基因（Haemagglutinin ,HA）高变区至终止密码子1591-2037氨基酸肽段，命名为B-HA-C，根据报道的A-HMTp210、C-HMTp210的引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成。
表1 引物序列
B-HA-C/F CGGGATCCAAAATTAGTTATGTCGCCG
B-HA-C/R CCCAAGCTTCTATAAGGTAAATCCAACACT
A-HMTp210/F CGCGGATCCGATGGCACAATTACATTTACA
A-HMTp210/R CCCAAGCTTACCTTGAGTGCTAGATGCTGTAGGTGC
C-HMTp210/F CCCAAGCTTGATGGCACAATTACATTTACA
C-HMTp210/R CCGCTCGAGCTAACCTTGAGTGCTAGATGCTGTAGGTGC
（2）基因扩增
以副鸡禽杆菌B型菌株Spross株基因组DNA为模板扩增B-HA-C核苷酸片段，如附图1所示，以副鸡禽杆菌A型菌株Hpg-8为模板扩增A-HMTp210核苷酸片段，以副鸡禽杆菌C型菌株Hpg-668株为模板扩增C-HMTp210核苷酸片段。50μL反应体系如下：2×buffer 25μL、高保真酶1μL、dNTP 1μL、上游引物/下游引物（20uM）各1μL、模板基因组 2μL，超纯水补至50μL。PCR反应程序为：95℃5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 3min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物电泳后切下目的片段，用天根胶回收试剂盒回收。
（3）克隆菌株的构建
① 双酶切
取胶回收产物与pET-28a、pET-28a-sumo质粒，使用BamHI和HindIII双酶切。40μL酶切体系如下：基因片段和载体 33μL，BamH1、HindIII各1.5μL，10×K buffer 4μL。37℃酶切3h，酶切产物电泳后，胶回收酶切产物。
② 连接转化
将双酶切的目的基因片段与质粒的胶回收产物用T4连接酶进行连接，根据摩尔质量比按目的基因片段：质粒为3:1的比例进行16℃过夜连接。
过夜连接产物取5μL加入到50μL DH5α感受态细胞中轻弹混匀，冰上放置30 min，42℃热激60s，冰浴2min；加入500μL LB培养基，37℃摇床培养1h后，取100 μL菌液加入到含50 ug/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中，37℃过夜培养。
③ 阳性克隆菌株的鉴定
挑取2-3个在抗性平板上生长的菌落，转接到含对应抗生素的培养基中，菌液变浑浊后，使用扩增目的基因的引物，进行菌液PCR鉴定，鉴定阳性的菌液，取0.5 mL送生工测序。
（4）表达菌株的构建
①转化
提取测序正确的菌液中的质粒，将其转化入BL21（DE3）菌株。
②阳性表达菌株的鉴定
PCR鉴定：取抗性平板上生长出的菌落，进行菌液PCR鉴定。
诱导表达鉴定：取PCR鉴定阳性的菌液，转接到对应抗性的培养基中，菌液生长至OD600nm≈0.4-0.6时，加入终浓度0.1mM IPTG诱导4-6h，进行表达鉴定，工程菌BL21-A-HMTp210、BL21-B-HA-C、BL21-C-HMTp210均能表达出目的条带，如附图2和附图3所示。
2、免疫原性鉴定
（1） A-HMTp210、B-HA-C、C-HMTp210蛋白的制备
构建的工程菌BL21-A-HMTp210、BL21-B-HA-C、BL21-C-HMTp210，分别接种LB培养基，在OD600nm≈0.6~.08时，以终浓度0.1mM IPTG诱导表达5~6小时后，离心取菌泥，以1/10原体积纯水重悬，高压均质破碎处理后，以硫酸铵进行盐析纯化和Triton X-114脱毒处理，制得纯度较高的目的蛋白溶液。
（2）蛋白免疫原性鉴定
取表达蛋白，按照疫苗中蛋白含量为25、50、100μg/ml制备三种疫苗，免疫5-8周龄SPF鸡，0.5ml/羽，免疫后28天，以副鸡禽杆菌强毒株Spross株进行攻击。当疫苗中p-A、p-B、p-C三种蛋白含量均为50μg时，对A、B、C三种血清型的强毒攻击能够提供100%的保护，结果见表2。
表2不同含量蛋白免疫鸡保护数
Figure 498418DEST_PATH_IMAGE001
3、 新流鼻三联灭活疫苗和新流二联灭活疫苗的的制备方法
（1）抗原制备
①鸡新城疫抗原的制备
取生产用La Sota株毒种用灭菌生理盐水稀释104-105倍，接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚接种0.1ml，置37℃继续孵育。将接种后24h内死胚弃去，24h-120h死胚及时放4℃，120h收混合样，测定制苗毒的HA和EID50分别≥1:256和≥108.0EID50/0.1ml。将测定好效价的新城疫病毒 液导入灭活罐内，计量加入0.2％-0.3％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，37℃灭活24小时。
②禽流感抗原的制备
取生产用WD株毒种用灭菌生理盐水稀释103-104倍，接种，接种9-11日龄SPF鸡胚，每胚接 种0.1ml，置37℃继续孵育。将接种后48h内死胚弃去，48h～120h死胚及时放4℃，120h收混合样，测定制苗毒的HA和EID50分别≥1:256和≥108.0EID50/0.1ml。将测定好效价的新城疫病毒 液导入灭活罐内，计量加入0.2％-0.3％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，37℃灭活24小时。
③鸡传染性鼻炎亚单位蛋白的制备
分别将该实施例中制备好的蛋白溶液用BCA蛋白浓度试剂盒进行蛋白浓度测定，用于疫苗制备。
（2）疫苗制备
按照表2的抗原含量，制备水相，添加水相体积2%-4%的吐温80，充分搅拌溶解，与油相按照油水比3:1体积进行乳化，18-24m/s线速度，剪切5-40min，制成均匀乳液，定量分装，2-8℃保存。制备三批次新流鼻三联灭活疫苗，分别记为01、02、03批，新流二联灭活疫苗1批，如表3所示。
表3 疫苗配方信息表（每毫升疫苗添加量）
抗原信息 新流鼻三联灭活疫苗 新流二联灭活疫苗
新城疫 0.05ml 0.05ml
H9禽流感 0.05ml 0.05ml
p-A 50μg /
p-B 50μg /
p-C 50μg /
4、 疫苗检验
（1）安全性检验
用4～5周龄SPF鸡10只，每只皮下或肌肉注射疫苗1.0ml(2羽份)，观察14日，不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应。
（2）有效性检验
新城疫部分：
用4～5周龄SPF鸡10只，各皮下或肌肉注射疫苗20μl，接种后21天，连同对照鸡5只，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。三批新流鼻三联灭活疫苗免疫21天后新城疫的抗体水平均能达到1:181-1:223，新流二联抗体水平在1:111，三批新流鼻三联灭活疫苗组抗体水平较新流二联灭活疫苗组高，结果如表4所示。
表4 新城疫抗体水平（几何平均值）
Figure 628048DEST_PATH_IMAGE002
禽流感部分：
用4～5周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.5m1，接种后21日，连同对照鸡5只，每只鸡分别采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。三批新流鼻疫苗免疫21天后，H9亚型禽流感抗体几何平均值在1:2896-1:3327，新流二联抗体水平在1:1552，结果如表5所示。
表5 H9亚型禽流感抗体水平（几何平均值）
Figure 645683DEST_PATH_IMAGE003
鸡传染性鼻炎部分：
用4-5周龄SPF鸡150只，01、02、03批新流鼻三联灭活疫苗及对照疫苗各免疫30只，皮下注射疫苗0.5ml，另设30只空白对照鸡不作处理。免疫后28日，每组各取10只分别眶下窦内注射1个发病量的Hpg-8株（3.5×103CFU/ml）、Spross株（7.0×103CFU/m）、Hpg-668（6.5×103CFU/ml）株强毒菌液0.2ml，观察7日。三批新流鼻三联灭活疫苗与对照疫苗对A、B、C三种血清型强毒株的攻击均能提供10/10的保护，表明三联疫苗对副鸡禽杆菌三种血清型有较好的保护，结果如表6所示。
表6 副鸡禽杆菌攻毒保护结果
Figure 874670DEST_PATH_IMAGE004
5、疫苗免疫接种对产蛋鸡群产蛋率的影响
01批、02批、03批新流鼻三联灭活疫苗和新流二联灭活疫苗，分别免疫200天产蛋鸡各500只，商售鼻炎三价灭活油乳剂疫苗各免疫500只，另设500只不免疫对照鸡群。免疫前1天及免疫后7天，统计产蛋数，计算产蛋率，连续统计7天。结果显示三批次新流鼻三联灭活疫苗、新流二联灭活疫苗免疫后对产蛋的影响较小，与未免疫对照组相比无显著性差异（p＞0.05），而商售全菌体三价灭活鼻炎疫苗免疫后，会造成短时间产蛋率下降，与未免疫对照组相比，差异极显著（p＜0.01），结果如表7所示。
表7 不同疫苗免疫后天内产蛋率（%）的变化
分组 第-1天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天
01批 90.2 89.6 90.2 91.2 90.8 91.2 91.6 91.4
02批 90.8 90.4 90.4 90.6 90.4 90.2 90.8 90.6
03批 90.6 90 91.6 90.6 91.2 91 90.8 90.8
新流二联灭活疫苗 90.4 89.6 90.8 91.2 91.6 91.2 90.6 90.6
对照疫苗 90.2 84.2 80.2 79.2 80.6 85.6 88.8 89.8
未免疫对照 91.2 90.6 91 90.8 90.6 90.4 90.6 91.2
注：免疫当天为第0天，免疫前1天记为第-1天。产蛋率=产蛋数/鸡群数。

Claims (5)

1.一种血清B型副鸡禽杆菌保护性抗原蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
2.编码如权利要求1所述的血清B型副鸡禽杆菌保护性抗原蛋白的编码基因，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.2序列。
3.鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎三联灭活疫苗，其特征在于：包括，鸡新城疫LaSota株、H9亚型禽流感WD株、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白A-HMTp210、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白B-HA-C和鸡传染性鼻炎亚单位蛋白C-HMTp210。
4.制备权利要求3所述的鸡新城疫、禽流感和鸡传染性鼻炎亚单位蛋白三联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）鸡新城疫抗原和H9亚型禽流感抗原的制备，
分别将鸡新城疫病毒La Sota株和H9亚型禽流感病毒WD株采用鸡胚法增殖培养，收集尿囊液抗原，添加总量0.2%-0.3%的甲醛溶液，37℃灭活24h，每隔6h摇晃一次；
（2） A、B、C三种血清型副鸡禽杆菌亚单位蛋白的制备，
分别将大肠杆菌工程菌BL21-A-HMTp210、BL21-B-HA-C和BL21-C-HMTp210接种LB培养基，以IPTG进行诱导5h-6h，离心取菌泥，用原体积1/10的50mM Tris缓冲液重悬，破碎处理，硫酸铵盐析纯化和Triton X-114脱毒处理，内毒素控制＜2500EU/ml，以BCA试剂盒（thermo）进行蛋白浓度的测定，添加总量0.2%-0.3%的甲醛溶液，2-8℃灭活120h；制得目的蛋白溶液A-HMTp210、B-HA-C、C-HMTp210；
（3）三联灭活疫苗的制备，
按照每毫升疫苗中添加鸡新城疫病毒抗原、H9禽流感病毒抗原、A-HMTp210、B-HA-C、C-HMTp210的量分别为0.05ml、0.05ml、50μg、50μg、50μg，配制水相，添加水相2%-4%比例的吐温-80，PBS补齐水相，充分混匀后作为水相；6%-8%司盘80添加至Marcol 52白油中，充分溶解作为油相，高压灭菌后备用；按照油水比2:1-3:1的比例加入油相中，18-24m/S线速度剪切5-40min，制成均匀乳液，即为鸡新城疫、H9亚型禽流感、鸡传染性鼻炎亚单位蛋白（A、B、C三种血清型）三联灭活疫苗，2-8℃保存。
5.根据权利要求4所述的三联灭活疫苗，在预防鸡新城疫、H9亚型禽流感、副鸡禽杆菌（A、B、C三种血清型）疾病时的应用。
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