CN116178367A

CN116178367A - 苯并杂环类化合物在治疗或预防乙型肝炎中的应用

Info

Publication number: CN116178367A
Application number: CN202111422117.5A
Authority: CN
Inventors: 李瑛颖; 冀斌; 杨子翊; 张胜誉; 陈明键
Original assignee: China Israel Hyde Artificial Intelligence Drug Research And Development Co ltd
Current assignee: China Israel Hyde Artificial Intelligence Drug Research And Development Co ltd
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2023-05-30

Abstract

本申请提供了苯并杂环类化合物在治疗或预防乙型肝炎中的应用。本申请还提供了通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防乙型肝炎的药物中的用途。本发明还提供了用于治疗或预防乙型肝炎的药物组合物，其包含通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐、任选的一种或多种另外的治疗剂或预防剂，以及药学上可接受的载体。

Description

苯并杂环类化合物在治疗或预防乙型肝炎中的应用

技术领域

本申请涉及抗乙型肝炎药物领域，具体涉及苯并杂环类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在治疗或预防乙型肝炎的药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。

乙型肝炎的治疗是一个长期的过程，治疗目标就是最大限度地抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维素化，延缓和阻止疾病进展，减少和防止肝脏失代偿、肝硬化、肝细胞性肝癌及其并发症的发生，从而改善生活质量和延长存活时间。

目前市场上有很多乙型肝炎治疗药物，主要通过使用干扰素或者核苷类似物进行抗病毒治疗。对于干扰素而言，重组DNA白细胞干扰素(IFN-α)可抑制HBV的复制。但是干扰素在治疗乙肝时，往往伴随着较强的不良反应，包括骨髓抑制，影响甲状腺功能和抑郁等。

核苷类似物主要通过抑制HBV复制过程中的逆转录酶活性从而抑制HBV产生，临床可用药物包括：拉米夫定、泛昔洛韦、阿昔洛韦、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦、膦甲酸钠等，这些药物均有一定抑制HBV效果。

这些逆转录酶抑制剂虽然可以有效降低HBV DNA水平，使患者控制乙肝病毒水平，但是由于其作用靶点为RNA逆转录为DNA的过程，对于HBV cccDNA和HBsAg的清除无直接作用。因此核苷类似物单药治疗发生HBsAg血清学转化的概率极低，并不能真正治愈乙肝，患者需要长期甚至终身服用药物。

在长期服用上述药物的条件下，所产生的耐药性、巨额的医药费用、药物严重的副作用等问题对于乙肝患者来说是沉重的负担。关键是，目前仍然没有一种药物能够完全清除病毒达到功能性治愈乙肝。因此，本领域迫切需要提供一种新的治疗乙型肝炎、能够清除HBsAg、达到功能性治愈的药物。

发明内容

本申请提供了苯并杂环类化合物在预防或治疗乙型肝炎中的用途，所述化合物能够降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和/或HBeAg水平，甚至能够清除HBsAg和HBeAg，有望功能性治愈乙肝，清除乙肝病毒。

在一方面，本申请提供了一种苯并杂环类化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，所述化合物具有通式1所示的结构(所述化合物在本文中也称为通式1的化合物)：

其中：

X为CH或N；

Y为O、S或NH；

R₁表示任选地被一个或多个选自卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基的取代基取代的5-10元杂芳基，所述杂芳基包含1至3个选自N、O和S的杂原子；

每个R₂独立地表示卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基；且

n为0至4的整数，

条件是所述化合物不为：

在一个实施方式中，通式1中的Y为NH。

在一个实施方式中，通式1中的R₁表示任选地被一个或多个选自卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基的取代基取代的8-10元双环杂芳基，所述杂芳基包含1至3个选自N、O和S的杂原子。

在一个实施方式中，通式1中的R₁选自：

在一个实施方式中，所述化合物选自：

在另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含具有通式1所示结构的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的盐，以及任选的一种或多种另外的治疗剂或预防剂，以及药学上可接受的载体：

其中：

X为CH或N；

Y为O、S或NH；

每个R₂独立地表示卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基；且

n为0至4的整数。

在一个实施方式中，所述药物组合物中包含的化合物选自：

在一个实施方式中，所述药物组合物中包含的另外的治疗剂或预防剂选自干扰素、PEG化的干扰素或者核苷类似物中的至少一种。在一个实施方式中，所述核苷类似物选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺。

在又一方面，本申请提供了具有通式1所示结构的化合物或其立体异构体或其药学上可接受的化合物在制备用于治疗乙型肝炎的药物中的用途：

其中：

X为CH或N；

Y为O、S或NH；

每个R₂独立地表示卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基；且

n为0至4的整数。

在所述用途的一个实施方式中，所述化合物选自：

在所述用途的一个实施方式中，所述药物能够降低乙型肝炎病毒(HBV)载量和/或HBsAg水平和/或HBeAg水平、甚至是清除HBsAg和/或HBeAg水平。

在所述用途的一个实施方式中，所述药物能够同时降低HBsAg水平和HBeAg水平。

在所述用途的一个实施方式中，所述药物能够同时清除HBsAg水平和HBeAg水平。

在所述用途的一个实施方式中，所述药物还包含一种或多种另外的治疗剂或预防剂。在一个实施方式中，所述一种或多种另外的治疗剂或预防剂选自干扰素、PEG化的干扰素和核苷类似物中的至少一种。在一个实施方式中，所述核苷类似物选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺。

在一些实施方式中，本申请所述通式1的化合物或其立体异构体的药学上可接受的盐包括但不限于：醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。

在一些实施方式中，本申请所述通式1的化合物或其立体异构体或其药学上可接受盐、包含其的药物组合物或药物通过选自以下的途径施用：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。

在一些实施方式中，本申请所述通式1的化合物或其立体异构体或其药学上可接受盐、包含其的药物组合物或药物经口服施用。

在一些实施方式中，本申请所述通式1的化合物或其立体异构体或其药学上可接受盐、包含其的药物组合物或药物为口服制剂。在一些实施方式中，本申请所述通式1的化合物或其立体异构体或其药学上可接受盐、包含其的药物组合物或药物为片剂或胶囊的形式。

本发明的技术方案具有以下有益效果：

1、将通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐应用于治疗或预防乙型肝炎，从而提供了一种新颖的乙型肝炎治疗选项。

2、通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐能够同时有效降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和/或HBeAg水平，甚至能够清除HBsAg和HBeAg，有望达到功能性治愈乙型肝炎的效果。

3、通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐能够与一种或多种另外的用于治疗乙型肝炎的治疗剂或预防剂进行组合，特别是与能够降低病毒滴度但是不能完全清除病毒、不能降低HBsAg和/或HBeAg水平的药物进行组合，从不同方面清除乙型肝炎病毒，并具有协同增效的可能性，从而为后续的组合给药设计提供了广阔的思路。

4、通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐具有较低的细胞毒性，细胞活力较高，对人体或动物的毒副作用小，安全性高。

附图说明

图1为对不同浓度的化合物CP15测定的细胞活力结果。

图2为不同浓度的化合物CP15对HBV DNA的抑制结果。

图3为不同浓度的化合物CP15对HBeAg的抑制结果。

图4为不同浓度的化合物CP15对HBsAg的抑制结果。

具体实施方式

本申请的发明人意外地发现本申请所述的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐具有抑制乙型肝炎病毒的潜在活性，尤其是具有降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和/或HBeAg水平，甚至是清除HBsAg和HBeAg的作用，可用于预防和治疗乙型肝炎，并且细胞毒性小、安全性高。

通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐

本申请提供了一组苯并杂环类化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，所述苯并杂环类化合物具有以下通式1所示的结构：

其中：

X为CH或N；

Y为O、S或NH；

每个R₂独立地表示卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基；且

n为0至4的整数。

在一个实施方式中，所述通式1中的X为CH。在一个实施方式中，所述通式1中的X为N。

在一个实施方式中，所述通式1中的Y为NH。在一个实施方式中，所述通式1中的Y为O。在一个实施方式中，所述通式1中的Y为S。

在一个实施方式中，所述通式1中的X为CH，Y为NH，则所述苯并杂环类化合物可称为吲哚类化合物。

在一个实施方式中，所述通式1中的X为N，Y为NH，则所述苯并杂环类化合物可称为苯并[d]咪唑类化合物。

在一个实施方式中，所述通式1中的R₁表示任选地被一个或多个、优选一个或两个选自卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基的取代基取代的5-10元杂芳基，所述杂芳基包含1至3个选自N、O和S的杂原子。

在一个实施方式中，所述通式1中的R₁表示任选地被一个或多个、优选一个或两个选自卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基的取代基取代的8-10元双环杂芳基，所述杂芳基包含1至3个选自N、O和S的杂原子。

在一个实施方式中，所述通式1中的R₁表示任选地被一个或多个、优选一个或两个选自卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基的取代基取代的噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、噻吩并吡嗪基、噻吩并哒嗪基、噻唑并吡啶基、异噻唑并吡啶基、呋喃并嘧啶基、呋喃并哒嗪基、三唑并吡啶基、咪唑并嘧啶基、咪唑并吡嗪基、咪唑并哒嗪基、吲嗪基、吲哚基、吲唑基、异吲唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹噁啉基、蝶啶基、噌啉基、喹唑啉基、中氮茚基等。

在一个实施方式中，所述通式1中的R₁选自以下基团：

在一些实施方式中，所述通式1中在适当的位置可以具有n个R₂，其中n为0、1、2、3或4。在一些实施方式中，所述通式1中在适当的位置可以具有n个R₂，其中n为0、1或2。

在一些实施方式中，所述通式1中的每个R₂独立地表示卤素、C_1-4烷基、卤代C_1-4烷基。

在一些实施方式中，所述通式1中的每个R₂独立地表示F、Cl、甲基、乙基、CF₃、CH₂F、CHF₂、CCl₃、CH₂Cl或CHCl₂。

在一些实施方式中，所述通式1中的每个R₂独立地表示F。

在一些实施方式中，在所述通式1中，X为CH或N；Y为NH；R₁表示任选地被一个或两个选自卤素或C_1-4烷基的取代基取代的8-10元双环杂芳基，所述杂芳基包含1至3个选自N、O和S的杂原子；每个R₂独立地表示卤素或C_1-4烷基；且n为0、1或2。

在一些实施方式中，在所述通式1中，X为CH或N；Y为NH；R₁表示任选地被一个或两个选自卤素或C_1-4烷基的取代基取代的三唑并吡啶基、萘啶基、喹啉基；每个R₂独立地表示F、Cl、甲基或乙基；且n为0、1或2。

在一些实施方式中，在所述通式1中，X为CH或N；Y为NH；R₁选自：

每个R₂独立地表示F；且n为0、1或2。

在一个实施方案中，本申请所述通式1的化合物选自：

在一个实施方式中，本申请所述通式1的化合物不为：

通式1的化合物含有不对称或手性中心，因此，存在不同的立体异构形式。通式1的所有立体结构体以及混合物，包括外消旋混合物，作为本申请的一部分。

在一个实施方式中，所述通式1的化合物或其立体异构体的药学上可接受的盐包括但不限于：醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。

通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的制备方法

本申请提供了合成通式1的化合物的一般合成路线，如下所示：

步骤1：使乙腈与六甲基二硅基氨基钾在适当的溶剂例如四氢呋喃(THF)中在适当的反应条件例如氮气保护、-78℃至室温例如-70℃的温度下反应适当的时间例如1小时，然后缓慢滴加化合物1溶液，体系温度缓慢升至室温反应适当时间例如16小时。将粗产物用硅胶柱色谱法进行纯化，得到化合物2。

步骤2：使化合物2与水合肼在适当的溶剂例如乙醇和水2:1的混合物中在适当的温度例如-80℃下反应适当的时间例如过夜反应。加水，有机溶剂萃取，有机相经洗涤、干燥、过滤、减压蒸馏后，进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物3。

步骤3：将化合物3溶于适当的有机溶剂例如N,N-二甲基甲酰胺中，在缩合剂例如2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、碱例如N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的存在下与酸4在适当条件下反应适当的时间，例如在室温下反应1小时。反应产物加水，有机溶剂萃取，有机相经洗涤、干燥、过滤、减压蒸馏后，进行硅胶柱色谱纯化，得到化合物5。

步骤4：使化合物5脱保护得到化合物6，例如可以在室温、酸性条件例如三氟乙酸下进行脱保护。

或者，从化合物3到化合物6也可以采取以下制备方法：

步骤5：对化合物3中的吡唑环上的1位N进行保护，得到化合物3a。例如，化合物3a中的保护基团可以为(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(SEM)，其可以通过在碱例如N,N-二异丙基乙胺的存在下与2-(三甲基甲硅烷基)乙氧甲基氯在适当的条件反应。

步骤6：使酸化合物4与草酰氯在适当的条件下反应形成酰氯化合物4a。

步骤7：将化合物3a与酰氯化合物4a在碱例如吡啶的存在下在适当的条件例如冰浴条件下反应适当的时间例如1小时。反应产物加冰水，有机溶剂萃取，有机相经洗涤、干燥、过滤、减压蒸馏后，通过制备型色谱版纯化，得到化合物5a。

步骤8：使化合物5a脱保护得到化合物6，例如可以在室温、酸性条件例如氯化氢的1,4-二氧六环溶液下进行脱保护。

步骤9：将化合物6溶于适当的有机溶剂例如N,N-二甲基甲酰胺中，在缩合剂例如2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、碱例如N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的存在下与酸化合物7在适当条件下反应适当的时间，例如在室温下反应1小时。反应产物加水，有机溶剂萃取，有机相经洗涤、干燥、过滤、减压蒸馏后，通过制备型HPLC色谱纯化，得到通式1的化合物。

本发明的通式1的化合物的立体异构体可通过以下方式获得：采用光学活性原料使其在不会引起外消旋化或差向异构化的条件下反应；或者使适当原料与“手性助剂”反应，所述手性助剂随后可以通过衍生化在适宜的阶段除去；或者将获得的外消旋混合物或其他混合物，基于它们不同的物理化学性质，采用众所周知的手段，例如，分步结晶或HPLC技术进行分离。也可以利用手性色谱柱分离获得对映异构体。

本申请的通式1的化合物或其立体异构体的药学上可接受的盐可通过本领域已知的方法使化合物或其立体异构体结构上的N原子与无机酸或有机酸形成。所述无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、半硫酸、硫酸、氢碘酸等。所述有机酸包括但不限于：醋酸、己二酸、藻酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、丁酸、柠檬酸、樟脑酸、樟脑磺酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、延胡索酸、葡庚酸、甘油磷酸、庚酸、己酸、2-羟基乙烷磺酸、乳酸、苹果酸、马来酸、甲磺酸、2-萘磺酸、烟酸、草酸、硫氰酸、甲苯磺酸和十一烷酸。

药物组合物

本申请还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，任选的一种或多种另外的治疗剂或预防剂，以及药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，所述通式1的化合物选自：

在一个实施方式中，所述另外的治疗剂或预防剂可以是如下文“另外的治疗剂或预防剂”部分中所述的任何一种或多种另外的治疗剂或预防剂。

在一个实施方式中，所述另外的治疗剂或预防剂可以选自干扰素、PEG化的干扰素或者核苷类似物中的至少一种。

在一个实施方式中，所述核苷类似物选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺。

在一个实施方式中，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请所述通式1的化合物(例如化合物CP9、CP15、CP38或其任意组合)、其立体异构体或其药学上可接受的盐和核苷类似物，以及药学上可接受的载体。

在一个实施方式中，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请所述通式1的化合物(例如化合物CP9、CP15、CP38或其任意组合)、其立体异构体或其药学上可接受的盐和核苷类似物，以及药学上可接受的载体，所述核苷类似物选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺。

在本申请的药物组合物中，所述通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐与另外的治疗剂或预防剂可以制成一种剂型，也可以分别制成独立的剂型，作为组合产品按顺序或同时施用。

在一个实施方式中，所述药物组合物可以通过选自以下的途径施用：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。在一个实施方式中，所述药物组合物通过口服施用。在一个实施方式中，所述药物组合物通过静脉内注射施用。

在一个实施方式中，所述药物组合物为口服制剂。在一个实施方式中，所述药物组合物为片剂或胶囊的形式。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物能够用于治疗或预防乙型肝炎。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物能够降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和/或HBeAg水平。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物能够同时降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和HBeAg水平。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物能够降低HBsAg水平和/或HBeAg水平。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物能够同时降低HBsAg水平和HBeAg水平。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物能够清除HBsAg和/或HBeAg。

在一个实施方式中，本申请的药物组合物能够同时清除HBsAg和HBeAg。

因此，本申请还提供了本申请所述药物组合物在制备用于治疗或预防乙型肝炎的药物中的用途。在一个实施方式中，本申请提供了本申请所述药物组合物在制备用于降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和/或HBeAg水平的药物中的用途。在一个实施方式中，本申请提供了本申请所述药物组合物在制备用于同时降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和HBeAg水平的药物中的用途。在一个实施方式中，本申请提供了本申请所述药物组合物在制备用于同时降低HBsAg水平和HBeAg水平的药物中的用途。在一个实施方式中，本发明提供了本申请所述药物组合物在制备用于清除HBsAg和/或HBeAg的药物中的用途。在一个实施方式中，本申请提供了本申请所述药物组合物在制备用于同时清除HBsAg和HBeAg的药物中的用途。

通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的用途

本申请提供了如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防乙型肝炎的药物中的用途。

在一些实施方式中，所述通式1的化合物选自：

在一个实施方式中，本申请提供了如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和/或HBeAg水平的药物中的用途。

在一个实施方式中，本申请提供了如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于同时降低乙型肝炎病毒(HBV)载量、HBsAg水平和HBeAg水平的药物中的用途。

在一个实施方式中，本申请提供了如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于降低HBsAg水平和/或HBeAg水平的药物中的用途。

在一个实施方式中，本申请提供了如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于同时降低HBsAg水平和HBeAg水平的药物中的用途。

在一个实施方式中，本申请提供了如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于清除HBsAg和/或HBeAg的药物中的用途。

在一个实施方式中，本申请提供了如上所定义的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备用于同时清除HBsAg和HBeAg的药物中的用途。

在一个实施方式中，所述药物还包含一种或多种另外的治疗剂或预防剂。所述一种或多种另外的治疗剂或预防剂可以是如下文“另外的治疗剂或预防剂”部分中所述的任何一种或多种另外的治疗剂或预防剂。

在一个实施方式中，所述另外的治疗剂或预防剂选自干扰素、PEG化的干扰素或者核苷类似物中的至少一种。

在一个实施方式中，所述药物通过选自以下的途径施用：口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。在一个实施方式中，所述药物通过口服施用。在一个实施方式中，所述药物通过静脉内注射施用。

在一个实施方式中，所述药物为口服制剂。在一个实施方式中，所述药物为片剂或胶囊的形式。

在本申请的药物中，所述通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐与另外的治疗剂或预防剂可以制成一种剂型，也可以分别制成独立的剂型，作为组合产品按顺序或同时施用。

乙型肝炎

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。

乙型病毒性肝炎的病原为乙型肝炎病毒，缩写为HBV，乙型肝炎病毒为DNA病毒。基因组是双链、环形、不完全闭合DNA。病毒最外层是病毒的外膜或称衣膜，其内层为核心部分，核蛋白即是核心抗原(HBcAg)，不能在血清中检出。HBsAg阳性者的血清在电子显微镜下可见3种颗粒：直径为22nm的圆形颗粒和丝状颗粒，还有较少的直径为42埃的球形颗粒，又称为Dane氏颗粒，是完整的HBV颗粒。

乙型肝炎的标志检测如下：①HBsAg与抗-HBs：HBsAg阳性表示HBV目前处于感染阶段，抗-HBs为免疫保护性抗体阳性示已产生对HBV的免疫力。慢性HBsAg携带者的诊断依据为无任何临床症状和体征、肝功能正常，HBsAg持续阳性6个月以上者。②HBeAg与抗-HBe：HBeAg阳性为HBV活跃复制及传染性强的指标，被检血清从HBeAg阳性转变为抗-HBe阳性表示疾病有缓解，感染性减弱。③HBcAg与抗-HBc：HBcAg阳性提示存在完整的HBV颗粒直接反应，HBV活跃复制由于检测方法复杂临床少用。抗-HBc为HBV感染的标志，抗-HBc IgM阳性提示处于感染早期，体内有病毒复制。在慢性轻度乙型肝炎和HBsAg携带者中HBsAg、HBeAg和抗-HBc三项均阳性具有高度传染性指标难以转阴。

另外的治疗剂或预防剂

在一个实施方式中，包含本申请所述的通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的药物或药物组合物还可以包含一种或多种另外的治疗剂或预防剂。

在一个实施方式中，所述另外的治疗剂或预防剂选自干扰素或者核苷类似物。

在一个实施方式中，所述另外的治疗剂或预防剂选自核苷类似物。

在一些实施方式中，所述另外的治疗剂或预防剂选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺中的一种或多种，例如选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺中的一种或选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺中的至少两种。

恩替卡韦(Entecavir，ETV)的化学名为2-氨基-1,9-二氢-9-[(1S,3R,4S)-4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊烷]-6H-嘌呤-6-酮，其结构式如下：

美国专利US5206244A公开了恩替卡韦及其治疗乙肝病毒的用途；WO9809964A1中公开了新的恩替卡韦合成方法；WO0164421A1公开了低剂量的恩替卡韦固体制剂。

恩替卡韦是一种高效的抗病毒剂，由美国施贵宝公司在20世纪90年代研发，具有较强的抗HBV作用。它能够通过磷酸化成为具有活性的三磷酸盐，三磷酸盐在细胞内的半衰期为15h。通过与HBV多聚酶的天然底物三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷竞争，恩替卡韦三磷酸盐能抑制病毒多聚酶(逆转录酶)的所有三种活性：(1)HBV多聚酶的启动；(2)前基因组mRNA逆转录负链的形成；(3)HBV DNA正链的合成。

富马酸替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir disoproxil fumarate，TDF)的化学名为(R)-[[2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]膦酸二异丙氧羰基甲酯富马酸盐，是替诺福韦的酯类前体，属于新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，具有抑制HBV病毒活性。

TDF是美国吉利德公司继阿德福韦酯后成功开发的另一个新型开环膦酸核苷类化合物，于2001年10月首次在美国上市，目前已经在欧洲、澳大利亚和加拿大等国家上市。

TDF在体内可通过竞争性地结合于天然脱氧核糖底物来抑制病毒聚合酶，并通过插入DNA中终止DNA链的合成。其主要作用机制为口服后水解为替诺福韦，替诺福韦被细胞激酶磷酸化，生成具有药理活性的代谢产物替诺福韦二磷酸，后者与5’-三磷酸脱氧腺苷酸竞争，参与病毒DNA的合成，进入病毒DNA后，由于缺乏3’-OH基团，导致DNA延长受阻，进而阻断病毒的复制。临床应用表明，TDF具有显著的抗HBV病毒疗效，并且毒副作用较小，因而具有较大的临床应用前景。

替诺福韦艾拉酚胺(Tenofovir Alafenamide)，是由美国吉利德科学公司开发的一种新核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)替诺福韦(Tenofovir)的前体药物。与上一代的抗乙肝类似药物替诺福韦二吡呋酯TDF相比，替诺福韦艾拉酚胺的抗病毒活性为其10倍，在血浆中的稳定性为其200倍，半衰期较其提高了225倍。与TDF相比，替诺福韦艾拉酚胺只需要十分之一的TDF给药剂量，即可实现与TDF相同的抗病毒疗效。因此替诺福韦艾拉酚胺用于乙型肝炎病毒(HBV)感染的预防或/和治疗，具有更好的疗效、更高的安全性和更低的耐药性。

给药途径

本申请的药物或药物组合物可以通过适合于待治疗病症的任何途径施用。合适的途径包括口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、阴道和肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外等途径。本领域技术人员将会理解，具体的给药途径可根据例如药物剂型、接受者的状况而变化。

在一个实施方式中，本申请的药物或药物组合物可以通过静脉内注射施用。

本申请的药物或药物组合物的一个优点在于，它们是口服生物可利用的并且可以口服施用。因此，在一个实施方式中，本申请的药物或药物组合物可以通过口服施用。在一个实施方式中，本申请的药物或药物组合物可以以片剂或胶囊的形式口服施用。

药物组合物或药物的制剂和配制

在某些实施方式中，以药物组合物的形式施用通式1的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐。本申请的药物组合物可以用常规载体和赋形剂(其将根据通常的实践选择)配制。片剂将含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，并且当用于通过非口服施用递送时，通常是等渗的。本申请的药物组合物或药物或其所有制剂将任选地含有赋形剂，例如“Handbook of Pharmaceutical Excipients”(1986)中所述的赋形剂。赋形剂包括抗坏血酸和其它抗氧化剂，螯合剂如EDTA，碳水化合物如葡聚糖，羟基烷基纤维素，羟基烷基甲基纤维素，硬脂酸等。制剂的pH范围为约3至约11，但通常为约7至10。在一些实施方式中，制剂的pH范围为约2至约5，但通常为约3至4。

制剂包括适用于前述给药途径的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)中找到。这样的方法包括使活性成分与由一种或多种辅助成分构成的载体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀地和紧密地结合在一起，然后根据需要使产品成形，来制备制剂。

适用于口服施用的本申请的制剂可以作为以下形式存在：各自含有预定量活性成分的离散单元，如胶囊剂或片剂；粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。

片剂通过任选地与一种或多种辅助成分一起压制或模制而制成。压制片剂可以通过以下来制备：在合适的机器中压制自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分，其任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物来制备。片剂可任选地包衣或刻痕，并任选地配制，以便自其提供活性成分的缓释或控释。

用于口服使用的制剂也可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合，或呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

本申请的药物组合物或药物也可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用上面提到的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液，或制备成冻干粉末。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌固定油通常可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸同样可用于制备注射剂。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和高渗氯化钠溶液。

定义

除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。

在本申请中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”表示“和/或”。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，根据下文的定义，“任选取代的烷基”是指“未取代的烷基”(未被取代基取代的烷基)或“取代的烷基”(被取代基取代的烷基)。

在本申请中，术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。

在本申请中，术语“烷基”意指仅由碳原子和氢原子组成、不含不饱和键且通过单键与分子的其余部分连接的直链或支链的基团。术语“C_1-4烷基”是指具有1至4个碳原子的烷基。C_1-4烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。

在本申请中，术语“卤代C_1-4烷基”是指被一个或多个卤素原子取代的C_1-4烷基，其中C_1-4烷基如上文所定义。卤代C_1-4烷基的实例包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、2,2-二氟乙基、氯甲基、2-氯乙基、二氯甲基、三氯甲基、1,2-二氯乙基、溴甲基、3-溴丙基、碘甲基等。

在本申请中，术语“5-10元杂芳基”意指环内具有1至4个选自氮、氧及硫的杂原子，以及至少一个芳香环的5元、6元、7元、8元、9元或10元环体系基团。5-10元杂芳基可以为单环或双环体系。5-10元杂芳基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。5-10元杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、噻吩并吡嗪基、噻吩并哒嗪基、噻唑并吡啶基、异噻唑并吡啶基、呋喃并嘧啶基、呋喃并哒嗪基、三唑并吡啶基、咪唑并嘧啶基、咪唑并吡嗪基、咪唑并哒嗪基、吲嗪基、吲哚基、吲唑基、异吲唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹噁啉基、蝶啶基、噌啉基、喹唑啉基、中氮茚基等。

在本申请中，术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。通式1的化合物含有不对称或手性中心，因此，存在不同的立体异构形式。通式1的所有立体结构体以及混合物，包括外消旋混合物，作为本申请的一部分。非对映体混合物能够分离成单独的非对映体，基于它们不同的物理化学性质，采用众所周知的手段，例如，对映异构体的拆分可通过与适当的光学活性物质反应转换为非对映异构体，将其分离并转化(例如水解)为相对应的单一的异构体。对映异构体也可利用手性色谱柱分离。

在本申请中，术语“药学可接受的”是指不影响本申请化合物的生物活性或性质的物质，并且相对无毒，即该物质可施用于个体而不会造成不良的生物反应或以不良方式与组合物中包含的任意组分相互作用。

在本申请中，术语“药学上可接受的盐”是指保留了本申请化合物的游离酸和游离碱的生物效力，并且在生物学或其它方面上没有不良作用的盐。

在本申请中，术语“治疗有效量”或“有效量”是指在该剂量下有效并且持续所需时间周期以实现期望的治疗结果的量。治疗有效量将取决于乙型肝炎或其症状的性质和严重程度、特定的治疗剂、接受者的总体状况(例如，身高、体重、年龄和身体状况)等因素，且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。

在本申请中，术语“治疗”可以是指，例如，减轻症状、延长存活、改善生活质量等。治疗不需要是“治愈”。治疗也可以是指功能性治愈和清除乙肝病毒。

在本申请中，术语“降低乙型肝炎病毒(HBV)载量”是指降低可检测到的患者血液中乙肝病毒DNA的量。

在本申请中，术语“降低HBsAg水平和/或HBeAg水平”是指降低可检测到的患者血液中乙肝病毒HBsAg和/或HBeAg的量。HBsAg和/或HBeAg的量通常与乙肝功能性治愈密切相关。

具体实施方式

以下实施例只是示例目的而非对本申请的限制。在阅读了下面的实施例之后，本申请的另外的目的、优势和新特征对本领域普通技术人员将变得显而易见。

实施例

实施例1：化合物CP15的制备

步骤1：

向乙腈(253.10mg，6.16mmol，1.5equiv)中加入四氢呋喃(15mL)，将体系的温度降至-70℃，在氮气保护下向体系中缓慢滴加六甲基二硅基氨基钾(0.9g，4.52mmol，1.1equiv)，-70℃℃反应1小时，将化合物1：1-(叔丁基)2-甲基(S)-哌啶-1,2-二羧酸酯(1g，4.11mmol，1.0equiv)溶于四氢呋喃(5mL)，缓慢滴加到反应体系中，体系温度缓慢升至室温反应16小时。加水终止反应后直接将溶剂蒸干，所得粗产物用硅胶柱色谱纯化，洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的比例为4/1，得到化合物2：(S)-2-(2-氰基乙酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(550mg，产率：55.04％)，为黄色油状物。

步骤2：

将化合物2：(S)-2-(2-氰基乙酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(550mg，2.18mmol，1.0equiv)溶于乙醇(4mL)和水(2mL)中，室温加入水合肼(163.68mg，3.27mmol，1.5equiv)，80℃过夜反应，加入水终止反应，水相用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥过滤后，减压蒸馏，所得粗产物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂二氯甲烷与甲醇的比例为10/1，得到化合物3：(S)-2-(3-氨基-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(400mg，产率：68.90％，LCMS纯度：100％)，为浅黄色固体。

LCMS条件：柱：Ascentis Express C18；长度：50mm，内径：3.0mm；流动相A：水/0.05％三氟乙酸；流动相B：乙腈/0.05％三氟乙酸；时间：2.00min；Rt:0.836min。

ESI-MS m/z:267.00[M+H]⁺。

步骤3：

将化合物3：(S)-2-(3-氨基-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(200mg，0.75mmol，1.0equiv)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，然后依次加入化合物4：4,6-二氟吲哚-2-羧酸(177.64mg，0.90mmol，1.2equiv)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(342.62mg，0.90mmol，1.2equiv)和N,N-二异丙基乙胺(291.15mg，2.25mmol，3.0equiv)。室温反应1小时，加水终止反应，水相用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压蒸馏，硅胶柱色谱纯化，洗脱剂石油醚与乙酸乙酯的比例为1/1，得到化合物5：(S)-2-(3-(4,6-二氟-1H-吲哚-2-甲酰氨基)-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(80mg，产率：23.92％，LCMS纯度：100％)，为亮黄色固体。

LCMS条件：柱：Ascentis Express C18；长度：50mm，内径：3.0mm；流动相A：水/0.05％三氟乙酸；流动相B：乙腈/0.05％三氟乙酸；时间：2.00min；Rt：1.187min。

ESI-MS m/z：446.05[M+H]⁺。

步骤4：

向化合物5：(S)-2-(3-(4,6-二氟-1H-吲哚-2-甲酰胺基)-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(90mg，0.20mmol，1.0equiv)的二氯甲烷(1.6mL)溶液中加入三氟乙酸(0.4mL)。室温反应1小时，LCMS监测反应完成。直接将溶剂蒸干得到化合物6：(S)-4,6-二氟-N-(5-(哌啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(69mg，产率：98.89％，LCMS纯度：98.73％)，为亮黄色固体。

LCMS条件：柱：Ascentis Express C18；长度：50mm，内径：3.0mm；流动相A：水/0.05％三氟乙酸；流动相B：乙腈/0.05％三氟乙酸；时间：2.00min；Rt：0.869min。

ESI-MS m/z：346.00[M+H]⁺。

步骤5：

将化合物6：(S)-4,6-二氟-N-(5-(哌啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(69mg，0.20mmol，1.0equiv)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，然后依次加入化合物7：[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-羧酸(39.11mg，0.24mmol，1.2equiv)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(91.16mg，0.24mmol，1.2equiv)和N,N-二异丙基乙胺(129.11mg，1.00mmol，5.0equiv)。室温反应1小时，用水终止反应，用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，高压液相制备得到目标化合物CP15：(S)-N-(5-(1-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-羰基)哌啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)-4,6-二氟-1H-吲哚-2-甲酰胺(12.8mg，产率：13.05％，LCMS纯度：99.88％)，为白色固体。

LCMS条件：柱：Luna Omega；长度：50mm，内径：3.0mm；流动相A：水/0.09％甲酸；流动相B：乙腈/0.1％甲酸；时间：2.00min；Rt：1.102min。

ESI-MS m/z:491.30[M+H]⁺。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.49(s,1H),12.08(s,1H),11.00(s,1H),9.21(s,1H),8.60(s,1H),7.94-7.97(m,1H),7.78(d,J＝9.2Hz,1H),7.61(s,1H),7.05–7.08(m,1H),6.92(t,J＝10.3Hz,1H),6.63(s,1H),2.95(br,1H),2.35-2.45(m,2H),2.15-2.30(m,1H),1.92(m,1H),1.45-1.75(m,4H)。

实施例2：化合物CP38的制备

步骤1：

向乙腈(0.76g，18.49mmol，1.5equiv)中加入四氢呋喃(30mL)，将体系的温度降至-70℃，在氮气保护下向体系中缓慢滴加六甲基二硅基氨基钾的四氢呋喃溶液(13.56mL，13.56mmol，1.1equiv)。-70℃反应1小时，将化合物1：1-(叔丁基)2-甲基(R)-哌啶-1,2-二羧酸酯(3g，12.33mmol，1.0equiv)溶于四氢呋喃(20mL)，缓慢滴加到反应体系中，体系温度缓慢升至室温反应16小时。加水终止反应后直接将溶剂蒸干，所得粗产物用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：石油醚与乙酸乙酯的比例为5/1)，得到化合物2：(R)-2-(2-氰基乙酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.6g，产率：51.43％)，为黄色油状物。

步骤2：

将化合物2：(R)-2-(2-氰基乙酰基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.6g，6.34mmol，1.0equiv)溶于乙醇(12mL)和水(6mL)中，室温加入水合肼(0.38g，7.61mmol，1.2equiv)，80℃反应7小时。加入水终止反应，水相用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压蒸馏，所得粗产物用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：二氯甲烷与甲醇的比例为12/1)，得到化合物3：(R)-2-(3-氨基-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.06g，产率：62.76％，LCMS纯度：100％)，为黄色固体。

LCMS条件：柱：HALO；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相A：水/0.05％三氟乙酸；流动相B：乙腈/0.05％三氟乙酸；时间：2.00min；Rt：0.894min。

ESI-MS m/z：267.30[M+H]⁺。

步骤3：

将化合物3：(R)-2-(3-氨基-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(150mg，0.56mmol，1.0equiv)溶于四氢呋喃(2mL)中，在冰浴条件下，缓慢加入N,N-二异丙基乙胺(109.18mg，0.85mmol，1.5equiv)，再向该体系中加入2-(三甲基甲硅烷基)乙氧甲基氯(103.28mg，0.62mmol，1.1equiv)，室温过夜反应。反应结束，加冰水终止反应，水相用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压蒸馏，所得的粗产物用硅胶板纯化(洗脱剂：二氯甲烷与甲醇的比例为20/1)，得到化合物4：(R)-2-(3-氨基-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(120mg，产率：48.50％，LCMS纯度：88.54％)，为棕色油状物。

LCMS条件：柱：HALO；长度：20mm，内径：3.0mm；流动相A：水/0.05％三氟乙酸；流动相B：乙腈/0.05％三氟乙酸；时间：2.00min；Rt：0.626min。

ESI-MS m/z：397.25[M+H]⁺。

步骤4：

将化合物8：5-氟吲哚-2-羧酸(50mg，0.28mmol，1.0equiv)溶于二氯甲烷(1mL)中，在冰浴条件下，向体系中依次滴加草酰氯(38.97mg，0.31mmol，1.1equiv)和N,N-二甲基甲酰胺(0.1mL)，反应30分钟。溶剂蒸干得到黄色油状化合物9：5-氟-1H-吲哚-2-羰基氯(55mg)，该化合物未经纯化直接用于下一步反应。

步骤5：

将化合物4：(R)-2-(3-氨基-1-((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(110.40mg，0.28mmol，1.0equiv)溶于二氯甲烷(2mL)中，在冰浴条件下，依次向该体系中滴加化合物9：5-氟-1H-吲哚-2-羰基氯(55mg，0.28mmol，1.0equiv)的二氯甲烷(0.5mL)溶液和吡啶(110.09mg，1.39mmol，5.0equiv)。反应1小时，加冰水终止反应，水相用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压蒸馏所得的粗产品用制备色谱板纯化(洗脱剂：石油醚与乙酸乙酯的比例为1/1)，得到浅黄色油状的化合物5：(R)-2-(3-(5-氟-1H-吲哚-2-甲酰氨基)-1-(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(60mg，产率：35.20％，LCMS纯度：91.07％)。

LCMS条件：柱：Ascentis Express C18；长度：50mm，内径：3.0mm；流动相A：水/0.05％三氟乙酸；流动相B：乙腈/0.05％三氟乙酸；时间：2.00min；Rt：1.402min。

ESI-MS m/z：580.10[M+Na]⁺。

步骤6：

向化合物5：(R)-2-(3-(5-氟-1H-吲哚-2-甲酰氨基)-1-(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(50mg，0.09mmol，1.0equiv)中加入氯化氢的1,4-二氧六环溶液(1.5mL)，室温反应1小时，LCMS监测反应完成，直接将溶剂蒸干，得到白色固体化合物6：(R)-5-氟-N-(5-(哌啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(40mg，产率：95.41％，LCMS纯度：74.29％)。

LCMS条件：柱：Kinetex EVO；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相A：水/6.5mM碳酸氢铵；流动相B：乙腈；时间：2.00min；Rt：0.921min。

ESI-MS m/z：328.00[M+H]⁺。

步骤7：

将化合物6：(R)-5-氟-N-(5-(哌啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(40mg，0.12mmol，1.0equiv)溶于N,N-二甲基甲酰胺(2mL)，然后依次加入化合物7：2-甲基-1,6-萘啶-3-甲酸(22.99mg，0.12mmol，1.0equiv)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(55.75mg，0.14mmol，1.2equiv)和N,N-二异丙基乙胺(78.96mg，0.61mmol，5.0equiv)。室温反应1小时，用水终止反应，用乙酸乙酯萃取3次，有机相用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏得粗品，高压液相制备得到目标化合物CP38：(R)-5-氟-N-(5-(1-(2-甲基-1,6-萘啶-3-羰基)哌啶-2-基)-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-2-甲酰胺(8.7mg，产率：13.36％，LCMS纯度：93.36％)，为浅黄色固体。

LCMS条件：柱：Kinetex EVO；长度：30mm，内径：3.0mm；流动相A：水/6.5mM碳酸氢铵；流动相B：乙腈；时间：3.00min；Rt：1.482min。

ESI-MS m/z:498.00[M+H]⁺。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.54(s,1H),11.80(s,1H),10.94(s,1H),9.40(s,1H),8.80-8.35(m,2H),7.88(d,J＝5.9Hz,1H),7.52-7.49(m,2H),7.09(t,J＝9.2Hz,1H),6.75-6.58(m,1H),6.04(br,1H),4.55-5.00(m,1H),3.00-3.20(m,1H),2.73(s,3H),2.30-2.42(m,1H),2.09-2.21(m,1H),1.89-1.99(m,1H),1.73(br,2H),1.53(br,2H)。

实施例3：应用HepG2.2.15细胞评价化合物CP9、CP15和CP38的体外抗HBV活性

材料

化合物CP15、CP38通过实施例1和2记载的方法制备得到；

化合物CP9购自天津药明康德新药开发有限公司，CAT#/ID：WXCD00160257_SE0026_SE1167，分子量：499.962；

恩替卡韦购自上海泰坦科技股份有限公司(批号：P1214012；99.0％纯度)；

细胞HepG2.2.15购自购自上海药明康德新药开发有限公司；

细胞传代培养基是含10％胎牛血清(FBS，ExCell货号FSP500)、500μg/ml G418、1％谷氨酰胺、1％NEAA(非必需氨基酸)、1mM丙酮酸钠、1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco，货号11960051)、主要用于细胞的传代培养。细胞铺板培养基是含2％胎牛血清(FBS，ExCell货号FSP500)、500μg/ml G418、1％谷氨酰胺、1％NEAA(非必需氨基酸)、1mM丙酮酸钠、1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco，货号11960051)，主要用于细胞的铺板和加药换液；

QIAamp 96DNA Blood Kit购自Qiagen(货号51162)；

HBsAg ELISA试剂盒购自安图生物(货号CL0310)；

HBeAg ELISA试剂盒购自安图生物(货号CL0312)；

CellTiter-Glo试剂盒购自Roche；

HBV病毒购自上海药明康德新药开发有限公司。

铺细胞和化合物处理

第0天，将在细胞铺板培养基中的HepG2.2.15铺种到96孔板中(6×10⁴个细胞/孔)。

第1天，加含化合物的培养基。受试化合物CP9、CP15和CP38用DMSO稀释3个单药浓度，对照化合物ETV共7个浓度，3倍稀释，三复孔(表1)。同时还设置了仅含DMSO不含化合物的DMSO对照。细胞在5％CO₂和37℃的条件下培养3天。

第4天，更换一次含化合物的新鲜细胞铺板培养基。

第7天，收集上清，将收集的细胞上清用ELISA法检测HBeAg和HBsAg，qPCR法检测HBV DNA水平。同时，CellTiter-Glo检测细胞活力，收集细胞冷冻保存(备用)。

表1.化合物测试浓度

样品检测

qPCR法检测细胞培养上清中HBV DNA的含量

参照QIAamp 96DNA Blood Kit说明书，提取细胞培养上清中的DNA。通过qPCR方法检测HBV DNA的含量。PCR反应：95℃，10min；95℃，15sec，60℃，1min，40个循环。

ELISA法检测细胞培养上清中HBeAg和HBsAg的含量

方法参照试剂盒说明书，简述如下：分别取50μl的标准品、样品和对照品加入到检测板中，然后每孔加入50μl酶结合物，37℃孵育60分钟，用洗液洗板后吸干，然后加入50μl预混发光底物，室温避光孵育10分钟，最后酶标仪测定发光值。

CellTiter-Glo细胞活力检测

参照CellTiter-Glo试剂盒说明书测定细胞活力，方法简述如下：收集细胞培养上清之后，每孔加入CellTiter-Glo(培养基1:1稀释)，室温孵育10分钟，酶标仪测定发光值。

数据计算

HBV DNA抑制率(％)＝(1-化合物组样品的HBV拷贝数/DMSO对照组的HBV拷贝数)×100％

HBsAg抑制率(％)＝(1-样品的HBsAg值/DMSO对照组HBsAg值)×100％

HBeAg抑制率(％)＝(1-样品的HBeAg值/DMSO对照组HBeAg值)×100％

细胞活力(％)＝((样品值–培养基对照组平均值)/(DMSO组平均值–培养基对照组平均值)×100％

应用GraphPad Prism软件(four parameter logistic equations)计算EC₅₀值。

数据分析

对照化合物ETV的结果如下表2所示：

表2

对照化合物ETV的结果表明该测试方法是有效的。此外，根据表2可知，ETV对于HBVDNA具有显著的抑制作用，但是对于HBeAg和HBsAg则无显著抑制作用。

受试化合物的结果如下表3所示：

表3

如表3和图1所示，本申请化合物CP15在1μM和10μM的浓度下的细胞活力甚至高于100％，即使是在20μM的浓度下细胞活力也高达80.3％，表明本申请化合物具有很高的细胞活力，具有毒副作用小、安全性高的潜能。

如表3和图2所示，10μM和20μM的CP15在HepG2-NTCP细胞中对HBV DNA的抑制率分别为16.6％和47.3％，表明本申请化合物对HBV DNA具有一定的抑制作用。

如表3和图3所示，10μM的CP15在HepG2.2.15细胞中对HBeAg的抑制率为37.4％，而20μM的CP15对HBeAg的抑制率则可达70.2％，表明本申请化合物对HBeAg具有明显的抑制作用，能够有效抑制HBeAg。

如表3和图4所示，1μM和10μM的CP15在HepG2.2.15细胞中对HBsAg的抑制率分别为36.7％和51.7％，而20μM的CP15对HBsAg的抑制率则高达92.6％，表明本申请化合物对HBsAg具有明显的抑制作用，能够有效抑制HBsAg，甚至能够完全清除HBsAg。

以上实验结果显示，本申请化合物具有较强的细胞活力和较小的细胞毒性，同时还能有效降低HBV病毒载量、HBsAg和HBeAg水平。可见，本申请化合物能够同时有效降低HBeAg和HBsAg水平，尤其是能够有效降低HBsAg水平，从而有望清除乙肝病毒，达到功能性治愈，避免长期或终身服药。同时也为本申请化合物与现有技术中能够降低HBV滴度但是不能降低HBsAg和HBeAg水平的乙肝药物进行联合用药从而从不同方面治疗乙肝打下了坚实的基础。

虽然已参照特定实施方式对本申请进行了说明，但本领域技术人员应认识到，在不偏离本申请主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本申请范围通过所附权利要求书限定。