CN116173225A

CN116173225A - 一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116173225A
Application number: CN202211624542.7A
Authority: CN
Inventors: 方杨武; 史宇升; 周超
Original assignee: Micro Nano Nucleic Acid Biomedicine Guangdong Co ltd
Current assignee: Micro Nano Nucleic Acid Biomedicine Guangdong Co ltd
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2023-05-30

Abstract

本发明涉及一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。该制备方法包括以下步骤：将核酸分子和外泌体混合，采用40kHz的超声处理，处理时间为30s‑240s，孵育，沉淀，得到外泌体药物递送系统。该制备方法通过特定的超声处理工艺，使该制备方法简单快速，对外泌体自身结构的影响及毒性作用小，装载的效率更高，便于后续对细胞的处理。

Description

一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用。

背景技术

外泌体是内源膜性纳米级囊泡，是天然良好的适合药物递送的载体，其可以携带多种类型的分子，包括小分子化合物、核酸和蛋白等。与病毒衍生载体相比，外泌体具有以下几个优点：获取来源广泛，无免疫反应的风险，可实现重复给药而不易发生耐受。

当前，最优选的药物递送系统是基于脂质体、白蛋白、聚合物胶束和纳米级聚合物-药物偶联物的纳米颗粒平台，由于外泌体正逐步发展为药物输送系统的潜在工具，因此需要完善核酸药物递送系统，从而达到外源调控基因的作用。然而，如何实现高效无外源物引入的装载药物仍然是一个令人关切的问题。基于EV的药物递送系统具有许多优点，例如高渗透性，较低的免疫原性和无细胞毒性，外泌体已被证明是用于输送各种货物的治疗性纳米载体，包括siRNA，miRNA，蛋白质和药物。

目前，使用外泌体作为药物递送载体的方法包括转染、电穿孔、超声处理和皂苷渗透等。然而这些方法都对细胞或外泌体均有影响，具体存在如下缺点：(1)转染试剂和电穿孔都对细胞有毒性作用；(2)普通超声处理和皂苷渗透则会改变外泌体形态，损伤其结构；(3)前期研究中采用电穿孔的方法进行装载，但其形成的外泌体聚集体降低了装载的效率。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种外泌体药物递送系统的制备方法，该制备方法通过特定的超声处理工艺，使该制备方法简单快速，对外泌体自身结构的影响及毒性作用小，装载的效率更高，便于后续对细胞的处理。

为了达到上述目的，本发明提供一种外泌体药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：将核酸分子和外泌体混合，采用40kHz的超声处理，处理时间为30s-240s，孵育，沉淀，得到外泌体药物递送系统。

本发明人在研究过程中发现，之所以外泌体作为药物递送系统的载体的应用受限，主要有以下几方面原因：(1)转染试剂由于脂质分子的免疫原性，大剂量使用会形成副作用，因此对细胞具有毒性作用；(2)电穿孔会在放电过程中形成电荷中和核酸质检的负电性，从而导致核酸分子的聚集无法实现向外泌体内部的装在，降低了装在的效率，且电穿孔对细胞也具有毒性作用；(3)常规的超声处理工艺会改变外泌体形态，损伤其结构；(4)皂苷渗透则会由于渗透压不稳定导致外泌体结构损伤。与上述常规方法相比，超声处理对外泌体的损伤更小且拥有更高的装在效率，同时考虑到常规的超声处理工艺改变外泌体形态的缺陷，本发明人提出通过上述特定的超声处理工艺来制备外泌体药物递送系统，过高的超声处理频率或过长的超声处理时间，容易造成外泌体损伤、结构不完整，因此，本发明人通过特定的超声处理频率和特定的超声处理时间，在核酸分子装载效率和外泌体结构完整之间寻找一个平衡点，使外泌体结构保持完整的同时，能够有效装载核酸分子。该制备方法与通过常规的超声处理工艺装载核酸分子相比，处理流程简单快速，且对外泌体自身结构的影响及毒性作用小，同时与常规超声处理工艺相比，该方法的装载效率更高，便于后续对细胞的处理。

在其中一个实施例中，所述处理时间为240s。

采用上述处理时间，超声处理后外泌体的装载效率较高，且外泌体结构保持完整。

在其中一个实施例中，所述孵育的温度为37℃。

在其中一个实施例中，所述孵育的时间为30min。

在特定的超声处理工序之后，外泌体膜的结构会变得松散，产生间隙，然后在孵育期间，核酸分子通过间隙进入外泌体，同时经过上述温度、时间的孵育之后，促进了间隙融合，加速了外泌体膜的运动修复，防止核酸的外溢，更好地留存核酸分子，促进装载效率的维持。

在其中一个实施例中，所述核酸分子的长度≤50nt。

在其中一个实施例中，所述核酸分子为siRNA。

在其中一个实施例中，所述核酸分子为STAT3 siRNA，序列如下所示：

正义链：5’-CCGTGGAACCATACACAAATT-3’(SEQ ID NO：1)；

反义链：5’-TTTGTGTATGGTTCCACGGTT-3’(SEQ ID NO：2)。

本发明还提供了所述制备方法得到的外泌体药物递送系统。

本发明还提供了所述外泌体药物递送系统在制备药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述应用包括：所述外泌体药物递送系统装载并递送抗肿瘤药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用，该制备方法通过特定的超声处理工艺，使该制备方法简单快速，对外泌体自身结构的影响及毒性作用小，装载的效率更高，便于后续对细胞的处理。

附图说明

图1为实施例中采用不同时间超声处理后外泌体形态的观察结果图；

图2为实施例中制备外泌体药物递送系统的流程示意图，其中50nt表示50个核苷酸碱基；

图3为实施例中装载前后siRNA的电泳图；

图4为实施例中qPCR检测STAT3 siRNA水平的结果图；

图5为实施例中WB检测STAT3蛋白表达水平的结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

来源：

HiScript III RT SuperMixforqPCR(+gDNAwiper)反转录试剂(诺唯赞公司)，ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix定量试剂(诺唯赞公司)，外泌露(微纳核酸生物医药(广东)有限公司)，超速离心管(Beckman,CAT#：326823)，超速离心管(Beckman,CAT#：344057)，透析膜(Millipore,CAT#:VSWP09025)。

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。

实施例

一种外泌体药物递送系统及其制备方法。

一、提取外泌体。

通过HEK293T细胞提取外泌体，具体操作如下：(1)收集HEK293T细胞培养上清，将获取的细胞培养上清经10,000g，4℃离心30min后收集上清。(2)将收集的上清转移到超速离心管(Beckman,CAT#：326823)内，100,000g离心(底部加200uL外泌露)，70min。(3)收集底部500μL液体，利用PBS稀释至5.5mL，转移到小的超速离心管(Beckman,CAT#：344057)，底部加500uL外泌露，100,000g离心70min后，弃掉最底部250uL液体，收集剩余200uL溶液。(4)通过透析膜(Millipore,CAT#:VSWP09025)，透析至1xPBS缓冲液中。收集到约200μL外泌体悬液，-80℃保存备用。

二、构建超声处理工艺。

超声处理外泌体并电镜检测：取10μg外泌体分为5组，每组2μg，加1xPBS稀释至50μl，在40kHz的超声条件下分别处理0、30s、60s、120s和240s。处理完对外泌体样品进行电镜观察。

观察结果如图1所示，可见通过频率为40kHz的超声处理后的外泌体，在不同处理时间段内，不超过240s的前提下，可以很明显地观察到外泌体结构保持完整。

三、制备外泌体药物递送系统。

超声处理、装载STAT3 siRNA，流程如图2所示：

设计合成STAT3 siRNA，具体序列如下所示：

正义链sense5’-CCGTGGAACCATACACAAATT-3’(SEQ ID NO：1)；

反义链antisense5’-TTTGTGTATGGTTCCACGGTT-3’(SEQ ID NO：2)。

上述正义链、反义链为RNA序列，其中T为WIPO Sequence序列表中的字母规范表示，为尿嘧啶U。

取1μg/μl浓度外泌体100μl，100μMsiRNA 10μl，总体积110μl，采用40kHz频率的超声处理240s，再37℃孵育30min。将外泌体沉淀下来后，通过10％浓度的PAGE胶检测上清中未装载的siRNA。沉淀外泌体使用PBS重悬成1μg/μl浓度保存备用。

检测结果：通过超声及恒温水浴孵育后对上清中残留的siRNA进行检测，可以观察到装载后的siRNA在上清中含量极低，而装载前还可以检测到siRNA条带，如图3所示。

四、细胞培养。

选择HCT116细胞进行培养，培养条件是DMEM+10％FBS+1％双抗，5％CO₂，37℃恒温培养。

五、细胞铺板。

按照六孔板每孔约5×10⁴个，根据细胞计数得到细胞浓度，用DMEM全培养液稀释至12mL，混匀，每孔加入2mL，37℃恒温培养1-2d。

六、细胞处理及样品收取。

采用本实施例步骤二中制备得到的装载有STAT3 siRNA的外泌体，使其终浓度为100ng/μl，与本实施例步骤四培养得到的细胞共孵育，37℃孵育24h后，收集细胞提取RNA和蛋白。检测STAT3的RNA表达和蛋白表达水平。使用未装载有siRNA的外泌体作为对照。

七、总RNA提取并反转成cDNA及qPCR定量检测。

使用TRIzol裂解液裂解细胞提取总RNA，定量后取1μg总RNA，使用HiScript IIIRT SuperMixforqPCR(+gDNA wiper)反转录试剂进行反转，并用ChamQ Universal SYBRQpcr Master Mix定量试剂进行stat3基因的定量检测。

检测结果如图4所示，将得到的装载有siRNA的外泌体处理细胞，就对目的基因的干扰效果进行检测，如图4所示，STAT3基因表达下调，通过对RNA水平的比较发现实现目的基因很好的干预。

八、蛋白提取及WB检测。

把RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂混合，提取各组细胞的蛋白质，BCA定量测定蛋白浓度。取蛋白样品20μl，加5μL 5x蛋白loading buffer混匀，95℃加热10min后，冰上冷却，利用10％的SDS-PAGE蛋白胶分离，将分离胶上的蛋白转印至PVDF膜，5％的脱脂牛奶封闭1h后，孵育GAPDH、STAT3抗体1h，再孵育辣根过氧化物酶标记的二抗1h，最后利用ECL化学发光底物反应，在Tanon凝胶成像仪中检测荧光信号。

检测结果如图5所示，将得到的装载有siRNA的外泌体处理细胞，就对目的基因的干扰效果进行检测，通过对蛋白表达水平的比较发现实现目的基因很好的干预。

九、外泌体纳米粒径分析。

取外泌体样品1μl，用PBS稀释1000倍后，利用1ml一次性注射器将稀释液体缓慢注入Nanosight仪器样品槽内，利用nanosight检测和分析软件统计样品内外泌体颗粒数和大小分布。

十、透射电镜鉴定外泌体形态。

取外泌体样品10μl，加10μl2.5％的戊二醛固定，使用1％的乙酸双氧铀复染后滴加到铜网上，在Hitachi H-7650透射电子显微镜下采集图片。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将核酸分子和外泌体混合，采用40kHz的超声处理，处理时间为30s-240s，孵育，沉淀，得到外泌体药物递送系统。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述处理时间为240s。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的时间为30min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸分子的长度≤50nt。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述核酸分子为siRNA。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述核酸分子为STAT3 siRNA，序列如下所示：

正义链：5’-CCGTGGAACCATACACAAATT-3’(SEQ ID NO：1)；

反义链：5’-TTTGTGTATGGTTCCACGGTT-3’(SEQ ID NO：2)。

8.权利要求1-7中任一项所述制备方法得到的外泌体药物递送系统。

9.权利要求8所述的外泌体药物递送系统在制备药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：所述外泌体药物递送系统装载并递送药物，所述药物包括抗肿瘤药物、抗感染药物、抗衰药物、免疫调节药物中的至少1种。