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CN116144709B - 一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型及其构建方法 - Google Patents

一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型及其构建方法 Download PDF

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CN116144709B CN202211065146.5A CN202211065146A CN116144709B CN 116144709 B CN116144709 B CN 116144709B CN 202211065146 A CN202211065146 A CN 202211065146A CN 116144709 B CN116144709 B CN 116144709B
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Abstract

本发明涉及基因工程小鼠模型技术领域，具体涉及一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型及其构建方法。构建方法包括以下依次进行的步骤：donor载体获取；gRNA的获取；获得可精准敲除Kdf1基因的条件性敲除小鼠模型。本技术方案解决利用现有技术的Kdf1基因功能缺陷小鼠模型难以实现Kdf1调控器官发育作用机制的精准研究的技术问题。本方案的小鼠模型，可以通过与多种组织来源的Cre小鼠交配传代，从而构建出可稳定传代的多种组织特异性敲除Kdf1基因的小鼠模型，避免因小鼠全身器官功能障碍所导致的胚胎致死，同时可以将牙胚上皮组织的Kdf1基因进行特异性敲除，为研究Kdf1基因的功能创造了条件。

Description

一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型及其构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程小鼠模型技术领域，具体涉及一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型及其构建方法。
背景技术
人类Kdf1基因(角质形成细胞分化因子1)于2013年发现，定位于人类染色体1p36.11，可编码有398个氨基酸的蛋白。小鼠Kdf1蛋白与人类Kdf1(C1orf172)蛋白具有90％的同源性，这为利用小鼠模型研究人类KDF1基因的功能奠定了极为有利的条件。尽管Kdf1基因在小鼠皮肤发育中的作用已初步确定，并已发现Kdf1蛋白特异性地表达在牙胚上皮中，几乎不表达在间充质，但关于Kdf1基因在与皮肤发育同源的牙齿及口腔粘膜上皮等部位中的发育作用尚不明确。迄今仅有3篇Kdf1基因突变与人类先天性缺牙的报道，Kdf1基因的功能及其致病性亟需进一步研究。
构建Kdf1基因缺陷小鼠模型是研究Kdf1基因的功能及其致病性的重要手段。2013年，Lee等人首次报道了Kdf1全身性功能缺陷的小鼠模型—shd小鼠，其技术手段为：利用N-乙基-N-亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea，ENU)全身性诱发Kdf1基因在第二内含子处出现T>G碱基颠换，导致Kdf1蛋白异构体1读码框改变出现氨基酸序列延长的移码突变，或导致Kdf1蛋白异构体2的框内缺失突变出现截短突变，进而影响小鼠Kdf1基因的功能。随后，该研究人员还利用基因诱捕技术将Kdf1(1810019J16Riktm1a(EUCOMM)Wtsi，Kdf1GT)导入小鼠胚胎干细胞,建立Kdf1基因碱基置换突变的Kdf1GT/GT小鼠，这一小鼠模型的全身表型与shd小鼠高度一致，也进一步互相印证了，两种小鼠发育缺陷均由Kdf1基因功能缺失所致。但是，上述研究中所构建的小鼠模型为全身性Kdf1基因功能缺陷，意味着小鼠的全身不同发育源性组织中所表达的Kdf1基因均丧失功能，因此，该种小鼠模型的全身组织器官障碍致围产期死亡。这种小鼠模型缺乏基因敲除的组织特异性，难以精准研究Kdf1基因在不同组织器官发育过程中的作用及机制。并且利用现有技术，如ENU等药物诱导而建立的基因突变小鼠模型或基于小鼠胚胎干细胞通过诱捕载体而建立的基因突变小鼠模型，存在基因突变点难预测、无法特异敲除特定来源细胞，敲除率低，敲除方法复杂等问题。亟需构建一种新型的Kdf1基因缺陷小鼠模型，以满足对Kdf1基因的调控牙胚和口腔上皮发育作用机制的精准研究的需求。
发明内容
本发明意在提供一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，以解决利用现有技术的Kdf1基因缺陷小鼠模型难以实现Kdf1调控牙胚和口腔上皮发育作用机制的精准研究的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，包括以下依次进行的步骤：
S1：donor载体获取：所述donor载体包括上游loxP位点和下游loxP位点；位于Kdf1基因的外显子2和外显子4位于上游loxP位点和下游loxP位点之间；
S2：gRNA的获取；
S3：获得Kdf1基因条件性敲除小鼠模型。
本方案还提供了按照一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法获得的基因型为Kdf1flox/flox的Kdf1基因条件性敲除小鼠模型。
本方案的原理及优点是：
本技术方案利用crisper-Cas9技术用于构建Kdf1基因的条件性敲除小鼠模型，通过在构建含有两个loxP位点donor载体，然后结合crisper-Cas9技术进行小鼠受精卵基因组的改造，获得含有可条件性敲除的目的基因的F0代小鼠，经过多代杂交和繁育，可以获得形状稳定的Kdf1flox/flox小鼠。当使用组织特异性Cre，如K14-Cre小鼠或Pitx2-Cre小鼠与Kdf1flox/flox小鼠交配，可以使其基因功能全面失活，达到稳定而高效的基因敲除效果。其中，Cre-loxP重组是现有技术的成熟技术，是一种特定位点的重组酶技术,可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位,用该系统可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激,对细胞中DNA进行修改。
综上，本技术方案的有益效果在于：
(1)本发明的Kdf1flox/flox小鼠模型，可以通过与多种组织来源的Cre重组酶小鼠交配，从而构建出多种组织特异性敲除Kdf1基因的小鼠，避免因小鼠全身器官功能障碍所导致的胚胎致死。另一方面，Kdf1基因仅表达在牙胚上皮等上皮组织中，特异性敲除牙胚上皮组织的Kdf1基因，有利于实现Kdf1基因调控牙胚和口腔上皮发育作用机制的精准研究。
(2)利用crisper-Cas9技术在构建和使用时非常简单、方便，而且成本较低，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合，避免了传统转基因导致的生物安全问题。在精确敲除动物基因组中的基因的基础上，以明确不同基因、分子的表达和互作情况，从而深入理解研究基因的功能及调控网络。
(3)Kdf1基因有四个外显子(exon 1-4)，五个转录本，发明人前期研究发现将Kdf1基因的第二外显子至第四外显子作为靶标片段，可以将Kdf1基因全部编码序列敲除，使其功能完全失活。在设计loxP位点时，loxP位点的插入应该避免影响目的基因的表达(同Cre工具鼠交配前)，并考虑到保证同Cre工具鼠交配后Kdf1基因完全失活，本方案选择将上游loxP插在exon 2上游的非保守位点,将下游loxP插在exon 4下游处的非保守位点，从而避免loxP的插入对目的基因表达的影响。
进一步，在S1中，所述donor载体包括位于Kdf1基因的外显子2的上游839-873bp的上游loxP位点和位于Kdf1基因的外显子4的下游560-594bp的下游loxP位点。
在设计loxP位点时，loxP位点的插入应该避免影响目的基因的表达(同Cre工具鼠交配前)，并考虑到保证同Cre工具鼠交配后Kdf1基因完全失活，本方案选择将上游loxP插在exon 2上游839-873bp处的非保守位点,将下游loxP插在exon 4下游560-594bp处的非保守位点，从而避免loxP的插入对目的基因表达的影响。在本技术方案中，敲除exon2-4是最优选择，能影响全部转录本(五个转录本全部受到影响)。并且，只有将loxp插入这两个特定的非保守位点，才能实现exon2-4的全部敲除，且不会影响条件性敲除前基因的功能，以及不会影响正确剪切和小鼠存活率。
进一步，在S1中，所述donor载体包括从5’端到3’端依次设置的序列如SEQ IDNO.2所示的5’同源臂区、序列如SEQ ID NO.4所示的上游loxP位点、序列如SEQ ID NO.1所示的选择性敲除去、序列如SEQ ID NO.4所示的下游loxP位点以及序列如SEQ ID NO.3所示的3’同源臂区。
采用上述技术方案，donor载体的设计还可以避免arm及cKO包含同gRNA完全匹配的序列，以避免gRNA对donor载体或同源重组修复位点可能产生的脱靶问题。上述设计也同时避免loxP位点的插入应该避免影响目的基因的表达。
进一步，在S2中，所述gRNA包括基因序列如SEQ ID NO.5所示的gRNA1、基因序列如SEQ ID NO.6所示的gRNA2、基因序列如SEQ ID NO.7所示的gRNA3以及基因序列如SEQ IDNO.8所示的gRNA4。
进一步，在S2中，所述gRNA由基因序列如SEQ ID NO.5所示的gRNA1和基因序列如SEQ ID NO.6所示的gRNA2组成。经过脱靶分析，gRNA1和gRNA2为最优gRNA。
进一步，所述S3包括显微注射步骤、阳性F0小鼠的获取步骤、F1代小鼠的获取步骤以及F2代小鼠的获取步骤；在显微注射步骤中，将Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到小鼠受精卵中；将显微注射后的受精卵送回到代孕小鼠输卵管中；小鼠出生后经鉴定筛选，获得阳性F0鼠。通过显微注射的方式将外源基因转入受精卵中，获得转基因小鼠。
进一步，在阳性F0小鼠的获取步骤中，将显微注射后的受精卵送回到代孕小鼠输卵管中；小鼠出生后经PCR和测序鉴定筛选，获得阳性F0鼠。在显微注射过程中，前后总计注射550枚受精卵并送回到代孕母鼠输卵管中，总计出生64只F0鼠，出生率为12％，5只定点阳性F0鼠，阳性率为7.8％，存活率100％。
进一步，在F1代小鼠的获取步骤中，性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，用PCR法筛选出基因型为Kdf1flox/+的F1代小鼠。通过杂交，获得遗传稳定的转基因小鼠后代。
进一步，在F2代小鼠的获取步骤中，将基因型为Kdf1flox/+的F1代小鼠近交繁育一代，用PCR法筛选出基因型为Kdf1flox/flox的F2代小鼠。通过近交获得纯合子F2代小鼠，可供后续的条件性基因迁出实验。
附图说明
图1为本发明实施例1的donor载体的序列(第一部分)。
图2为本发明实施例1的donor载体的序列(第二部分)。
图3为本发明实施例1的donor载体的序列(第三部分)。
图4为本发明实施例1的donor载体的序列(第四部分)。
图5为本发明实施例1的donor载体的序列(第五部分)。
图6为本发明实施例1的donor载体、Kdf1基因的野生型等位基因、含有cKO的突变型等位基因、Cre重组后的突变型等位基因的结构示意图。
图7为本发明实施例1的gRNA1的染色体定位分析。
图8为本发明实施例1的gRNA2的染色体定位分析。
图9为本发明实施例1的gRNA3的染色体定位分析。
图10为本发明实施例1的gRNA4的染色体定位分析。
图11为本发明实施例1的gRNA1的脱靶分析。
图12为本发明实施例1的gRNA2的脱靶分析。
图13为本发明实施例1的gRNA3的脱靶分析。
图14为本发明实施例1的gRNA4的脱靶分析。
图15为本发明实施例2的RCR以及测序引物结合位点的示意图(F1代)。
图16为本发明实施例2的RCR验证的电泳图(PCR引物对1)。
图17为本发明实施例2的RCR验证的电泳图(PCR引物对2)。
图18为本发明实施例2的测序结果图(F1代)。
图19为本发明实施例2的RCR引物结合位点的示意图(F0代第一次鉴定)。
图20为本发明实施例2的第一次鉴定电泳图(引物F5R4)。
图21为本发明实施例2的第一次鉴定电泳图(引物F2R3)。
图22为本发明实施例2的第二次鉴定电泳图(引物F1R1)。
图23为本发明实施例2的第二次鉴定电泳图(引物F2R2)。
图24为本发明实施例2的F2代鉴定电泳图。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段：所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。实验例中小鼠基因组提取使用TaKaRa试剂盒(TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit)，并取鼠尾进行基因组提取。
实施例1：载体和gRNA(guide-RNA)设计和构建
Kdf1基因的接收号为NM_001083916.1，Kdf1flox/flox小鼠模型的构建过程包括以下步骤：
本步骤主要包括设计gRNA序列和打靶载体方案；利用In-Fusion技术构建包括loxP位点的donor载体(打靶载体)，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证。
donor载体的序列参见图1-图5，donor载体包括5’同源臂区(5’arm)、上游loxP位点、选择性敲除去(cKO)、下游loxP位点、以及3’同源臂区(3’arm)。图1-图5中的浅色部分为cKO区域(SEQ ID NO.1)，浅色区域中的单下划线部分为外显子(依照从前到后的顺序依次为exon 2-4)；图中深色部分的波浪线标记的区域为5’arm(SEQ ID NO.2)和3’arm(SEQ IDNO.3)，双下划线标记的区域为两个loxP位点(SEQ ID NO.4)。Kdf1基因有四个外显子(exon1-4)，五个转录本，发明人前期研究发现将Kdf1基因的第二外显子至第四外显子作为靶标片段，可以将Kdf1基因全部编码序列敲除，使其功能完全失活。在设计loxP位点时，loxP位点的插入应该避免影响目的基因的表达(同Cre工具鼠交配前)，并考虑到保证同Cre工具鼠交配后Kdf1基因完全失活，本方案选择将上游loxP插在exon 2上游839-873bp处的非保守位点,将下游loxP插在exon 4下游560-594bp处的非保守位点，从而避免loxP的插入对目的基因表达的影响(参见图6以及图1-5)。在本技术方案中，敲除exon2-4是最优选择，若只敲除exon 2或exon 2和3，仍残留部分基因编码区，无法实现Kdf1基因功能全面失活。并且，只有将loxp插入这两个特定的非保守位点，才能实现exon2-4的全部敲除，且不会影响条件性敲除前基因的功能，以及不会影响正确剪切和小鼠存活率。loxp插入位点的寻找还需要考虑到gRNA脱靶评分，即需要根据gRNA设计的具体情况考虑loxp插入位点的确认。上述的donor载体的设计还可以避免arm及cKO包含同gRNA完全匹配的序列，以避免gRNA对donor载体或同源重组修复位点可能产生的脱靶问题。发明人曾经尝试过其他的loxp插入位点，均不能满足上述要求，会带来定点阳性F0鼠出生率、阳性率为和存活率远低于实施例2，以及定点阳性F0鼠的生长状态不理想等的实验结果。仅有上述的exon 2上游839-873bp处的非保守位点和exon 4下游560-594bp处的非保守位点，才能满足本技术方案的需求。所以loxp插入位点的确认是通过大量实验研究的结果，在实际进行实验之前是难以评估loxp插入位点选择的效果的。
gRNA靶标序列：
gRNA1(与基因的反义链配对)：5’-GGACGCCTCGTCTGCTCATAGGG-3’，(SEQ ID NO.5，位于chr4:133527089-133527111，图7，参考数据库：Mus musculus GRCm38/mm10)；
gRNA2(与基因的正义链配对)：5’-CTGCTGTATTATCCGGGTCTAGG-3’，(SEQ ID NO.6，位于chr4:133531335-133531357，图8)。
在选择gRNA靶标序列过程中，发明人尝试了多种靶标序列，还包括如下的两种序列：
gRNA3(与基因的正义链配对)：5’-GAGTGCCCTATGAGCAGACGAGG-3’，(SEQ ID NO.7，位于chr4:133527084-133527106，图9)；
gRNA4(与基因的正义链配对)：5’-TGGGTGCTGCTGTATTATCCGGG-3’，(SEQ ID NO.8，位于chr4:133531329-133531351，图10)。
gRNA1-4的脱靶分析结果参见图11-图14，gRNA1和gRNA2为最优的gRNA。
实施例2：显微注射及F0鼠的鉴定、F1代小鼠培育和筛选
本步骤主要包括将Donor载体、gRNA(gRNA1和gRNA2)和Cas9蛋白(购自NewEngland Biolabs公司，货号M0646M)通过现有技术的常规手段共注射到受精卵。更具体地，配制管1溶液(获得gRNA和Cas9蛋白的混合物)：在5.2uL RNase-free水中加入0.8uL100pmol/uL的CrRNA(0.4ul+0.4ul)，再加入0.6uL 100pmol/uL的TracRNA混匀孵育5min，之后再加入0.2uL Cas9蛋白(NEB，货号：M0646M)混匀孵育10min得到管1溶液(形成gRNA1和gRNA2)；配制管2溶液：终浓度为15ng/uL的Donor质粒；将管1溶液和管2溶液等体积混合得到RNP注射复合物，注射小鼠受精卵。其中，crRNA即CRISPR RNA，而tracrRNA(trans-activating crRNA)即反式激活crRNA；在CRISPR/Cas9系统中,crRNA会与tracrRNA结合形成gRNA(guide RNA),然后Cas9蛋白在gRNA的协助下精准定位到靶位点，最终完成DNA双链的精准编辑。tracrRNA和crRNA均可通过现有技术常规手段，在gRNA靶标序列确认之后设计获得，可通过商业化手段委托相关生物技术公司合成。将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠。
将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，用PCR实验方法筛选出基因型为Kdf1flox/+的F1代小鼠，引物序列为：
PCR引物对1：
5’arm正向引物(F1)：5’-TCCTATTGACCTGCCCCTTAGCG-3’；
3’loxP反向引物(R1)：5’-GTGGATTCGGACCAGTCTGA-3’；
PCR引物对2：
5’loxP正向引物(F2)：5’-GTGCCCTATGAGCAGACATAACT-3’；
3’arm反向引物(R2)：5’-AGACTGCCCTGCCCACTTGC-3’。
PCR引物对1和PCR引物对2的扩增位点示意图参见图15。扩增后的电泳结果参见图16和图17。在构建得到F1代flox杂合鼠后，使用F1R1、F2R2引物进行验证，引物对能覆盖整个区域，可以鉴定出来是不是正确完全重组了(存在如下可能：完全正确重组，没有形成重组、形成重组但不完全)。除此之外，也进行了测序(F1代测序结果参见图18)和southern验证，进一步确定目的序列完全正确重组。上述实验结果已经验证小鼠构建成功，但是如果后续繁殖还是完全按照这个流程去验证，过程非常麻烦。所以后续采用更为简便的验证和鉴定方，只需要验证局部，即可确认是否存在目的序列(详见后文)。
同时进行测序验证，测序引物包括：
5’测序引物(F3)：5’-CTCCTCTGACCTCCGTGGGC-3’；
3’测序引物(F4)：5’-AGCCTCATGTTTAAAGACTTCCCT-3’。
典型测序结果参见图14，测序结果和电泳结果说明含有cKO的突变型等位基因构建成功。
在显微注射过程中，前后总计注射550枚受精卵并送回到代孕母鼠输卵管中，总计出生64只F0鼠，出生率为12％，5只定点阳性F0鼠，阳性率为7.8％，存活率100％。其中，对于F0小鼠进行了两次鉴定。一次鉴定的扩增位点示意图参见图19，二次鉴定的扩增位点示意图参见图15(引物同前的F1鉴定，为F1R1、F2R2引物)。阳性F0小鼠可成功与野生型小鼠配繁，获得子代基因型为Kdf1flox/+的F1代小鼠。一次鉴定的使用的引物对为F2和R3(扩增目标等位基因336bp)以及F5和R4(见后文，扩增目标等位基因216bp，野生型等位基因142bp)。
反向引物(R3)：5’-CTGGCTGGCTCAGCAATTAAGAAT-3’。
F0一次鉴定结果(引物F5R4)见图20；F0一次鉴定结果(引物F2R3)见图21(共测试44个样本，此处选择部分样本电泳图作为示例)。F0二次鉴定结果(引物F1R1)见图22；F0一次鉴定结果(引物F2R2)见图23(选取42/14/21/23/44/2/3/4号样本)。
将F1代小鼠继续配繁一代(近交)，PCR实验方法筛选出基因型为Kdf1flox/flox的F2代小鼠，引物序列为：
5’正向引物(F5):5’-AGTTTCCTAATGGACACTACAGGAC-3’；
3’反向引物(R4):5’-CATGCTAGGCAGCACTATGGAC-3’。
电泳结果显示，Kdf1flox/flox为一条216bp的电泳条带；Kdf1flox/+为216bp和142bp的两条条带；Kdf1+/+为一条142bp的电泳条带。F2鉴定结果参见图24。
上述方案利用crisper-Cas9技术用于构建Kdf1基因的条件性敲除小鼠模型时，会敲除小鼠模型Kdf1基因全部编码区外显子，使其基因功能全面失活，达到稳定而高效的基因敲除效果。与传统方法相比，构建过程化繁为简，且成本较低，周期短，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合，避免了传统转基因导致的生物安全问题。当使用组织特异性Cre，如K14-Cre小鼠或Pitx2-Cre小鼠与Kdf1flox/flox小鼠交配产生的条件性基因敲除小鼠具有组织特异性敲除，有利于实现Kdf1基因调控牙胚和口腔上皮发育作用机制的精准研究。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (6)

1.一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：
S1：donor载体获取：所述donor载体包括上游loxP位点和下游loxP位点；Kdf1基因的外显子2和外显子4位于上游loxP位点和下游loxP位点之间；
所述donor载体包括从5’端到3’端依次设置的序列如SEQ ID NO.2所示的5’同源臂区、序列如SEQ ID NO.4所示的上游loxP位点、序列如SEQ ID NO.1所示的选择性敲除区、序列如SEQ ID NO.4所示的下游loxP位点以及序列如SEQ ID NO.3所示的3’同源臂区；
S2：gRNA的获取；所述gRNA由基因序列如SEQ ID NO.5所示的gRNA1和基因序列如SEQID NO.6所示的gRNA2组成；
S3：获得Kdf1基因条件性敲除小鼠模型。
2. 根据权利要求1所述的一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，在S2中，所述gRNA还包括基因序列如SEQ ID NO.7所示的gRNA3以及基因序列如SEQ IDNO.8所示的gRNA4。
3.根据权利要求1所述的一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述S3包括显微注射步骤、阳性F0小鼠的获取步骤、F1代小鼠的获取步骤以及F2代小鼠的获取步骤；在显微注射步骤中，将Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到小鼠受精卵中。
4.根据权利要求3所述的一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，在阳性F0小鼠的获取步骤中，将显微注射后的受精卵送回到代孕小鼠输卵管中；小鼠出生后经PCR和测序鉴定筛选，获得阳性F0鼠。
5.根据权利要求4所述的一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，在F1代小鼠的获取步骤中，性成熟的阳性F0鼠与野生型鼠配繁一代，用PCR法筛选出基因型为Kdf1 flox/+的F1代小鼠。
6.根据权利要求5所述的一种Kdf1基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，在F2代小鼠的获取步骤中，将基因型为Kdf1 flox/+的F1代小鼠近交繁育一代，用PCR法筛选出基因型为Kdf1 flox/flox的F2代小鼠。
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Enamel Structure Defects in Kdf1 Missense Mutation Knock-in Mice. Biomedicines;Li P等;Biomedicines;20230207;第11卷(第2期);第482页 *

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