CN116143900B - 一种重组鸽干扰素α及其表达工程菌株与制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种重组鸽干扰素α及其表达工程菌株与制备方法，涉及生物领域，通过将优化后的鸽干扰素α基因定向克隆至真核表达质粒pPIC9K中构建重组真核表达质粒转化至毕赤酵母X‑33感受态细胞中筛选表达工程菌株，对表达工程菌株进行甲醇诱导、上清收集、亲和层析纯化后获得重组鸽干扰素α。该重组鸽干扰素α产量达到45mg/L，抗病毒活性为3.16×106U/mL，比活性为6.77×106U/mg，其可刺激细胞提高ISG15、OAS、PKR、Mx基因的转录水平，具有显著的生物学活性，能提升鸽群天然免疫力和增强鸽群抗病能力。本发明的制备方法操作简单，成本低，适用于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组鸽干扰素α及其表达工程菌株与制备方法。
背景技术
鸽已成为继鸡、鸭、鹅之后的第四大家禽，其养殖规模不断扩大，处于快速发展阶段。当前鸽传染病(如鸽瘟、鸽痘、鸽毛滴虫感染、鸽白色念珠菌感染)对鸽养殖带来巨大影响，严重危害鸽产业健康发展。我国鸽专用兽药品种较少，仅有针对细菌等的抗生素药物(国家兽药基础数据库)。与此同时，非专属兽药在鸽上使用不符合法律规范，且存在风险。因此，开展鸽专用免疫防控产品(疫苗、诊断试剂、药物、益生菌等)研发对保障鸽产业健康和可持续发展具有重要意义。
干扰素(Interferon，IFN)是一类具有抗病毒活性、调节免疫、抗肿瘤等多种生理活性的糖蛋白。根据IFN结合宿主细胞表面受体的不同，可分为I型(IFN-α、IFN-β)、II型(IFN-γ)、III型(IFN-λ)。IFN与细胞表面特异性受体结合后会引发级联反应(如JAK-STAT通路)，触发核内抗病毒相关基因(如PKR、IRF7、ISG15、Mx1、OAS等)的转录与翻译。不同型IFN已在动物疫病防治中发挥重要作用。例如，董世娟等人报道重组猪IFN-α可抑制PRRSV在体内外的复制(董世娟.重组猪α干扰素制备与冻干工艺及体内外抗PRRSV复制作用[D].南京农业大学,2018.)；侯凤香等人报道重组鸡IFN-α可抑制NDV、AIV在鸡胚成纤维细胞的增殖，且对H9N2亚型禽流感灭活疫苗具有免疫增强作用(侯凤香.重组鸡α干扰素结构与功能及其抗病毒活性的研究[D].南京农业大学,2009.)；王晶宇等人研制的重组犬IFN-α4和IFN-α2具有较高活性，分别达到1.19×l05U/mL和1.70×106U/mL(王晶宇.犬干扰素α4、α2基因的表达及抗病毒活性分析[D].南京农业大学,2017.)。
目前，关于利用基因工程技术制备鸽干扰素主要集中在重组鸽干扰素α(IFN-α)，李思文等报道用大肠杆菌表达的重组鸽IFN-α具有较好的生物活性，且对VSV的抑制率强于鸡IFN-α(李思文.p53对重组鸽α干扰素抗病毒作用的影响[D].东北林业大学,2018.)。然而，大肠杆菌表达系统制备的重组蛋白存在内毒素残留、包涵体变性复性损失、纯化步骤繁琐、蛋白修饰水平低等缺点。
毕赤酵母表达系统是最简单和最可靠的外源基因表达系统，在很多外源蛋白的工业化生产中已经取代了传统的大肠杆菌表达系统和酿酒酵母表达系统。毕赤酵母表达系统的优势：含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能(罗士强.毕赤酵母表达的RBD蛋白的免疫原性受其N-糖基化修饰的影响[D].安徽大学,2021)。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组鸽干扰素α及其表达工程菌株与制备方法，以解决现有技术存在的问题。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种重组鸽干扰素α，通过切除鸽干扰素α基因序列中的信号肽并进行毕赤酵母密码子优化与人工合成，将优化后的鸽干扰素α基因定向克隆至真核表达质粒pPIC9K中构建重组真核表达质粒，将重组真核表达质粒转化至毕赤酵母X-33感受态细胞中筛选表达工程菌株，对该表达工程菌株进行甲醇诱导、上清收集、亲和层析纯化后获得重组鸽干扰素α。
作为优选的实施方式，优化后的鸽干扰素α基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明的一种重组鸽干扰素α的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、鸽干扰素α基因的优化与人工合成；
步骤二、重组真核表达质粒的构建与鉴定；
步骤三、重组鸽干扰素α的表达工程菌株的构建；
步骤四、重组鸽干扰素α的制备。
作为优选的实施方式，步骤一的具体操作步骤如下：
根据鸽干扰素α基因序列信息，切除序列中信号肽，在其序列末端添加6个组氨酸，并针对毕赤酵母细胞进行密码子优化，最后在其序列两端分别引入限制性内切酶位点EcoRI和NotI；优化后的鸽干扰素α基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQID NO:2。
作为优选的实施方式，步骤二的具体操作步骤如下：
将优化后的鸽干扰素α基因与pPIC9K载体分别经限制性内切酶EcoR I和Not I消化后，经琼脂糖凝胶电泳回收，目的片段用T4连接酶连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂板过夜培养，次日挑取单菌落，将测序正确的重组真核表达质粒命名为pPIC9K-pigeonIFNα，-20℃保存备用。
作为优选的实施方式，步骤三的具体操作步骤如下：
用限制性内切酶Sal I将重组真核表达质粒pPIC9K-pigeonIFNα线性化，加入至毕赤酵母X-33感受态细胞中混匀后转移至预冷电转杯，冰浴后转移至电转仪进行电转化，电转化后立刻加入预冷的山梨醇，吸打后转移至离心管，30℃培养箱中静置培养，室温下离心，收集菌体并用YPG培养基重悬，涂布至含有博莱霉素的YPG固体培养基上，37℃培养3天，挑取单菌落进行PCR鉴定，鉴定正确后获得重组鸽干扰素α的表达工程菌株，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
作为优选的实施方式，步骤三中，所述博莱霉素的浓度为100μg/mL。
作为优选的实施方式，步骤三中，所述电转仪的电转化参数为：电压1.5kV，电阻250Ω，电容25μF。
作为优选的实施方式，步骤四的具体操作步骤如下：
将重组鸽干扰素α的表达工程菌株接种至YPG培养液中复壮，次日接种至含有YPG培养液的摇瓶中，28℃、200r/min培养过夜，离心收集菌体，用等体积的BMMY液体培养基重悬，28℃、200r/min诱导120小时，且每间隔24小时补加终浓度0.5％的甲醇，收集上清液，利用亲和层析柱从收集的上清液中纯化获得重组鸽干扰素α；采用SDS-PAGE法与Westernblot法分析重组鸽干扰素α的分子量大小及纯度。
本发明的一种表达工程菌株，该表达工程菌株用于表达所述的一种重组鸽干扰素α。
本发明的有益效果是：
本发明研制了一种高效、稳定、糖基化程度高的重组鸽干扰素α，该重组鸽干扰素α是通过毕赤酵母表达系统制备而成，其产量达到45mg/L，抗病毒活性为3.16×106U/mL，重组鸽干扰素α可刺激细胞提高ISG15、OAS、PKR、Mx基因的转录水平，具有显著的生物学活性，可用于提升鸽群天然免疫力和增强鸽群抗病能力。其优点如下：
1、本发明的一种重组鸽干扰素α的抗病毒活性(抗病毒活性为3.16×106U/mL，比活性为6.77×106U/mg)显著高于已报道的数值(5.5×105U/mg)，是目前报道活性最高的重组鸽干扰素α。
2、本发明的一种重组鸽干扰素α的表达工程菌株是采用毕赤酵母表达系统构建的，该策略属首次公开。
3、本发明的一种重组鸽干扰素α的制备方法，操作简易、成本不高，能够保证重组鸽干扰素α的产量、活性、安全性和生产实用性，适用于大规模生产。
附图说明
图1为重组真核表达质粒pPIC9K-pigeonIFNα的图谱。
图2为重组鸽干扰素α的表达工程菌株的PCR鉴定结果。
图3为重组鸽干扰素α的Westernblot鉴定结果。
图4为重组鸽干扰素α接种DF-1细胞后细胞内ISG15、OAS、PKR、Mx基因的转录水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1鸽干扰素α基因优化与人工合成
根据鸽干扰素α(IFN-α)基因(GenBank登录号：MG833835.1)序列信息，切除序列中信号肽(第1-30位氨基酸)，在其序列末端添加6个组氨酸(His)，并针对毕赤酵母细胞进行密码子优化，最后在其序列两端分别引入限制性内切酶位点EcoR I和Not I，优化后的鸽干扰素α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行人工合成。
实施例2重组真核表达质粒的构建与鉴定
将实施例1经过人工合成的鸽干扰素α基因与pPIC9K载体(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)分别经限制性内切酶EcoR I和限制性内切酶Not I(EcoR I和Not I均购自宝日医生物技术(北京)有限公司)消化后，经1％琼脂糖凝胶电泳回收，目的片段用T4连接酶(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)中，涂板过夜培养，次日挑取单菌落，经测序将鉴定正确的重组真核表达质粒命名为pPIC9K-pigeonIFNα(图1)，-20℃保存备用。
实施例3重组鸽干扰素α的表达工程菌株的构建
用限制性内切酶Sal I(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)将重组真核表达质粒pPIC9K-pigeonIFNα线性化，加入至毕赤酵母X-33感受态细胞(长沙爱科博生物科技有限公司)中轻轻混匀后转移至预冷电转杯，冰浴5分钟，转移至电转仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品)，设置电转化参数：电压为1.5kV，电阻为250Ω，电容为25μF，电转化后立刻加入1mL预冷的山梨醇(浓度为1M，购自上海碧云天生物技术有限公司)，吸打2次后转移至1.5mL离心管，30℃培养箱中静置培养1h，随后室温下4000r/min离心4分钟，收集菌体并用100μLYPG培养基(购自北京索莱宝科技有限公司)重悬，涂布至含有100μg/mL博莱霉素(Zeocin，购自上海碧云天生物技术有限公司)的YPG固体培养基上，37℃培养3天，挑取单菌落进行PCR鉴定，结果如图2所示，长度为630bp，鉴定正确后获得用于表达重组鸽干扰素α的工程菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例4重组鸽干扰素α的制备
将实施例3获得的重组鸽干扰素α的表达工程菌株先接种至20mLYPG培养液中复壮，次日取5mL接种至1L摇瓶(含250mLYPG培养液)中，28℃、200r/min培养过夜，离心收集菌体，用等体积的BMMY液体培养基(购自北京索莱宝科技有限公司)重悬，28℃、200r/min诱导120小时(每隔24小时补加终浓度0.5％的甲醇)，收集上清液，参照亲和层析柱(购自上海碧云天生物技术有限公司)说明书纯化获得重组蛋白，采用SDS-PAGE法与Westernblot法分析重组蛋白的分子量大小及其纯度。Westernblot鉴定结果如图3所示，所获得的重组蛋白相对分子质量大小为34.7kDa，与预期值大小相符，表明该重组蛋白为重组鸽干扰素α，浓度为0.467mg/mL，纯度达到96％。
实施例5重组鸽干扰素α的生物活性检测
根据细胞病变抑制法(VSV-CEF法，实验步骤参考“王晶宇.犬干扰素α4、α2基因的表达及抗病毒活性分析[D].南京农业大学,2017.”)测定重组鸽干扰素α的抗病毒活性。结果显示，重组鸽干扰素α的抗病毒活性为3.16×106U/mL，比活性为6.77×106U/mg，显著高于已报道的数值(5.5×105U/mg，参考“李思文.p53对重组鸽α干扰素抗病毒作用的影响[D].东北林业大学,2018.”)。
将重组鸽干扰素α以1μg/mL的剂量接种DF-1细胞(由江苏省农业科学院兽医研究所保存)，24小时后收集细胞，用总RNA提取试剂盒(购自北京金沙生物科技有限公司)提取细胞总RNA，用一步法qRT-PCR法检测细胞中ISG15、OAS、PKR、Mx基因的转录水平。结果如图4所示，实验组的重组鸽干扰素α刺激的DF-1细胞中ISG15、OAS、PKR、Mx基因的转录水平较对照组显著提高，表明重组鸽干扰素α具有显著的生物学活性。
本发明的重组鸽干扰素α具有较高的生物学活性，可用于提升鸽群天然免疫力和增强鸽群抗病能力；其制备方法操作简易、成本低，能够保证重组鸽干扰素α的产量、活性、安全性和生产实用性，适用于大规模生产。
本发明公开了一种重组鸽干扰素α及其表达工程菌株与制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一种重组鸽干扰素α及其表达工程菌株与制备方法
<160>3
<210>1
<211>630
<212>DNA
<213>Artificial sequence(人工序列)
<400>1
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Claims (5)
1.一种重组鸽干扰素α，其特征在于，通过切除鸽干扰素α基因序列中的信号肽并进行毕赤酵母密码子优化与人工合成，将优化后的鸽干扰素α基因定向克隆至真核表达质粒pPIC9K中构建重组真核表达质粒，将重组真核表达质粒转化至毕赤酵母X-33感受态细胞中筛选表达工程菌株，对该表达工程菌株进行甲醇诱导、上清收集、亲和层析纯化后获得重组鸽干扰素α；优化后的鸽干扰素α基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2.如权利要求1所述的一种重组鸽干扰素α的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、鸽干扰素α基因的优化与人工合成；
根据鸽干扰素α基因序列信息，切除序列中信号肽，在其序列末端添加6个组氨酸，并针对毕赤酵母细胞进行密码子优化，最后在其序列两端分别引入限制性内切酶位点EcoRI和NotI；优化后的鸽干扰素α基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ IDNO:2；
步骤二、重组真核表达质粒的构建与鉴定；
将优化后的鸽干扰素α基因与pPIC9K载体分别经限制性内切酶EcoR I和Not I消化后，经琼脂糖凝胶电泳回收，目的片段用T4连接酶连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂板过夜培养，次日挑取单菌落，将测序正确的重组真核表达质粒命名为pPIC9K-pigeonIFNα，-20℃保存备用；
步骤三、重组鸽干扰素α的表达工程菌株的构建；
用限制性内切酶Sal I将重组真核表达质粒pPIC9K-pigeonIFNα线性化，加入至毕赤酵母X-33感受态细胞中混匀后转移至预冷电转杯，冰浴后转移至电转仪进行电转化，电转化后立刻加入预冷的山梨醇，吸打后转移至离心管，30℃培养箱中静置培养，室温下离心，收集菌体并用YPG培养基重悬，涂布至含有博莱霉素的YPG固体培养基上，37℃培养3天，挑取单菌落进行PCR鉴定，鉴定正确后获得重组鸽干扰素α的表达工程菌株，其核苷酸序列为SEQID NO:3；
步骤四、重组鸽干扰素α的制备；
将重组鸽干扰素α的表达工程菌株接种至YPG培养液中复壮，次日接种至含有YPG培养液的摇瓶中，28℃、200r/min培养过夜，离心收集菌体，用等体积的BMMY液体培养基重悬，28℃、200r/min诱导120小时，且每间隔24小时补加终浓度0.5％的甲醇，收集上清液，利用亲和层析柱从收集的上清液中纯化获得重组鸽干扰素α；采用SDS-PAGE法与Westernblot法分析重组鸽干扰素α的分子量大小及纯度。
3.根据权利要求2所述的一种重组鸽干扰素α的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述博莱霉素的浓度为100μg/mL。
4.根据权利要求2所述的一种重组鸽干扰素α的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述电转仪的电转化参数为：电压1.5kV，电阻250Ω，电容25μF。
5.一种表达工程菌株，其特征在于，该表达工程菌株用于表达权利要求1所述的一种重组鸽干扰素α。
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