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CN116135885A - 靶向cd73蛋白的融合蛋白 - Google Patents

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CN116135885A
CN116135885A CN202211458337.8A CN202211458337A CN116135885A CN 116135885 A CN116135885 A CN 116135885A CN 202211458337 A CN202211458337 A CN 202211458337A CN 116135885 A CN116135885 A CN 116135885A
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CN
China
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antibody
fusion protein
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
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Pending
Application number
CN202211458337.8A
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English (en)
Inventor
张振清
贾云莉
李志远
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotheus Inc
Original Assignee
Biotheus Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本申请涉及一种融合蛋白，其包含特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段。本申请所述融合蛋白还可以进一步包含TGF‑β结合部分。本申请还提供了包含所述融合蛋白的多特异性分子、免疫缀合物、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、药物组合物；编码所述融合蛋白的核酸分子、表达载体和用于制备所述融合蛋白的宿主细胞，及其应用。

Description

靶向CD73蛋白的融合蛋白
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种包含能够特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的融合蛋白。
背景技术
胞外-5'-核苷酸酶(由NT5E基因编码，又称CD73)，成熟蛋白全长522aa，分子量约为70KD，糖基化程度较高，成熟蛋白通过葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞表面形成同源二聚体，同时也存在切割体并以可溶形式(souble CD73，sCD73)循环。腺苷通路上游的CD39可以水解ATP产生AMP，CD73可以水解AMP产生腺苷，作用于免疫细胞的腺苷受体(A2AR)，激活下游的蛋白激酶A(PKA)和CSK激酶，抑制LCK、MAPK、PKC等一系列与免疫激活相关的信号通路，从而发挥免疫抑制作用。
CD73组织特异性低，多种正常组织如肺、胰腺、胃、小肠、卵巢、小脑等均中高程度表达。CD73在甲状腺癌、结肠直肠癌、肝癌、胶质瘤、肾癌等多种瘤种中表达上调，且与不良预后密切相关。此外，肿瘤微环境中的免疫细胞，DC细胞、Treg(调节型T细胞)、NK(自然杀伤细胞)、MDSC(髓系抑制细胞)、TAM(肿瘤相关巨噬细胞)等多种细胞表面均有表达。CD73的表达受到多重因素的调控，在肿瘤微环境中以低氧诱导因子-1(HIF-1)为主。肿瘤微环境的低氧条件，诱导HIF-1表达上调，进而诱导CD73在TME中广泛表达。放化疗治疗造成肿瘤杀伤释放ATP通过CD39-CD73-腺苷通路，有利于各种促癌类细胞的增殖和功能，而不利于抑癌类细胞。基于上述机制，多位研究者对CD73在抗肿瘤作用进行了探索研究，临床前小鼠模型结果显示，靶向CD73的抗体或基因敲除CD73可以有效阻断肿瘤生长和转移。
肿瘤微环境中TGF-β介导的信号传导可以通过包括上皮细胞间质转型(EMT)在内的多种机制促进肿瘤的侵袭、迁移和转移。TGF-β在癌症和包括癌症相关成纤维细胞(CAFs)在内的间质细胞中表达。TGF-β可通过激活CAFs、刺激免疫抑制和促进血管因子来维持肿瘤进展。CD73-腺苷通路和TGF-β通路具有独立和互补的免疫抑制功能。因此，如果药物能够通过同时阻断TGF-β和CD73两个免疫信号通路，可以进一步提高抗肿瘤活性及疗效。
发明内容
本申请提供了一种融合蛋白，其包含能够特异性结合CD73的抗体或其抗原结合片段。在本申请中，所述融合蛋白还可以进一步包含TGF-β结合部分。本申请所述的融合蛋白具有下述性质中的一种或多种：1)能够特异性结合人和/或猴CD73蛋白；2)能够结合TGF-β；3)对于肿瘤细胞表面CD73酶活性具有抑制作用；4)对于可溶性CD73酶活性具有抑制作用；5)能够阻断TGF-β/SMAD信号通路；6)能够解除腺苷对T细胞的抑制作用；以及7)能够抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖。
一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区氨基酸序列中的至少一个CDR。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:10或SEQID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述VH包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ IDNO:42所示的轻链可变区氨基酸序列的至少一个CDR。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR1，所述L-FR1的C端与所述LCDR1的N端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:20或SEQID NO:25所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述VL包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，所述VH和VL包含选自下述任一组氨基酸序列：
1)所述VH包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
2)所述VH包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；以及
3)所述VH包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含抗体重链恒定区。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区源自IgG恒定区。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区源自人IgG恒定区。
在某些实施方式中，所述重链恒定区源自选自下组的重链恒定区：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
在某些实施方式中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链恒定区。
在某些实施方式中，所述轻链恒定区源自Igκ。
在某些实施方式中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述轻链包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含TGF-β结合部分。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述TGF-β结合部分与人TGF-β特异性结合。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述TGF-β结合部分包含人TGF-β受体的细胞外结构域。
在某些实施方式中，所述人TGF-β受体包含人TGF-βRⅡ。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述TGF-β结合部分包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述TGF-β结合部分与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的重链可变区连接。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述TGF-β结合部分与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的所述重链恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述TGF-β结合部分的N端与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的所述重链恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述融合蛋白中的所述TGF-β结合部分通过肽接头与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的重链可变区连接。
在某些实施方式中，所述肽接头包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包括包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的多肽及包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包括各自包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的两个多肽和各自包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的两个多肽。
在某些实施方式中，所述融合蛋白具有下述性质中的一种或多种：
1)能够特异性结合人和/或猴CD73蛋白；
2)对于肿瘤细胞表面CD73酶活性具有抑制作用；
3)对于可溶性CD73酶活性具有抑制作用；
4)能够阻断TGF-β/SMAD信号通路；以及
5)能够解除腺苷对T细胞的抑制作用。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其编码本申请所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了载体，其包含本申请所述的核酸分子。
在某些实施方式中，所述载体包含质粒载体或病毒载体。
另一方面，本申请提供了宿主细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。
另一方面，本申请提供了免疫缀合物，其包含所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了多特异性分子，其包含本申请所述的融合蛋白。
在某些实施方式中，所述多特异性分子额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
另一方面，本申请还提供了嵌合抗原受体，其包含本申请所述的融合蛋白。
另一方面，本申请还提供了免疫效应细胞，其包含所述嵌合抗原受体。
另一方面，本申请还提供了制备所述融合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述融合蛋白表达的条件下，培养所述的宿主细胞。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含所述融合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述免疫缀合物、所述多特异性分子、所述嵌合抗原受体和/或所述免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方式中，所述药物组合物还包含其他药物活性成分。
另一方面，本申请还提供了试剂盒，其包含所述融合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述免疫缀合物、所述多特异性分子、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请还提供了所述融合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述宿主细胞、所述免疫缀合物、所述多特异性分子、所述嵌合抗原受体、所述免疫效应细胞、所述药物组合物和/或所述试剂盒，在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括实体瘤和/或血液瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括CD73阳性肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组中的一种或多种：结直肠癌、肾细胞癌、非小细胞癌和胰腺癌。
另一方面，本申请提供了一种刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述的融合蛋白或所述的药物组合物。
另一方面，本申请提供了一种检测CD73和/或TGF-β在样品中的存在或其量的方法，所述方法包括施用所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白在制备用于测定CD73和/或TGF-β在样品中的存在或其量的检测试剂中的用途。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是鼠源抗体13D12对肿瘤表面CD73的结合曲线。
图2显示的是鼠源抗体13D12对猴CD3+CD8+T细胞的结合情况的流式散点图。
图3显示的是人源化抗体7002-01对可溶性重组CD73的结合情况。
图4A-4B显示的是人源化抗体7002-01对肝癌病人(A)、黑色素瘤(B)病人的血清中CD73酶活性的抑制情况。
图5显示的是人源化抗体7002-01对AMP介导的CD4+T细胞抑制的缓解效果。
图6显示的是人源化抗体7002-01对PBMC对于肿瘤细胞的杀伤的恢复效果。
图7显示的是融合蛋白的结构示意图。
图8显示的是融合蛋白对人CD73过表达细胞水平亲和力的检测。
图9显示的是融合蛋白对猴CD73过表达细胞水平亲和力的检测。
图10显示的是融合蛋白对人乳腺癌细胞CD73的酶活抑制检测。
图11显示的是融合蛋白对人黑色素瘤细胞CD73的酶活抑制检测。
图12显示的是融合蛋白对可溶性CD73抗原的酶活抑制检测。
图13显示的是融合蛋白阻断TGF-β/SMAD信号通路检测。
图14显示的是融合蛋白对反转T细胞抑制的实验结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“分化簇73”或“CD73”也称为胞外-5'-核苷酸酶，其能够将细胞外5’单磷酸核苷转化为核苷，即将单磷酸腺苷(AMP)转化为腺苷。术语CD73包括膜结合形式(也称为膜结合CD73)或可溶形式(也称为可溶性或非膜结合CD73)。CD73可以分离自天然表达它们的细胞或组织，或使用本领域熟知的技术以重组方式产生。CD73的序列均是本领域公知的，可参见NCBI数据库登录号NM_002526。
术语“融合蛋白”通常指具有至少两个共价连接在一起的部分的蛋白质/多肽。其中每个部分可以是具有不同特性的蛋白质/多肽。该特性可以是生物学性质，例如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质，例如与靶分子的结合，反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键或通过肽接头连接。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合CD73蛋白)的其它抗体片段。通常，这样的片段应当包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对应，且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and ClinicalImmunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如，CD73)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。
在本申请中，术语“Fab′片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“F(ab')2”通常指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,TrendsBiotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。术语“dAb”通常包括sdAb。术语“sdAb”通常指单域抗体。单域抗体通常指仅由抗体重链可变区(VH结构域)或抗体轻链的可变区(VL)组成的抗体片段。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体的CDR区以外的部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如羊驼，小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
术语“全人源抗体”通常指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人源抗体可能含有鼠糖链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成全人源抗体。可用于制造抗体的示例性技术在美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140中描述。其它技术，如使用文库，是本领域已知的。
在本申请中，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
在本申请中，所述抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。在某些实施方案中，本申请的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可通过Kabat编号系统确定。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且包含抗原结合位点。
在本申请中，术语“可变”通常指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在本申请中，术语“FR”通常指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区(Framework Region)。通常，天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更长的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。该术语也适用于，如抗原结合蛋白对与多个抗原交叉反应的特定表位是有特异性的，其中，特异性的抗体能结合携带交叉反应表位的多种抗原。这种抗原结合蛋白的结合位点和/或具有特异性结合交叉反应表位的抗原结合蛋白，分别也被称为多特异性或交叉特异性结合位点的抗原结合蛋白。例如，抗原结合蛋白可具有与多个不同抗原交叉反应的表位特异性结合的多特异性结合位点。
在本申请中，术语“转化生长因子β”和“TGF-β”通常指人中由TGFB1、TGFB2和/或TGFB3基因编码的任何TGF-β家族蛋白。如本文所用，术语“人TGF-β1”通常指由人TGFB1基因(例如，野生型人TGFB1基因)编码的TGFβ1蛋白。示例性的野生型人TGFβ1蛋白由GenBankTM登录号NP_000651.3提供。如本文所用，术语“人TGFβ2”通常指由人TGFB2基因(例如，野生型人TGFB2基因)编码的TGFβ2蛋白。示例性的野生型人TGFβ2蛋白由GenBankTM登录号NP_001129071.1和NP_003229.1提供。如本文所用，术语“人TGFβ3”是指由人TGFB3基因(例如，野生型人TGFB3基因)编码的TGFβ3蛋白。示例性的野生型人TGFβ3蛋白由GenBankTM登录号NP_003230.1、NP_001316868.1和NP_001316867.1提供。
在本申请中，术语“转化生长因子β受体”和“TGF-β受体”是指在人中由TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3基因编码的任何TGFβ受体家族蛋白。如本文所用，术语“人TGFβR1”是指由人TGFBR1基因(例如，野生型人TGFBR1基因)编码的TGF-βRⅠ蛋白。示例性的野生型人TGF-βRⅠ蛋白由GenBankTM登录号NP_004603.1、NP_001124388.1和NP_001293139.1提供。在本申请中，术语“TGF-βRⅡ”可以包含野生型人TGF-βRⅡ或其功能活性片段。例如，在本申请中，所述TGF-βRⅡ可以包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“结合部分”通常是指具有特异性结合靶分子或复合物的能力的部分。结合部分可以包含小分子、肽、修饰的肽(例如，具有非天然氨基酸残基的肽和/或订书肽(stapled peptide))、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段、scFv、含Fc的多肽、融合抗体、配体、适体、核酸、其变体或其任何组合。在某些实施方案中，结合部分包含天然蛋白质的结构域或其变体，其中天然蛋白质经由该结构域与靶分子或复合物结合。例如，术语“TGF-β结合部分”通常是指与TGF-β家族的一种或多种蛋白质(例如，TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3特异性结合的部分)，并且在某些实施方案中可以包含TGF-β受体(例如，TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ或TGF-βRⅢ)的细胞外结构域。
在本申请中，术语“连接”通常指两个分子或部分之间的共价或非共价结合。所述连接可以包含直接连接，也可以包含间接连接。例如，所述间接连接可以经由中间分子或部分。
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体可以包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类可以包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常指所述其他试剂(例如，化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述融合蛋白缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的融合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠，和/或非离子表面活性剂。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，术语“预防和/或治疗”通常指本申请所述的治疗性或预防性措施。例如，“治疗”方法可以采用向患有疾病或容易患此类疾病或病症的受试者施用融合蛋白，以便对所述疾病或病症或复发性疾病或病症进行预防、治愈、延迟、降低其严重程度或改善其一种或多种症状，或是为了延长受试者的生存期，超过在没有这种治疗的情况下的预期生存期。
在本申请中，术语“有效量”在向受试者施用疗法的情形下通常是指实现所期望的预防或治疗作用的疗法的量。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CD73的抗体或其抗原结合片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CD73的抗体或其抗原结合片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以通过Kabat定义。
一方面，本申请提供一种融合蛋白，其包含特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述CD73抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区(VH)氨基酸序列中的至少一个CDR。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:11、SEQID NO:16和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段的CDR可以通过任何形式划分，只要VH与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的HCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含HCDR3，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含HCDR2，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含HCDR1，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含VH，所述VH包含SEQ IDNO:41所示的氨基酸序列。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包括抗体重链恒定区。例如，所述抗体重链恒定区可以源自任一种免疫球蛋白的重链恒定区，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。例如，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG重链恒定区。在本申请中，所述免疫球蛋白的重链恒定区可以包含其突变体。在本申请中，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG1-4中任一种的重链恒定区。例如，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含源自人IgG1重链恒定区。例如，所述重链恒定区可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。例如，所述重链恒定区可以包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL可以包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。例如，所述VL可以包含SEQID NO:21、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30中任一项所示的氨基酸序列。在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段的LCDR可以通过任何形式划分，只要VL与SEQ ID NO:42中任一项所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的LCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含LCDR3，所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含LCDR2，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含LCDR1，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1可以包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:29中任一项所示的氨基酸序列，所述L-FR2可以包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述L-FR3可以包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，且所述L-FR4可以包含SEQID NO:20或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含VL，所述VL包含SEQ IDNO:42所示的氨基酸序列。例如，所述VL可以包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:30中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含抗体轻链恒定区。例如，所述轻链恒定区可以源自人抗体轻链恒定区。例如，所述轻链恒定区可以源自人Igκ恒定区。例如，所述轻链恒定区可以包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR1可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所示HCDR3可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述LCDR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含VH和VL。例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQID NO:26所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述VL可以包含SEQID NO:30所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体可以包含重链，例如，所述重链可以包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体可以包含轻链，例如，所述轻链可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含抗体或其抗原结合片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv和/或dAb。在本申请中，所述抗体可以包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。例如，所述人源化CD73抗体的VH可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述人源化CD73抗体的VL可以包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述人源化CD73抗体的VH可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。例如，所述人源化CD73抗体的VL可以包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
此外，需要说明的是，本申请所述CD73抗体或其抗原结合片段可以包含与其存在一个或多个保守序列修饰的重链和/或轻链序列。所谓“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请所述分离的抗原结合蛋白中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述CD73抗体或其抗原结合片段的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换。本领域内的技术人员知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失，具体可以参见，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt et al.,(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelleyand O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10:341-6and Beers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
在某些实施方案中，可以将一个、两个或更多个突变(例如氨基酸取代)引入本文所述的抗体的Fc区(例如，CH2结构域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区(根据EU编号系统编号)以增加或减少抗体对效应细胞表面上的Fc受体(例如，激活的Fc受体)的亲和力。减少或增加抗体对Fc受体的亲和力的抗体的Fc区中的突变以及将此类突变引入Fc受体或其片段的技术是本领域技术人员已知的。可以进行以改变抗体对Fc受体的亲和力的抗体的Fc受体中的突变的实例描述于例如，Smith P etal.,(2012)PNAS 109:6181-6186，美国专利号6,737,056和国际公开号WO02/060919；WO98/23289；和WO 97/34631中，其全部以其整体通过引用并入本文。
在某些实施方案中，可以将一个、两个或更多个氨基酸取代引入IgG恒定结构域Fc区以改变抗体的效应物功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基234、235、236、237、239、243、267、292、297、300、318、320、322、328、330、332和396(根据EU编号系统编号)的一个或多个氨基酸，使得该抗体对效应物配体具有改变的亲和力，但保留了亲本抗体的抗原结合能力。改变对其的亲和力的效应物配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在美国专利号5,624,821和5,648,260中对此方法进行了更详细的描述，其每一篇以其整体通过引用并入本文。在某些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可以降低循环抗体的Fc受体结合，从而增加肿瘤的定位。关于缺失或去活化恒定结构域从而增加肿瘤定位的突变的描述，参见例如，美国专利号5,585,097和8,591,886，其每一篇以其整体通过引用并入本文。在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸取代引入本文所述抗体的Fc区，以去除Fc区上潜在的糖基化位点，其可以减少Fc受体结合(参见例如，Shields RL et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604，其以其整体通过引用并入本文)。在各种实施方案中，可以进行本文所述的抗体的恒定区中的以下一个或多个突变：N297A取代；N297Q取代；L234A取代；L234F取代；L235A取代；L235F取代；L235V取代；L237A取代；S239D取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；S239D取代；F243L取代；D265A取代；S267E取代；L328F取代；R292P取代；Y300L取代；A327Q取代；P329A取代；A332L取代；I332E取代；或P396L取代(根据EU编号系统编号)。在某些实施方式中，在所述抗体的恒定区中，所述IgG的Fc区可以包含L234A和L235A突变；可选地，所述IgG的Fc段还包含G237A突变。
在本申请中，所述融合蛋白可以包含特异性结合CD73蛋白的部分和TGF-β结合部分。例如，所述特异性结合CD73蛋白的部分可以包含本申请所述的CD73抗体。
在本申请中，所述TGF-β结合部分可以与所述CD73抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链任何部分连接，例如，包括N端或C端氨基酸残基。例如，TGF-β结合部分可以直接或经由接头(例如，肽接头)与免疫球蛋白链连接(共价或非共价)。共价连接可以是化学连接或遗传连接(即，以形成融合蛋白)。在某些实施方式中，所述TGF-β结合部分可以与免疫球蛋白链的C端氨基酸残基连接(例如，共价)。在某些实施方式中，所述TGF-β结合部分可以与免疫球蛋白链的C端氨基酸残基在没有接头的情况下连接(例如，经由肽键)。在某些实施方案中，所述TGF-β结合部分可以经由接头与免疫球蛋白链的C端氨基酸残基连接(例如，共价)。在某些实施方式中，所述接头可以是肽接头。在某些实施方案中，所述肽结构具有通式(G4S)n，其中n是整数。在某些实施方式中，所述肽接头包含与SEQ ID NO:36具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述TGF-β结合部分可以与CD73抗体的重链恒定区连接(例如，共价)。TGF-β结合部分可以与CD73抗体的重链恒定区的任何部分连接(例如，共价)。在某些实施方式中，TGF-β结合部分可以与CD73抗体的重链恒定区的C端氨基酸残基连接。例如，所述连接可以通过肽接头连接。例如，所述肽接头可以包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述TGF-β结合部分可以是特异性结合一个或多个TGF-β的家族成员或同等型的任何部分。在某些实施方案中，TGF-β结合部分特异性结合TGF-β1(例如，人TGF-β1)。在某些实施方案中，TGF-β结合部分特异性结合TGF-β2(例如，人TGF-β2)。在某些实施方案中，TGF-β结合部分特异性结合TGF-β3(例如，人TGF-β3)。在某些实施方案中，TGF-β结合部分特异性结合TGF-β1(例如，人TGF-β1)、TGF-β2(例如，人TGF-β2)和TGF-β3(例如，人TGF-β3)的至少两个。在某些实施方案中，TGF-β结合部分特异性结合TGF-β1(例如，人TGF-β1)和TGF-β3(例如，人TGF-β3)。在某些实施方案中，TGF-β结合部分特异性结合TGF-β1(例如，人TGF-β1)、TGF-β2(例如，人TGF-β2)和TGF-β3(例如，人TGF-β3)。本领域技术人员将理解，特异性结合TGF-β的一个家族成员或同等型的TGF-β结合部分可以以相似或更高的亲和力结合TGF-β的一个或多个其他家族成员或同等型。示例性TGF-β结合部分公开于DeCrescenzo et al.(2008)Transforming Growth Factor-βin Cancer Therapy,VolumeII,Cancer Drug Discovery and Development,Humana Press；Zwaagstra et al.(2012)Mol Cancer Ther.11(7):1477-87；Ravi et al.(2018)Nat.Commun.9:741；EP0975771B1,US7786261B2,US8993524B2和US20150225483A1中，其每一篇以其整体通过引用并入本文。
在某些实施方案中，TGF-β结合部分包含结合TGF-β1(例如，人TGF-β1)、TGF-β2(例如，人TGF-β2)和/或TGF-β3(例如，人TGF-β3)的蛋白质或其具有相似或改进的TGFβ结合亲和力的变体的结构域。在某些实施方案中，结构域是TGF-β受体(例如，人TGF-β受体)的细胞外结构域。在某些实施方案中，结构域是TGF-β受体(例如，人TGF-β受体)的TGFβ结合结构域。在某些实施方案中，TGF-β受体选自下组：TGF-βRⅠ(例如，人TGF-βRⅠ)、TGF-βRⅡ(例如，人TGF-βRⅡ)和TGF-βRⅢ(例如，人TGF-βRⅢ)。在某些实施方案中，所述TGF-β结合部分包含TGF-βRⅡ的胞外结构域。在某些实施方案中，TGF-β结合部分包含与SEQ ID NO:37所示的序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，TGF-β结合部分包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，TGF-β结合部分由与SEQ ID NO:37所示的序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。
在本申请中，所述融合蛋白可以包含：1)CD73抗体或其抗原结合片段；2)TGF-β结合部分以及3)肽接头。
在本申请中，所述融合蛋白可以包含第一多肽和第二多肽，其中，第一多肽可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，第二多肽可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。其中，第一多肽从N端到C端可以依次包含：CD73抗体的重链、肽接头、TGF-βRⅡ胞外域，其中，第二多肽可以包含CD73抗体的轻链。例如，第一多肽可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。例如，第二多肽可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可以包含两个拷贝的第一多肽和两个拷贝第二多肽，其中，第一多肽从N端到C端可以依次包含：CD73抗体的重链、肽接头、TGF-βRⅡ胞外域，其中，第二多肽可以包含CD73抗体的轻链。例如，第一多肽可以包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。例如，第二多肽可以包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白的预期性质包括：(1)特异性结合CD73(例如，膜结合人CD73或可溶性人CD73)；(2)抑制或降低CD73(例如，膜结合人CD73或可溶性人CD73)的酶活性；(3)在腺苷单磷酸(AMP)存在下，增加抗CD3/抗CD28刺激的T细胞(例如CD4+T细胞)的增殖；(4)介导CD73内化；(5)降低表达CD73的肿瘤细胞中的腺苷水平；(6)刺激免疫应答(例如针对肿瘤或免疫原的免疫应答)；(7)预防和/或治疗肿瘤(例如表达CD73的肿瘤)。本申请的融合蛋白具有上述预期性质中的一项或多项。
核酸分子、载体、宿主细胞
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其可以编码本申请所述的融合蛋白。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
免疫缀合物、多特异性分子、嵌合抗原受体、免疫效应细胞、药物组合物、制备方法
另一方面，本申请还提供了免疫缀合物，其可以包含本申请所述的融合蛋白。
在某些实施方式中，可以将本申请所述的融合蛋白或其片段与另一治疗剂连接。该连接可以通过一个或多个共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(所述接头可以为本领域所知)以形成免疫缀合物。所述免疫缀合物还可以包含例如抗体-药物缀合物(ADC)。
在某些实施方式中，使用本领域现有的接头技术可以将治疗剂偶联至本申请的融合蛋白。已经用于将治疗剂偶联至抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择例如易于在溶酶体隔室内被低pH切割或易于被蛋白酶(例如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，如组织蛋白酶，诸如组织蛋白酶B、C、D)切割的接头。
另一方面，本申请提供了多特异性分子，其可以包含本申请所述的融合蛋白，及额外的特异性结合抗原部分。
例如，本申请的融合蛋白可连接至能够特异性结合可用作联合治疗的潜在靶标的任何蛋白质的其他抗体或其抗原结合片段。为产生所述多特异性分子，可以将本发明的融合蛋白连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(例如另外的抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。
因此，在另一个方面，本申请提供了一种多特异性分子，其包含本发明的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述多特异性分子特异性结合CD73(例如膜结合人CD73和/或可溶性人CD73)，和TGF-β，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
另一方面，本申请还提供了一种嵌合抗原受体，其包含本申请所述的融合蛋白。
另一方面，本申请还提供了一种免疫效应细胞，其包含本申请所述的嵌合抗原受体。在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包含淋巴细胞。
另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的免疫缀合物、所述的多特异性分子、所述的嵌合抗原受体和/或所述的免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。
在本申请中，所述药物组合物还可以包含其他的药物活性成分。例如，所述药物活性成分可以包含具有抗肿瘤活性的药物。例如，所述药物活性成分可以包含免疫检查点抑制剂。
另一方面，本申请还提供了制备所述融合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述融合蛋白表达的条件下，培养本申请所述的宿主细胞。
方法和用途
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的免疫缀合物、所述的多特异性分子、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞和/或所述的药物组合物。
另一方面，本申请还提供了所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的免疫缀合物、所述的多特异性分子、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞和/或所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的免疫缀合物、所述的多特异性分子、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞和/或所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤表达CD73。在某些实施方式中，所述CD73可以是膜结合人CD73和/或可溶性人CD73。
在某些实施方案中，所述肿瘤涉及表达CD73的肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述CD73在所述肿瘤细胞表面上表达。
在某些实施方式中，所述肿瘤为CD73阳性肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组中的一种或多种：结直肠癌、肾细胞癌、非小细胞癌和胰腺癌。
在本申请中，所述融合蛋白还可以与其他治疗剂组合施用。例如，所述治疗剂可以包括免疫检查点抑制剂。在本申请中，所述融合蛋白还可以与其他治疗术一起施用，例如，所述治疗术可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。
另一个方面，本申请提供了一种用于刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本申请所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的免疫缀合物、所述的多特异性分子、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞和/或所述的药物组合物。在另一个方面，提供了所述的融合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞、所述的免疫缀合物、所述的多特异性分子、所述的嵌合抗原受体、所述的免疫效应细胞和/或所述的药物组合物用于刺激受试者中的免疫应答的用途，或在制备用于刺激受试者中的免疫应答的药物中的用途。
在某些实施方案中，所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
在某些实施方案中，所述免疫应答是针对肿瘤(例如表达CD73的肿瘤)的免疫应答。在某些实施方案中，所述受试者患有肿瘤(例如表达CD73的肿瘤)。
检测用途和试剂盒
本申请的融合蛋白能够特异性结合CD73和TGF-β，从而可用于检测CD73和/或TGF-β在样品中的存在或其水平。
因此，在另一个方面，本申请提供了一种试剂盒，其包括本申请所述的融合蛋白。在一些实施方案中，本申请的融合蛋白带有可检测的标记。
在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在另一个方面，本发明提供了检测CD73在样品中的存在或其量的方法，其包括以下步骤：
(1)将所述样品与本申请的融合蛋白接触；
(2)检测所述融合蛋白与CD73之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
所述复合物的形成表明存在CD73或表达CD73的细胞。
在某些实施方案中，所述样品是细胞样品，即包含细胞(例如肿瘤细胞)的样品。在此类实施方案中，所述复合物是由所述融合蛋白与所述样品中的细胞所表达的CD73之间形成的。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在另一些实施方案中，在步骤(2)中，使用带有可检测的标记的试剂来检测申请的融合蛋白。
所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。在某些实施方案中，所述CD73是人CD73，例如膜结合和/或可溶性人CD73。
在另一个方面，提供了本申请的融合蛋白用于测定TGF-β在样品中的存在或其量的用途，或在制备用于测定TGF-β在样品中的存在或其量的检测试剂中的用途。在某些实施方案中，所述TGF-β是人TGF-β。
在另一个方面，本发明提供了检测TGF-β在样品中的存在或其量的方法，其包括以下步骤：
(1)将所述样品与本申请的融合蛋白接触；
(2)检测所述融合蛋白与TGF-β之间复合物的形成或检测所述复合物的量。
所述复合物的形成表明存在TGF-β或表达TGF-β的细胞。
在某些实施方案中，所述样品是细胞样品，即包含细胞(例如肿瘤细胞)的样品。在此类实施方案中，所述复合物是由所述融合蛋白与所述样品中的细胞所表达的TGF-β之间形成的。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还带有可检测的标记。在另一些实施方案中，在步骤(2)中，使用带有可检测的标记的试剂来检测本申请的融合蛋白。
所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。在某些实施方案中，所述TGF-β是人TGF-β。
在另一个方面，提供了本申请的融合蛋白用于测定TGF-β在样品中的存在或其量的用途，或在制备用于测定TGF-β在样品中的存在或其量的检测试剂中的用途。在某些实施方案中，所述TGF-β是人TGF-β。
本申请还提供了以下实施方案：
1.融合蛋白，其包含特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区氨基酸序列中的至少一个CDR。
2.根据实施方案1所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR2，且所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
6.根据实施方案4-5中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR1，所述H-FR1的C端与所述HCDR1的N端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
7.根据实施方案4-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
8.根据实施方案3-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2和所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案2-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含H-FR4，所述H-FR4的N端与所述HCDR3的C端直接或间接相连，且所述H-FR4包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案10所述的融合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:42所示的轻链可变区氨基酸序列的至少一个CDR。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
17.根据实施方案15-16中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR1，所述L-FR1的C端与所述LCDR1的N端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQID NO:17、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案15-17中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1和所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
19.根据实施方案14-18中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2和所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案13-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含L-FR4，所述L-FR4的N端与所述LCDR3的C端直接或间接相连，且所述L-FR4包含SEQID NO:20或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案1-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区VL，所述VL包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案21所述的融合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案1-22中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，所述VH和VL包含选自下述任一组氨基酸序列：
1)所述VH包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
2)所述VH包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；以及
3)所述VH包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含抗体重链恒定区。
25.根据实施方案24所述的融合蛋白，其中所述重链恒定区源自IgG恒定区。
26.根据实施方案24-25中任一项所述的融合蛋白，其中所述重链恒定区源自人IgG恒定区。
27.根据实施方案24-26中任一项所述的融合蛋白，其中所述重链恒定区源自选自下组的重链恒定区：IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
28.根据实施方案24-27中任一项所述的融合蛋白，其中所述重链恒定区包含SEQID NO:33或SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链恒定区。
31.根据实施方案30所述的融合蛋白，其中所述轻链恒定区源自Igκ。
32.根据实施方案30-31中任一项所述的融合蛋白，其中所述轻链恒定区包含SEQID NO:35所示的氨基酸序列。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述轻链包含SEQID NO:32所示的氨基酸序列。
35.根据实施方案1-34中任一项所述的融合蛋白，其还包含TGF-β结合部分。
36.根据实施方案35所述的融合蛋白，其中所述TGF-β结合部分与人TGF-β特异性结合。
37.根据实施方案35-36中任一项所述的融合蛋白，其中所述TGF-β结合部分包含人TGF-β受体的细胞外结构域。
38.根据实施方案37所述的融合蛋白，其中所述人TGF-β受体包含人TGF-βRⅡ。
39.根据实施方案35-38中任一项所述的融合蛋白，其中所述TGF-β结合部分包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案35-39中任一项所述的融合蛋白，其中所述TGF-β结合部分与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的重链可变区连接。
41.根据实施方案35-40中任一项所述的融合蛋白，其中所述TGF-β结合部分与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的C端直接或间接相连。
42.根据实施方案35-41中任一项所述的融合蛋白，其中所述TGF-β结合部分的N端与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的C端直接或间接相连。
43.根据实施方案35-42中任一项所述的融合蛋白，其中所述TGF-β结合部分通过肽接头与所述特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段的重链可变区连接。
44.根据实施方案43所述的融合蛋白，其中所述肽接头包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的融合蛋白，其包括包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的多肽及包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的多肽。
46.根据实施方案1-45中任一项所述融合蛋白，其包括各自包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的两个多肽和各自包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的两个多肽。
47.根据实施方案1-46中任一项所述的融合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够特异性结合人和/或猴CD73蛋白；
2)对于肿瘤细胞表面CD73酶活性具有抑制作用；
3)对于可溶性CD73酶活性具有抑制作用；
4)能够阻断TGF-β/SMAD信号通路；以及
5)能够解除腺苷对T细胞的抑制作用。
48.分离的核酸分子，其编码实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白。
49.载体，其包含实施方案48所述的核酸分子。
50.根据实施方案49所述的载体，其包含质粒载体或病毒载体。
51.宿主细胞，其包含实施方案48所述的核酸分子或实施方案49-50中任一项所述的载体。
52.免疫缀合物，其包含实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白。
53.多特异性分子，其包含实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白。
54.根据实施方案53所述的多特异性分子，其额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
55.嵌合抗原受体，其包含实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白。
56.免疫效应细胞，其包含实施方案55所述的嵌合抗原受体。
57.制备实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述融合蛋白表达的条件下，培养实施方案51所述的宿主细胞。
58.药物组合物，其包含实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白、实施方案48所述的核酸分子、实施方案49-50中任一项所述的载体、实施方案51所述的宿主细胞、实施方案52所述的免疫缀合物、实施方案53-54中任一项所述的多特异性分子、实施方案55所述的嵌合抗原受体和/或实施方案56所述的免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
59.根据实施方案58所述的药物组合物，其还包含其他药物活性成分。
60.试剂盒，其包含实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白、实施方案48所述的核酸分子、实施方案49-50中任一项所述的载体、实施方案51所述的宿主细胞、实施方案52所述的免疫缀合物、实施方案53-54中任一项所述的多特异性分子、实施方案55所述的嵌合抗原受体、实施方案56所述的免疫效应细胞或实施方案58-59中任一项所述的药物组合物。
61.实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白、实施方案48所述的核酸分子、实施方案49-50中任一项所述的载体、实施方案51所述的宿主细胞、实施方案52所述的免疫缀合物、实施方案53-54中任一项所述的多特异性分子、实施方案55上所述的嵌合抗原受体、实施方案56所述的免疫效应细胞、实施方案58-59中任一项所述的药物组合物或实施方案60所述的试剂盒，在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
62.根据实施方案61所述的用途，其中所述疾病和/或病症包括肿瘤。
63.根据实施方案61-62中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症包括实体瘤和/或血液瘤。
64.根据实施方案62-63中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括CD73阳性肿瘤。
65.根据实施方案62-64中任一项所述的用途，其中所述肿瘤选自下组中的一种或多种：结直肠癌、肾细胞癌、非小细胞癌和胰腺癌。
66.一种刺激受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白或实施方案58-59中任一项所述的药物组合物。
67.一种检测CD73和/或TGF-β在样品中的存在或其量的方法，所述方法包括施用实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白。
68.实施方案1-47中任一项所述的融合蛋白在制备用于测定CD73和/或TGF-β在样品中的存在或其量的检测试剂中的用途。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1鼠源抗人CD73抗体的产生
为了获得鼠源抗人CD73抗体，使用不同的免疫策略(表1)来免疫小鼠(Balb/c,上海灵畅生物)。所使用的抗原包括：CD73蛋白(即重组表达的人源CD73，其序列如SEQ ID NO:40)和CHOS-人CD73(即过表达CD73的CHOS细胞系，表达的CD73序列如SEQ ID NO:40)；佐剂包括：完全弗氏佐剂CFA(InvivoGen公司，货号vac-cfa-60)、IFA(InvivoGen公司，货号vac-ifa-60)、QuickAntibody(北京博奥龙免疫技术有限公司，货号KX0210041)；施用途径包括：腹膜内(ip)及皮下(sc)。在加强免疫3天后将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0使用聚乙二醇法进行融合，得到既能表达抗体又能在体外无限增殖的B细胞融合，并且在HAT选择培养基中培养。将融合后的杂交瘤细胞铺在96孔细胞培养板中，并且通过初级筛选挑选出阳性克隆进行2-3轮亚克隆。
表1免疫策略
Figure BDA0003954469190000331
初级筛选：在初级筛选中通过使用人源CD73表达的肿瘤细胞或过表达细胞系测试生长克隆的上清液对细胞表面CD73结合能力。通过用DyLight488山羊抗鼠IgG(Abcam目录编号ab97015)第二抗体揭示出在上清液中的反应抗体的存在，在全视野细胞扫描分析仪上进行结合能力的评估(详细实验步骤可参见实施例2)。次级筛选：在CD73表达细胞上以及进行CD73酶活阻断能力的筛选，以评估抗体的细胞膜表面CD73酶活性阻断性质；使用人血清可溶性CD73进行CD73酶活阻断能力的筛选，以评估抗体的可溶性CD73酶活性阻断性质(详细实验步骤可参见实施例6)。
从最终获得的阳性杂交瘤单克隆细胞株的培养上清中分离纯化得到鼠源单克隆抗体13D12。
实施例2鼠源抗CD73抗体的抗原结合活性评价
2.1通过细胞扫描分析仪检测鼠源抗体与CD73阳性细胞的结合情况
所使用的细胞：MDA-MB-231(内源表达人CD73；人乳腺癌细胞系)、SK-ME-S(内源表达人CD73；人肺鳞癌细胞系)、H2030(内源表达人CD73；人非小细胞肺癌细胞系)、SKLU1(内源表达人CD73；人肺腺癌细胞系)、BT549(内源表达人CD73；人乳腺管癌细胞系)、A375(内源表达人CD73；人黑色素瘤细胞系)、Calu6(内源表达人CD73；人退行性癌细胞系)、4T1(内源表达鼠CD73；鼠乳腺癌细胞系)、CHOS-人CD73(经人CD73转染)及CHOS(CD73阴性)细胞。
表达CD73的CHOS细胞的构建：通过慢病毒感染和抗性筛选的方法(MOI＝3-10，5μg/ml polybrene)在CHOS细胞(Invitrogen)上过表达人源CD73(SEQ ID NO:40)。慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供，细胞感染72小时后加相应抗性继续培养2-4周，扩增并冻存，以用于后续实验。
实验方法：将10000个细胞平铺于100μL DMEM+10％ FBS/孔中，使用平底96孔板，过夜使细胞贴壁或沉于孔底，第二天去掉上清。通过将1/3体积(100μL)稀释于200μL DMEM中来实施8点连续3倍稀释。细胞板的每一孔中加入100μL经稀释的抗体(筛选时使用融合克隆上清或亚克隆上清)，相应阴性对照孔加入100μLDMEM，室温孵育1小时。去掉上清后，每孔加入100μL第二抗体(DyLight488山羊抗鼠IgG(Abcam目录编号ab97015)，浓度为5μg/mL(稀释于DMEM中)，室温孵育0.5小时。染色完成后去掉上清，用PBS+2％ FBS清洗一次后每孔加入100100μLFBS+2％ FBS，然后上机器进行读数。使用全视野细胞扫描分析仪(Nexcelom公司，型号
Figure BDA0003954469190000341
Image Cytometer)对实验板进行测定读数。测定时选择第二抗体对应荧光通道和明场通道同时对孔内细胞进行高速扫描成像。荧光通道得到的成像根据有荧光标记的细胞形态和荧光强度设定参数对抗体结合的细胞进行计数，明场通道得到的成像根据细胞形态设定参数对贴壁细胞进行计数，然后两组数据相除得到和抗体结合的显示荧光的细胞占细胞总数的百分比。根据该比例判定抗CD73抗体与表达CD73的细胞株的结合效果。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用和CD73抗体有结合显示绿色荧光的细胞和活细胞总数的百分比，根据曲线拟合出抗CD73抗体在各细胞上结合的EC50值。
13D12对于各肿瘤细胞结合的EC50值如表2-1和表2-2所示，N.B.表示在测定浓度范围内没有检测到；对部分细胞的结合曲线如图1所示。结果显示，13D12可结合天然表达CD73的细胞及重组表达人CD73的CHOS细胞，但这些抗体不结合不表达CD73的细胞(CHOS)，也不结合表达鼠CD73的细胞(4T1)。
表2-1抗体对内源性表达人CD73的肿瘤细胞结合EC50
Figure BDA0003954469190000351
表2-2抗体对重组表达人CD73的CHOS细胞以及其他不表达人CD73细胞的结合EC50
Figure BDA0003954469190000352
2.2鼠源抗体与食蟹猴T细胞的结合
自美迪西获得来自两个供体(1132F与1300M)的猴血液。使用Ficoll密度梯度离心分离系统分离外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC与待测抗体一起孵育，再用荧光染料标记的二抗(DyLight488山羊抗鼠IgG，Abcam目录编号ab97015；DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)染色细胞上结合的抗体，并使用荧光染料标记的针对CD3+及CD8+的抗体来识别T细胞。汇集未经染色对照样品及荧光补偿对照样品，上流式细胞仪运行样品，检测抗体对于食蟹猴T细胞的结合。
图2显示了13D12与猴1132F CD3+CD8+T细胞的结合情况的流式散点图。鼠源抗体13D12结合的平均荧光强度变化倍数如下表所示。结果显示，13D12能够结合食蟹猴CD8+T细胞。
表3抗体对猴PBMC的结合
Figure BDA0003954469190000353
实施例3鼠源抗CD73抗体的可变区序列测定及嵌合抗体制备
离心收集杂交瘤细胞，每5-10×106细胞加入1ml TRIzol和0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，离心取水相加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟后收集沉淀，乙醇洗涤后干燥得到RNA。在冰浴离心管里面加入模板RNA和引物，使引物和模板正确配对后进行反转录过程，在进行PCR扩增。4个微量离心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37℃温浴5min,备用。在一个空的微量离心管中加入1pmol的PCR扩增双链DNA,10pmol测序引物,2μl 5×测序缓冲液,加双蒸水至总体积10μl,96℃加热8min,冰浴泠却1min,4℃10000g离心10s。加入2μl预冷的标记混合物(dCTP、dGTP、dTTP各0.75μmol/L)，α-32P-dATP 5μCi，1μl 0.1mol/L DDT，测序酶2U,加水至15μl，混匀后置冰上2min,标记新合成的DNA链。3.5μl标记反应混合物加入到准备好的4个微量离心管中，37℃温浴5min。每管各加入4μl终止液。样品在80℃的水浴中热变性5min，每一泳道加2μl加到测序胶上，电泳分离这些片段，收集序列信息。
鼠源抗体13D12的VH和VL序列如表4所示。进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，Public HealthService，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了鼠源单抗13D12的CDR序列。
表4：鼠源抗体的序列信息
Figure BDA0003954469190000361
将编码上述鼠源抗体的重链可变区(SEQ ID NO:11)和轻链可变区(SEQ ID NO:21)的序列分别与编码人抗体的重链恒定区(SEQ ID NO:33)和轻链恒定区(SEQ ID NO:35)的序列相连接，并在HEK293细胞(ATCC)中进行重组表达，收获培养瓶生长的含有抗体克隆的细胞上清液，使用protein A柱纯化，并且使用100mM醋酸pH3.0洗脱抗体蛋白。然后将纯化的抗体蛋白上样到分子排阻层析柱上进一步分离纯化。将对应于单体的抗体蛋白配制于PBS缓冲液中，配制品缓冲液补充有20％甘油。从而获得相应的嵌合抗体ch13D12。
实施例4鼠源抗CD73抗体的人源化
为提高候选抗体与人源抗体的序列的同源性，减少抗体对人的免疫原性，可以对以上实施例提供的鼠源抗体进行人源化设计和制备，使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in AntibodyEngineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。
具体而言，将鼠源抗体13D12的重链和轻链CDR区分别移植到对应的人源化模板的FR框架上，并对人源化模板的FR区氨基酸残基进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留鼠源抗体的抗原结合能力。根据以上方法，本发明人制备获得了鼠源抗体13D12的人源化抗体，命名为7002-01(其重链可变区及轻链可变区分别如SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:26所示)。抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示。
实施例5人源化抗CD73抗体的抗原结合活性评价
5.1通过流式细胞术测定抗体与CD73表达细胞的结合。
将500,000个CD73表达细胞(参见实施例2)置于100μL FACS buffer(PBS+2％FBS)/孔中待用，使用圆底低吸附96孔板。抗体样本通过将1/2体积(100μL)稀释于200μLFACS buffer中来实施3倍浓度的12点连续3倍稀释。细胞板的每一孔中加入100μL经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入100μL FACS buffer，4摄氏度孵育1小时。离心去掉上清后，使用FACS buffer清洗两遍，每孔加入100μL第二抗体(DyLight488山羊抗鼠IgG，Abcam目录编号ab97015；DyLight488山羊抗人IgG，Abcam目录编号ab97003)5μg/mL，稀释于FACS buffer中)，4摄氏度再孵育0.5小时。染色完成后离心去掉上清，用FACS buffer清洗两次后每孔加入100μL FACS buffer重悬细胞，然后上机器进行读数。使用流式细胞分析仪(BD公司，型号ACCURI C6 PLUS)对实验板中细胞进行测定读数。测定时先根据FCS和SSC圈定细胞位置，然后选择第二抗体对应绿色荧光通道(FITC)和SSC对细胞进行分析，数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用平均荧光强度数值，根据曲线拟合出抗CD73抗体的EC50。表5显示了人源化抗体7002-01对于天然表达CD73的细胞及重组表达人CD73的细胞的结合情况，N.D.表示没有进行检测。结果表明，人源化抗体7002-01对膜结合CD73具备良好的结合活性。
表5抗体对表达人CD73的肿瘤细胞结合EC50
Figure BDA0003954469190000371
5.2通过ELISA测定抗体与可溶性人CD73蛋白的结合
将1μg/ml重组人CD73蛋白(百英生物，重组人源CD73蛋白)包被在PBS中的ELISA板上，在4℃下过夜。将板在洗涤缓冲液(PBS，0.05％吐温20)中洗涤3次，并且通过添加200μl/w PBS+2％ BSA阻断使非特异性位点饱和。将剂量范围的抗CD73抗体梯度稀释100μL加入包被好抗原的ELISA板中在37℃下孵育1h。将板在洗涤缓冲液中洗涤3次，并且在室温下添加HRP偶联的山羊抗人或山羊抗小鼠IgG Fc片段第二抗体持续1hr以检测结合的抗CD73抗体。将板在洗涤缓冲液中洗涤3次，通过添加TMB(HRP底物)并且在室温下在黑暗中孵育板5至10分钟来揭示结合的第二抗体。通过添加硫酸溶液1M终止酶反应，并且在450nm处测量光吸收。以光吸收值为纵坐标，以抗体浓度log值为横坐标绘制曲线图，并且使用图板棱柱(GraphPad Prism)软件计算EC50。结果如图3所示，人源化抗体7002-01对可溶性重组CD73具有良好的结合活性，其EC50为0.0081μg/ml。
5.3通过Biacore测定人源化抗体与重组人源CD73蛋白的亲和力
在25℃下在Biacore T200(GE)上进行SPR测量抗体亲和力。将抗体用运行缓冲液1*HBS-EP+稀释至1ug/ml，并以10ul/min的流速分别捕获到芯片表面(Protein A chip，GE,Cat#29127556)上30s。随后，将一系列浓度的CD73蛋白(百英生物，重组人源CD73蛋白)以30ul/min的流速注入相应抗体通道，缔合阶段为180s，随后解离900s。再生使用10mM pH1.5Gly-HCL。使用1:1动态结合模型拟合整个传感图组。二价亲和力和动态结合和解离速率常数显示于下表中。
表6抗体对重组CD73结合的亲和力常数
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
7002-01 2.97E+05 6.24E-05 2.102E-10
实施例6抗CD73抗体对CD73酶活性的抑制活性评价
6.1肿瘤细胞中CD73酶活性的抑制试验
已知过量的AMP阻断ATP依赖性荧光素酶活性。将AMP切割为腺苷+无机磷酸的CD73通过减少AMP恢复荧光素酶活性和光发射。因此，阻断CD73的酶活性的抗体将减少光发射。
收获人CD73阳性细胞且计数。播种平底96板每孔20，000细胞于100μL完全培养基中。抗体样品通过将1/3体积(100μL)稀释于200μL DMEM中来实施8点连续3倍稀释，将稀释样品100μL加入相应板孔，阴性对照为同种型对照抗体(ISO)。于37℃孵育1小时，去掉上清后并用PBS清洗细胞两次。在不完全培养基中制备浓度为125μM AMP溶液，向每个孔中添加100μL AMP，并且将板在37℃下孵育另外两小时。离心反应板，取出50μL加入另一块96荧光板(OptiPlate-96,Perkin Elmer，#6005290)中，并加入同体积浓度为50μM的ATP溶液，并加入CTG试剂(普洛麦格公司，G7572)50μL于每孔，将板在室温下于黑暗中孵育15分钟，并且使用酶标仪测量荧光(Lum)。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标为抑制率，绘制酶活性抑制曲线并计算IC50，抑制率计算方法如下：
抑制率＝(Lum阳性对照-Lum抗体)/(Lum阳性对照-Lum阴性对照)*100
抗体在不同人源肿瘤细胞系中阻断内源细胞CD73的IC50如下表所示。结果表明，人源化抗体7002-01能够显著抑制肿瘤细胞表面CD73的酶活性。
表7抗体抑制不同人源肿瘤细胞表面CD73酶活的IC50
Figure BDA0003954469190000391
6.2肿瘤病人血清CD73酶活性的抑制试验
将肿瘤病人血清稀释于磷酸buffer(Tris 125mM，MgCl2 25mM，NaCl125mM)，每孔加入12.5μL待用，使用白色平底96孔板。抗体样品通过将1/1.5体积(100μL)稀释于50μL磷酸buffer中和将1/10体积(10μL)稀释于90μL磷酸buffer中来实施10点连续2～10倍稀释，细胞板的每一孔中加入12.5μL经稀释的抗体，阴性对照加入12.5μL磷酸buffer，离心后37℃孵育1.5小时。AMP使用磷酸buffer稀释成20μM溶液，每孔加入25μL AMP(阳性对照除外)，离心后37℃下孵育另外1小时。反应结束后在阳性对照加入25μL AMP。立即向每个孔中添加25μL AMP-GloTM Reagent I(普洛麦格公司，货号V5012)，离心反应板，并且将板在室温下孵育1小时。向每个孔中添加50μL AMP Detection Solution(普洛麦格公司，货号V5012)，离心后室温下孵育1小时。使用酶标仪测量荧光(Lum)。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标为抑制率，绘制酶活性抑制曲线并计算IC50，抑制率计算方法如下：
抑制率＝100-(Lum阳性对照-Lum抗体)/(Lum阳性对照-Lum阴性对照)*100
结果如图4A-4B所示，抗CD73抗体可有效抑制肝癌病人(A)、黑色素瘤(B)病人血清中CD73对于AMP的去磷酸化，抑制CD73酶活性。
实施例7抗CD73抗体介导的CD73内化
通过流式细胞术测试抗CD73抗体介导的CD73内化。当测定抗体引起的内化和时间的关系的时候，在37℃下将所指示细胞与10μg/mL抗体一起孵育不同时间。用含2％ FBS的PBS洗涤若干次后，加入10μg/mL第二抗体4℃下染色30分钟，然后通过流式细胞术分析细胞的CD73表达。当比较抗体引起内化程度的不同的时候，在4℃和37℃两种温度下平行将所指示细胞与10μg/mL抗体一起孵育20小时。用含2％ FBS的PBS洗涤若干次后，加入10μg/mL第二抗体4℃下染色30分钟,然后通过流式细胞术分析细胞的CD73表达。
MFI37为37℃条件下孵育的样品的MFI；MFI4为4℃条件下孵育的样品的MFI，该条件下只发生结合而不发生内吞，MFI背景为仅有第二抗体的MFI，抗体介导的细胞表面CD73内吞百分比由以下公式计算：
内化CD73的百分比＝100–100×(MFI4-MFI37)/MFI4
结果如表8所示，这些抗体介导了不同程度的肿瘤细胞表面上CD73的内化。
表8：抗体介导肿瘤细胞表面上CD73的内化比例
细胞 抗体 6小时 4小时 2小时 1小时 0.5小时 0小时
A375 7002-01 11％ 3％ 4％ 5％ 1％ 0％
MDA-MB-231 7002-01 8％ 4％ 4％ 3％ 5％ 0％
H2030 7002-01 -1％ -2％ 4％ 1％ 6％ 0％
HCC44 7002-01 11％ 4％ 7％ 0％ 3％ 0％
Calu6 7002-01 13％ 7％ 6％ 3％ 7％ 0％
实施例8抗CD73抗体缓解AMP介导的CD4+ T细胞抑制
实验前一天用抗CD3/抗CD28刺激PBMC细胞24小时，收集PBMC细胞(新鲜单采血经Ficoll分离所得)，使用CD4+ T Cell Isolation Kit human(美天旎，货号130-096-533)分选出CD4+T细胞，细胞离心去上清，用含40μM EHNA和120IU/ml IL2的AIMV培养基将CD4+T细胞重悬(EHNA终浓度20μM，IL2终浓度60IU/ml)，将200,000 CD4+T细胞置于100μL/孔中，使用96孔低吸附圆底板。通过将1/3体积(100μL)稀释于200μL AIMV培养基中来实施10点连续2～10倍稀释，每孔加入50μL经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入50μL AIMV培养基，37摄氏度孵育0.5小时。用AIMV制备400μM AMP(终浓度100μM)，每孔加入50μL配好的AMP溶液(对照孔加入不含AMP培养基)。离心后上机器进行读数。之后将板在37℃下孵育72小时然后上机器进行再次读数。读数使用全视野细胞扫描分析仪(Nexcelom公司，型号
Figure BDA0003954469190000411
ImageCytometer)对实验板内细胞进行测定。测定时选择明场通道对孔内细胞进行高速扫描成像。根据该克隆团大小情况判定抗CD73抗体缓解AMP介导的CD4+ T细胞抑制效果。其中，以MEDI9447(MedImmune)和BMS986179(BMS)为参比抗体，由吉凯表达纯化。
T细胞增殖第4天的细胞增长情况如图5所示；图中所使用#18为内部使用PBMC捐供者编号；图中所使用抗体浓度起始为100μg/mL，四倍稀释共九个点。人源化抗体7002-01能够有效缓解AMP介导的CD4+ T细胞抑制，T细胞增殖得到明显恢复，且效果优于参比抗体MEDI9447和BMS986179。
实施例9抗CD73抗介导的肿瘤细胞杀伤
将5000个A375细胞平铺于100μL DMEM+10％ FBS/孔中，使用平底96孔板，过夜使细胞贴壁，第二天去掉上清。通过将1/3体积(100μL)稀释于200μL AIMV中来实施10点连续2～10倍稀释。细胞板的每一孔中加入50μL经稀释的抗体，相应阴性对照孔加入50μL AIMV，37摄氏度孵育0.5小时。收集提前一天用CD3/CD28刺激24小时后的PBMC细胞(新鲜单采血经Ficoll分离所得)，用含40μM EHNA和120IU/ml IL2的AIMV重悬(EHNA终浓度20μM，IL2终浓度60IU/ml)，按5,000/100μL加入每孔。用AIMV制备浓度为400μM AMP溶液，向每个孔中添加50μL(AMP终浓度100μM)。离心后37℃孵育72小时。每孔加入10μL CCK8试剂盒(日本同仁公司，货号CK04)，37度孵育4小时后使用酶标仪测量OD450。根据对照孔数值将OD值分别换算成抑制百分比，据此判定抗CD73抗体抗介导的肿瘤细胞杀伤大小。百分比越大代表抗CD73抗介导的肿瘤细胞杀伤效果越好，反之百分比越小代表抗CD73抗介导的肿瘤细胞杀伤效果越差。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标使用抑制百分比，根据曲线拟合出抗CD73抗体在A375细胞上的IC50值。
结果如图6所示，图中所使用#22为内部使用PBMC捐供者编号，结果显示人源化抗体7002-01能够有效恢复PBMC对于肿瘤细胞的杀伤。
实施例10融合蛋白的分子设计及表达质粒准备
通过将免疫小鼠并经过人源化改造的GB7002.01抗体序列(VH的氨基酸序列如SEQID NO:28所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)，重链方面在Fc的C端通过(G4A)4链接TGFbRII的序列(连接后的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示)，轻链使用GB7002.01抗体序列的轻链序列(氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示)，构建成可以同时靶向人CD73和TGFb的融合蛋白。同时构建CD73单抗GB7002.01以及Fc(CH2-CH3)-TGFbRII对照。
将设计的融合蛋白序列送交基因合成公司(Tsingke)进行基因合成，合成完毕后构建到pcDNA3.1(+)的表达载体上，并完成一定数量的质粒抽提的工作，经过内毒，测序比对，酶切验证、DNA质量等QC验证，用于下一步实验。
融合蛋白结构示意图如图7所示。
实施例11融合蛋白表达和纯化
采用ExpiCHOTM Expression System试剂盒(购自Thermo)，将中量制备的融合蛋白表达质粒转入Expi-CHO细胞中，转染方法按照商品说明书，细胞培养5天后收集上清利用Protein A磁珠(购自金斯瑞)分选法纯化目的蛋白。将磁珠用适当体积的Binding buffer(PBS+0.1％ Tween 20，pH 7.4)重悬(1-4倍磁珠体积)后加入至待纯化样品中，室温孵育1小时，期间温柔振荡。样品置于磁力架上(购自海狸)，弃去上清，磁珠用Binding buffer清洗3遍。按照磁珠体积的3-5倍体积加入Elution buffer(0.1M sodium citrate,pH 3.2)室温振荡5-10min，置回磁力架上，收集Elution buffer，转移至已加入Neutralizationbuffer(1M Tris，pH 8.54)的收集管中混匀，完成制备。
实施例12融合蛋白的蛋白水平亲和力检测
ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solutionBased measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30min，然后线上检测60s建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器上。再将传感器放入100nM的MSLN抗原中作用5min，之后将传感器转移至PBS中解离5min。使用1:1结合模型进行动力学的分析。
结果如表9-11所示，融合蛋白对人猴CD73的亲和力与GB7002.01基本相当，融合蛋白对人TGFβ1的亲和力与Fc(CH2-CH3)-TGFbRII基本相当。
表9候选分子对人CD73抗原的亲和力
编号 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
GB7002.01 4.7E-10 2.74E+05 1.29E-04
GB7002.01-TGFbRII 1.1E-09 2.81E+05 3.20E-04
表10候选分子对猴CD73抗原的亲和力
Figure BDA0003954469190000421
Figure BDA0003954469190000431
表11候选分子对人TGFb1抗原的亲和力
编号 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
Fc(CH2-CH3)-TGFbRII 1.30E-07 6.27E+03 8.45E-04
GB7002.01-TGFbRII 5.80E-08 1.15E+04 6.66E-04
实施例13融合蛋白对人和猴CD73过表达细胞水平亲和力的检测
通过转染人和猴的cDNA的pCHO1.0载体(购自Invitrogen)产生过表达人和猴CD73的CHO细胞(CHO-hMSLN细胞和CHO-CynoMSLN细胞)。将扩大培养的过表达细胞调整细胞密度至2×106cells/ml,100μL/孔加入96孔流式板，离心备用。将纯化的融合蛋白抗体用PBS稀释，400nM开始3倍稀释共12个点，将上述稀释好的样品100μL/孔加入上述带有细胞的96孔流式板中，4℃孵育30min,PBS清洗两次。100μL/孔加入用PBS稀释100倍的Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(PE)(购自Abcam,ab98596)，4℃孵育30min,PBS清洗两次。100μl/孔加入PBS重悬细胞，在CytoFlex(Bechman)流式细胞仪上进行检测并计算对应的MFI。
在如上方法的测定实验中，实验结果如图8和表12所示，本发明所有的纯化样品和CHO-hMSLN细胞均有结合活性，融合蛋白对人猴CD73过表达细胞的亲和力与GB7002.01基本相当。
在如上方法的测定实验中，实验结果如图9和表13所示，本发明所有的纯化样品和CHO-cynoMSLN细胞均有结合活性，融合蛋白对人猴CD73过表达细胞的亲和力与GB7002.01基本相当。
表12融合蛋白对人CD73过表达细胞水平亲和力EC50
编号 EC50(nM)
GB7002.01 5.476
GB7002.01-TGFbRII 4.764
表13融合蛋白对猴CD73过表达细胞水平亲和力EC50
编号 EC50(nM)
GB7002.01 4.18
GB7002.01-TGFbRII 4.523
实施例14融合蛋白对肿瘤细胞表面CD73酶活性的抑制试验
已知过量的AMP阻断ATP依赖性荧光素酶活性。将AMP切割为腺苷+无机磷酸的CD73通过减少AMP恢复荧光素酶活性和光发射。因此，阻断CD73的酶活性的抗体将减少光发射。
收获人CD73阳性细胞且计数。播种平底96板每孔20，000细胞于100μL完全培养基中。抗体样品通过将1/3体积(100μL)稀释于200μL DMEM中来实施8点连续3倍稀释，将稀释样品100μL加入相应板孔，阴性对照为同种型对照抗体(ISO)。于37℃孵育1小时，去掉上清后并用PBS清洗细胞两次。在不完全培养基中制备浓度为125μM AMP溶液，向每个孔中添加100μL AMP，并且将板在37℃下孵育另外两小时。离心反应板，取出50μL加入另一块96荧光板(OptiPlate-96,Perkin Elmer，#6005290)中，并加入同体积浓度为50μM的ATP溶液，并加入CTG试剂(Promega，G7572)50μL于每孔，将板在室温下于黑暗中孵育15分钟，并且使用酶标仪测量荧光(Lum)。数据分析使用GraphPad，横坐标使用抗体浓度的对数，纵坐标为抑制率，绘制酶活性抑制曲线并计算IC50，抑制率计算方法如下：
抑制率＝(Lum阳性对照-Lum抗体)/(Lum阳性对照-Lum阴性对照)*100
实验结果如图10和图11所示，本发明所有的纯化样品对两种人肿瘤系细胞的表面的CD73酶活均有很好的抑制作用，表14表明，所有的纯化样品对两种人肿瘤系细胞的表面的CD73酶活抑制IC50基本相当。
表14融合蛋白抑制不同人源肿瘤细胞表面CD73酶活的IC50
Figure BDA0003954469190000441
实施例15融合蛋白对可溶性CD73抗原酶活性的抑制试验
将0.3μg/mL可溶性CD73(购自Acro)按照50μL/孔放置于96孔板(Costar，#3599)中，不同剂量抗体浓度(400nM，3倍稀释，12个点)的抗体接种于细胞孔中，50μL/孔，37℃孵育30min。然后加入100μM AMP(Sigma，#A2252-5G)于37℃孵育30分钟，50μL/孔。取50μL上清液放入白板(Costar，#3917)，使用AMP-Glo试剂盒AMP Detection Solution(Promega，#V5011)读取荧光素酶信号。
实验结果如图12和表15所示，本发明所有的纯化样品对可溶性CD73酶活均有很好的抑制作用，且抑制IC50基本相当。
表15融合蛋白抑制可溶性CD73酶活的IC50
蛋白编号 IC50(nM)
GB7002.01 0.7049
GB7002.01-TGFbRII 0.9858
实施例16融合蛋白阻断TGF-β/SMAD信号通路实验
取适量293-TGF-β/SMAD效应胞接种于96孔细胞培养白底板，置于37℃，5％CO2培养箱培养过夜。将纯化的Fc(CH2-CH3)-TGFbRII，GB7002.01-TGFbRII融合蛋白，梯度稀释后和TGF-β1(acrobiosystems,TG1-H421)混合，室温孵育30min。将上述混合物加入带有细胞的白底板中继续培养过夜。向每孔中加入Bio-Glo TM试剂(Promega)，使用多功能酶标仪读取荧光信号值。
实验结果如图13和表16所示，本发明所有的纯化样品对阻断TGF-β/SMAD信号通路活性基本相当。
表16融合蛋白阻断TGF-β/SMAD信号通路IC50
蛋白编号 IC50(nM)
Fc(CH2-CH3)-TGFβRII 0.002450
GB7002.01-TGFβRII 0.001589
实施例17融合蛋白对反转T细胞抑制实验
PBMC细胞上含有CD39，CD73等腺苷通路分子，加入的ATP在CD39、CD73的水解下，最终会变成腺苷，从而抑制T细胞的激活。而CD73酶活阻断抗体理论上可以阻断腺苷的生成，从而解除腺苷对T细胞抑制作用。
根据这个实验原理，我们设置如下实验：
复苏适量PBMC(购自上海赛笠)，经过离心清洗后，放置在T75瓶上贴壁培养2小时后去除单核细胞，收集上清悬浮细胞，离心用2mm CellTrace Violet(Thermofisher，#C34557)染色。2x10^5染色细胞分布于96个平底板中(提前包被1ug/ml抗CD3抗体)，加入不同浓度稀释的CD73抗体在37℃孵育1h，加入终浓度为1ug/ml的anti-CD28抗体。最后添加500uM ATP，抑制T细胞增殖，注意最大增殖孔不添加ATP。3-5天后通过流式细胞术，定量分析染色稀释T细胞增殖(FACS抗体分化CD4或CD8 T细胞)来评估T细胞增殖和抗体阻断腺苷免疫抑制作用的能力。
实验结果如图14所示，本发明所有的纯化样品对反转T细胞抑制活性方面基本相当。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (10)

1.融合蛋白，其包含特异性结合CD73蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区氨基酸序列中的至少一个CDR，以及如SEQ ID NO:42所示的轻链可变区氨基酸序列的至少一个CDR。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其还包含TGF-β结合部分。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够特异性结合人和/或猴CD73蛋白；
2)对于肿瘤细胞表面CD73酶活性具有抑制作用；
3)对于可溶性CD73酶活性具有抑制作用；
4)能够阻断TGF-β/SMAD信号通路；以及
5)能够解除腺苷对T细胞的抑制作用。
4.分离的核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。
5.免疫缀合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。
6.多特异性分子，其包含权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。
7.嵌合抗原受体，其包含权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。
8.免疫效应细胞，其包含权利要求7所述的嵌合抗原受体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的免疫缀合物、权利要求6所述的多特异性分子、权利要求7所述的嵌合抗原受体和/或权利要求8所述的免疫效应细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
10.权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的免疫缀合物、权利要求6所述的多特异性分子、权利要求7所述的嵌合抗原受体、权利要求8所述的免疫效应细胞、或权利要求9中任一项所述的药物组合物，在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
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