CN116121212A - 一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用，涉及药用植物基因工程领域，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，或其经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有羟化酶功能的蛋白质；或与其具有90％或90％以上同一性，且具有羟基化苄基异喹啉类生物碱的蛋白质；其重组表达载体、重组微生物；该酶和还原酶StCPR组成的酵母体系，该羟化酶及其重组表达载体在异源表达的StCYP80B蛋白体外合成、重组微生物和该酵母体系在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。本发明提供的羟化酶StCYP80B，扩大了底物识别范围，是羟基化不同结构单苄基异喹啉类生物碱的有效酶促工具。

Description

一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用

技术领域

本发明涉及药用植物基因工程领域，尤其涉及一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶及其应用。

背景技术

粉防己Stephania tetrandra S.Moore为防己科Menispermaceae千金藤属Stephania植物，其根为著名的传统中药材防己，具有利水消肿、祛风止痛的功效。防己中富含苄基异喹啉类生物碱(BIAs)，主要包括单苄基异喹啉型、双苄基异喹啉型、阿朴啡型、原小檗碱型等，这些BIAs具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用。但是，目前防己野生资源匮乏，人工种植规模小，种植周期长，有效成分的含量不高，限制了其中活性BIAs的应用与发展。生物合成是解决资源问题的重要手段，阐释粉防己中BIAs生物合成的关键酶，可为利用生物技术高效地生产这类有效成分提供理论基础。

BIAs的生物合成通常始自L-酪氨酸转化为多巴胺和4-羟基苯基乙醛，在去甲乌药碱合酶(NCS)的催化生成S-去甲乌药碱，然后经3个甲基转移酶(6OMT，CNMT，4′OMT)和羟化酶(CYP80B或称为NMCH)形成关键中间体S-牛心果碱((S)-reticuline)，再通过偶联、异构、重排、羟基化、甲基化、去甲基化等反应形成多种类型的BIAs。在上述途径中，从S-去甲乌药碱到S-牛心果碱均为单苄基异喹啉类生物碱，这类化合物的结构修饰对下游多种类型BIAs有重要作用，其中羟化酶CYP80B就是对单苄基异喹啉类起结构修饰的关键酶之一。

目前，粉防己中功能明确的CYP80B尚未见报道，其他植物中发现的CYP80B，称为N-甲基乌药碱3′-羟化酶，只能催化单一的底物S-N-甲基乌药碱((S)-N-methylcoclaurine)形成S-3′-羟基-N-甲基乌药碱((S)-3′-OH-N-methylcoclaurine)，不能催化不具N-甲基的底物乌药碱(coclaurine)，底物谱单一。因此，发现能羟基化不同结构BIA的CYP80B，可以拓宽该类酶的底物谱，对于单苄基异喹啉类及其下游多类型BIAs的合成都有重要的理论和实用价值。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的羟化酶，具有多样的底物谱，以满足对不同结构的苄基异喹啉类生物碱(BIA)进行羟基化的需求。

发明内容

鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种羟化酶，具有多样的底物谱，能满足对不同结构的苄基异喹啉类生物碱(BIA)进行羟基化的需求。

为实现上述目的，本发明提供了一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶StCYP80B，羟化酶StCYP80B氨基酸序列为：

(a1)羟化酶StCYP80B氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

或(a2)上述(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有羟化酶功能的蛋白质的氨基酸序列；

或(a3)与上述(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有羟基化苄基异喹啉类生物碱的蛋白质的氨基酸序列。

进一步地，羟化酶StCYP80B核苷酸序列为：

(b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

或(b2)将上述(b1)的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；

或(b3)与上述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80B蛋白的DNA分子。

本发明还提供了一种羟化酶StCYP80B的基因的重组表达载体，该重组载体包括亚克隆载体或酵母细胞表达载体。

进一步地，含有StCYP80B基因的重组载体包括亚克隆载体以及酵母等微生物细胞表达载体。

本发明还提供了一种羟化酶StCYP80B的基因的重组微生物，该重组微生物包括酵母细胞。

进一步地，含有StCYP80B基因的重组微生物包括酵母等微生物细胞。

本发明还提供了一种共表达StCYP80B和StCPR的酵母体系，该酵母体系组成为羟化酶StCYP80B和还原酶StCPR。

进一步地，还原酶StCPR的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ IDNO.4所示。

本发明还提供了一种羟化酶StCYP80B在体外合成苄基异喹啉类化合物中的应用。

本发明还提供了一种含有StCYP80B基因的重组表达载体在异源表达的StCYP80B蛋白体外合成的应用。

本发明还提供了一种含有StCYP80B基因的重组微生物在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。

本发明还提供了一种酵母体系在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。

进一步地，羟化酶蛋白来源于粉防己Stephania tetrandra，命名为StCYP80B，

进一步地，CYP450还原酶(CYP450 Reductase,CPR)来源于粉防己Stephaniatetrandra，命名为StCPR。

进一步地，共表达StCYP80B和StCPR的酵母体系对苄基异喹啉生物碱的羟化转化率显著高于仅表达StCYP80B体系的转化率。

进一步地，羟化酶StCYP80B催化不具N-甲基的底物乌药碱(coclaurine)的应用。

进一步地，StCYP80B作为羟化酶的应用。

进一步地，StCYP80B基因在制备羟化酶中的应用。

进一步地，含有StCYP80B基因的重组表达载体在制备羟化酶中的应用。

进一步地，含有StCYP80B基因的重组微生物在制备羟化酶中的应用。

进一步地，StCYP80B的蛋白在参与苄基异喹啉类生物碱的生物合成中的应用。

进一步地，StCYP80B的蛋白在制备苄基异喹啉类生物碱中的应用。

进一步地，羟化酶StCYP80B既能催化单一的底物S-N-甲基乌药碱((S)-N-methylcoclaurine)形成S-3′-羟基-N-甲基乌药碱，又能催化不具N-甲基的底物乌药碱(coclaurine)。

在本发明的较佳实施方式1中，详细说明粉防己中一种苄基异喹啉类生物碱3′位羟化酶(StCYP80B)及其编码基因的发现过程；

在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明酿酒酵母体内验证StCYP80B的功能；

在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明StCYP80B微粒体蛋白提取与体外催化过程。

本发明有益的技术效果如下：

本发明公开了新的羟化酶StCYP80B及其编码基因。StCYP80B能催化N-甲基乌药碱(N-methylcoclaurine)形成3′-羟基-N-甲基乌药碱(3′-OH-N-methylcoclaurine)，也能催化不具N-甲基的底物乌药碱(coclaurine)形成3′-羟基-乌药碱(3′-OH-coclaurine)，与已报道的CYP80B相比，扩大了底物识别范围，是羟基化不同结构单苄基异喹啉类生物碱的有效酶促工具，对于单苄基异喹啉类及其下游多类型BIAs的合成都有重要意义。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例2的酵母体系中StCYP80B催化(R,S)-N-甲基乌药碱形成羟化产物的LC-MS以及LC-MS/MS分析色谱图；

图2是本发明的一个较佳实施例2的酵母体系中StCYP80B催化(R,S)-乌药碱形成羟化产物的LC-MS以及LC-MS/MS分析色谱图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1、粉防己中一种苄基异喹啉类生物碱3′位羟化酶(StCYP80B)及其编码基因的发现

通过对粉防己根、叶组织进行转录组测序，获得粉防己转录组数据库。经过与NCBI、KEGG等公共数据的序列进行Blast筛选、序列比对等分析，挖掘到6条CYP80B候选序列。经过酿酒酵母异源表达，底物饲喂后确定其中一条蛋白具有催化(R,S)-N-甲基乌药碱和(R,S)-乌药碱3′位羟基化的作用。将该蛋白命名为StCYP80B，其氨基酸如序列表的SEQID NO.1所示，由490个氨基酸组成。将编码StCYP80B蛋白的基因命名为StCYP80B基因，其开放阅读框cDNA序列如序列表的序列SEQ ID NO.2所示。

通过相同的方法，从粉防己转录组挖掘到1条CYP450还原酶，将其蛋白命名为StCPR，由690个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表的SEQ ID NO.3所示。将编码StCPR蛋白的基因命名为StCPR，其开放阅读框cDNA序列如序列表的SEQ ID NO.4所示。在酿酒酵母异源表达体系中，共表达StCYP80B和StCPR的体系对(R,S)-N-甲基乌药碱和(R,S)-乌药碱的羟化转化率显著高于仅表达StCYP80B体系的转化率。

实施例2、酿酒酵母体内验证StCYP80B的功能

一、构建异源表达质粒

酿酒酵母游离型质粒pESC-Leu使用限制型内切酶NotⅠ和SacⅠ进行双酶切，胶回收线性化质粒。设计含有质粒两端同源臂的引物(F1与R1)，从粉防己cDNA样品中PCR扩增得到带同源臂的StCYP80B基因，回收纯化PCR产物。

引物序列F1如序列SEQ ID NO.5所示：5′-CTCACTAAAGGGCGGCCGCATGGAGATAGTCTCTGC-3′；R1如序列SEQ ID NO.6所示：5′-TCACTAAAGGGCGGCCGCATGGATCAAACCATCCTCTC-3′。

采用同源重组法构建重组质粒pESC-Leu-StCYP80B，热激法转化大肠杆菌DH10B，挑取抗氨苄青霉素的转化子，LB培养基扩增，提取质粒后依次进行PCR、酶切以及测序验证，获得测序正确的重组质粒pESC-Leu-StCYP80B。

酿酒酵母游离型质粒pESC-Leu-StCYP80B使用限制型内切酶XhoⅠ和NheⅠ进行双酶切，胶回收线性化质粒。设计含有质粒两端同源臂的引物(F2与R2)，从粉防己cDNA样品中PCR扩增得到带同源臂的StCPR基因，回收纯化PCR产物。

引物序列F2如序列SEQ ID NO.7所示：5′-TTTCCGAAGAAGACCTCGAGATGGCTTCCAAGTACGCGAA-3′；R2如序列SEQ ID NO.8所示：5′-TAGAGCGGATCTTAGCTAGCTCACCAAACGTCCCTGAGAT-3′。

采用与构建质粒pESC-Leu-StCYP80B的相同方法步骤，得到测序正确的重组质粒pESC-Leu-StCYP80B-StCPR。

二、酵母重组菌株的获得

采用Frozen-EZ yeast Transformation II kit酵母转化试剂盒将步骤一得到的重组质粒pESC-Leu-StCYP80B或pESC-Leu-StCYP80B-StCPR转化至酿酒酵母YPH499菌株。菌液涂布至缺陷型培养基SD-Leu平板，30℃静置培养2d后可挑取单菌落。同时转化空质粒至YPH499菌株得到空白对照菌。

三、酵母全细胞催化

挑取步骤二中缺陷型平板上生长的单克隆菌落至15ml SD-Leu液体培养基，30℃，220rpm震荡培养过夜。控制OD600至0.8-1.2，离心(3000rpm，5min)，去除SD-Leu，更换诱导培养基SG-Leu，诱导培养20h后离心，获得菌体细胞沉淀。

以50mM PBS清洗菌体一次并重悬至终体积500μl。投喂底物(R,S)-N-甲基乌药碱和(R,S)-乌药碱，终浓度0.25mM。30℃，220rpm全细胞催化24h。

四、反应液处理与检测

取步骤三中的反应液加入等体积甲醇终止反应，超声提取15min后，离心(12000rpm，10min)去除沉淀，上清液经0.22μm有机滤膜过滤后，进行LC-UV-MS和LC-MS/MS分析。

LC-UV-MS检测条件如下：液相系统为岛津LCMS-2020；色谱柱为Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm×75mm，1.6μm)；柱温为室温(约25℃)；流速0.2ml/min；流动相为A(0.1％甲酸水溶液)-B(甲醇)进行梯度洗脱，时间程序：0min，5％(v/v)B％；10min，45％(v/v)B％；11min，95％(v/v)B％；12min，95％(v/v)B％；PDA检测，监测波长为282nm；质谱检测采用电喷雾电离离子源(ESI)采集正离子，扫描范围100-800m/z；接口电压4.5kv。

LC-MS/MS检测条件如下：液相系统为岛津LCMS-8060；色谱柱为Venusil XBP PH(2.1×100mm，5μm)；柱温40℃；流速0.5ml/min；流动相为A(0.1％甲酸水溶液)-B(乙腈)，时间程序：0min，5％(v/v)B％；5min，25％(v/v)B％；7min，95％(v/v)B％；9min，95％(v/v)B％；质谱检测采用ESI采集正离子，接口电压4.0kV；扫描模式为多反应监测(MRM)，选择以下离子对进行检测：底物N-甲基乌药碱m/z300.25→107.15及其产物3′-羟基-N-甲基乌药碱m/z 316.15→123.05，底物乌药碱m/z286.25→107.15及其产物3′-羟基-乌药碱m/z302.15→123.05。

其中，底物为(R,S)-N-甲基乌药碱的结果如图1所示，图1为酵母体系中StCYP80B催化(R,S)-N-甲基乌药碱形成羟化产物的LC-MS以及LC-MS/MS分析色谱图，其中，图1上部分中第一个结构式为3′-羟基-N-甲基乌药碱；第二个结构式为N-甲基乌药碱；1A部分为与培养液空白对照与酶促反应液的LC-MS提取离子色谱图，1B部分为对照品和酶促反应液的LC-MS/MS色谱图，色谱峰“1”表示化合物3′-羟基-N-甲基乌药碱，色谱峰“2”表示化合物N-甲基乌药碱；培养液空白对照为加底物但不含StCYP80B的培养液，酶促反应液为共表达StCYP80B和StCPR的重组酿酒酵母全细胞催化底物的样品。。1A部分LC-MS检测的质谱提取离子色谱图显示，异源表达StCYP80B的酿酒酵母可以催化N-甲基乌药碱产生m/z增加16Da的羟化产物Product 1；1B部分LC-MS/MS色谱图显示，酶促反应液中生成的Product 1与3′-羟基-N-甲基乌药碱对照品的离子对m/z和保留时间一致，说明是3′位发生羟化形成的3′-羟基-N-甲基乌药碱。

其中，底物为(R,S)-乌药碱的结果如图2所示，图2为酵母体系中StCYP80B催化(R,S)-乌药碱形成羟化产物的LC-MS以及LC-MS/MS分析色谱图，其中，图2上部分中第一个结构式为3′-羟基-乌药碱；第二个结构式为乌药碱；2A部分为培养液空白对照与酶促反应液的LC-MS提取离子色谱图，2B部分为对照品和酶促反应液的LC-MS/MS色谱图，色谱峰“3”表示化合物3′-羟基-乌药碱，色谱峰“4”表示化合物乌药碱。培养液空白对照为加底物但不含StCYP80B的培养液，酶促反应液为共表达StCYP80B和StCPR的重组酿酒酵母全细胞催化底物的样品。。2A部分LC-MS检测的质谱提取离子色谱图显示，异源表达StCYP80B的酿酒酵母可以催化乌药碱产生m/z增加16Da的羟化产物Product 2；2B部分LC-MS/MS色谱图显示，酶促反应液中生成的Product 2与3′-羟基-乌药碱对照品的离子对m/z和保留时间一致，说明是3′位发生羟化形成的3′-羟基-乌药碱。

转化质粒pESC-Leu-StCYP80B-StCPR与pESC-Leu-StCYP80B的两种酵母体系相比较，前者对底物N-甲基乌药碱和乌药碱的羟化转化率是后者的3-100倍，说明酵母体内共表达StCPR可以增强StCYP80B的催化作用。

上述结果表明，StCYP80B具有催化N-甲基乌药碱和乌药碱的3′位发生羟化的功能；StCPR可有效提高StCYP80B在异源表达体系的催化活性。

实施例3、StCYP80B微粒体蛋白提取与体外催化

一、微粒体蛋白的提取

按实施例二中步骤一至三的方法获得菌体细胞沉淀。每克菌体加入1ml TESBbuffer，采用震荡细胞破碎仪破碎菌体，震荡速度6m/s，时间10s/次，置于冰上3min，重复6次。离心(10,000g，4℃，20min)，取上清液，超速离心(100,000g，4℃，1h)，得到微粒体沉淀，溶于适量TEG buffer。使用生工改良型Bradford蛋白测定试剂盒测定微粒体蛋白浓度。

二、体外酶促反应

取微粒体沉淀，配制酶促反应体系。每个反应体系为0.5ml，含微粒体蛋白1mg，0.05mM FAD，0.05mM FMN，1mM NADPH，适量底物(R,S)-N-甲基乌药碱和(R,S)-乌药碱，TEGbuffer(PH:7.5)至0.5ml。于30℃，220rpm反应2h，得酶促反应液。

三、反应液处理与检测

向酶促反应液中加入等体积甲醇终止反应，涡旋混匀，离心(12000rpm，4℃，5min)，取上清液进行LC-MS/MS分析。检测条件同实施例二中步骤四的LC-MS/MS法。

结果表明，StCYP80B蛋白能催化N-甲基乌药碱和乌药碱的3′位碳原子进行羟基化反应，生成3′-OH产物。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种参与苄基异喹啉类生物碱生物合成的羟化酶StCYP80B，其特征在于，所述羟化酶StCYP80B氨基酸序列为：

(a1)所述羟化酶StCYP80B氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

或(a2)所述(a1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有羟化酶功能的蛋白质的氨基酸序列；

或(a3)与所述(a1)的氨基酸序列具有90％或90％以上同一性，且具有羟基化苄基异喹啉类生物碱的蛋白质的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的羟化酶StCYP80B，其特征在于，所述羟化酶StCYP80B核苷酸序列为：

(b1)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

或(b2)将所述(b1)的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的DNA序列；

或(b3)与所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，且编码CYP80B蛋白的DNA序列。

3.含有如权利要求1或2所述的羟化酶StCYP80B的基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组载体包括亚克隆载体或酵母细胞表达载体。

4.含有如权利要求1或2所述的羟化酶StCYP80B的基因的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包括酵母细胞。

5.一种共表达StCYP80B和StCPR的酵母体系，其特征在于，所述酵母体系组成为羟化酶StCYP80B和还原酶StCPR。

6.如权利要求5所述的酵母体系，其特征在于，所述还原酶StCPR的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求1或2所述的羟化酶StCYP80B在体外合成苄基异喹啉类化合物中的应用。

8.如权利要求3所述的重组表达载体在异源表达StCYP80B蛋白体外合成苄基异喹啉类化合物的应用。

9.如权利要求4所述的重组微生物在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。

10.如权利要求5所述的酵母体系在体内合成苄基异喹啉类化合物中的应用。

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