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CN116121186A - 一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法 Download PDF

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CN116121186A CN202310002702.2A CN202310002702A CN116121186A CN 116121186 A CN116121186 A CN 116121186A CN 202310002702 A CN202310002702 A CN 202310002702A CN 116121186 A CN116121186 A CN 116121186A
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岳永莉
李雪玲
郝瑞峰
黄新朋
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Abstract

本发明公开了一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤如下：S1、将脂肪间充质干细胞接种到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中；S2、向传代细胞中加入消化酶，消化3‑5min，收集细胞，离心，弃上清，按1:3的传代比例将干细胞接种到新的培养皿或孔板中；S3、将100mg棕榈油酸溶于DMSO中，制成0.5mol/L的浓储液，再加入到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中，制成棕榈油酸条件培养液；S4、取3‑5代的传代细胞，接种至棕榈油酸条件培养液中，培养1‑5代；S5、添加成脂诱导剂至已接种预处理传代细胞的培养液中，每隔48h换一次培养液，继续培养1‑5代。本发明采用上述的一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，缩短了细胞群体的增值时间，加快了细胞成脂分化进程，促进了脂肪酸代谢。

Description

一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法。
背景技术
脂肪间充质干细胞(adipose-derivedmesenchymalstemcells，ADSCs)是存在于脂肪组织中的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，具有相似于骨髓间充质干细胞的生物学特性，具有自我更新、旁分泌、免疫调控等能力。在体外操作中，ADSCs具有来源广泛、侵入性小、获取方便的特点，体外分离容易，且纯度高。还可通过原位注射与静脉注射的方式进行自体或异体移植，进入体内后可自行靶向归巢、参与组织重建，且抗免疫排斥反应，是进行组织器官修复的理想种子细胞，也是医疗美容中目前应用最广的细胞产品。
现有技术中，通常采用一步法自体脂肪干细胞丰胸的方法，通过采集自体脂肪细胞分离培养脂肪干细胞，将培养的脂肪干细胞加入脐带间充质干细胞以及再次采集自体脂肪细胞混合，再加入生长因子与转换因子，混合均匀后过滤弃滤渣，取清亮滤液注入乳房的不同位置，从而达到丰胸效果。
然而，移植后自体脂肪干细胞进入体内后，其成脂分化进程慢、增殖能力低、特异性基因表达水平低、脂肪酸代谢程度低。因此，发明一种提高脂肪间充质干细胞成脂分化能力、促进脂肪酸代谢的脂肪间充质干细胞培养方法对于干细胞培养技术领域十分重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，增强脂肪间充质干细胞的成脂分化能力，提高细胞增殖速度，促进细胞的脂肪酸代谢。
为实现上述目的，本发明提供了一种棕榈油酸在脂肪间充质干细胞培养方法中的应用。
一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤如下：
S1、取培养至1-3代的脂肪间充质干细胞，接种到培养基中；
S2、向传代细胞中，加入消化酶，消化3-5min，收集细胞，离心，弃上清，按1:3的传代比例将干细胞接种到新的培养皿或孔板中；
S3、将100mg棕榈油酸溶于DMSO中，制成0.5mol/L的浓储液，再加入到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中，制成棕榈油酸条件培养液；
S4、预处理：取3-5代的传代细胞，接种至棕榈油酸条件培养液中，培养1-5代；
S5、诱导成脂分化：添加成脂诱导剂至已接种预处理传代细胞的培养液中，每隔48h换一次培养液，继续培养1-5代。
优选的，步骤S1中，所述培养基所含成分为DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS。
优选的，步骤S2中，所述传代细胞为汇合度达到85-90％的细胞；所述消化酶为0.25％的胰酶；所述离心速率为1500rpm，离心时间为5min。
优选的，步骤S3中，所述棕榈油酸条件培养液的浓度为0.01-1mmol/L。
优选的，步骤S5中，所述成脂诱导剂的成分为10ng/mL胰岛素、1nmol/L地塞米松、0.25mmol/LIBMX、0.2mmol/L吲哚美辛；所述培养液所含成分为DMEM、3％FBS、0.1％PS；培养4天后，所述成脂诱导剂中不再添加IBMX和吲哚美辛。
因此，本发明采用上述一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，具有提高脂肪间充质干细胞的增值能力和成脂分化能力的特点，能促进脂肪酸代谢，从而加快成脂分化进程。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是实验测试一中经不同浓度棕榈油酸条件培养液预处理后的细胞生长曲线图(A)和群体倍增时间图(B)；
图2是实验测试一中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代(B)与5代(C)后的细胞相差图；
图3是实验测试一中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代与5代后的细胞表面标记分子(A、C)与多能因子(B、D)的表达情况图；
图4是实验测试一中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代(A-C)与5代(D-F)后的细胞的脂肪酸相关基因表达情况图；
图5是实验测试一中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代(B)与5代(C)并进行成脂诱导分化后的细胞油红O染色图；
图6是实验测试一中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代(A)与5代(B)并进行成脂诱导分化后的细胞中甘油三酯含量图；
图7是实验测试一中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代(A)与5代(B)并进行成脂诱导分化后的脂肪细胞特异性基因表达情况图；
图8是实验测试二中经不同浓度棕榈油酸条件培养液预处理后的细胞生长曲线图(A)和群体倍增时间图(B)；
图9是实验测试二中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代后的细胞表面标记分子(A)与多能因子(B)的表达情况图；
图10是实验测试二中经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液预处理1代后的细胞脂肪酸相关基因表达情况图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例一
一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤如下：
S1、取培养至1-3代的脂肪间充质干细胞，接种到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中；
S2、向汇合度达到85-90％的传代细胞中，加入0.25％胰酶，消化3-5min，收集细胞，1500rpm，离心5min，弃上清，按1:3的传代比例将干细胞接种到新的培养皿或孔板中；
S3、将100mg棕榈油酸溶于DMSO中，制成0.5mol/L的浓储液，再加入到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中，制成0.01mmol/L棕榈油酸条件培养液；
S4、预处理：取3-5代的传代细胞，接种至棕榈油酸条件培养液中，培养1-5代；
S5、诱导成脂分化：添加成脂诱导剂至已接种预处理传代细胞的培养液中，其中，成脂诱导剂的成分为10ng/mL胰岛素、1nmol/L地塞米松、0.25mmol/LIBMX、0.2mmol/L吲哚美辛，培养液的成分为DMEM、3％FBS、0.1％PS，每隔48h换一次培养液，培养4天后，不再添加IBMX和吲哚美辛，培养1-5代。
实施例二
一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤如下：
S1、取培养至1-3代的脂肪间充质干细胞，接种到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中；
S2、向汇合度达到85-90％的传代细胞中，加入0.25％胰酶，消化3-5min，收集细胞，1500rpm，离心5min，弃上清，按1:3的传代比例将干细胞接种到新的培养皿或孔板中；
S3、将100mg棕榈油酸溶于DMSO中，制成0.5mol/L的浓储液，再加入到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中，制成0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液；
S4、预处理：取3-5代的传代细胞，接种至棕榈油酸条件培养液中，培养1-5代；
S5、诱导成脂分化：添加成脂诱导剂至已接种预处理传代细胞的培养液中，其中，成脂诱导剂的成分为10ng/mL胰岛素、1nmol/L地塞米松、0.25mmol/LIBMX、0.2mmol/L吲哚美辛，培养液的成分为DMEM、3％FBS、0.1％PS，每隔48h换一次培养液，培养4天后，不再添加IBMX和吲哚美辛，培养1-5代。
实施例三
一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤如下：
S1、取培养至1-3代的脂肪间充质干细胞，接种到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中；
S2、向汇合度达到85-90％的传代细胞中，加入0.25％胰酶，消化3-5min，收集细胞，1500rpm，离心5min，弃上清，按1:3的传代比例将干细胞接种到新的培养皿或孔板中；
S3、将100mg棕榈油酸溶于DMSO中，制成0.5mol/L的浓储液，再加入到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中，制成1mmol/L棕榈油酸条件培养液；
S4、预处理：取3-5代的传代细胞，接种至棕榈油酸条件培养液中，培养1-5代；
S5、诱导成脂分化：添加成脂诱导剂至已接种预处理传代细胞的培养液中，其中，成脂诱导剂的成分为10ng/mL胰岛素、1nmol/L地塞米松、0.25mmol/LIBMX、0.2mmol/L吲哚美辛，培养液的成分为DMEM、3％FBS、0.1％PS，每隔48h换一次培养液，培养4天后，不再添加IBMX和吲哚美辛，培养1-5代。
对比例一
一种常规培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤如下：
S1、取培养至1-3代的脂肪间充质干细胞，接种到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中；
S2、向汇合度达到85-90％的传代细胞中，加入0.25％胰酶，消化3-5min，收集细胞，1500rpm，离心5min，弃上清，按1:3的传代比例将干细胞接种到新的培养皿或孔板中；
S3、预处理：取3-5代的传代细胞，接种至含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养液中，培养1-5代；
S4、诱导成脂分化：添加成脂诱导剂至已接种预处理传代细胞的培养液中，其中，成脂诱导剂的成分为10ng/mL胰岛素、1nmol/L地塞米松、0.25mmol/LIBMX、0.2mmol/L吲哚美辛，培养液的成分为DMEM、3％FBS、0.1％PS，每隔48h换一次培养液，培养4天后，不再添加IBMX和吲哚美辛，培养1-5代。
实验测试一
以对比例一为对照组，实施例一、二、三分别为实验组一、二、三，其中，培养的细胞为胎牛脂肪间充质干细胞。
(1)分别取对照组、实验组一、二、三中连续培养8天后的胎牛脂肪间充质干细胞，统计细胞增殖数，绘制细胞增殖曲线，并根据增殖曲线计算群体倍增时间。
由图1可得，用0.01mmol/L、0.1mmol/L浓度的棕榈油酸条件培养液培养的胎牛脂肪间充质干细胞，其增殖速度与对照组相比稍快；其中，用0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液培养的细胞倍增时间最短。
(2)分别取对照组和实验组二中预处理培养一代(4d)和连续培养五代(20d)的胎牛脂肪间充质干细胞，通过倒置显微镜拍摄获得相差图。
由图2可得，在初始培养时，细胞呈典型的成纤维状，用0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液培养的一代细胞，其成纤维形态不变，连续培养五代后，细胞开始出现上皮状形态。
(3)分别取对照组和实验组二中预处理培养一代(4d)和连续培养五代(20d)的胎牛脂肪间充质干细胞，检测胎牛脂肪间充质干细胞的表面标记分子CD34、CD73、CD90、CD105与多能因子OCT4、SOX2、NANOG的表达情况。
由图3可得，用0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液短期预处理的胎牛脂肪间充质干细胞，其表面标记分子的转录水平均有所升高，多能因子中OCT4和SOX2的表达水平显著升高。用0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液长期预处理的胎牛脂肪间充质干细胞，其表面标记分子中的CD73、CD90和多能性因子中的OCT4、NANOG的表达水平均有显著升高。
(4)分别取对照组和实验组二中预处理培养一代(4d)和连续培养五代(20d)的胎牛脂肪间充质干细胞，检测胎牛脂肪间充质干细胞的脂肪酸相关基因的表达情况。
由图4可得，经0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液短期预处理的胎牛脂肪间充质干细胞中，脂肪酸从头合成基因ACC1、延伸基因ELOVL6、沉积基因DGAT1和ACAT1的表达水平均显著升高，脂肪酸氧化相关基因中线粒体氧化限速基因CPT1A的表达水平也有显著上升，表明棕榈油酸的短期处理对细胞内脂肪酸的合成、延伸、沉积以及线粒体氧化分解有促进作用。经0.1mmol/L棕榈油酸长期预处理的胎牛脂肪间充质干细胞中，脂肪酸从头合成基因的表达水平有所下降，延伸基因ELOVL6的表达水平显著降低，脂肪酸沉积酶DGAT1、ACAT1基因的表达水平有所下降，脂肪酸氧化相关基因中的转录因子PPARγ的表达水平则有显著上升，表明棕榈油酸的长期预处理可抑制细胞内脂肪酸的合成、延伸、沉积以及线粒体氧化分解相关的酶的表达。
(5)分别取对照组和实验组二中预处理培养一代(4d)和连续培养五代(20d)的胎牛脂肪间充质干细胞，并对细胞进行成脂诱导分化。取诱导第14天的细胞，对细胞进行油红O染色，通过倒置显微镜拍摄获得细胞相差图。
由图5可得，用0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液进行预处理，再经成脂诱导分化后的细胞的脂滴可被油红O染成红色，表明细胞已经成功分化为脂肪细胞。
(6)分别取对照组和实验组二中培养一代(4d)和连续培养五代(20d)的胎牛脂肪间充质干细胞，并对细胞进行成脂诱导分化。分别收集诱导第4、7、10、14天的细胞，用ELISA法检测细胞中的甘油三酯含量。
由图6可得，随着诱导时间的增加，细胞内的甘油三酯含量在四个时间点呈时间依赖性增加，且经过棕榈油酸条件培养液短期预处理后的细胞，在分化过程中，其甘油三酯含量始终高于对照组。而经过棕榈油酸条件培养液长期预处理后的细胞，虽然初始甘油三酯含量与对照组相当，但是随着诱导时间的增加，其甘油三酯含量始终高于对照组，且差距逐渐加大。
(7)分别取实验组二中培养一代(4d)和连续培养五代(20d)的胎牛脂肪间充质干细胞，并对细胞进行成脂诱导分化。分别收集诱导第4、7、10、14天的细胞，用实时定量PCR法检测脂肪细胞特异基因的表达水平。
由图7可得，经过棕榈油酸条件培养液短期预处理后的细胞，在分化过程中，其脂肪细胞特异基因ADI、FABP4、LPL，在诱导的第4天时，表达水平低于对照组，但从第7天开始，则逐渐高与对照组，到第14天时，又有所回落；而特异基因PPARγ，则是在诱导第4天时显著高于对照组，然后于第7天回落，之后又逐渐升高。经过棕榈油酸条件培养液长期预处理后的细胞，在分化过程中，其ADI、FABP4、LPL基因的表达规律基本与短期预处理相近，不同的是，ADI和LPL基因在诱导第10天时的表达量显著高于其他检测时间点。而且PPARγ虽与短期预处理相反但与ADI等的变化规律相近。
实验测试二
以对比例一为对照组，实施例一、二、三分别为实验组一、二、三，其中，培养的细胞为成体牛脂肪间充质干细胞。
(1)分别取对照组、实验组一、二、三中连续培养8天后的成体牛脂肪间充质干细胞，统计细胞增殖数，绘制细胞增殖曲线，并根据增殖曲线计算群体倍增时间。
由图8可得，经0.01mmol/L和0.1mmol/L的棕榈油酸条件培养液培养后，对细胞增殖具轻微促进作用；其中，用0.1mmol/L棕榈油酸条件培养液培养后的细胞增殖时间最短。
(2)分别取对照组和实验组二中预处理培养一代(4d)的成体牛脂肪间充质干细胞，检测成体牛脂肪间充质干细胞的表面标记分子CD34、CD90、CD105与多能因子OCT4、SOX2、NANOG的表达情况。
由图9可得，用0.1mmol/L的棕榈油酸条件培养液培养后的细胞，其表面标记分子CD105的RNA表达水平显著升高，多能因子中SOX2的表达水平显著升高，其他基因与对照组的差异甚微。
(3)分别取对照组和实验组二中预处理培养一代(4d)的成体牛脂肪间充质干细胞，检测成体牛脂肪间充质干细胞的脂肪酸相关基因的表达情况。
由图10可得，用0.1mmol/L的棕榈油酸条件培养液短期培养后的细胞，其脂肪酸相关转录因子SREBP、从头合成相关酶基因ACLY和FASN的RNA表达水平显著升高，脂肪酸沉积酶DGAT1和ACAT1基因的表达水平也有显著上升，脂肪酸氧化相关基因中的转录因子PPARγ和脂肪酸线粒体氧化酶CPT1A和CPT1B均有显著提升。表明棕榈油酸的短期预处理可促进细胞内脂肪酸的合成、延伸、沉积以及线粒体氧化分解相关的酶的表达。
因此，本发明采用上述一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，可增强干细胞群体的增殖能力与多能性，促进干细胞的脂肪酸代谢，进而加快干细胞的成脂分化进程，并提高干细胞的成脂分化能力。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种棕榈油酸在脂肪间充质干细胞培养方法中的应用。
2.一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤如下：
S1、取培养至1-3代的脂肪间充质干细胞，接种到培养基中；
S2、向传代细胞中，加入消化酶，消化3-5min，收集细胞，离心，弃上清，按1:3的传代比例将干细胞接种到新的培养皿或孔板中；
S3、将100mg棕榈油酸溶于DMSO中，制成0.5mol/L的浓储液，再加入到含DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS的培养基中，制成棕榈油酸条件培养液；
S4、预处理：取3-5代的传代细胞，接种至棕榈油酸条件培养液中，培养1-5代；
S5、诱导成脂分化：添加成脂诱导剂至已接种预处理传代细胞的培养液中，每隔48h换一次培养液，继续培养1-5代。
3.根据权利要求1所述的一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S1中，所述培养基所含成分为DMEM/F12、15％FBS、0.1％PS。
4.根据权利要求1所述的一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S2中，所述传代细胞为汇合度达到85-90％的细胞；所述消化酶为0.25％的胰酶；所述离心速率为1500rpm，离心时间为5min。
5.根据权利要求1所述的一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S3中，所述棕榈油酸条件培养液的浓度为0.01-1mmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种利用棕榈油酸培养脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤S5中，所述成脂诱导剂的成分为10ng/mL胰岛素、1nmol/L地塞米松、0.25mmol/LIBMX、0.2mmol/L吲哚美辛；所述培养液所含成分为DMEM、3％FBS、0.1％PS；培养4天后，所述成脂诱导剂中不再添加IBMX和吲哚美辛。
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