CN116121122B - 一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用，属于复合益生菌制剂技术领域。所述复合益生菌制剂包括猫源益生菌罗伊氏乳杆菌TC4，其具有良好的耐酸耐胆盐能力和肠上皮细胞粘附性，对常见的导致猫腹泻的致病菌如大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌和志贺氏菌等有抑菌效果，对多种抗生素敏感。该复合益生菌制剂还包括动物乳杆菌MC2、凝结芽孢杆菌TBC169和益生元菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶等成分。猫动物试验表明：本发明中的益生菌复合制剂可以通过缓解抗生素导致的肠道菌群失调，激活免疫，从而显著降低由克林霉素导致的猫腹泻率。

Description

一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种防治猫腹泻的益生菌复合制剂及其应用，属于复合益生菌制剂技术领域，具体涉及一种罗伊氏乳杆菌及其在制备防治猫腹泻制剂中的应用。

背景技术

益生菌是一类对宿主健康有益的活微生物，已被证实可以预防和/或治疗由肠道菌群紊乱而导致的宠物腹泻。益生元是指不可被机体消化利用，但可选择性促进肠道有益菌增殖和代谢的碳水化合物，益生元对宿主肠道健康起重要作用，添加一定量的益生元可增强益生菌的功能。抗生素在治疗宠物腹泻中发挥重要作用，然而随着细菌耐药性加剧，严重降低了抗菌药的治疗效果。克林霉素等抗生素可导致宠物抗生素相关胃肠道症状(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)。抗生素腹泻发生的可能机制是肠道微生物群的紊乱，益生菌或合生元与抗生素共同使用可使抗生素性腹泻减少。

目前宠物市场上的益生菌产品来源混杂，保健功能不明确，微生态产品质量良莠不齐。虽然目前已有一些宠物源益生菌的研究和专利申请，但仍缺乏针对纠正抗生素治疗导致的肠道菌群紊乱而开发的宠物源益生菌复合制剂。因此，从健康猫肠道中分离、鉴定和筛选宠物源益生菌，制备成纠正肠道菌群紊乱的猫专用益生菌复合制剂，具有十分重要的应用价值和市场前景。

发明内容

本发明目的之一是提供一株罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)TC4，该罗伊氏乳杆菌TC4已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20367，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该罗伊氏乳杆菌益生菌具有良好的耐酸耐胆盐能力和肠上皮细胞粘附性，对常见的导致猫腹泻的致病菌如大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、和志贺氏菌等有抑菌效果，对多种抗生素敏感。

在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌TC4的16S rRNA基因序列如图2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌TC4的形态学特征的扫描电子显微图(SEM)如图3所示。

本发明目的之二是提供一种包含罗伊氏乳杆菌TC4的益生菌复合制剂。优选地，其组分还包括：动物乳杆菌MC2、凝结芽孢杆菌TBC169中的一种或两种益生菌。更为优选地，其还进一步包括：菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶中的一种或多种益生元。该制剂用于防治抗生素导致的猫肠道菌群紊乱及腹泻。主要表现为：猫急性腹泻严重指数评分和粪便评分显著改善，血液IL-6、TNF-α和IL-10的含量，以及粪便中SIgA的含量升高，同时潜在致病菌大肠杆菌数量降低和有益菌乳酸菌增加。

在本发明的一种实施方式中，所述益生菌复合制剂由益生菌罗伊氏乳杆菌TC4、动物乳杆菌MC2、凝结芽孢杆菌TBC169和益生元菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶组成。

在本发明的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌TC4活菌数量≥1×10⁸CFU/g，动物乳杆菌MC2活菌数量≥1×10⁸CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数量≥2×10⁷CFU/g。优选地，所述罗伊氏乳杆菌TC4活菌数量为1×10⁸-1×10¹⁰CFU/g，动物乳杆菌MC2活菌数量为1×10⁸-1×10¹⁰CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数量为2×7⁷-2×7¹⁰CFU/g。更为优选地，所述罗伊氏乳杆菌TC4活菌数量为1×10⁹CFU/g，动物乳杆菌MC2活菌数量为1×10⁹CFU/g，凝结芽孢杆菌活菌数量为2×10⁷CFU/g。

在本发明的一种实施方式中，所述益生元菊粉、低聚甘露糖能选择性增殖益生菌罗伊氏乳杆菌和动物乳杆菌，两者起协同作用。

在本发明的一种实施方式中，所述菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶粉的质量比分别为1-4：1-2：1-4。优选地，所述菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶的质量比分别为3：2：3。

本发明目的之三是提供如上所述的罗伊氏乳杆菌或如上所述的益生菌复合制剂在制备防治腹泻制剂中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述腹泻是抗生素导致的腹泻。优选地，所述抗生素为阿莫西林、红霉素、克林霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄西林、磺胺甲恶唑、头孢曲松、盘尼西林、头孢西丁和达福普中的一种或多种。更为优选地，所述抗生素为克林霉素。

在本发明的一种实施方式中，所述腹泻是宠物腹泻。优选地，所述宠物腹泻是猫腹泻或犬腹泻。更优选地，所述宠物腹泻是猫腹泻。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂为食品、药品或保健品。

附图说明

图1：利用体外肠道菌群模拟系统发酵益生元底物增殖潜在益生菌的结果，不同益生元底物发酵后肠道菌群在属水平的丰度(A)；被益生元增殖的细菌OTU(B)；细菌OTU序列在EzBioCloud数据库的比对结果(C)。

图2：罗伊氏乳杆菌TC4的16s rRNA基因序列。

图3：罗伊氏乳杆菌TC4的扫描电镜图。

图4：罗伊氏乳杆菌TC4的胃酸和胆盐敏感性(A)、细胞黏附能力(B)、抑菌效果(C)和抗生素敏感性(D)。

图5：益生菌复合制剂对猫急性腹泻严重程度指数(A)和Purina粪便评分(B)的改善作用。

图6：益生菌复合制剂对免疫指标sIgA(A)、IL-10(B)、IL-6(C)和TNF-α(D)的影响。

图7：益生菌复合制剂对粪便样本中大肠杆菌(A)、乳酸菌(B)和总细菌数(C)的影响。

图8：益生菌复合制剂在属水平对肠道菌群结构的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例中使用的罗伊氏乳杆菌TC4，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20367，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，最新命名为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)。

以下实施例中使用的动物乳杆菌MC2，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20368，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)。

实施例1体外肠道菌群模拟系统发酵益生元，增殖益生菌

1.1粪便样本采集

收集杭州地区两家猫舍共计12只种猫的粪便样本，所有提供粪便样本的猫健康状况良好，无消化系统疾病，在样本采集前至少3个月未接受任何药物治疗，包括抗生素。经过浙江省农业科学院伦理委员会批准(伦理号2022ZAASLA45)，收集的新鲜粪便样本保存在无菌收集管中，3小时内运回实验室处理。

1.2批量发酵

将粪便样本的批量培养物在含有5mL基础培养基(YCFA)的10mL小瓶中发酵。为了评估壳聚糖(LCOS)、壳寡糖(COS)、阿拉伯胶(GUM)、低聚甘露糖(MOS)、果寡糖(FOS)、菊粉(INU)这6种不同益生元对猫粪便菌群的影响，在发酵前向粪便样品中添加经过滤膜灭菌的益生元原液，最终浓度为8mg/mL。另制备不含益生元的培养基(CONT)以及原始粪便样本(ORI)作为对照。在115℃下对培养基进行15min的高压灭菌，将初始pH调整为6.5。取新鲜粪便样品，用全自动粪便匀浆机将其悬浮于8.0mL0.1M厌氧磷酸盐-缓冲盐水(pH＝7.0)中，制成10％(w/v)粪便匀浆液，制备接种物。在37℃下，将1％的粪浆接种到每个小瓶中，进行批量发酵。24小时后，将培养物离心，收集沉淀，-80℃保存。

1.3肠道菌群16S rRNA高通量测序

使用QIAamp DNAStool Mini Kit从发酵液中提取微生物基因组DNA。使用NanoDrop2000紫外分光光度计测定提取的DNA浓度，并通过琼脂凝胶电泳(1.0％)确认DNA的完整性和大小。采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)分别扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区。二代测序(2×300对端)在IlluminaMiSeq平台上进行，按照美吉生物制药科技有限公司(上海，中国)的标准方案进行。测序后，通过QIIME软件包对原始fastq文件进行解复用和质量过滤。使用UPARSE将操作分类单元(Operational taxonomic units,OTU)聚类在97％的相似度，使用UCHIME识别并删除嵌合序列。使用RDP Classifier对SILVA数据库v.128进行OTU的分类注释，置信阈值为0.7。为了进一步计算alpha和beta多样性，我们删除了罕见的OTU(<0.001％)，以减少样本的异质性。生物信息学分析在美吉云平台上运行。

结果表明，相对于对照组(CONT)，益生元FOS、MOS及INU底物发酵可以显著提高乳酸菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)以及链球菌(Streptococcus)的相对丰度(图1A)。其中OTU50、OTU307和OTU198是可以被益生元FOS、MOS、INU显著增殖的微生物类别(图1B)。上传此3个OTU序列，通过EzBioCloud数据库中的16S rRNA基因比对发现，OTU50、OTU307和OTU198分别对应鼠乳杆菌(L.murinus)/动物乳杆菌(L.animalis)(仅16SrRNA序列无法区分这两种微生物的菌种，需宏基因组测序确认)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)和约氏乳杆菌(L.johnsonii)，序列相似度为100％(图1C)，说明，这三类微生物是可以被益生元增殖的潜在益生菌。鉴于FOS和INU的功能类似，所以选择益生元复配的时候，只选择了INU和MOS复配，又考虑到阿拉伯胶可以显著增加群菌短链脂肪酸的生成，因此益生元复配中也加入了GUM。

实施例2健康猫粪便中潜在益生菌的分离培养和鉴定

2.1菌株的分离培养

将猫的新鲜粪便样本用无菌生理盐水连续梯度稀释后分别涂布于MRS、TPY、RCM 3种琼脂培养基(OXOID)，在超净台或厌氧手套箱的37℃条件下孵育48±3小时。在鉴定之前随机选择单菌落并重复在培养基上划线进行分离。

2.2菌株的鉴定

通过MALDI Biotyper(Bruker,Germany)在种水平上鉴定所有分离株，当MALDI-TOF MS的分数≤2.0时，通过16S rDNA基因测序分析进行额外确认。提取菌株基因组DNA，利用细菌通用引物(上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对菌株的16S rRNA基因组进行PCR扩增。扩增后，将扩增产物于1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，确认目的条带后送测序公司测序并将测序结果在Genbank数据库进行BLAST比对。本研究选择其中被益生元增殖的43株乳酸菌分离株，将每种分离株在20％(w/v)甘油管中于-80℃下保存，用于进一步筛选和评价研究。

2.3乳酸菌扫描电镜(SEM)

将对数生长期的乳酸菌离心后去上清，然后用2.5％戊二醛溶液中4℃固定过夜。在PBS中洗涤三次15分钟后，用1％的锇酸溶液固定样品1-2小时，用梯度浓度(包括50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％乙醇处理两次，每次20min；最后，在真空冷冻干燥器中干燥到临界点，使用离子溅射涂层器用金溅射涂层。然后通过SEM(TM3000，Hitachi，日本)观察涂层样品。

我们利用MRS、TPY、RCM 3种琼脂培养基在厌氧或需氧条件下总共从猫肠道菌群中分离到237株微生物。通过MALDI Biotyper和16S rDNA基因测序鉴定，共得到43株潜在益生菌菌株进行体外益生功能筛选评价，包括24株鼠/动物乳杆菌、14株罗伊氏乳杆菌、5株约氏乳杆菌。其中，罗伊氏乳杆TC4的测序结果序列如图2所示，该序列经与EzBioCloud数据库比对后，发现该序列与罗伊氏乳杆菌16S rDNA序列同源性达100％。该菌株已于2020年7月16日提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.20367。扫描电镜显示：罗伊氏乳杆TC4的形态特征是一种末端呈圆形的短杆菌(图3)。

实施例3体外益生菌筛选

3.1胃酸和胆盐敏感性

根据Silva等人(2013)和Sandes等人(2017)的改进方法评估了人工胃液敏感性(GJS)和人工胆汁敏感性(BSS)。将乳酸菌克隆接种于pH 7.0的无菌生理盐水(对照)或人工胃液(NaCl2g/L，胃蛋白酶3.2g/L，pH 2.5)或人工小肠液(NaHCO₃ 150mM，胰蛋白酶1.9g/L，pH 8.0)中，并在37℃下孵育3小时。离心样品，将沉淀悬浮在1mL MRS肉汤中。对于GJS和BSS分析，将每种培养物转移到管中，在MRS肉汤或补充有0.3％胆汁酸的MRS肉汤中稀释2％(v/v)。然后，将200μL细菌悬浮液等分到无菌的96孔微孔板中，并在恒温分光光度计中孵育。在37℃下持续培养18小时。通过每30分钟测量的OD₆₂₀吸光度确定生长曲线。使用程序Graphpad Prism 8.0通过以下公式计算生长抑制百分比：(1-AreaS/AreaCT)×100，其中AreaS和AreaCT分别对应菌株在人工胃液或胆汁盐压力下和对照的生长曲线下面积。菌株被分类为胃酸胆盐抗性GJS/BSS<40％、中度抗性40≤GJS/BSS≤75％或敏感GJS/BSS>75％。结果基于三个独立测定的平均值。图4A显示了罗伊氏乳杆菌TC4对胃酸的抗性是3.2％，对胆汁的抗性为65.1％，说明其对胃酸具有抗性(GJS<40％)，对胆盐具有中度抗性(40≤BSS≤75％)。

3.2细胞黏附实验

将细胞在5％CO₂培养箱中培养，用Dulbecco改良的Eagle基本培养基(DMEM)，添加20％灭活的胎牛血清，100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。用胰蛋白酶消化单层细胞3分钟，用血细胞计数器计数，并以2.5×10⁴个细胞/孔的密度接种在1.0mL的细胞培养物中。为了进行粘附测定，将Caco-2在不含抗生素的1mL培养基中培养。每隔一天更换一次培养基，孵育15天后准备进行粘附测定。候选乳酸菌在37℃的MRS肉汤中培养24h，然后用无菌PBS(pH＝7.4)洗涤两次。将得到的细胞在补充20％胎牛血清的DMEM中适当稀释，以达到约10⁹CFU/mL的浓度。将细菌悬浮液加到组织培养板的每个孔中，并在37℃下孵育2小时。孵育后，将单层细胞用PBS洗涤3次，并用Triton X-100溶液(0.05％)裂解Caco-2细胞，然后通过在MRS琼脂上的稀释平板法对粘附于Caco-2的细菌进行计数。此外，用SEM确认乳酸菌菌株对Caco-2细胞的粘附。所有步骤都在放置在6孔组织板上的无菌玻璃盖玻片上进行。使用2.5％w/v戊二醛(用0.1M磷酸盐缓冲液pH＝7.4配置)进行固定。然后，用PBS洗涤样品，用2％w/v的四氧化锇进行固定。最终，将样品在一系列梯度的乙醇中脱水，先是30％，然后是50％，70％，80％和无水乙醇。细胞在临界点干燥器(英国E3100)中干燥，并涂金，使用SEM检查样品。

扫描电子显微镜(SEM)显示乳酸杆菌附着在Caco-2细胞上(图4B)说明罗伊氏乳杆菌TC4对Caco-2细胞具有黏附性，计数结果显示其平均黏附数为7.0±2.2CFU/细胞。

3.3抑菌试验

通过将24小时的乳酸杆菌MRS肉汤培养物在10000rpm，4℃下离心20分钟，然后使用0.22μm注射器过滤器过滤除菌，制备乳杆菌分离物的无细胞上清液。将4种测试病原体(大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、和志贺氏菌)的接种物(30μL-75μL)加入到BHI琼脂(琼脂浓度8％)上进行菌苔培养，将牛津杯置于BHI固体培养基的平板上。然后将无细胞上清液(50-100μl)的乳杆菌分离物加入到在BHI琼脂中制备的预密封孔(直径＝7mm)中，并在37℃需氧培养18-24小时。试验病原体的抑制程度：高(直径>15mm的抑菌圈，+++)；中等(10-15mm直径的抑菌圈，++)；低(<10mm直径的区抑菌圈，+)；无(-)。

抑菌试验表明：罗伊氏乳杆菌TC4对大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、和志贺氏菌均为中度抑菌，抑菌圈范围为10-15mm(图4C)。

3.4抗生素药物敏感性试验

通过琼脂盘扩散法进行抗生素微生物药敏试验。分离的乳酸菌在MRS琼脂(Oxoid)上，在需氧条件下，37℃培养24小时。然后，使用0.85％缓冲盐水制备浓度为10⁸个细胞悬浮液(0.5McFarland标度)，并涂布于MRS琼脂。抗生素圆盘(Oxoid)分布于琼脂表面，在37℃下培养24小时。然后，根据自动抑菌圈测量的菌落计数器记录抑菌圈的直径(mm)。使用的15种抗生素圆盘分别是：阿莫西林-AMC(30μg)、红霉素-E(15μg)、克林霉素-DA(2μg)、氯霉素-C(30μg)、四环素-TE(30μg)、庆大霉素-CN(10μg)、氨苄青霉素-AMP(10μg)、磺胺甲恶唑-SXT(25μg)、头孢曲松-CRO(30μg)、卡那霉素-K(30μg)、链霉素-S(10μg)、恩诺沙星-ENR(5μg)、青霉素GP(10U)、头孢西丁-FOX(30μg)和奎奴普汀-QD(15μg)。使用大肠杆菌ATCC25922对含有抗菌剂的圆盘进行质量控制。根据Charteris等人(1998年)提出的临界水平，将乳杆菌分离株分为耐药、中度敏感和敏感三类。

抗生素药敏试验结果表明：罗伊氏乳杆菌TC4对阿莫西林、红霉素、克林霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄西林、磺胺甲恶唑、头孢曲松、盘尼西林、头孢西丁和达福普抗生素敏感(图4D)，对庆大霉素中等敏感，而对卡那霉素、链霉素和恩诺沙星耐药。值得注意的是氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素)、环丙沙星和甲氧苄啶的抗生素耐药性被认为是大多数乳酸菌种固有的。

实施例4猫动物实验

4.1实验流程

选用3-6月龄的健康蓝猫共32只，随机分为4组，每组8只，分别为对照组(CONT)、克林霉素腹泻模型组(AAD)、益生菌+克林霉素腹泻模型组(PROB)和合生元+克林霉素腹泻模型组(SYBR)，实验周期为21天。猫咪采用笼养方式，自由采食和饮水。每日清理猫舍，定期观察临床症状，记录体重、进食等数据。

第1-7天，CONT组和AAD组分别灌服0.9％NaCl；PROB组灌服罗伊氏乳杆菌TC4(1×10⁹CFU/mL)；SYBR组灌服含罗伊氏乳杆菌TC4的益生菌复合制剂(配方如表1所示)，灌服量均为5mL/只/天。

表1猫复合益生菌制剂配方

第8-10天连续3日，CONT组继续灌服0.9％NaCl，AAD组、PROB组和SYBR组分别灌服克林霉素溶液5mL(平均剂量为35mg/kg，称量磨成粉末溶于生理盐水中)；间隔4个小时后，PROB组继续灌服罗伊氏乳杆菌TC4；SYBR组灌服含罗伊氏乳杆菌TC4的益生菌复合制剂。

第11-21天，CONT组和AAD组分别灌服0.9％NaCl；PROB组继续灌服罗伊氏乳杆菌TC4；SYBR组灌服含罗伊氏乳杆菌TC4的益生菌复合制剂。

第8、11、22天采集血液，分离血清，送血常规检测，剩余血样保存于-20℃。粪便样本于第7、10、21天灌服完毕后开始收集，并放置-20℃保存。

4.2腹泻评估

通过猫急性腹泻严重程度指数的评分系统(Acute diarrhea severity index，ADS；表2)和Purina粪便评分表(表3)评估罗伊氏乳杆菌TC4及其益生菌复合制剂防治腹泻的作用。

表2猫急性腹泻严重程度指数的评分系统(ADS)

注：FeSc:根据布里斯托大便表的粪便评分系统

表3Purina粪便评分表

注：1-2分表示便秘；3-4分是理想粪便形状，4分是最容易排便的形状；5-7分代表轻度到重度腹泻。

ADS评分系统将活动评分、食欲评分、呕吐评分、排便频率和粪便水合程度这5方面的评分相加得到的ADS总分。图5A结果显示：在造模期间(第8-10天)，抗生素腹泻模型组(AAD)的评分最高，并与CONT组存在显著差异(p＜0.01)，并在造模后一直维持在较高水平，说明克林霉素造成的腹泻效应持久。而益生菌组(PROB)和合生元组(SYNB组)评分均低于AAD组。从AAD评分指标看，PROB组防治腹泻的效果优于SYNB组。

Purina粪便评分显示(图5B)：克林霉素造模腹泻后，从第9天开始，AAD组的猫的粪便评分大于4分，并在造模第3天(即第10天)时，粪便评分达到最高值，与CONT组存在极显著差异(p＜0.01)，在恢复期间(第11-22天期间)，粪便分数继续维持在4分左右或以上，表明在使用抗生素后，在没有任何益生菌/合生元保护肠道的措施下，抗生素对肠道菌群紊乱造成深远影响。而PROB组的粪便评分仅在第9、10两天有所上升，但在第11天显著下降，并维持在2-3分，说明使用益生菌可以对猫的肠道稳态起到保护作用，并显著减轻猫的腹泻症状。SYNB组在克林霉素造模后，虽然粪便评分低于AAD组，并维持在4分左右，但效果不及PROB组。腹泻评分指标表明，罗伊氏乳杆菌TC4和其益生菌复合制剂均有防治克林霉素诱导的猫腹泻的作用，且单用罗伊氏乳杆菌TC4的效果优于其益生菌复合制剂。

4.3免疫指标评估

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)对猫血清样品中的白细胞介素6、干扰素α和白细胞介素10，共3种免疫因子的含量进行检测。进一步采用ELISA方法对粪便样品中的分泌型免疫球蛋白A(SIgA)含量进行检测。

结果表明，在服用罗伊氏乳杆TC4一周后，PROB组的粪便分泌型免疫球蛋白(SlgA)的含量显著升高。在克林霉素造模腹泻后，AAD组、PROB组和SYNB组在第11天和22天的粪便SlgA量显著高于对照CONT组(图6A)。此外，只有SYNB组的血清IL-10、IL-6、TNF-α(图6B-6D)在第22天显著升高，说明相对于益生菌，合生元可缓慢激活猫咪的免疫应答，通过同时增加血清中抗炎和抑炎因子的含量，对猫的肠道提供更强的保护作用。

4.4细菌总数、乳酸杆菌和大肠杆菌的qPCR定量检测

采用蛋白酶K裂解法进行对猫粪便样本进行基因组DNA抽提，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，NanoDrop2000检测DNA纯度，Quantus Flourometer(Picogreen)检测DNA浓度。利用大肠埃希菌和嗜酸乳杆菌16S rRNA基因的PCR产物构建质粒，将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准曲线。定量细菌总数、乳酸杆菌和大肠杆菌所用的引物如表4所示。使用诺唯赞的Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒扩增。qPCR扩增程序如下：预变性：95℃预变性30s，循环1次。循环反应：在95℃变性10s，60℃退火30S，循环40次。在熔解曲线阶段：95℃反应15S，60℃反应60S，95℃反应15S，循环1次。荧光数据采集在延伸时进行。实时定量PCR在Stratagene Mx3000p荧光定量PCR仪中进行。每次扩增最后一个循环后进行产物熔解曲线分析，以确定扩增的特异性。

表4引物列表

结果如图7所示，猫咪在灌服益生菌或合生元一周后，在第7天，总细菌和乳酸菌数在PROB组和SYNB组相对于CONT组显著升高，而大肠杆菌数在各组间没有显著差异，提示灌服益生菌或合生元增加了潜在益生菌的数量。在克林霉素造模腹泻3天后的第11天，AAD组和PROB组的大肠杆菌数相对于对照CONT组增多，而SYNB组与对照组无明显差异，PROB组和SYNB组的乳酸菌和总菌数量继续保持高位水平。第22天时，大肠杆菌与总细菌数在各组间均无显著差异，PROB组和SYNB组的乳酸菌数显著高于对照组。以上结果说明使用克林霉素破坏了肠道菌群稳态，导致猫咪腹泻，而给予猫咪益生菌和合生元，可以提高其肠道内乳酸菌和总细菌的含量，让乳酸菌更持久地定植于肠道，纠正了肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生，从而大幅度降低腹泻率。

4.5肠道菌群16S rRNA高通量测序

测序方法同实施例1中的1.3。

如图8所示，猫咪在灌服益生菌或合生元一周后，在第7天，PROB组和SYNB组的乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度显著升高，相应的双歧杆菌属(Bifidobacterium)和欧氏菌属(Olsenella)的丰度相对降低。高通量测序的结果与qPCR的结果相一致，说明灌服益生菌或合生元增加了乳酸菌的数量。在克林霉素造模腹泻3天后的第11天，只有没有益生菌/合生元保护的AAD组的大肠杆菌/志贺氏杆菌属(Escherichia/Shigella)丰度显著增加，而PROB组和SYNB组则与CONT组则无显著差异。相对于CONT组，AAD、PROB和SYNB三组的乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度增加而双歧杆菌属(Bifidobacterium)和欧氏菌属(Olsenella)含量相对降低。在第22天，由于持续的灌服益生菌和合生元，PROB组和SYNB组的乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度维持在高位水平。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一株罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)TC4，已于2020年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20367，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.一种包含权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)TC4的益生菌复合制剂。

3.根据权利要求2所述的益生菌复合制剂，其特征在于，所述益生菌复合制剂由罗伊氏乳杆菌TC4、动物乳杆菌MC2、凝结芽孢杆菌TBC169、菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶组成；所述动物乳杆菌MC2保藏号为CGMCC No.20368。

4.根据权利要求3所述的益生菌复合制剂，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌TC4活菌数量≥1×10 ⁸ CFU/g，动物乳杆菌MC2活菌数量≥1×10 ⁸ CFU/g，凝结芽孢杆菌TBC169活菌数量≥2×10 ⁷ CFU/g。

5.根据权利要求3所述的益生菌复合制剂，其特征在于，所述菊粉、低聚甘露糖、阿拉伯胶的质量比分别为（1-4）：（1-2）：（1-4）。

6.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)TC4或权利要求2-5任一项所述的益生菌复合制剂在制备防治猫腹泻制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述腹泻是抗生素导致的腹泻。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗生素为阿莫西林、红霉素、克林霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄西林、磺胺甲恶唑、头孢曲松、盘尼西林、头孢西丁和达福普中的一种或多种。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述防治猫腹泻制剂为食品、药品或保健品。