CN116114791A - 一种含改性腐植酸钠微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含改性腐植酸钠的复合微生态制剂及其制备方法，通过一次联合发酵枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、凝结芽孢杆菌菌液，后续加入改性腐植酸钠、玉米淀粉、滑石粉和食盐，干燥过筛后制备出一种含改性腐植酸钠的复合微生态制剂，该复合微生态制剂将好氧型、兼性厌氧、厌氧营养型菌体搭配，实现了有氧协同联合发酵，不仅成品菌体配比合理、有效活菌总数高，而且分散度均一、稳定性周期长，更耐储存和运输。

Description

一种含改性腐植酸钠微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种含改性腐植酸钠微生态制剂及其制备方法。

背景技术

微生态制剂是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂，因其具生物活性功能多、不污染环境、无残留影响等优点，在间接替代抗生素药物使用上发挥着巨大的作用。目前，微生态制剂的菌种主要包括酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌，其多为单一菌种发酵后简单混合，造成培养基底料营养物质浪费。

腐植酸钠C₉H₈Na₂O₄，无毒无臭无腐蚀，具有抑菌、止泻、收敛的作用，被认为是畜禽养殖“后抗生素时代”及饲用氧化锌禁用后的重要替代品之一。但现有技术表明，1％普通腐植酸钠作为载体加入会极大影响制剂的pH值(pH＞11.0)，造成微生态制剂在制备及存储过程中活性减弱甚至丧失。

专利CN108865935A公开了一种水质改良的微生态制剂及其制备方法，其为液体制剂且载体多为水不溶性，影响制剂中的菌体分散度，容易发生菌体沉淀，从而导致成型产品活性保持困难、储存失活。

专利CN109010662A公开了一种促消化促生长微生态制剂，其有效菌粉及活性物因各自密度差异，导致分散不均一。

综上，目前，市场上需要一种成品活性高、分散均一、易于储存，且可利用腐殖酸的多种菌种混合的微生态制剂生产方法。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种含改性腐植酸钠的复合微生态制剂及其制备方法，通过一次联合发酵枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、凝结芽孢杆菌菌液，后续加入改性腐植酸钠、玉米淀粉、滑石粉和食盐，干燥过筛后制备出一种含改性腐植酸钠的复合微生态制剂，该复合微生态制剂将好氧型、兼性厌氧、厌氧营养型菌体搭配，实现了有氧协同联合发酵，不仅成品菌体配比合理、有效活菌总数高，而且分散度均一、稳定性周期长，更耐储存和运输。

为了达到上述效果，本发明采用了以下技术方案：

本发明一方面提供了一种混合微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

1)使用培养液分别配置枯草芽孢杆菌液、凝结芽孢杆菌液、丁酸梭菌液；

2)使用糖蜜、中温豆饼粉、硫酸铵、玉米粉、脱酚棉籽蛋白粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰和水制备发酵培养基；

3)将枯草芽孢杆菌液接种至发酵培养基，培养一段时间后，进行第二次接种；

4)将凝结芽孢杆菌液接种至步骤3)所述的发酵培养基上，培养一段时间后，进行第三次接种；

5)将丁酸梭菌液接种至步骤4)所述的发酵培养基上，进行培养，获得混合菌液；

6)将混合菌液、改性腐植酸钠、玉米淀粉、滑石粉和食盐混合均匀后，干燥过筛，得含腐植酸钠的混合微生态制剂。

进一步的，步骤1)培养液为酵母浸粉0.3％-0.5％、蛋白胨0.8％-1.0％、葡萄糖0.5-0.8％、氯化钠0.8％-1.0％、氯化钙0.03％-0.05％、硫酸锰0.01％-0.03％、硫酸铵0.05％-0.08％，用氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5±0.5，水补齐100％，高温灭菌，冷却，接种，培养，菌液浓度OD₆₀₀为0.6×10⁸-1.0×10⁸CFU/mL。

进一步的，步骤2)的发酵培养基中，糖蜜3％-5％、中温豆饼粉1.5％-3.0％、硫酸铵0.05％-0.10％、玉米粉2％-5％、脱酚棉籽蛋白粉0.1％-0.2％、磷酸氢二钾0.05％-0.15％、磷酸二氢钠0.1％-0.3％、硫酸镁0.05％-0.15％、氯化钙0.01％-0.05％、硫酸锰0.003％-0.01％、水补齐100％。

进一步的，步骤3)接种为将枯草芽孢杆菌菌液按0.5％-2％(v/v)的比例接种；培养条件为使用1M磷酸或氨水调节发酵培养基pH，pH控制在4.5-6.5；溶解氧控制20％-50％；37℃培养12-14小时，在1h内将培养温度缓慢升温至40℃。

进一步的，步骤4)接种为将凝结芽孢杆菌种子液按1％-2.5％(v/v)的比例接种；培养条件为使用1M磷酸或氨水调节发酵培养基pH，pH控制在6.5-7.5，溶解氧控制15％-25％，40℃培养13-16小时，1h内缓慢降温至35℃。

进一步的，步骤5)接种为将丁酸梭菌种子液按照1％-3％(v/v)的比例接种；培养条件为使用1M磷酸或氨水调节发酵培养基pH，pH控制在6.0-8.0，静置培养20-24小时。

进一步的，步骤6)改性腐植酸钠5％-12％(w/w)、玉米淀粉3％-5％(w/w)、滑石粉0.05％-0.1％(w/w)、食盐0.1％-0.2％(w/w)；干燥为喷雾干燥；喷雾进风温度127℃-138℃，出风温度68℃-72℃。

本发明另一方面提供了通过上述制备方法制备的含腐植酸钠的混合微生态制剂。

本发明中使用的改性腐植酸钠，其制备步骤包括：

(1)将10份腐植酸矿粉与1份氢氧化钠及10份蒸馏水在搅拌反应釜中混匀，通入蒸汽反应120分钟，获得腐植酸钠粗品；

(2)将腐植酸钠粗品经2000rpm离心20min获得含有可溶性腐植酸钠的离心液，并将离心液转至搅拌反应釜中；

(3)在搅拌反应釜中调整离心液中的腐植酸钠含量为40-50％；

(4)向搅拌反应釜中加入单宁酯酰水解酶和漆酶酶解；单宁酯酰水解酶占腐植酸钠重量的0.05～0.25％；漆酶占腐植酸钠重量的0.01-0.05％，反应温度为40～60℃，150-200rpm反应60-120min，获得改性腐植酸钠反应液；

(5)改性腐植酸钠反应液经干燥获得改性腐植酸钠制品。

有益效果：

1、本发明将好氧型枯草芽孢杆菌首先接种，消耗掉大量氧气，为兼性厌氧型凝结芽孢杆菌二次接种和发酵提供合适的低氧环境，前两次菌种接种发酵一段时间后，为厌氧型丁酸梭菌三次接种和发酵提供了合适的无氧环境，三者实现了有氧协同发酵，三次接种可避免前期竞争抑制，同时可相互促进增殖，缩短各自发酵周期。

2、本发明通过好氧型、兼性厌氧、厌氧营养型菌体搭配，将枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、凝结芽孢杆菌三次接种，一次联合发酵，实现了菌种次级代谢产物的有效利用和培养基营养成分的充分利用。

3、本发明加入改性腐植酸钠，降低了微生态制剂pH，提高了微生态制剂有效活菌保有率。

4、本发明制备的含改性腐植酸钠微生态制剂作为饲料添加剂使用时，其通过提高活菌数和有效活菌保有率，可维持动物消化道有益菌的优势作用，限制有害菌的毒害作用，从而提高机体的抗应激能力，进一步提高饲料转化率、增加动物体重。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明所用试剂均为市售，无特殊要求；本发明所用发酵设备为常规容积、压力要求市售设备主体根据实际培养需求进行部分连接管道和配件改装。

本发明菌种来源：枯草芽孢杆菌保藏号为CCTCC CB 20081704、丁酸梭菌保藏号为CCTCC CB 20081668，凝结芽孢杆菌保藏号为CCTCC AB 92066。

液体混合微生态制剂制备方法参照CN107699527一种益生菌微生态制剂及其制备方法和应用实施；

固体混合微生态制剂制备方法参照CN107699527一种益生菌微生态制剂及其制备方法和应用实施；

普通腐植酸钠参照CN109081924一种饲用腐植酸钠及其制备方法和应用实施；

改性腐殖酸钠制备参照CN201810462099.5改性腐植酸钠制品及制备方法和应用实施；

活菌数测量参照GB4789.2—2016食品微生物菌落总数的测定实施；

还原糖含量参照GB 5009.7-2016食品中还原糖的测定实施。

实施例1：

一种含改性腐植酸钠微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

1)制备枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌混合发酵菌液

①制备种子液：按照酵母浸粉0.5％、蛋白胨1.0％、葡萄糖0.5％、氯化钠1.0％、氯化钙0.03％、硫酸锰0.01％、硫酸铵0.05％取料，用盐酸调节pH至6.5，水补齐100％，高温灭菌，冷却；分别接种枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、丁酸梭菌，制备菌种种子液，培养完成后菌液浓度(OD₆₀₀)分别为0.7×10⁸CFU/mL、0.85×10⁸CFU/mL、0.9×10⁸CFU/mL。

②配制发酵培养基：按照糖蜜4％、中温豆饼粉2.0％、硫酸铵0.07％、玉米粉3％、脱酚棉籽蛋白粉0.15％、磷酸氢二钾0.1％、磷酸二氢钠0.2％、硫酸镁0.1％、氯化钙0.03％、硫酸锰0.007％，水补足100％，取料后混合均匀。

2)发酵工艺控制

①将枯草芽孢杆菌种子液按1％(v/v)的比例接种，初始培养基pH控制5.0(1M磷酸调节)，转速100rpm-200rpm，通风0.6-0.7:1，溶解氧控制30％-40％，37℃培养20小时，检测活菌数5.0×10⁹CFU/mL，在1h内将培养温度缓慢升温至40℃，进行第二次接种(见②步骤)。

②将凝结芽孢杆菌种子液按1.5％(v/v)的比例接种，培养基pH控制7.0(1M氨水调节)，转速70rpm-80rpm，通风0.25:1，溶解氧控制18％-22％，40℃培养22小时，检测活菌数为8.9×10⁹CFU/mL，停止通风，每30min点动搅拌30s(50-100rpm)，1h内缓慢降温至35℃后进行第三次接种(见③步骤)。

③将丁酸梭菌种子液按照4％(v/v)的比例接种，培养基pH控制7.0(1M磷酸调节)，静置培养26小时。取样检测活菌总数1.2×10¹⁰CFU/ml，镜检芽孢率98.5％、菌体湿重300g/L。

3)制备含改性腐植酸钠复合微生态制剂

将一次联合发酵获得枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌以及凝结芽孢杆菌的混合发酵菌液，经初级过滤(40目)去除其中的大颗粒发酵残渣，再向滤液中添加8％(w/w)改性腐植酸钠、4％(w/w)玉米淀粉、0.07％滑石粉(w/w)、0.15％食盐(w/w)，搅拌均匀后进行喷雾干燥，温度控制：进风温度132℃，出风温度70℃。干燥粉末过60目筛，检测合格后，包装入库。

实施例2

对比枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌以及凝结芽孢杆菌三菌联合发酵与二联菌种发酵，发酵周期70h时，两者培养工艺对营养物质的消耗情况及菌体生长情况，分别设置实验组和对照组：

1)实验设置

实验组：按照实施例1进行枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及丁酸梭菌三菌联合培养，检测活菌数和还原糖含量。

对照组1：枯草芽孢杆菌+丁酸梭菌

对照组2：枯草芽孢杆菌+凝结芽孢杆菌

对照组3：凝结芽孢杆菌+丁酸梭菌，

对照组1-3分别发酵培养，枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌使用菌种浓度、发酵培养基和发酵工艺控制均与实施例1中一致，在发酵周期为70h时，分别检测其活菌数和还原糖含量。

3)检测结果如表1所述：

表1对照组与实验组制剂的活菌数和还原糖含量

表1表明：相同发酵周期和营养成分条件下，在菌体增殖和营养物质的利用上，三菌联合发酵(枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌及丁酸梭菌)优于二菌联合发酵，节约生产成本，提高生产效率。

实施例3

对比实施例1制备的含改性腐植酸钠复合微生态制剂与常规液体、固体微生态制剂(菌粉单独混合)储存稳定性，分别设置实验组和对照组：

1)实验设置

实验组：实施例1获得的含改性腐植酸钠复合微生态制剂

对照组1：液体混合微生态制剂

对照组2：固体混合微生态制剂

分别设置组A和组B，组A处理条件为35℃条件下，静置放置30d；组B为35℃条件下，往复振荡(50次/min)放置30d，观察外观并检测活菌总数。

2)检测结果如表2所述：

表2不同条件下，对照组与实验组制剂的活菌数

表2表明：在35℃条件下，静置放置30d，含改性腐植酸钠复合微生态制剂活菌损失在0.2％以内，液体混合微生态制剂活菌损失达27.7％，固体混合微生态制剂损失达9.9％，同时，液体混合微生态菌剂从1d起开始出现明显的菌体沉淀；在35℃条件下，往复振荡(50次/min)放置30d，含改性腐植酸钠复合微生态制剂活菌损失在0.5％以内，液体混合微生态制剂活菌损失达40.2％，固体混合微生态制剂损失达14.4％。试验证实该含改性腐植酸钠复合微生态制剂有更好的储存稳定性。

实施例4

对比实施例1制备的含改性腐植酸钠复合微生态制剂与常规液体、固体微生态制剂(菌粉单独混合)分散均匀程度，分别设置实验组和对照组：

1)实验设置

将实施例3中试验进行第7天时的实验组和对照组样品分别选取不同位置取样检测活菌总数。

2)试验结果如表3所示：

表3不同条件下，对照组与实验组制剂的活菌数

表3表明：静置条件下，液体混合微生态制剂分散极不均匀，与菌体沉淀有关，固体混合微生态制剂均匀程度较好，与初始混合均匀度有关，该含改性腐植酸钠复合微生态制剂分散均匀程度最好；往复振荡条件下，后期单一菌粉混合的微生态制剂分散均匀度最差，与载体及菌粉各自密度有关，液体混合微生态制剂分散程度较好，该含改性腐植酸钠复合微生态制剂分散均匀程度最好。

实施例5

对比实施例1制备的含改性腐植酸钠复合微生态制剂与含普通腐植酸钠复合微生态制剂喷雾干燥过程有效活菌稳定性，分别设置实验组和对照组：

1)实验设置

实验组：实施例1制备的含改性腐植酸钠复合微生态制剂

对照组：将实施例1中添加的改性腐植酸钠替换为普通腐植酸钠，比较两者混合液pH及制剂过程有效活菌保有率。

2)试验结果如表4所示：

表4对照组与实验组制剂的pH及制剂过程有效活菌保有率

组别	pH	有效活菌保有率
			实验组	6.45	99.8％
对照组	11.93	84.3％

表4表明：相对于普通腐植酸钠引起的高pH环境，从对微生态制剂所处环境pH改变角度出发，该含改性腐植酸钠的复合微生态制剂更有利于提高微生态制剂有效活菌保有率。

以上实施例仅仅是对本发明的解释和具体实施方式和实施效果进行举例，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对发明做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种混合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)使用培养液分别配置枯草芽孢杆菌液、凝结芽孢杆菌液、丁酸梭菌液；

2)使用糖蜜、中温豆饼粉、硫酸铵、玉米粉、脱酚棉籽蛋白粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰和水制备发酵培养基；

3)将枯草芽孢杆菌液接种至发酵培养基，培养一段时间后，进行第二次接种；

4)将凝结芽孢杆菌液接种至步骤3)所述的发酵培养基上，培养一段时间后，进行第三次接种；

5)将丁酸梭菌液接种至步骤4)所述的发酵培养基上，进行培养，获得混合菌液；

6)将混合菌液、改性腐植酸钠、玉米淀粉、滑石粉和食盐混合均匀后，干燥过筛，得含腐植酸钠的混合微生态制剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述培养液为酵母浸粉0.3％-0.5％、蛋白胨0.8％-1.0％、葡萄糖0.5-0.8％、氯化钠0.8％-1.0％、氯化钙0.03％-0.05％、硫酸锰0.01％-0.03％、硫酸铵0.05％-0.08％，用氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5±0.5，水补齐100％，高温灭菌；所述菌液浓度OD₆₀₀为0.6×10⁸-1.0×10⁸CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述发酵培养基中，糖蜜3％-5％、中温豆饼粉1.5％-3.0％、硫酸铵0.05％-0.10％、玉米粉2％-5％、脱酚棉籽蛋白粉0.1％-0.2％、磷酸氢二钾0.05％-0.15％、磷酸二氢钠0.1％-0.3％、硫酸镁0.05％-0.15％、氯化钙0.01％-0.05％、硫酸锰0.003％-0.01％，水补齐100％。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述接种为将枯草芽孢杆菌菌液按体积比0.5％-2％的比例接种；所述培养条件为pH4.5-6.5,溶解氧控制20％-50％,37℃培养12-14小时，在1h内将培养温度缓慢升温至40℃。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述接种为将凝结芽孢杆菌种子液按体积比1％-2.5％的比例接种；所述培养条件为pH6.5-7.5，溶解氧控制15％-25％，40℃培养13-16小时，1h内缓慢降温至35℃。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)所述接种为将丁酸梭菌种子液按照体积比1％-3％的比例接种；所述培养条件为pH6.0-8.0，静置培养20-24小时。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述按重量比计，改性腐植酸钠5％-12％、玉米淀粉3％-5％、滑石粉0.05％-0.1％、食盐0.1％-0.2％。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述干燥为喷雾干燥；所述喷雾进风温度127℃-138℃，出风温度68℃-72℃。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备的含腐植酸钠的混合微生态制剂。