CN116113699B

CN116113699B - 改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其在提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量中的应用

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Publication number: CN116113699B
Application number: CN202080105049.7A
Authority: CN
Inventors: 皮莉; 朱程军; 孙悦; 林丽春; 邢盼盼; 苏海霞; 陈磊; 唐鹏; 王炯; 左江; 黄治华; 李晓波; 刘梦洁; 蔡成平; 胡小蓉; 王筱蒙; 杨磊; 刘莎
Original assignee: Wuhan Grand Hoyo Co ltd
Current assignee: Wuhan Grand Hoyo Co ltd
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2025-02-28
Anticipated expiration: 2040-12-24
Also published as: CN116113699A; WO2022133917A1

Abstract

本发明提出了改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，与野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列相比，所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位和/或第931位和/或第943位氨基酸被取代。本发明通过将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列进行特定位点突变，所得到的改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对氨基酸碳流量的代谢有很大影响，利用该改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的编码基因在谷氨酸棒杆菌中表达，可以高效提高氨基酸产量，应用前景好。

Description

改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其在提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其在提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量中的应用。

背景技术

氨基酸是蛋白质的基本组成部分，这些营养关键化合物广泛用于制备饲料添加剂、食品成分、营养品和药物。近年来世界氨基酸产量稳步增长。特别地，天冬氨酸族氨基酸(包括L-赖氨酸和L-苏氨酸)已经在世界范围内广泛应用，并且通过使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或者大肠杆菌(Escherichia coli)进行发酵，在氨基酸市场中已经占据了越来越大的份额。

先前的研究表明，草酰乙酸(Oxaloacetate,OAA)衍生的氨基酸如L-赖氨酸或L-苏氨酸的产率主要取决于通过补缺途径的碳通量。谷氨酸棒杆菌具有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)和丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PYC)，用于补充消耗的草酰乙酸。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是一种见于大部分细菌和所有植物的酶。磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)是糖酵解的中间产物，在PEP被PEPC羧化为草酰乙酸后，又会很快被苹果酸脱氢酶(Malate Dehydrogenase)转化为苹果酸(Malate)，因此为三羧酸循环(TCA循环)补充了中间产物。而TCA循环过程中的许多中间产物都是氨基酸合成所需的底物，所以在大多数生物中，PEPC的主要作用是分流糖酵解，为氨基酸的合成提供原料。TCA循环中某些中间产物是合成许多重要有机物的前体，如OAA是天冬氨酸族氨基酸合成的碳架。α-酮戊二酸是谷氨酸族氨基酸合成的碳架。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2反应生成草酰乙酸。反应方程式如下：PEP+CO2＝OAA+Pi。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性增强，有助于增加草酰乙酸的积累，作为天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸合成途径中重要前体，草酰乙酸供给充足才能保证相关氨基酸的高效合成，因此，增强前体物草酰乙酸供给对高产天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸也是十分重要的。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶首先在菠菜叶片中发现的。在体内它是以同源四聚体的形式存在的，单体的大小为100-1l0kDa。PEP羧化酶在其活性表达方面也经历各种调节。已有研究报道了从许多不同细菌中分离纯化了PEPC酶，发现他们的活性都受到许多代谢物的调控。在大肠杆菌中，PEPC酶活性可被乙酰辅酶A和果糖1，6-二磷酸激活，并可产生协同激活作用，但受到天冬氨酸和苹果酸的严重抑制。在醋酸杆菌(Acetobacter aceti)中，PEPC酶活受天冬氨酸和一些TCA循环代谢物抑制，尤其是琥珀酸。在谷氨酸棒状杆菌中，PEPC的调控情况与大肠杆菌PEPC不同，其酶活不能被乙酰辅酶A所激活，但同样可被天冬氨酸所强烈抑制。此外，与黄短杆菌相比，谷氨酸对谷氨酸棒状杆菌PEPC的酶活抑制更明显。PEPC酶的这些精细的调控表明PEPC是从碳源转变为氨基酸的代谢流中的重要调控节点，这使其成为氨基酸生产菌株改造的重要靶点。

在现有技术中，开发了多种技术以在氨基酸发酵中进行有效生产，其中以对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行修饰为主。但是，目前对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的修饰一般是通过过表达细菌本身的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因或者是对其进行突变修饰，从而提高草酰乙酸的积累量，而且产酸提高效果并不显著，难以满足工业需求，而且迄今为止，没有专利报道异源表达植物中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因来提高谷氨酸棒状杆菌的CO2固定能力，从而提高草酰乙酸的积累量，进而提高产酸。

因此，目前通过改造磷酸烯醇丙酮酸羧化酶以获得高产氨基酸菌株仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、重组表达载体、基因工程菌、试剂盒、获得改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的方法及其应用、提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法和生产氨基酸的方法，通过将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行密码子优化以及特定氨基酸位点突变，所得到的改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶对氨基酸碳通量有很大影响，利用该改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的编码基因在谷氨酸棒杆菌中表达，可以高效提高氨基酸产量，应用前景好。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。根据本发明的实施例，与野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列相比，所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中的第771位和/或第931位和/或第943位氨基酸被取代；所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者具有与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。通过将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列上的3个氨基酸残基进行突变会显著影响磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性，进一步增强谷氨酸棒杆菌氨基酸代谢途径中的碳流量，进而，有助于提高谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量，应用前景好。

根据本发明的实施例，上述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于植物。

根据本发明的实施例，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于高粱。

根据本发明的实施例，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代和/或第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和/或第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。

根据本发明的实施例，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸。根据本发明的实施例，与编码野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核苷酸序列相比，所述编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核苷酸序列预先经过密码子优化，且优化后的核苷酸序列的第2312位碱基、第2791位碱基和/或第2827位碱基具有突变，所述编码野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者具有与SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。由此，根据本发明实施例的核酸在谷氨酸棒杆菌中表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，有助于提高氨基酸产量。

根据本发明的实施例，所述优化后的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或者具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述优化后的核苷酸序列具有c.2312C＞A、c.2791C＞A和/或c.2827G＞A的突变。

根据本发明的实施例，所述优化后的核苷酸序列具有c.2791C＞A和c.2827G＞A突变。

为了使PEPC便于纯化，可在由SEQ ID NO：1所示氨基酸残基序列组成的蛋白质C端连接上6×HIS标签。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组表达载体。根据本发明的实施例，所述重组表达载体选自含有前面所述核酸的表达载体。由此，根据本发明实施例的重组表达载体在谷氨酸棒杆菌中表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，有助于提高氨基酸产量。

根据本发明的实施例，所述表达载体选自大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种基因工程菌。根据本发明的实施例，所述基因工程菌是通过将前面所述重组表达载体转化到受体菌内所获得的。由此，根据本发明实施例的基因工程菌可以高产氨基酸。

根据本发明的实施例，所述受体菌选自谷氨酸棒杆菌。

本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述重组表达载体或前面所述基因工程菌。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒可以实现高产氨基酸的目的。

本发明的又一方面，本发明提出了一种获得改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中的氨基酸序列中的第771位和/或第931位和/或第943位氨基酸进行突变，得到所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。通过将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列上的三个氨基酸残基进行突变，会显著影响磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性，进一步影响谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量，进而，通过对这三个位点进行氨基酸取代，有助于提高谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量，应用前景好。

根据本发明的实施例，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于植物，优选高粱。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、所述编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、重组表达载体、基因工程菌在提高氨基酸产量中的应用。由此，根据本发明实施例的改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、编码其的核酸、重组表达载体、基因工程菌有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵的氨基酸产量，应用前景好。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述重组表达载体转化到谷氨酸棒杆菌中，并对转化后的基因工程菌进行发酵培养。由此，在基因工程菌发酵过程中表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，有助于提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量。

根据本发明的实施例，所述氨基酸包括天冬氨酸族氨基酸和/或谷氨酸族氨基酸。

根据本发明的实施例，所述天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和/或异亮氨酸；所述谷氨酸族氨基酸包括谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和/或精氨酸。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种生产氨基酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述基因工程菌进行发酵培养。如前所述，该基因工程菌的氨基酸产量高，由此，将该基因工程菌进行发酵培养，可以实现高产氨基酸的目的。

根据本发明的实施例，所述天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和/或异亮氨酸；所述谷氨酸族氨基酸包括谷氨酸、谷氨酰胺和/或精氨酸。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的质粒图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、重组表达载体、基因工程菌、试剂盒、获得改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的方法、用途、提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法和生产氨基酸的方法，下面将分别对其进行详细描述。

改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶

在本发明的一个方面，本发明提出了一种改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。根据本发明的实施例，与野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列相比，该改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列具有优化密码子，且具有优化密码子的酶的氨基酸序列的第771位和/或第931位和/或第943位氨基酸被取代。

发明人发现，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列上的第771位、第931位、第943位氨基酸残基会显著影响磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性，进一步影响谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量，进而，通过对这三个位点的氨基酸进行定点突变，有助于提高谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量，应用前景好。

本发明术语中，密码子优化指根据不同物种蛋白系统表达对密码子的偏好性，进行基因序列的重新设计，从而实现蛋白的高水平表达，本发明通过将来源于高粱的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因进行优化，使其适合在谷氨酸棒状杆菌中表达。

定点突变为本领域常规技术手段，其为定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于植物。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于高粱。高粱属于C4植物，与其他C3植物相比C4植物的PEPC对其底物HCO3^-有较高的亲合力，在光合途径中，催化CO₂原初固定，浓缩CO₂，使得其有较高的光合作用能力。发明人通过Uniprot和ExPASy对PEPC一级结构进行分析，找到其与天冬氨酸及苹果酸的结合位点，通过Pymol软件模拟，将Ser-第771位的Ser突变为Tyr，发现蛋白质的构象发生很大变化，其与苹果酸的分子间作用力减弱，推测此突变可能会在很大程度上影响磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性；同时分析Lys931可能是与PEP结合的关键位点，将Lys931突变为Gln，其与PEP的分子间作用力增强，且整体能量变低，推测此突变能够增强与PEP的亲和力，蛋白结构更加稳定；第943位的天冬氨酸突变成天冬酰胺，其与甘氨酸结合的活性空腔变小，推测可以降低对甘氨酸的敏感性。

根据本发明的实施例，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列来源于高粱磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，该酶以及与其具有至少80％同源性的酶均可以在微生物中表达，提高氨基酸产量。

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根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代。由此，有效缓解苹果酸的抑制作用，提高酶活力。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代。由此，以便提高对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的亲和力，提高酶活力。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。由此，降低对甘氨酸的敏感性，提高酶活力。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代和第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代。由此，缓解苹果酸的抑制作用同时提高对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的亲和力，提高酶活力。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代和第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。由此，缓解苹果酸的抑制作用同时降低对甘氨酸的敏感性，提高酶活力。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。由此，提高对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的亲和力同时降低对甘氨酸的敏感性，提高酶活力。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代和第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。

发明人发现，在上述3个突变位点中，第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代这两个突变共同作用下，效果较佳，氨基酸产量更高。

编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸

在本发明的另一方面，本发明提出了一种编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸。根据本发明的实施例，与编码野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核苷酸序列相比，所述编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核苷酸序列针对谷氨酸棒杆菌进行了密码子优化，且优化后的核苷酸序列的第2312位碱基、第2791位碱基和/或第2827位碱基具有突变。

目前，采用微生物发酵(如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌)生产氨基酸已经是占据了越来越高的比重。由于植物的固碳能力较强，所以优先选择植物来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶作为研究对象。由于植物源的酶难于在微生物中实现异源表达，所以，依据目标微生物的特性，预先对编码野生型的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核苷酸序列进行密码子优化，使其能够更好地实现异源表达。进一步地，发明人发现，经密码子优化所得的核苷酸序列上的第第2312位碱基、第2791位碱基和/或第2827位碱基会显著影响磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性，进一步影响谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量，进而，通过对这3个位点的碱基进行定点突变，有助于提高谷氨酸棒杆菌的氨基酸产量，应用前景好。

根据本发明的实施例，编码野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或者具有与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。

atggcgtccgagcggcaccactccatcgacgcgcagctccgtgccctcgcacccggcaaggtctccgaggagctcatccagtatgacgccctgctcgtcgaccgcttcctcgacatcctccaggacctccatggccccagccttcgcgaatttgtccaggagtgctacgaggtgtcggccgactacgagggcaagaaagacacgtccaagctgggggagctgggagccaagctgacggggctggcccccgccgacgccatcctggtggcgagctccatcctgcacatgctcaacctcgccaacctggcggaggaagtggagctggcgcaccgccgccggaacagcaagctcaagcacggggacttctccgacgagggctccgccaccaccgagtccgacatcgaggagacgctcaagcgcctcgtgtcgctcggcaagacccccgcggaggtgttcgaggcgctcaagaaccagagcgtcgacctcgtcttcaccgcgcatcccacgcagtccgccaggaggtcgctcctgcagaaaaacgccaggatccggaattgtctgacgcagctgagtgccaaggacgtcacggtcgaagacaagaaggagctcgacgaggctctgcacagagagatccaagcagctttcagaactgatgaaatcaggagagcacaacccaccccacaggatgaaatgcgctatgggatgagctacatccatgaaactgtatggaacggtgtgcctaagtttttgcgccgtgtggatacagccctgaagaatatcggcatcaatgagcgccttccctacgatgttcctctcattaagttctgttcttggatgggtggtgaccgtgatggaaatccaagagttactccggaggtgacaagagatgtgtgcttgctgtctagaatgatggctgcaaacttgtacatcaatcaggtcgaagacctgatgtttgagctctctatgtggcgctgcaatgatgagcttcgtgctcgagccgaagaagtccagagtactccagcttcaaagaaagttaccaagtattacatagaattctggaagcaaattcccccaaacgagccctaccgggtgatccttggtgctgtaagggacaagttatacaacacacgcgagcgtgcacgccatctgctggcaactggattttctgaaatttctgaggacgcggtatttaccaagatcgaagagttccttgagccccttgagctgtgctacaaatccctgtgtgagtgcggcgacaaggccatcgccgacgggagcctcctggacctccttcgccaggtgttcacgttcggtctctccctggtgaagctggacatccggcaggagtcggagcggcagaccgacgtgatcgacgccatcaccacgcacctcggcatcgggtcgtaccgctcgtggcccgaggacaagcggatggagtggctggtgtcggagctgaaaggcaagcgcccactgctgcccccggaccttcccatgaccgaggagatcgccgacgtcatcggcgccatgcgcgtcctggccgagctcccgatcgacagcttcggcccctacatcatctccatgtgcacggcgccctcggacgtgctcgccgtcgagctcctgcagcgcgagtgtggcattcgccagacgctccccgtggtgccgctgttcgagaggctggccgacctgcaggcggcgccggcgtccgtggagaagctcttctccactgactggtacatcaaccacatcaacggcaagcagcaggtgatggtcggctactccgactccggcaaggacgccggccgcctgtccgcggcgtggcagctgtacgtggcgcaggaggagatggccaaggtggccaagaagtacggcgtgaagctgaccttgttccacggccgcggtggcaccgtcggcaggggcggtggcccgacgcacctcgccatcctgtcccagccgccggacaccatcaacgggtccatccgtgtgacggtgcagggcgaggtcatcgagttcatgttcggggaggagaacctgtgcttccagtctctgcagcggttcacggccgccacgctggagcacggcatgcacccgccggtgtctcccaagcccgagtggcgcaagctcatggaggagatggccgtcgtcgccacggaggagtaccgctccgtcgtcgtcaaggagccgcgattcgtcgagtacttcagatcggctacccctgagactgagtacgggaagatgaacatcggcagcaggccagccaagaggaggccgggcggcggcatcaccaccctgcgtgccatcccctggatcttctcgtggacacagacgaggttccacctccccgtgtggctgggagtcggcgccgccttcaagtgggccatcgacaaggacatcaagaacttccagaagctcaaggagatgtacaacgagtggccattcttcagggtcaccctggacctgctggagatggttttcgccaagggagaccctggcattgccggcttgtacgacgagctgcttgtcgccgaggaactcaagccctttgggaagcagctcagggacaaatacgtggagacacagcagcttctcctacagatcgctgggcacaaggacattcttgaaggcgatccttacctgaagcaggggctgcgtctgcgcaatccctacatcaccaccctgaacgtgttccaggcctacacgctgaagcggataagggaccccagcttcaaggtgacgccgcagccgccgctgtccaaggagttcgccgacgagaacaagcccgccggactggtgaagctgaacggcgagcgagtaccgccggggctggaagacacgctcatcctcaccatgaagggtatcgccgccggcatgcagaacaccggctag(SEQ ID NO：2)

根据本发明的实施例，优化后的核苷酸序列具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或者具有与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。该核苷酸序列可以在微生物中高效异源表达。进一步地，通过对上述3个核苷酸位点至少之一进行，使得该核苷酸编码的酶可以提高氨基酸产量。

ATGGCTTCCGAGCGCCACCACTCCATCGACGCTCAGCTGCGCGCTCTGGCTCCAGGCAAGGTTTCCGAGGAGCTGATCCAGTACGACGCTCTGCTGGTTGACCGCTTCCTGGACATCCTGCAGGACCTGCACGGCCCATCCCTGCGCGAGTTCGTTCAGGAGTGCTACGAGGTTTCCGCTGACTACGAGGGCAAGAAGGACACCTCCAAGCTGGGCGAGCTGGGCGCTAAGCTGACCGGCCTGGCTCCAGCTGACGCTATCCTGGTTGCTTCCTCCATCCTGCACATGCTGAACCTGGCTAACCTGGCTGAGGAGGTTGAGCTGGCTCACCGCCGCCGCAACTCCAAGCTGAAGCACGGCGACTTCTCCGACGAGGGCTCCGCTACCACCGAGTCCGACATCGAGGAGACCCTGAAGCGCCTGGTTTCCCTGGGCAAGACCCCAGCTGAGGTTTTCGAGGCTCTGAAGAACCAGTCCGTTGACCTGGTTTTCACCGCTCACCCAACCCAGTCCGCTCGCCGCTCCCTGCTGCAGAAGAACGCTCGCATCCGCAACTGCCTGACCCAGCTGTCCGCTAAGGACGTTACCGTTGAGGACAAGAAGGAGCTGGACGAGGCTCTGCACCGCGAGATCCAGGCTGCTTTCCGCACCGACGAGATCCGCCGCGCTCAGCCAACCCCACAGGACGAGATGCGCTACGGCATGTCCTACATCCACGAGACCGTTTGGAACGGCGTTCCAAAGTTCCTGCGCCGCGTTGACACCGCTCTGAAGAACATCGGCATCAACGAGCGCCTGCCATACGACGTTCCACTGATCAAGTTCTGCTCCTGGATGGGCGGCGACCGCGACGGCAACCCACGCGTTACCCCAGAGGTTACCCGCGACGTTTGCCTGCTGTCCCGCATGATGGCTGCTAACCTGTACATCAACCAGGTTGAGGACCTGATGTTCGAGCTGTCCATGTGGCGCTGCAACGACGAGCTGCGCGCTCGCGCTGAGGAGGTTCAGTCCACCCCAGCTTCCAAGAAGGTTACCAAGTACTACATCGAGTTCTGGAAGCAGATCCCACCAAACGAGCCATACCGCGTTATCCTGGGCGCTGTTCGCGACAAGCTGTACAACACCCGCGAGCGCGCTCGCCACCTGCTGGCTACCGGCTTCTCCGAGATCTCCGAGGACGCTGTTTTCACCAAGATCGAGGAGTTCCTGGAGCCACTGGAGCTGTGCTACAAGTCCCTGTGCGAGTGCGGCGACAAGGCTATCGCTGACGGCTCCCTGCTGGACCTGCTGCGCCAGGTTTTCACCTTCGGCCTGTCCCTGGTTAAGCTGGACATCCGCCAGGAGTCCGAGCGCCAGACCGACGTTATCGACGCTATCACCACCCACCTGGGCATCGGCTCCTACCGCTCCTGGCCAGAGGACAAGCGCATGGAGTGGCTGGTTTCCGAGCTGAAGGGCAAGCGCCCACTGCTGCCACCAGACCTGCCAATGACCGAGGAGATCGCTGACGTTATCGGCGCTATGCGCGTTCTGGCTGAGCTGCCAATCGACTCCTTCGGCCCATACATCATCTCCATGTGCACCGCTCCATCCGACGTTCTGGCTGTTGAGCTGCTGCAGCGCGAGTGCGGCATCCGCCAGACCCTGCCAGTTGTTCCACTGTTCGAGCGCCTGGCTGACCTGCAGGCTGCTCCAGCTTCCGTTGAGAAGCTGTTCTCCACCGACTGGTACATCAACCACATCAACGGCAAGCAGCAGGTTATGGTTGGCTACTCCGACTCCGGCAAGGACGCTGGCCGCCTGTCCGCTGCTTGGCAGCTGTACGTTGCTCAGGAGGAGATGGCTAAGGTTGCTAAGAAGTACGGCGTTAAGCTGACCCTGTTCCACGGCCGCGGCGGCACCGTTGGCCGCGGCGGCGGCCCAACCCACCTGGCTATCCTGTCCCAGCCACCAGACACCATCAACGGCTCCATCCGCGTTACCGTTCAGGGCGAGGTTATCGAGTTCATGTTCGGCGAGGAGAACCTGTGCTTCCAGTCCCTGCAGCGCTTCACCGCTGCTACCCTGGAGCACGGCATGCACCCACCAGTTTCCCCAAAGCCAGAGTGGCGCAAGCTGATGGAGGAGATGGCTGTTGTTGCTACCGAGGAGTACCGCTCCGTTGTTGTTAAGGAGCCACGCTTCGTTGAGTACTTCCGCTCCGCTACCCCAGAGACCGAGTACGGCAAGATGAACATCGGCTCCCGCCCAGCTAAGCGCCGCCCAGGCGGCGGCATCACCACCCTGCGCGCTATCCCATGGATCTTCTCCTGGACCCAGACCCGCTTCCACCTGCCAGTTTGGCTGGGCGTTGGCGCTGCTTTCAAGTGGGCTATCGACAAGGACATCAAGAACTTCCAGAAGCTGAAGGAGATGTACAACGAGTGGCCATTCTTCCGCGTTACCCTGGACCTGCTGGAGATGGTTTTCGCTAAGGGCGACCCAGGCATCGCTGGCCTGTACGACGAGCTGCTGGTTGCTGAGGAGCTGAAGCCATTCGGCAAGCAGCTGCGCGACAAGTACGTTGAGACCCAGCAGCTGCTGCTGCAGATCGCTGGCCACAAGGACATCCTGGAGGGCGACCCATACCTGAAGCAGGGCCTGCGCCTGCGCAACCCATACATCACCACCCTGAACGTTTTCCAGGCTTACACCCTGAAGCGCATCCGCGACCCATCCTTCAAGGTTACCCCACAGCCACCACTGTCCAAGGAGTTCGCTGACGAGAACAAGCCAGCTGGCCTGGTTAAGCTGAACGGCGAGCGCGTTCCACCAGGCCTGGAGGACACCCTGATCCTGACCATGAAGGGCATCGCTGCTGGCATGCAGAACACCGGCTAA(SEQ ID NO：3)

根据本发明的实施例，优化后的核苷酸序列具有c.2312C＞A、c.2791C＞A和/或c.2827G＞A的突变。具有优化密码子的核苷酸序列的第2312位C碱基突变为A碱基、第2791位C碱基突变为A碱基、第2827位G碱基突变为A碱基这三个中的至少一个发生突变，均可以使得酶活性提高，进一步提高氨基酸产量。其中第2791位C碱基突变为A碱基、第2827位G碱基突变为A碱基这两种突变同时存在，氨基酸产量较高。

根据本发明的实施例，密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示或者与SEQID NO：2具有至少80％同源性。由此，经密码子优化后的酶可以在微生物中高效表达，尤其是谷氨酸棒杆菌。

重组表达载体

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组表达载体。根据本发明的实施例，该重组表达载体选自含有前面所述核酸的表达载体。由此，根据本发明实施例的重组表达载体在谷氨酸棒杆菌中表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，有助于提高氨基酸产量。

根据本发明的实施例，表达载体选自大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体。

大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体指能在大肠杆菌和棒状杆菌中复制并稳定存在,含有一个在大肠杆菌和棒状杆菌中皆具有转录启动功能的启动子以及转录终止功能的终止子。组成型表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。其中，启动子(promoter)是RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列，终止子(terminator)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。诱导型表达载体是为实现外源蛋白分泌表达，最直接的方法就是将该基因插人到宿主分泌蛋白的表达元件(启动子和分泌信号信号肽序列)的后面。在表达载体中引入严格调控的强启动子，能够使目的基因在低诱导物浓度条件下仍能表达。诱导方式通常为化学诱导和环境诱导。

根据本发明的实施例，大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体为组成型表达载体PVcaseG，组成型表达载体为包括来源于谷氨酸棒杆菌本身的gapa为启动子和为来源于大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体PXMJ19的rrnB终止子。将前面所述编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸序列(简称pepcTB)插入到PVcaseG载体上，构建成PVcaseG-pepcTB重组表达载体(质粒图参见图1)，同时将931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，第943位天冬氨酸突变为天冬酰胺，电转到谷氨酸棒状杆菌中，在谷氨酸棒杆菌中通过IPTG诱导表达，可以提高磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸所描述的特征和优点，同样适用于该重组表达载体，在此不再赘述。

基因工程菌

根据本发明的实施例，受体菌选自谷氨酸棒杆菌。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组表达载体所描述的特征和优点，同样适用于该基因工程菌，在此不再赘述。

试剂盒

本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组表达载体和基因工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。

获得改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的方法

本发明的又一方面，本发明提出了一种获得改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中的第771位、第931位和/或第943位氨基酸进行突变，得到所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。通过将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列上的3个氨基酸残基进行突变会显著影响磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性，进一步影响谷氨酸棒杆菌发酵的氨基酸产量。进而，通过对这三个位点至少之一的氨基酸取代，有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵的氨基酸产量，应用前景好。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于植物，优选高粱。由此，改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵的氨基酸碳通量，实现高产氨基酸。

根据本发明的实施例，野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代、第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和/或第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。由此，改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵的氨基酸碳通量，实现高产氨基酸。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶所描述的特征和优点，同样适用于该获得改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的方法，在此不再赘述。

用途

本领域技术人员能够理解的是，前面针对改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、所述编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、重组表达载体、基因工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对前面所述重组表达载体转化到谷氨酸棒杆菌中，并对转化后的基因工程菌进行发酵培养。由此，重组表达载体在谷氨酸棒杆菌发酵过程中表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，酶活性高，有助于提高氨基酸产量。

根据本发明的实施例，氨基酸包括天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸。发明人发现，采用前述重组表达载体转化到谷氨酸棒杆菌中，可以显著提升天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸产量。

根据本发明的实施例，天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和/或异亮氨酸；谷氨酸族氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸。发明人发现，采用前述重组表达载体转化到谷氨酸棒杆菌中，可以显著提升上述天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸产量。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组表达载体所描述的特征和优点，同样适用于该提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法，在此不再赘述。

生产氨基酸的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种生产氨基酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述基因工程菌进行发酵培养。由此，重组表达载体在谷氨酸棒杆菌发酵过程中表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，酶活性高，有助于提高氨基酸产量。

根据本发明的实施例，氨基酸包括天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸。发明人发现，采用前述基因工程菌可以显著提升天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸产量。

根据本发明的实施例，天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和/或异亮氨酸；谷氨酸族氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸。发明人发现，采用前述基因工程菌可以显著提升上述天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸产量。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对基因工程菌所描述的特征和优点，同样适用于该生产氨基酸的方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

质粒pk18mobsacB购自武汉淼灵生物科技有限公司、穿梭质粒PXMJ19购自普如汀生物技术(北京)有限公司、大肠杆菌DH5α为本领域常规使用；DNA聚合酶(Q5 High-Fidelity DNA Polymerase)购自基因有限公司；限制性内切酶(EcoRI、SalI、EcoRV)、DNAmarker、质粒提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒，均购自Takara宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司、Onestep clonning克隆重组试剂盒购自NEB北京公司；硫酸卡那霉素购自Biosharp公司；蔗糖等其余化学药品试剂均为国药分析纯。质粒提取操作步骤参照质粒小提取试剂盒说明书；DNA胶回收操作步骤参照DNA胶回收试剂盒说明书；谷氨酸棒杆菌基因组提取操作步骤参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书；DNA片段重组连接操作步骤参照Onestep clonning克隆重组试剂盒明书；谷氨酸棒杆菌感受态的制备及转化方法参照vander Rest等的方法(M.E.vander Rest,C.Lange,D.Molenaar.A heat shock following electroporation induces highlyefficient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneicplasmid DNA.Appl.Microbiol.Biotechnol.1999,52:541-545)。通过氨基酸分析仪(日立8800)进行发酵液中的氨基酸含量检测。

下述实施例中酶活通过PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸和磷酸氢离子，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm测定NADH减少速率，从而计算PEPC活性。每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。本发明中所采用的的测定蛋白质含量的方法为BCA试剂盒检测法。

异亮氨酸种子培养基配方为：葡萄糖3.0％、硫酸铵2.5％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、碳酸钙4％，余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

异亮氨酸发酵培养基配方为：葡萄糖16.0％、硫酸铵0.8％、玉米浆3.5％、酵母膏0.3％、丝肽粉0.3％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％，余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

精氨酸种子培养基配方为：葡萄糖3.0％，磷酸氢二钾0.2％，尿素0.12％，硫酸铵0.5％，酵母膏0.5％，玉米浆5.5％，硫酸镁0.04％，生物素50ug/L，丝肽粉1.0％，玉米油10滴/L，轻质碳酸钙1％。

精氨酸发酵培养基配方为：葡萄糖12.5％，磷酸氢二钾0.15％，尿素0.1％，硫酸铵4.5％，酵母膏0.5％，玉米浆5.5％，硫酸镁0.05％，生物素0.05％，维生素B1 0.1％，玉米油10滴/L，糖蜜4.0％，丝肽粉0.3％，轻质碳酸钙0.5％，余量为去离子水，pH为7；所述％为重量体积(g/mL)百分比。

实施例1

基于谷氨酸棒杆菌的特性，对编码高粱的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO：2)进行密码子优化，获得SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

实施例2

对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的定点诱变及构建能在大肠杆菌中表达的重组载体pet28a-pepcTB

以合成的PEPC载体为模板，使用以下引物通过反向PCR扩增突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的编码基因PEPC，同时为了便于后续纯化在基因C端加上6×HIS标签。所用酶为Q5高保真酶。

对N端第771位磷酸化位点丝氨酸突变为酪氨酸，引物如下：

5’-CTTCTACTGGACCCAGACCCGCTTCCACCTGCCAGTTTGGCTGGG-3’(SEQ ID NO：4)

3’-TGGGTCCAGTAGAAGATCCATGGGATAGCGCGCAGGGTGGTGATG-5’(SEQ ID NO：5)

第931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，引物如下：

5’-CCTGGTTCAGCTGAACGGCGAGCGCGTTCCACCAGGCCTGGAGAA-3’(SEQ IDNO：6)

3’-TTCAGCTGAACCAGGCCAGCTGGCTTGTTCTCGTCAGCGAACTCC-5’(SEQ ID NO：7)

第943位天冬氨酸突变为天冬酰胺，引物如下：

5’-CCTGGAGAACACCCTGATCCTGACCATGAAGGGCATCGCTGCTGG-3’(SEQ ID NO：8)

3’-AGGGTGTTCTCCAGGCCTGGTGGAACGCGCTCGCCGTTCAGCTGA-5’(SEQ ID NO：9)

PEPC扩增引物：

5’-CAATTCCCCTCTAGAATGGCTTCCGAGCGCCACCAC-3’(SEQ ID NO：10)

5’-TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3’(SEQ ID NO：11)

高保真Q5 High-Fidelity DNAPolymerase聚合酶PCR扩增核苷酸片段pepc约2.9kb。PCR反应体系(50μl)为：5×Q5 reaction buffer 10μl、10mM dNTP 1μl、引物各2.5μl、模板视样品浓度而定、Q5酶0.5μl、加水至50μl。反应条件为：98℃30s，98℃10s，55℃-72℃30s，72℃1.5min，33个循环；72℃2min。1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收2.9kb的4个PCR产物。

第771位和931位同时突变时，以931位突变的PEPC基因载体为模板，在771位使用771位突变引物进行反向pcr，所得产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收，再以Pepc扩增引物扩增第771位和931位同时突变的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。最终产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收。

第771位和943位同时突变时，以771位突变的PEPC基因载体为模板，在943位使用943位突变引物进行反向pcr，所得产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收，再以Pepc扩增引物扩增第771位和943位同时突变的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。最终产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收。

第931位和943位同时突变时，以931位突变的PEPC基因载体为模板，在943位使用943位突变引物进行反向pcr，所得产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收，再以Pepc扩增引物扩增第931位和943位同时突变的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。最终产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收。

第771位、931位和943位同时突变时，以771位和931位同时突变的PEPC基因载体为模板，在943位使用943位突变引物进行反向pcr，所得产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收，再以Pepc扩增引物扩增第771位、931位和943位同时突变的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。最终产物1％琼脂糖凝胶电泳检测且DNA胶回收试剂盒纯化回收。

利用XbaI/BamHI双酶切质粒pet28a(质粒pet28a购自武汉淼灵生物科技有限公司)，反应体系为：质粒1μg、10×buffer 5μl、XbaI 1μl、BamHI 1μl、补水至50μl。37℃酶切2h。1％琼脂糖凝胶电泳检测并DNA胶回收纯化试剂盒回收5.3kb核苷酸片段。

Onestep clonning克隆重组试剂盒重组上述双酶切产物(即XbaI/BamHI双酶切质粒pet28a)及突变的pepc片段，重组产物转化大肠杆菌BL21，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，经过37℃过夜培养后，挑选转化子测序验证，测序正确的转化子即含有重组质粒pet28a-pepcTB，分别命名为pet28a-pepcTB1(771位丝氨酸突变为酪氨酸)、pet28a-pepcTB2(931位赖氨酸突变为谷氨酰胺)、pet28a-pepcTB3(943位天冬氨酸突变为天冬酰胺)、pet28a-pepcTB12(771位丝氨酸突变为酪氨酸，同时931位赖氨酸突变为谷氨酰胺)、pet28a-pepcTB13(771位丝氨酸突变为酪氨酸，同时943位天冬氨酸突变为天冬酰胺)pet28a-pepcTB23(931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，同时943位天冬氨酸突变为天冬酰胺)、pet28a-pepcTB123(771位丝氨酸突变为酪氨酸，931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，同时943位天冬氨酸突变为天冬酰胺)。

实施例3

根据常规方案，将重组载体pet28a-pepcTB1、pet28a-pepcTB2、pet28a-pepcTB3、pet28a-pepcTB12、pet28a-pepcTB13、pet28a-pepcTB23、pet28a-pepcTB123均转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)CodonPlus RIPL中。由转化实验产生的重组大肠杆菌菌株被指定为：E.coli pepc1、E.coli pepc2、E.coli pepc3、E.coli pepc12、E.coli pepc13、E.colipepc23、E.coli pepc123。

将上述重组大肠杆菌菌株在37℃下在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养，直至OD600达到0.4-1.0。然后，将0.1-0.5Mm/L IPTG加入到培养基中，并将细菌在30℃再培养4-16小时。离心收集菌体用缓冲液(20mM Tris-HCl，Ph6.8)洗涤并悬浮。超声破碎，条件为100W，30min，4℃、12 000r/min离心2min，所得到的上清液即为粗酶液。

实施例4

大肠杆菌突变的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶酶学性质分析：

根据常规方案，将上述粗酶液进行SDS-PAGE电泳分离，目的蛋白大小约102KDa，通过BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白含量检测。通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，其原理为：多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露的6X His-tag的蛋白质能结合于固化Ni2+树脂，从而将带有his-tag组氨酸标签的融合蛋白与其它蛋白区分开来。当我们用高浓度的咪唑(imidazole)溶液洗脱的时侯，咪唑便与融合蛋白his-tag的咪唑环竞争结合，最终将融合蛋白洗脱下来。纯化后的蛋白再次进行SDS-PAGE电泳检测。

通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活检测试剂盒测定酶活，其原理为PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸和磷酸氢离子，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，并用紫外分光光度计测定340nm处吸光度的变化。每mg蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

不同位点的突变对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活的影响不一样，酶活测定结果如表1所示。可以看出，突变后磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活均有不同程度的变化，第771位磷酸化位点丝氨酸突变为酪氨酸，最终使酶活在原来的基础上提高了1.96倍；第931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，提高对磷酸烯醇式丙酮酸的亲和力，最终使酶活在原来的基础上提高了3.79倍；第943位天冬氨酸突变为天冬酰胺，降低对甘氨酸的敏感性，最终使酶活在原来的基础上提高了6.3倍；第771位磷酸化位点丝氨酸突变为酪氨酸，同时第931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，最终使酶活在原来的基础上提高了5.44倍；第771位磷酸化位点丝氨酸突变为酪氨酸，同时第943位天冬氨酸突变为天冬酰胺，最终使酶活在原来的基础上提高了3.41倍；第931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，同时第943位天冬氨酸突变为天冬酰胺，最终使酶活在原来的基础上提高了12.05倍；第771位磷酸化位点丝氨酸突变为酪氨酸，同时第931位赖氨酸突变为谷氨酰胺，第943位天冬氨酸突变为天冬酰胺，最终使酶活在原来的基础上提高了6.41倍。

表1大肠杆菌突变菌株酶活测定

实施例5

构建单点突变和组合突变PEPC基因的谷氨酸棒杆菌表达载体

首先在基础质粒PVcase(质粒图谱如图1所示)上构建以gapa为启动子，rrnB为终止之的组成型表达载体PVcaseG。启动子与终止子的扩增都以实验室现有菌株m13基因组为模板，所用引物如下：

Gapa扩增

5’-ATTCGAGCTCGGTACCCCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3’(SEQ ID NO：12)

5’-ACAGCCATGGAGATCTGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTG-3’(SEQ ID NO：13)

RrnB扩增

5’-TTAGAGGAGACACACCAGATCTCCATGGCTGTTTTG-3’(SEQ ID NO：14)

5’-TGCCTGCAGGTCGACATGAAAGAGTTTGTAGAAACGC-3’(SEQ ID NO：15)

利用KpnI/SalI双酶切质粒PVcase，通过如上所述一步克隆的方法构建组成型表达载体PVcaseG。

以质粒PVcaseG为模板，反向PCR扩增所得目的产物经胶回收即为线性载体，扩增引物如下：

5’-CACCACCACCACTAAAGATCTCCATGGCTGTTTTG-3’(SEQ ID NO：16)

5’-GCGCTCGGAAGCCATGGTGTGTCTCCTCTAAAGATTG-3’(SEQ ID NO：17)

分别以质粒pet28a-pepcTB1、pet28a-pepcTB2、pet28a-pepcTB3、pet28a-pepcTB12、pet28a-pepcTB13、pet28a-pepcTB23、pet28a-pepcTB123为模板，扩增单点突变及组合突变PEPC基因，扩增引物如下：

5’-TAGAGGAGACACACCATGGCTTCCGAGCGCCACCAC-3’(SEQ ID NO：18)

5’CAGCCATGGAGATCTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGGTGTTCTGCATGCCAG-3’(SEQ IDNO：19)

Onestep clonning克隆重组试剂盒重组上述线性载体及突变的pepc片段，重组产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，经过37℃过夜培养后，挑选转化子测序验证，测序正确的转化子即含有重组质粒PVcaseG-pepcTB，分别命名为PVcaseG-pepcTB1、PVcaseG-pepcTB2、PVcaseG-pepcTB3、PVcaseG-pepcTB12、PVcaseG-pepcTB13、PVcaseG-pepcTB23、PVcaseG-pepcTB123。

根据常规方案，将不同的PVcaseG-pepcTB载体同时电转到谷氨酸棒状杆菌C.glutamicum H5和C.glutamicum H1中，由转化实验产生的重组谷氨酸棒状杆菌被命名为：H5-Vpepc1、H5-Vpepc2、H5-Vpepc3、H5-Vpepc12、H5-Vpepc13、H5-Vpepc23、H5-Vpepc123；H1-Vpepc1、H1-Vpepc2、H1-Vpepc3、H1-Vpepc12、H1-Vpepc13、H1-Vpepc23、H1-Vpepc123。

实施例6

重组菌株磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达与酶活测定

将对照菌株C.glutamicum H5和C.glutamicum H1以及上述重组谷氨酸棒杆菌分别接种于异亮氨酸和精氨酸发酵培养基，30℃培养36h后，取发酵液，4℃、10 000r/min离心2min收集菌体，用0.1mol HCL洗两次，再用pH 7.5，0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，重悬后超声破碎，破碎条件为300W，1h。4℃、10 000r/min离心2min取上清液进行酶活测定，通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活检测试剂盒测定酶活，结果如表1所示。与对照菌株C.glutamicum H5相比，重组菌株H5-Vpepc1、H5-Vpepc2、H5-Vpepc3、H5-Vpepc12、H5-Vpepc13、H5-Vpepc23、H5-Vpepc123酶活均有不同程度的提高，尤其是H5-Vpepc23最终酶活提高了7.68倍。与对照菌株C.glutamicum H1相比，重组菌株H1-Vpepc1、H1-Vpepc2、H1-Vpepc3、H1-Vpepc12、H1-Vpepc13、H1-Vpepc23、H1-Vpepc123酶活也均有不同程度的提高，H1-Vpepc23酶活提高效果最为显著，最终酶活提高了7.49倍。

表2谷氨酸棒状杆菌突变菌株酶活测定

注：C.glutamicum H5于2016年11月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，菌种名称为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，株号为H5，保藏编号为CCTCC NO：M2016609。

C.glutamicum H1于2020年10月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，菌种名称为谷氨酸棒杆菌H1，分类号为Corynebacterium glutamicum H1，保藏编号为CCTCC NO：M 2020644。

实施例7

以菌株C.glutamicum H5为对照，将重组菌H5-Vpepc1、H5-Vpepc2、H5-Vpepc3、H5-Vpepc12、H5-Vpepc13、H5-Vpepc23、H5-Vpepc123装入5L发酵罐进行培养。分别取对照菌和重组菌的甘油菌种1ml固态活化培养基上划线，30℃培养16h；从活化培养基上挑一接种环菌苔转接到例如100ml种子培养基中，30℃、200rpm振荡培养12～16h。按10％的体积比接种种子至含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，控温30℃，氨水控制pH在7.0，通过调整转速及通气量维持溶氧在30％，当残糖含量低于1.5％时，流加80％的葡萄糖，维持残糖含量在1.5～2.5％，发酵时间为55h以上，本实施例发酵时间65h。发酵结束后，发酵液离心取上清衍生化后，使用HPLC对各主要氨基酸进行分析其实验结果统计如表3所示，结果表明增强PEPC酶活性可显著改变天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸产量。与对照菌株相比，重组菌的天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸产量都有不同程度的提高，重组菌H5-Vpepc23效果最为明显，天冬氨酸族氨基酸总产量由之前的46.5g/L提高到54.94g/L，提高了18.15％，特别是异亮氨酸，产量由之前的38.83g/L提高到42.95g/L，提高了10.61％；谷氨酸族氨基酸由之前的3.81g/L提高到9.48g/L，提高了1.49倍。

表3发酵液中的氨基酸分析

实施例8

以菌株C.glutamicum H1为对照，将重组菌H1-Vpepc1、H1-Vpepc2、H1-Vpepc3、H1-Vpepc12、H1-Vpepc13、H1-Vpepc23、H1-Vpepc123装入5L发酵罐进行培养。从平板上挑取单菌落接种至种子培养基中，于温度为32℃、转速为200r/min的条件下摇床培养12h，得到种子液；按照5％接种量，将种子培养液进行合并至补料瓶中，连接补料管道，将种子培养液接种至发酵培养基中，开始发酵培养。控温30℃，罐压：0.03～0.08Mpa，氨水控制pH在7.0，通过调整转速及通气量维持溶氧在30％，当残糖含量低于3.0％时，流加80％的葡萄糖，维持残糖含量在1.5～3.0％，发酵时间为72h以上。发酵结束后，发酵液离心取上清衍生化后，使用HPLC对各主要氨基酸进行分析，其实验结果统计如表4所示，结果表明增强PEPC酶活性可显著改变天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸的碳通量。与对照菌株相比，重组菌的天冬氨酸族氨基酸和谷氨酸族氨基酸产量都有不同程度的提高，重组菌H1-Vpepc23效果最为明显，天冬氨酸族氨基酸总产量由之前的21.02g/L提高到33.89g/L，提高了61.23％，；谷氨酸族氨基酸由之前的98.61g/L提高到127.94g/L，提高了29.74％，特别是精氨酸，产量由之前的66.83g/L提高到83.67g/L，提高了25.20％。

表4氨基酸产量

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉远大弘元股份有限公司

<120> 改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其在提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量中的应用

<130> PIDC3205449PCN

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 960

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 1

<400> 1

Met Ala Ser Glu Arg His His Ser Ile Asp Ala Gln Leu Arg Ala Leu

1 5 10 15

Ala Pro Gly Lys Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Tyr Asp Ala Leu Leu

20 25 30

Val Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln Asp Leu His Gly Pro Ser Leu

35 40 45

Arg Glu Phe Val Gln Glu Cys Tyr Glu Val Ser Ala Asp Tyr Glu Gly

50 55 60

Lys Lys Asp Thr Ser Lys Leu Gly Glu Leu Gly Ala Lys Leu Thr Gly

65 70 75 80

Leu Ala Pro Ala Asp Ala Ile Leu Val Ala Ser Ser Ile Leu His Met

85 90 95

Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Glu Leu Ala His Arg Arg

100 105 110

Arg Asn Ser Lys Leu Lys His Gly Asp Phe Ser Asp Glu Gly Ser Ala

115 120 125

Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu Lys Arg Leu Val Ser Leu

130 135 140

Gly Lys Thr Pro Ala Glu Val Phe Glu Ala Leu Lys Asn Gln Ser Val

145 150 155 160

Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gln Ser Ala Arg Arg Ser Leu

165 170 175

Leu Gln Lys Asn Ala Arg Ile Arg Asn Cys Leu Thr Gln Leu Ser Ala

180 185 190

Lys Asp Val Thr Val Glu Asp Lys Lys Glu Leu Asp Glu Ala Leu His

195 200 205

Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr Asp Glu Ile Arg Arg Ala Gln

210 215 220

Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Tyr Gly Met Ser Tyr Ile His Glu

225 230 235 240

Thr Val Trp Asn Gly Val Pro Lys Phe Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala

245 250 255

Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Val Pro Leu

260 265 270

Ile Lys Phe Cys Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg

275 280 285

Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys Leu Leu Ser Arg Met Met

290 295 300

Ala Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gln Val Glu Asp Leu Met Phe Glu Leu

305 310 315 320

Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu Leu Arg Ala Arg Ala Glu Glu Val

325 330 335

Gln Ser Thr Pro Ala Ser Lys Lys Val Thr Lys Tyr Tyr Ile Glu Phe

340 345 350

Trp Lys Gln Ile Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg Val Ile Leu Gly Ala

355 360 365

Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu Arg Ala Arg His Leu Leu

370 375 380

Ala Thr Gly Phe Ser Glu Ile Ser Glu Asp Ala Val Phe Thr Lys Ile

385 390 395 400

Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr Lys Ser Leu Cys Glu

405 410 415

Cys Gly Asp Lys Ala Ile Ala Asp Gly Ser Leu Leu Asp Leu Leu Arg

420 425 430

Gln Val Phe Thr Phe Gly Leu Ser Leu Val Lys Leu Asp Ile Arg Gln

435 440 445

Glu Ser Glu Arg Gln Thr Asp Val Ile Asp Ala Ile Thr Thr His Leu

450 455 460

Gly Ile Gly Ser Tyr Arg Ser Trp Pro Glu Asp Lys Arg Met Glu Trp

465 470 475 480

Leu Val Ser Glu Leu Lys Gly Lys Arg Pro Leu Leu Pro Pro Asp Leu

485 490 495

Pro Met Thr Glu Glu Ile Ala Asp Val Ile Gly Ala Met Arg Val Leu

500 505 510

Ala Glu Leu Pro Ile Asp Ser Phe Gly Pro Tyr Ile Ile Ser Met Cys

515 520 525

Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu Gln Arg Glu Cys

530 535 540

Gly Ile Arg Gln Thr Leu Pro Val Val Pro Leu Phe Glu Arg Leu Ala

545 550 555 560

Asp Leu Gln Ala Ala Pro Ala Ser Val Glu Lys Leu Phe Ser Thr Asp

565 570 575

Trp Tyr Ile Asn His Ile Asn Gly Lys Gln Gln Val Met Val Gly Tyr

580 585 590

Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala Ala Trp Gln Leu

595 600 605

Tyr Val Ala Gln Glu Glu Met Ala Lys Val Ala Lys Lys Tyr Gly Val

610 615 620

Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly

625 630 635 640

Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln Pro Pro Asp Thr Ile Asn

645 650 655

Gly Ser Ile Arg Val Thr Val Gln Gly Glu Val Ile Glu Phe Met Phe

660 665 670

Gly Glu Glu Asn Leu Cys Phe Gln Ser Leu Gln Arg Phe Thr Ala Ala

675 680 685

Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Val Ser Pro Lys Pro Glu Trp

690 695 700

Arg Lys Leu Met Glu Glu Met Ala Val Val Ala Thr Glu Glu Tyr Arg

705 710 715 720

Ser Val Val Val Lys Glu Pro Arg Phe Val Glu Tyr Phe Arg Ser Ala

725 730 735

Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly Lys Met Asn Ile Gly Ser Arg Pro Ala

740 745 750

Lys Arg Arg Pro Gly Gly Gly Ile Thr Thr Leu Arg Ala Ile Pro Trp

755 760 765

Ile Phe Ser Trp Thr Gln Thr Arg Phe His Leu Pro Val Trp Leu Gly

770 775 780

Val Gly Ala Ala Phe Lys Trp Ala Ile Asp Lys Asp Ile Lys Asn Phe

785 790 795 800

Gln Lys Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Phe Arg Val Thr

805 810 815

Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro Gly Ile Ala

820 825 830

Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu Glu Leu Lys Pro Phe Gly

835 840 845

Lys Gln Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr Gln Gln Leu Leu Leu Gln

850 855 860

Ile Ala Gly His Lys Asp Ile Leu Glu Gly Asp Pro Tyr Leu Lys Gln

865 870 875 880

Gly Leu Arg Leu Arg Asn Pro Tyr Ile Thr Thr Leu Asn Val Phe Gln

885 890 895

Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro Ser Phe Lys Val Thr Pro

900 905 910

Gln Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala Asp Glu Asn Lys Pro Ala Gly

915 920 925

Leu Val Lys Leu Asn Gly Glu Arg Val Pro Pro Gly Leu Glu Asp Thr

930 935 940

Leu Ile Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala Ala Gly Met Gln Asn Thr Gly

945 950 955 960

<210> 2

<211> 2883

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2

<400> 2

atggcgtccg agcggcacca ctccatcgac gcgcagctcc gtgccctcgc acccggcaag 60

gtctccgagg agctcatcca gtatgacgcc ctgctcgtcg accgcttcct cgacatcctc 120

caggacctcc atggccccag ccttcgcgaa tttgtccagg agtgctacga ggtgtcggcc 180

gactacgagg gcaagaaaga cacgtccaag ctgggggagc tgggagccaa gctgacgggg 240

ctggcccccg ccgacgccat cctggtggcg agctccatcc tgcacatgct caacctcgcc 300

aacctggcgg aggaagtgga gctggcgcac cgccgccgga acagcaagct caagcacggg 360

gacttctccg acgagggctc cgccaccacc gagtccgaca tcgaggagac gctcaagcgc 420

ctcgtgtcgc tcggcaagac ccccgcggag gtgttcgagg cgctcaagaa ccagagcgtc 480

gacctcgtct tcaccgcgca tcccacgcag tccgccagga ggtcgctcct gcagaaaaac 540

gccaggatcc ggaattgtct gacgcagctg agtgccaagg acgtcacggt cgaagacaag 600

aaggagctcg acgaggctct gcacagagag atccaagcag ctttcagaac tgatgaaatc 660

aggagagcac aacccacccc acaggatgaa atgcgctatg ggatgagcta catccatgaa 720

actgtatgga acggtgtgcc taagtttttg cgccgtgtgg atacagccct gaagaatatc 780

ggcatcaatg agcgccttcc ctacgatgtt cctctcatta agttctgttc ttggatgggt 840

ggtgaccgtg atggaaatcc aagagttact ccggaggtga caagagatgt gtgcttgctg 900

tctagaatga tggctgcaaa cttgtacatc aatcaggtcg aagacctgat gtttgagctc 960

tctatgtggc gctgcaatga tgagcttcgt gctcgagccg aagaagtcca gagtactcca 1020

gcttcaaaga aagttaccaa gtattacata gaattctgga agcaaattcc cccaaacgag 1080

ccctaccggg tgatccttgg tgctgtaagg gacaagttat acaacacacg cgagcgtgca 1140

cgccatctgc tggcaactgg attttctgaa atttctgagg acgcggtatt taccaagatc 1200

gaagagttcc ttgagcccct tgagctgtgc tacaaatccc tgtgtgagtg cggcgacaag 1260

gccatcgccg acgggagcct cctggacctc cttcgccagg tgttcacgtt cggtctctcc 1320

ctggtgaagc tggacatccg gcaggagtcg gagcggcaga ccgacgtgat cgacgccatc 1380

accacgcacc tcggcatcgg gtcgtaccgc tcgtggcccg aggacaagcg gatggagtgg 1440

ctggtgtcgg agctgaaagg caagcgccca ctgctgcccc cggaccttcc catgaccgag 1500

gagatcgccg acgtcatcgg cgccatgcgc gtcctggccg agctcccgat cgacagcttc 1560

ggcccctaca tcatctccat gtgcacggcg ccctcggacg tgctcgccgt cgagctcctg 1620

cagcgcgagt gtggcattcg ccagacgctc cccgtggtgc cgctgttcga gaggctggcc 1680

gacctgcagg cggcgccggc gtccgtggag aagctcttct ccactgactg gtacatcaac 1740

cacatcaacg gcaagcagca ggtgatggtc ggctactccg actccggcaa ggacgccggc 1800

cgcctgtccg cggcgtggca gctgtacgtg gcgcaggagg agatggccaa ggtggccaag 1860

aagtacggcg tgaagctgac cttgttccac ggccgcggtg gcaccgtcgg caggggcggt 1920

ggcccgacgc acctcgccat cctgtcccag ccgccggaca ccatcaacgg gtccatccgt 1980

gtgacggtgc agggcgaggt catcgagttc atgttcgggg aggagaacct gtgcttccag 2040

tctctgcagc ggttcacggc cgccacgctg gagcacggca tgcacccgcc ggtgtctccc 2100

aagcccgagt ggcgcaagct catggaggag atggccgtcg tcgccacgga ggagtaccgc 2160

tccgtcgtcg tcaaggagcc gcgattcgtc gagtacttca gatcggctac ccctgagact 2220

gagtacggga agatgaacat cggcagcagg ccagccaaga ggaggccggg cggcggcatc 2280

accaccctgc gtgccatccc ctggatcttc tcgtggacac agacgaggtt ccacctcccc 2340

gtgtggctgg gagtcggcgc cgccttcaag tgggccatcg acaaggacat caagaacttc 2400

cagaagctca aggagatgta caacgagtgg ccattcttca gggtcaccct ggacctgctg 2460

gagatggttt tcgccaaggg agaccctggc attgccggct tgtacgacga gctgcttgtc 2520

gccgaggaac tcaagccctt tgggaagcag ctcagggaca aatacgtgga gacacagcag 2580

cttctcctac agatcgctgg gcacaaggac attcttgaag gcgatcctta cctgaagcag 2640

gggctgcgtc tgcgcaatcc ctacatcacc accctgaacg tgttccaggc ctacacgctg 2700

aagcggataa gggaccccag cttcaaggtg acgccgcagc cgccgctgtc caaggagttc 2760

gccgacgaga acaagcccgc cggactggtg aagctgaacg gcgagcgagt accgccgggg 2820

ctggaagaca cgctcatcct caccatgaag ggtatcgccg ccggcatgca gaacaccggc 2880

tag 2883

<210> 3

<211> 2883

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3

<400> 3

atggcttccg agcgccacca ctccatcgac gctcagctgc gcgctctggc tccaggcaag 60

gtttccgagg agctgatcca gtacgacgct ctgctggttg accgcttcct ggacatcctg 120

caggacctgc acggcccatc cctgcgcgag ttcgttcagg agtgctacga ggtttccgct 180

gactacgagg gcaagaagga cacctccaag ctgggcgagc tgggcgctaa gctgaccggc 240

ctggctccag ctgacgctat cctggttgct tcctccatcc tgcacatgct gaacctggct 300

aacctggctg aggaggttga gctggctcac cgccgccgca actccaagct gaagcacggc 360

gacttctccg acgagggctc cgctaccacc gagtccgaca tcgaggagac cctgaagcgc 420

ctggtttccc tgggcaagac cccagctgag gttttcgagg ctctgaagaa ccagtccgtt 480

gacctggttt tcaccgctca cccaacccag tccgctcgcc gctccctgct gcagaagaac 540

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aaggagctgg acgaggctct gcaccgcgag atccaggctg ctttccgcac cgacgagatc 660

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accgtttgga acggcgttcc aaagttcctg cgccgcgttg acaccgctct gaagaacatc 780

ggcatcaacg agcgcctgcc atacgacgtt ccactgatca agttctgctc ctggatgggc 840

ggcgaccgcg acggcaaccc acgcgttacc ccagaggtta cccgcgacgt ttgcctgctg 900

tcccgcatga tggctgctaa cctgtacatc aaccaggttg aggacctgat gttcgagctg 960

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gcttccaaga aggttaccaa gtactacatc gagttctgga agcagatccc accaaacgag 1080

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cgccacctgc tggctaccgg cttctccgag atctccgagg acgctgtttt caccaagatc 1200

gaggagttcc tggagccact ggagctgtgc tacaagtccc tgtgcgagtg cggcgacaag 1260

gctatcgctg acggctccct gctggacctg ctgcgccagg ttttcacctt cggcctgtcc 1320

ctggttaagc tggacatccg ccaggagtcc gagcgccaga ccgacgttat cgacgctatc 1380

accacccacc tgggcatcgg ctcctaccgc tcctggccag aggacaagcg catggagtgg 1440

ctggtttccg agctgaaggg caagcgccca ctgctgccac cagacctgcc aatgaccgag 1500

gagatcgctg acgttatcgg cgctatgcgc gttctggctg agctgccaat cgactccttc 1560

ggcccataca tcatctccat gtgcaccgct ccatccgacg ttctggctgt tgagctgctg 1620

cagcgcgagt gcggcatccg ccagaccctg ccagttgttc cactgttcga gcgcctggct 1680

gacctgcagg ctgctccagc ttccgttgag aagctgttct ccaccgactg gtacatcaac 1740

cacatcaacg gcaagcagca ggttatggtt ggctactccg actccggcaa ggacgctggc 1800

cgcctgtccg ctgcttggca gctgtacgtt gctcaggagg agatggctaa ggttgctaag 1860

aagtacggcg ttaagctgac cctgttccac ggccgcggcg gcaccgttgg ccgcggcggc 1920

ggcccaaccc acctggctat cctgtcccag ccaccagaca ccatcaacgg ctccatccgc 1980

gttaccgttc agggcgaggt tatcgagttc atgttcggcg aggagaacct gtgcttccag 2040

tccctgcagc gcttcaccgc tgctaccctg gagcacggca tgcacccacc agtttcccca 2100

aagccagagt ggcgcaagct gatggaggag atggctgttg ttgctaccga ggagtaccgc 2160

tccgttgttg ttaaggagcc acgcttcgtt gagtacttcc gctccgctac cccagagacc 2220

gagtacggca agatgaacat cggctcccgc ccagctaagc gccgcccagg cggcggcatc 2280

accaccctgc gcgctatccc atggatcttc tcctggaccc agacccgctt ccacctgcca 2340

gtttggctgg gcgttggcgc tgctttcaag tgggctatcg acaaggacat caagaacttc 2400

cagaagctga aggagatgta caacgagtgg ccattcttcc gcgttaccct ggacctgctg 2460

gagatggttt tcgctaaggg cgacccaggc atcgctggcc tgtacgacga gctgctggtt 2520

gctgaggagc tgaagccatt cggcaagcag ctgcgcgaca agtacgttga gacccagcag 2580

ctgctgctgc agatcgctgg ccacaaggac atcctggagg gcgacccata cctgaagcag 2640

ggcctgcgcc tgcgcaaccc atacatcacc accctgaacg ttttccaggc ttacaccctg 2700

aagcgcatcc gcgacccatc cttcaaggtt accccacagc caccactgtc caaggagttc 2760

gctgacgaga acaagccagc tggcctggtt aagctgaacg gcgagcgcgt tccaccaggc 2820

ctggaggaca ccctgatcct gaccatgaag ggcatcgctg ctggcatgca gaacaccggc 2880

taa 2883

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 4

<400> 4

cttctactgg acccagaccc gcttccacct gccagtttgg ctggg 45

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 5

<400> 5

tgggtccagt agaagatcca tgggatagcg cgcagggtgg tgatg 45

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 6

<400> 6

cctggttcag ctgaacggcg agcgcgttcc accaggcctg gagaa 45

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 7

<400> 7

ttcagctgaa ccaggccagc tggcttgttc tcgtcagcga actcc 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 8

<400> 8

cctggagaac accctgatcc tgaccatgaa gggcatcgct gctgg 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 9

<400> 9

agggtgttct ccaggcctgg tggaacgcgc tcgccgttca gctga 45

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 10

<400> 10

caattcccct ctagaatggc ttccgagcgc caccac 36

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 11

<400> 11

ttagtggtgg tggtggtggt g 21

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 12

<400> 12

attcgagctc ggtaccccga agatctgaag attcctg 37

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 13

<400> 13

acagccatgg agatctggtg tgtctcctct aaagattg 38

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 14

<400> 14

ttagaggaga cacaccagat ctccatggct gttttg 36

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 15

<400> 15

tgcctgcagg tcgacatgaa agagtttgta gaaacgc 37

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 16

<400> 16

caccaccacc actaaagatc tccatggctg ttttg 35

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 17

<400> 17

gcgctcggaa gccatggtgt gtctcctcta aagattg 37

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 18

<400> 18

tagaggagac acaccatggc ttccgagcgc caccac 36

<210> 19

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 19

<400> 19

cagccatgga gatctttagt ggtggtggtg gtggtggccg gtgttctgca tgccag 56

Claims

1.一种改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其特征在于，与野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列相比，所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中的第771位和/或第931位和/或第943位氨基酸被取代；

所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代和/或第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和/或第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。

2.根据权利要求1所述的改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其特征在于，所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。

3.一种编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列是在SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的基础上具有c.2312C＞A、c.2791C＞A和/或c.2827G＞A的突变。

4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列是在SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的基础上具有c.2791C＞A和c.2827G＞A突变。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体选自含有权利要求3或4所述核酸的表达载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体选自大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体。

7.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过将权利要求5或6所述重组表达载体转化到受体菌内所获得的。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述受体菌选自谷氨酸棒杆菌。

9.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求5或6所述重组表达载体或权利要求7或8所述基因工程菌。

10.一种获得改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的方法，其特征在于，包括：

将野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中的第771位、第931位和/或第943位氨基酸进行突变，得到所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；

所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列的第771位丝氨酸被酪氨酸所取代、第931位赖氨酸被谷氨酰胺所取代和/或第943位天冬氨酸被天冬酰胺所取代。

11.权利要求1或2所述改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、权利要求3或4所述编码改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、权利要求5或6所述重组表达载体、权利要求7或8所述基因工程菌在提高氨基酸产量中的应用。

12.一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法，其特征在于，包括：将权利要求5或6所述重组表达载体转化到谷氨酸棒杆菌中，并对转化后的基因工程菌进行发酵培养。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述氨基酸包括天冬氨酸族氨基酸和/或谷氨酸族氨基酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和/或异亮氨酸；

所述谷氨酸族氨基酸包括谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和/或精氨酸。

15.一种生产氨基酸的方法，其特征在于，包括：将权利要求7或8所述基因工程菌进行发酵培养。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述氨基酸包括天冬氨酸族氨基酸和/或谷氨酸族氨基酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸族氨基酸包括天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和/或异亮氨酸；