CN116103261A

CN116103261A - 幽门螺杆菌岩藻糖基转移酶突变体

Info

Publication number: CN116103261A
Application number: CN202310292697.3A
Authority: CN
Inventors: 王冀姝; 张珂凡; 黄滔
Original assignee: Beijing Ruimai Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Ruimai Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-23
Filing date: 2023-03-23
Publication date: 2023-05-12
Also published as: WO2024192890A1

Abstract

本发明公开了一种幽门螺杆菌α‑1,3‑岩藻糖基转移酶的突变体，编码所述突变体的多核苷酸，以及含有所述多核苷酸的表达载体和宿主细胞，本发明还公开了应用所述的幽门螺杆菌α‑1,3‑岩藻糖基转移酶的突变体将靶分子标记于目的细胞或者目的蛋白质标记的方法，根据所述方法标记的细胞或者蛋白质，以及所述的细胞或者蛋白质在制备疾病治疗药物中的应用。本发明提供的幽门螺杆菌α‑1,3‑岩藻糖基转移酶的突变体相较于野生型，能以更优的效率将靶分子标记在细胞膜表面上，提供了酶活性定量检测的方法以及被标记细胞或者蛋白质在制备疾病治疗药物中的应用前景。

Description

幽门螺杆菌岩藻糖基转移酶突变体

技术领域

本发明公开了一种岩藻糖基转移酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

糖基化是一种常见的翻译后修饰，在酶的控制下，在氨基酸或脂质上附加糖类的过程。与蛋白质和核酸的生物合成途径不同，糖基化是蛋白质翻译后修饰，非模板驱动的过程。岩藻糖基化是生物体内一类常见的糖基化修饰，广泛存在于各类细胞表面的质膜上，被认为是糖基化过程的终点。岩藻糖基转移酶是将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖（鸟苷二磷酸岩藻糖）转移到聚糖的酶，参与末端聚糖结构的合成。根据岩藻糖在聚糖连接位置，岩藻糖基化分为核心岩藻糖基化和支链岩藻糖基化。幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶催化的是支链岩藻糖基化，将岩藻糖从GDP-岩藻糖（供体底物）转移至N多糖支链上的GlcNAc（N-乙酰氨基葡萄糖）和LacNac(N-乙酰乳糖胺)（受体底物）。因此岩藻糖基转移酶分别识别供体和受体两个底物，并催化岩藻糖的转移。据目前的各种文献报道，岩藻糖基转移酶的主要供体底物是分子量比较小的GDP-岩藻糖（GDP-Fucose）。酶活性检测的试剂盒选用的是高纯度的GDP-Fucose作为供体底物，受体底物一般是纯化的单一蛋白例如胎球蛋白（检测试剂盒例如Promega，货号VA1090,VA1091,VA1092），酶活性(Km)约为1~100 μM。而当供体底物变为分子量较大的GDP-Fucose衍生物，或受体底物为复杂的蛋白质混合物（例如细胞质膜）时，酶活性(Km)非常低，上述的商品化检测试剂盒无法检测出酶活性。

Wu等利用幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶将抗体类大分子蛋白转移到细胞膜表面的多糖上例如LacNAc和α2,3 sialylLacNAc。利用这种技术，Wu等构建了两种类型的工程细胞-使用自然杀伤细胞系（NK-92MI）和小鼠原代CD8+OT-1T细胞，通过岩藻糖基转移酶将Her2抗体和PD-L1的抗体分别转移至NK-92MI和CD8+OT-1T细胞，并在小鼠模型中展示了特异性肿瘤靶向性和对抗肿瘤细胞产生的抑制信号（参见Li J,等. ACS Cent Sci. 2018Dec 26;4(12):1633-1641. ）。因此利用岩藻糖基转移酶将有治疗意义的分子标记到细胞上，将使得诸如CAR-T这样的细胞治疗的效果得到大幅提升。本发明人在研究中发现，相比小分子GDP-Fucose而言，岩藻糖基转移酶对于大分子的供体底物的酶活性降低近千倍，不能满足工程化细胞制备的需求。

虽然本领域已有数项专利文献描述了一些取代突变或者取代突变的组合可以提高幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶的活性，例如CN201611051529.1和CN202110273518.2。但实验发现，这些突变体，例如突变体A128N15（A128N，H129E，S46F,Y132I）在大肠杆菌BL21(DE3)中没有明显表达；或者为包涵体表达，例如突变体（A78S，T88A，G95V），突变体（F9Y，V19A），突变体（G224K，V284L）。包涵体表达的酶不易复性，且复性后酶活性很低（数据未显示）。以上突变体的科研和产业价值相对较低。以岩藻糖基转移酶为工具酶进行工程化细胞制备，需要酶能够更好地识别复杂的底物。

因此，本发明的目的就是获得在大肠杆菌中可溶表达的能够识别复杂底物的高活性的突变体，进一步提高幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶对大分子供体底物和复杂的受体底物的活性，并提供相应的检测方法，拓展工程化细胞的制备的可能性和便宜性。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一种幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的突变体，所述α-1,3-幽门螺杆菌岩藻糖基转移酶突变体在序列如SEQ ID NO.1所示的野生型幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的108和/或139位氨基酸发生变异。为获取上述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶，本发明采取的技术方案为：

利用易错PCR突变原理，以幽门螺杆菌的alfa-1,3岩藻糖基转移酶(strain ATCC700392 / 26695)的截短体（序列如所示SEQ ID NO. 1）的基础上，获取幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶的随机取代突变体。SEQ ID NO. 1在本发明中命名为野生型(wt)。野生型和突变体分别在大肠杆菌中进行诱导表达。选取可溶表达的突变体，进行纯化。

在所述幽门螺杆菌α-1,3-幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体的一个优选的技术方案中，所述突变体的序列如SEQ ID NO.5所示。相较于野生型，所述突变体在第108位的丙氨酸（Alanine）被缬氨酸（Valine）取代，在本发明中所述突变体被命名为“A108V”。

本发明还提供了编码上述幽门螺杆菌α-1,3-幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体优选技术方案的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了表达上述幽门螺杆菌α-1,3-幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体的表达载体，所述表达载体含有上述的多核苷酸。在本发明的一个具体实施方案中，所述载体为可以商业化获得的MilliporeSigma ™ pET-41a(+) DNA Vector，基因工程领域的其它常规表达载体也可以应用于本发明。

本发明还提供了表达上述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，基因工程领域的其它常规宿主细胞也可以应用于本发明。

在所述幽门螺杆菌α-1,3-幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体的另一个优选的技术方案中，所述突变体的序列如SEQ ID NO.7所示。相较于野生型，所述突变体在第139位天冬氨酸Aspartic acid被谷氨酸Glutamic acid取代。在本发明中所述突变体被命名为“D139E”。

本发明还提供了编码上述幽门螺杆菌α-1,3-幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体优选技术方案的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.8所示。

其次，本发明提供了一种应用上述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的突变体将靶分子标记于目的细胞或者目的蛋白质标记的方法，所述方法包括：

（1）将GDP-岩藻糖与靶分子相缀合获得连接复合物；

（2）在所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的突变体存在的条件下，使步骤（1）获得的连接复合物与含有GlcNac受体分子的目的细胞或者目的蛋白质一起孵育，获得被标记了靶分子的目的细胞。

在一个优选的技术方案中，所述靶分子为治疗性分子。在本发明的一个具体实施方案中，所述治疗性分子为人IL-15的Fc融合蛋白衍生物（本发明中称为N803），在所述具体实施方案中，通过N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS ester）与胺交联将GDP-岩藻糖偶联到纯化的N803，。获得N803-GDP-岩藻糖偶联分子（分子量约为120KD；相比分子量为500D的GDP-Fucose，称为大分子量的GDP-Fucose衍生物）作为供体底物，偶联后的N803会携带6至10个左右的GDP-岩藻糖衍生物。在所述具体实施方案中，所述含有GlcNac受体分子的目的细胞为人洗涤红细胞。以人洗涤红细胞作为受体底物，通过本发明提供的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的突变体的催化， GDP-岩藻糖偶联的N803被标记于红细胞膜表面。

第三，本发明提供了一种根据上述方法标记的细胞或者蛋白质。在本发明的一个具体实施方案中，获得了在细胞膜表面被标记GDP-岩藻糖偶联的N803的红细胞。N803是IL-15衍生物，可以激活T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，并介导这些细胞的增殖和存活，在抗肿瘤、促炎症、抗感染中起到重要作用。N803由Altor BioScience公司研发，在一项1期临床实验显示，Nivolumab (PD-1抗体，Opdivo)联合N803治疗转移性非小细胞肺癌的能够明显延长患者长期生存。N803作为重组蛋白药物通过融合免疫球蛋白的Fc片段将IL-15的血清半衰期从数分钟延长到8-10小时。小鼠的体内研究显示，显著提高了肿瘤治疗效果(Xu H,et al. A novel multimeric IL15/IL15Rα-Fc complex to enhance cancerimmunotherapy. Oncoimmunology. 2021 Mar 11;10:1893500.)。但相比其它肿瘤免疫治疗药物，半衰期仍然需要进一步提高。人的成熟红细胞寿命约为120天，将N803偶联在红细胞膜表面，有望显著提高药物半衰期，并减少药物静脉输入的次数和剂量。

最后，本发明提供了上述的细胞或者蛋白质在制备疾病治疗药物中的应用。通过将药物偶联至成熟红细胞膜表面，改变药物的半衰期，以及分布、代谢和排泄等药代动力学特点，从而最大发挥药物治疗特性并减少副作用。此外，可以通过本发明提供的方法，将各种治疗性药物，包括多肽、小分子和核酸，偶联在NK细胞、T细胞、B细胞，以及干细胞和前体细胞的细胞膜上，不仅能够完整保留各种细胞各自的功能，还可以发挥偶联药物的特点，实现靶向治疗。

在一个优选的技术方案中，所述疾病为肿瘤、炎症性疾病、代谢类疾病或需要酶替代治疗的罕见病。例如将肿瘤相关抗原（TAAs）的抗体，如抗Her2，EFGR，VEGFR，CD19等偶联至NK细胞表面加强NK细胞的靶向性、提高抗肿瘤的效果。此外，还可以通过偶联一种或者数种肿瘤特异识别抗原，改善CAR-T的靶向性，减少CAR-T的脱靶副作用。此外，还可以将代谢相关的酶偶联在血液细胞表面，例如尿酸氧化酶，清除血液和组织中的尿酸，治疗难治性痛风。以及偶联免疫细胞抑制性抗体或者多肽如PD-L1，抑制病理性激活的T淋巴细胞和B淋巴细胞，从而治疗类似红斑狼疮等自身免疫性疾病；或者激活Treg细胞，治疗炎症性疾病，如类风湿性关节炎。

本发明利用易错PCR突变原理，在野生型幽门螺杆菌的alfa-1,3岩藻糖基转移酶截短体的基础上，筛选获取了幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶的随机取代突变体A108V和D139E。在相同的底物和实验条件下，突变体D139E、突变体A108V表现出了将N803偶联在细胞膜表面上的更高的催化效率，催化效率是野生型的1.75-1.82倍，其它的突变体（N167Q和突变体P64S）则明显减弱了很多，只有野生型的25%-6%。Westernblot的方法也证实了突变体D139E和突变体A108V催化的红细胞上携带有更多的N803，通过灰度分析的半定量比较，突变体D139E和突变体A108V上携带的N803分别是野生型的2倍和5倍。以流式细胞术的平均荧光强度（MFI）做为酶催化反应产物的指标对突变体的酶活性进行定量评价，突变体D139E的Km约为1μM，酶活性较野生型Km（约为3μM）提高了3倍。

附图说明

图1.易错PCR产生的突变列表1-120位氨基酸（去除了终止密码突变和移码突变）；

图2.易错PCR产生的突变列表121-240位氨基酸（去除了终止密码突变和移码突变）；

图3.易错PCR产生的突变列表241-364位氨基酸（去除了终止密码突变和移码突变）；

图4.突变体在大肠杆菌中可溶性表达的检测图

图5.野生型和突变体催化的大分子供体底物标记人红细胞的流式细胞术检测图；

图6.野生型和突变体催化的大分子供体底物标记人红细胞的平均荧光强度比较图；

图7.野生型和突变体催化的大分子供体底物标记人红细胞相对的载量的Westernblot检测图；

图8. 野生型和突变体在简单体系中（高纯度的GDP-Fucose作为供体底物，胎球蛋白为受体底物）的酶活性比较图；

图9.在复杂的供体和受体底物情况下用流式细胞术检测不同浓度的突变体D139E将供体(GDP-Fucose衍生物)转移至受体(红细胞的细胞膜表面)的比较图；

图10.流式细胞术中的平均荧光强度（MFI）与突变体D139E浓度的关系图；

图11.在复杂的供体和受体底物情况下用流式细胞术测定野生型，突变体D139E和突变体N167Q的酶活性比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1. 幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的制备

1. 突变体的筛选

易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

本发明中，野生型幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶的蛋白质序列如SEQ IDNO. 1所示，委托苏州君跻生物科技有限公司按照序列SEQ ID NO. 2合成模板DNA以及相应的引物：

Forward：5’-CATATGTTTCAGCCGCTGCTG-3’

Reverse: 5’-GTTTACGCGTAAGTCATCGTAATTG-3’

易错PCR的反应条件如下：

50微升PCR体系中加入10×TITANIUM Taq Buffer 5 微升（400 mM Tricine-KOH(pH 8.0 at 25°C)，160 mM KCl，35 mM MgCl2，37.5 µg/ml BSA ），dGTP (2 mM) 1微升，50×Diversify dNTP Mix 1微升（dATP, dCTP,dGTP, and dTTP 各10 mM ），两条引物各10 µM，DNA模板 50ng，TITANIUM Taq 20单位， PCR级别纯水将终体积补足至 50微升。上述各种试剂来自Clontech，货号639141。

将反应组分充分混匀和离心后，将PCR管放入PCR热循环中，PCR反应参数设置：94°C 30 秒；25 个循环（94°C 30 秒， 68°C1 分钟）； 68°C 1分钟； 4°C 浸存。

将上述PCR获取的产物进行琼脂糖电泳，切胶回收纯化，然后按照10微升体积反应体系：取T载体1微升 (50ng)（T载体为pMD™19-T Vector Cloning Kit，Takara Cat. No.6013），加入等摩尔数PCR产物。加入含ATP的10×Buffer 1微升，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH₂O 补足至10微升。16℃连接过夜。将链接产物进行大肠杆菌转化，简述如下：

(1) 将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。

(2) 于100微升感受态细胞中加入10微升连接产物，冰浴30min。

(3) 将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。

(4) 在离心管中加入SOC培养基300微升，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。

(5) 将200微升转化菌液均匀地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/mlIPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落委托苏州君跻生物科技有限公司进行测序。根据测序结果，去除无义突变、移码突变、终止密码突变，选取单一突变位点。然后逐一进行DNA合成并克隆至pET41a （MilliporeSigma ™ pET-41a(+) DNA Vector，目录号：70-556-3）。突变体的列表如图1-3。图1-3按照幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列逐一水平排列；纵向为20种人体必须氨基酸的种类。相交点横坐标对应的是该位点的野生型氨基酸，纵坐标为易错PCR造成的突变。

2. 突变体的表达

幽门螺杆菌的α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的表达，简述如下

(1)取2微升质粒加入100 微升BL21(DE3)感受态细胞中（ThermoFisher, 目录号:EC0114），立即混匀，冰上放置30 min。

(2)42℃热激90 s，迅速冰浴2 min。

(3) 加入500 uL LB培养基，37℃，rpm<=200振荡培养60 min。

(4) 6000rpm离心1min，弃去大部分上清，留约100-150 uL，重悬菌体后，涂于含Amp的LB平板上，37℃过夜培养。

(5)小量表达：挑取1个单克隆于1 mL Amp抗性的LB培养基中，37 ℃，220 rpm振荡培养约5h，在上一步管中加入2.5mL 含Amp的LB液体培养基，37 ℃，220 rpm振荡培养过夜。

(6) 将过夜培养的菌液按1:50比例转接到20ml含Amp的LB培养基中，37℃，220rpm，培养至OD600=0.6 (约3h)，加入终浓度0.5mM IPTG，30℃，220 rpm培养6h。

(7) 测定培养液的OD600，取10OD菌液，10000rpm，2min离心，去掉上清。

(8) 用1 mL 裂解液 (10mM Tris-HCl, pH 8.0)重悬菌体，置于冰上进行超声裂解细胞，超声条件：130W、4min、on 3s、off 3s。

(9) 超声结束后，裂解液12000rpm, 10min离心得到上清(lysis supernatant)；将上清液在4°C下以125000g超速离心。

图4显示了所有突变体，经过大肠杆菌诱导表达后，可溶部分进行SDS-PAGE分析的图谱。 80微升经过纯化的重组蛋白分别加入20微升 5×Reduce loadingbuffer，95 ℃加热5 min，每个样品取12.5微升(相当于0.1OD)进行SDS-PAGE电泳。不可溶的部分，加入50微升1×Reduce loadingbuffer，95 ℃加热5 min后也进行了SDS-PAGE电泳（结果未显示）。SDS-PAGE电泳结果显示，只有P64S、A108V、D139E和N167Q四个突变体有可见的可溶性表达。图4中的第46,47,53和60号样品分别为P64S、A108V、D139E和N167Q四个突变体。其中，P64S是指第64位脯氨酸（Proline）被丝氨酸（Serine）取代；A108V是指第108位丙氨酸（Alanine）被缬氨酸（Valine）取代；D139E是指第139位天冬氨酸Aspartic acid被谷氨酸Glutamicacid取代；N167Q是指第167位天冬酰胺Asparagine被谷氨酰胺Glutamine取代。

3. 酶蛋白纯化

按照上述表达诱导条件，将培养体积扩大到100ml，并取得超声裂解液的上清液。根据使用手册，将上清液应用于HiTrap螯合HP柱，并用 20mM咪唑溶液进行洗脱。将洗脱液汇集并通过透析将溶剂更换为50 mM Tris缓冲液（pH 8.0），然后再经过凝胶过滤层析（superdex200，GE Healthcare）进行进一步纯化得到纯度较高的蛋白，产生具有98%以上均一性的蛋白质。以牛血清白蛋白为标准，使用基于Bradford法的Bio-Rad蛋白质分析试剂盒测定蛋白质浓度。

实施例2. 大分子供体底物的制备

N803（又称为ALT803，是人IL-15的Fc融合蛋白衍生物）[2013 The IL 15 basedsuperagonist ALT 803 promotes the antigen independent conversion of memoryCD8 T cells into innate like effector cells with antitumor]，根据文献发表的序列，设计相应的DNA并融合至人IgG4-Fc序列。委托苏州君跻生物科技有限公司合成质粒DNA，并克隆至载体pRM293（在质粒pTT5的基础上进行改造获得pRM293, 具体参见Shi C.Purification and characterization of a recombinant G-protein-coupledreceptor, Saccharomyces cerevisiae Ste2p, transiently expressed in HEK293EBNA1 cells. Biochemistry. 2005;44(48):15705–15714.）上。并委托苏州君跻生物科技有限公司将质粒瞬时转染至HEK293细胞(National Research Council，Canada)中，并利用Mabselect sure(Protein A, GE healthcare)进行亲和纯化。通过N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS ester）与胺交联将GDP-岩藻糖偶联到纯化的N803 备用，此后除非特殊声明，N803均为GDP-岩藻糖偶联的N803。

1. NHS酯活化的交联剂和被标记化合物在生理至弱碱性条件下（pH 7.2 至 9）与N803上的伯胺反应，形成稳定的酰胺键。利用此原理，TCO-PEG4-NHS上的NHS与N803蛋白上的伯胺反应，得到TCO-PEG4-N803。具体方法和过程如下：

将400 μg纯化后的N803蛋白与150 μg TCO-PEG4-NHS (上海派瑞医药科技有限公司，产品编号A34125)反应，并加入20 mM HEPES buffer（pH 7.0~7.5，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，产品编号15630），室温下孵育30分钟后，加入5 μmol Tris buffer终止反应，室温下孵育5分钟，反应产物加入PD SpinTrap G-25脱盐柱（Cytiva公司，产品编号28918004），800×g离心，去除未反应的以及反应生成的小分子，获得纯的TCO-PEG4-NHS。

2. 基于反式环辛烯和四嗪反应对之间的逆需求Diels-Alder环加成反应，TCO（反式环辛烯）和Tz（Tetrazine，四嗪）之间的连接形成二氢哒嗪键。利用此原理，TCO-PEG4-N803与GDP-岩藻糖衍生物GDP-Fucose-Triazole-PEG4-Tz反应，得到GDP-Fucose-Triazole-PEG4- PEG4-N803，即GDP-岩藻糖偶联的N803。具体如下：

将上一步得到的TCO-PEG4-N803进一步与30 μg GDP-Fucose-Triazole-PEG4-Tz（岩唐生物科技有限责任公司合成，产品编号YT-HJP-3-29）反应，室温下孵育30分钟后，反应产物加入PD SpinTrap G-25脱盐柱（Cytiva公司，产品编号28918004），800×g离心，去除未反应的以及反应生成的小分子，获得纯的GDP-岩藻糖偶联的N803。

根据MALDI-TOF的检测，偶联后的N803会携带6至10个左右的GDP-岩藻糖衍生物。此后除非特殊声明，N803均为GDP-岩藻糖偶联的N803。

实施例3.突变体催化的大分子供体底物标记人红细胞及流式细胞术检测

从健康匿名献血者处获取2-3 mL血液，采血部位为肘前静脉，皮肤消毒后，使用一次性真空采血装置，由专业人员操作。血液沿试管壁缓慢流入，达到标记处后拔出试管，并迅速颠倒数次混匀，防止凝固。500×g，4摄氏度下离心血液5分钟，并在试管上标记红细胞压积（红色，下层）和血浆（黄色，上层）水平。通过微量移液器缓慢并充分抽吸血浆及中间沉淀物（buffy coat），抽取的液体加入漂白剂，并丢弃到生物危险废物中。取0.5 mL红细胞压积转移至15 mL离心管中，加入PBS pH 7.4溶液5 mL盖上盖子，翻转数次混匀。500×g，4摄氏度下离心5分钟，吸取上清液，弃去。重复PBS洗涤步骤3-4次。洗涤后的红细胞加入1000微升 PBS，置于4摄氏度保存待用。

在5×10⁹/mL红细胞中分别加入100 μg/mL岩藻糖基转移酶的突变体，以及150 μg/mL GDP-岩藻糖偶联的N803，室温下孵育30分钟。用PBS pH7.4洗涤， 500×g离心，去除上清。红细胞重悬于PBS pH7.4，与anti-hIgG-Biotin抗体（北京百奥莱博科技有限公司，产品编号F030822，1:200稀释）4摄氏度下共同孵育30分钟，PBS洗涤一次后，用Streptavidin-PE（BioLegend, Inc.，产品编号405204，1:200稀释）染色，4摄氏度下共同孵育30分钟，PBS洗涤一次后，用流式细胞仪（北京层浪生物科技有限公司，产品型号MateCyte）检测，并用NovoExpress软件分析。

如图5所示，在相同的底物和实验条件下，突变体D139E、突变体A108V、突变体N167Q、突变体P64S和野生型，均能够将GDP-岩藻糖偶联的N803到红细胞膜表面，但效率不同。突变体D139E和突变体A108V能将更多的N803偶联在细胞膜表面，其效率是野生型的1.75-1.82倍，而突变体N167Q和突变体P64S则明显减弱了很多，只有野生型的25%-6% (图6）。

实施例4.Westernblot的方法检测红细胞膜上的抗体的存在以及相对的载量

为了进一步证实N803被转移到红细胞的细胞膜上，用Westernblot的方法检测红细胞膜上的抗体的存在以及相对的载量。红细胞没有细胞核和细胞器，可以在低渗溶液中裂解，去除可溶的细胞内血红蛋白后，剩余的都是膜蛋白。将上述条件下，在不同岩藻糖基转移酶的突变体催化的5×10⁷红细胞用纯净水低渗裂解后，分别用细胞膜蛋白提取试剂盒（北京鑫泉永硕科技有限公司，货号XQ-P1203）提取膜蛋白，参照试剂盒说明书进行细胞膜蛋白提取，简述如下：向每1×10⁷细胞或每100 μL细胞沉淀中加入500 μLCER试剂，震荡重悬，冰浴2min。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内，在冰水浴中上下手动匀浆20~30次。将裂解物800 g，4℃，离心5min，得到的上清即为胞膜-胞浆混合物。在上清液中加入1/10体积的MER，混匀后冰浴5min，14000 rpm，4℃，离心30 min，得到的沉淀即为胞膜组分。用50μL重悬buffer重悬备用。加入相同体积的2×SDS-PAGE电泳缓冲液，取20μL经过PAGE分离的蛋白质样品，并转移到硝酸纤维素薄膜上。用anti-hIgG-Biotin标记的一抗抗体（百奥莱博，货号F030822；）和Streptavidin-HRP（金斯瑞，货号M00091）进行孵育，用TBST漂洗后，进行化学发光反应，用ChemiDoc™成像系统（BioRAD）进行拍照，未经过酶处理的红细胞作为阴性对照标记为Naïve cells（图7）。图7显示，未经过酶处理的红细胞上没有检测到N803的存在，突变体N167Q和突变体P64S催化的红细胞上也没有检测到明显的N803存在。而突变体D139E和突变体A108V催化的红细胞上，以及野生型酶催化的红细胞上，都能检测到N803,且突变体D139E和突变体A108V催化的红细胞上携带有更多的N803。根据成像系统自带的图像分析软件ChemiDoc Imagers进行灰度分析，突变体D139E和突变体A108V上携带的N803分别是野生型的2倍和5倍。

实施例5.应用小分子和简单蛋白作为底物的酶活检测

研究过程中，也同样用Promega试剂盒检测4种突变体，以高纯度的GDP-Fucose作为供体底物，胎球蛋白为受体底物时的酶活性，酶活性测定按手册（Promega GDP-Glo™Glycosyltransferase Assay）所述进行。100 µM超纯GDP-岩藻糖（GDP-Fucose）（PromegaCat.#VA1097）作为供体底物，40µM胎球蛋白（Promega Cat#V4961）作为受体底物。依次加入梯度稀释的纯化的岩藻糖基转移酶的突变体（0ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100 ng）所有酶反应均在25µL体积的白色96孔板中进行。在室温下静置孵育60分钟，放入GloMax® 96 微孔板发光检测仪（Cat# E6501），室温下读取，并按照横坐标为反应体系中酶的质量，纵坐标为发光检测仪上读取的数据作图。图8发现除突变体P64S外，突变体D139E，突变体A108V3，突变体N167Q与野生型相比并没有显著的酶活性的差异。

因此用小分子（GDP-Fucose）和简单蛋白（胎球蛋白）作为底物的酶活检测，并不能真正反映在复杂条件下的酶的催化能力。

实施例6.以流式细胞术的平均荧光强度（MFI）做为酶反应产物的指标对复杂体系中的酶活性进行定量分析

流式细胞术的平均荧光强度（MFI）可以比较在相同条件下，目标分子在细胞膜上的多少，可以作为酶反应产物的指标。在本发明中，利用岩藻糖转移酶作为工具酶，把有临床治疗意义的蛋白转移到细胞膜上，制备工程细胞时，岩藻糖转移酶的底物不再是理想状况下的单一简单的底物，而是复杂而均一性不高的底物混合物，例如本发明中使用的供体的底物是GDP-岩藻糖偶联的N803，受体底物是红细胞。实施例3所建立的检测是在相同条件下（供体浓度，受体个数），野生型和突变体在相同的“单一”浓度下，比较细胞上被标记的多少。并不能完整体现出酶活性，只是简单对比。不能计算Km，属于定性分析。目的是区分和去除没有活性的突变体。实施例3（图5）和实施例5（图8）的结果显示，在简单和复杂体系中，酶的突变体表现出截然不同的特点，例如突变体N167Q在简单体系中有良好的酶活性，但在复杂体系中却没有酶活性。因此在描述工程细胞制备所需的工具酶的活性特点时，需要建立以复杂体系为基础的酶活性定量分析方法。因此，我们建立了以流式细胞术为基础的酶活性定量检测方法，并根据米氏方程，进行非线性回归分析，通过拟合的方程计算出Km。该方法中，首先寻找到适合的酶浓度，在本发明中就是“不选择饱和浓度和不敏感区域”，针对不同浓度的“底物”测得数据；然后在该酶浓度下，针对不同浓度的底物（本发明中选择供体底物GDP-岩藻糖偶联的N803），测得酶反应产物的数据（本发明中使用MFI作为反应产物数据），然后根据米氏方程进行非线性回归分析，通过拟合的方程计算出Km。Km仅仅与酶的性质有关，与酶的浓度无关。

首先确定适合的酶浓度，底物过量的情况下，逐渐增加酶的浓度，然后检测底物被转移至细胞上的效率，选取效率居中时的酶浓度。具体过程如下：

在5×10⁹/mL红细胞中加入50μg/mLGDP-岩藻糖偶联的N803，并加入不同浓度的岩藻糖基转移酶的D139E突变体，浓度分别为0μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100μg/mL，室温下孵育30分钟。用PBS pH7.4洗涤， 500×g离心，去除上清。红细胞重悬于PBS pH7.4，与anti-hIgG-Biotin抗体（北京百奥莱博科技有限公司，产品编号F030822，1:200稀释）4摄氏度下共同孵育30分钟，PBS洗涤一次后，用Streptavidin-PE（BioLegend,Inc.，产品编号405204，1:200稀释）染色，4摄氏度下共同孵育30分钟，PBS洗涤一次后，用流式细胞仪（北京层浪生物科技有限公司，产品型号MateCyte）检测，并用NovoExpress软件分析。获取流式细胞术的平均荧光强度（MFI）。

如图9和图10所示，D139E突变体的浓度20 μg/mL时反应已经到饱和，选择10 μg/mL (80 nM)进行Km测定。过程如下：

野生型，突变体N167Q和突变体D139E浓度固定为10 μg/mL (80 nM)，在5×10⁹/mL红细胞中加入0nM（0μg/mL）, ~40 nM（5μg/mL），~80 nM (10 μg/mL)，~160 nM (20 μg/mL)，320 nM (40 μg/mL)，640 nM (80μg/mL)， 1280 nM (160μg/mL)GDP-岩藻糖偶联的N803。用实施例3所述方法进行孵育和流式细胞术检测，获取流式细胞术的平均荧光强度，然后利用GraphPadPrism 8软件中进行非线性拟合，选择软件中提供的酶动力学分析和Michaelis-Menten方程计算后得到Km值。图11显示了在复杂的供体和受体底物情况下用流式细胞术测定野生型，突变体D139E和突变体N167Q的酶活性比较图。突变体N167Q几乎无酶活性，突变体D139E的Km约为1μM，野生型Km约为3μM。酶活性较野生型Km（约为3μM）提高了3倍。

Claims

1.一种幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的突变体，其特征在于，所述α-1,3-幽门螺杆菌岩藻糖基转移酶突变体在序列如SEQ ID NO.1所示的野生型幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的108和/或139位氨基酸发生变异。

2. 根据权利要求1所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体，其征在于，所述幽门螺杆菌α-1,3-幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体的序列如SEQ ID NO.5所示。

3.一种编码权利要求2所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6所示。

4.一种表达权利要求2所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种表达权利要求2所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述幽门螺杆菌α-1,3-幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶突变体的序列如SEQ ID NO.7所示。

7.一种编码权利要求6所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.8所示。

8.一种表达权利要求6所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种表达权利要求6所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶突变体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求8所述的表达载体。

10.一种应用权利要求2或6所述的幽门螺杆菌α-1,3-岩藻糖基转移酶的突变体将靶分子标记于目的细胞或者目的蛋白质标记的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将GDP-岩藻糖与靶分子相缀合获得连接复合物；

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述靶分子为治疗性分子。

12.一种根据权利要求11所述方法标记的细胞或者蛋白质。

13.权利要求12所述的细胞或者蛋白质在制备疾病治疗药物中的应用。

14.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述疾病为肿瘤、炎症性疾病、代谢类疾病或需要酶替代治疗的罕见病。