CN116083463B - 一种用于增强免疫疗法效果的mRNA及其在制备mRNA疫苗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于增强免疫疗法效果的mRNA及其在制备mRNA疫苗中的用途，属于免疫疗法领域。本发明首次发现同时表达抗原和GM‑CSF、FLT3L、OX40L、4‑1BBL、CD70五种分子的mRNA能够诱导强效抗原特异性免疫反应，显著增强免疫疗法的效果，在制备mRNA疫苗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫疗法领域，具体涉及一种用于增强免疫疗法效果的mRNA及其在制备mRNA疫苗中的用途。
背景技术
近年来，对抗SARS-CoV-2病毒的mRNA疫苗作为重要预防手段备受瞩目。该类mRNA疫苗从实验室研究快速转入临床应用，并在抗疫过程中做出了巨大的贡献。同时，制药公司和研究机构也在紧锣密鼓的布局针对各类肿瘤和感染性疾病的mRNA疫苗研发管线。一方面，mRNA仅需要到达细胞质就能发挥作用且不会引起宿主基因组的插入突变；另一方面，mRNA是一个瞬时的生理调节器，且与传统蛋白疫苗等相比，技术难度和成本更低，利于快速大量生产以应对紧急事件，因此mRNA疫苗拥有广阔的发展前景。
由于极易被广泛存在的RNA酶降解，mRNA分子通常被包裹在脂质纳米颗粒(lipidnanoparticles，LNPs)等纳米载体内以提高其稳定性。常见的LNPs组成成分有可电离阳离子脂质、中性磷脂、甾醇和PEG化脂质等。各成分在LNPs中分别起到不同的作用，其中负责与mRNA结合的可电离阳离子脂质为LNPs的核心组成成分，中性磷脂为促进LNPs结构稳定的辅助脂质，甾醇起到稳定LNPs和调节膜流动性的作用，PEG化脂质用于确保LNPs的体内稳定性。
虽然LNPs中的可电离阳离子脂质具有一定的佐剂效应，但是该效应增强抗原相关特异性免疫的效果还需加强，目前亟需开发出能够显著增强免疫疗法效果的mRNA疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于增强免疫疗法效果的mRNA及其在制备mRNA疫苗中的用途。
本发明提供了一种mRNA，它是由线性化DNA模板转录而来，所述线性化DNA模板包含抗原、GM-CSF、FLT3L、OX40L、4-1BBL和CD70融合蛋白基因的编码区。
进一步地，所述抗原为蛋白或多肽抗原。
进一步地，所述线性化DNA模板包含依次连接的GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、蛋白或多肽抗原、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区。
进一步地，所述蛋白抗原为肿瘤抗原或感染性疾病抗原。
进一步地，本发明所述线性化DNA模板的序列示例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4，但是，本发明所述线性化DNA模板中所编码的抗原不限于SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中所示的OVA或NA。
进一步地，编码本发明所述mRNA的cDNA序列示例如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9，但是，编码本发明所述mRNA的cDNA序列中所编码的抗原不限于SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中所示的OVA或NA。
进一步地，所述mRNA编码的蛋白序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种制备上述mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：向线性化DNA模板中加入T7 RNA聚合酶、核苷酸底物和RNA酶抑制剂，体外转录，然后加帽和纯化，得到mRNA。
本发明还提供了一种脂质纳米颗粒，它是以上述mRNA、可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇、聚乙二醇化的脂质或其衍生物为原料制备得到的。
进一步地，所述可电离阳离子脂质为ALC-0315(((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))，磷脂为DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)，聚乙二醇化的脂质为DMG-PEG2000(二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000)；
所述可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇、聚乙二醇化的脂质或其衍生物的摩尔比为(20-60)：(10-50)：(30-60)：(1-5)；
所述mRNA、可电离阳离子脂质的N/P为(1-10)：1。
进一步地，所述可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇、聚乙二醇化的脂质或其衍生物的摩尔比为50：10：38.5：1.5；
所述mRNA、可电离阳离子脂质的N/P为6：1。
mRNA、可电离阳离子脂质的N/P指可电离阳离子脂质中的可电离的氮原子与mRNA中的磷酸基团的摩尔比。
本发明还提供了一种制备上述脂质纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：将mRNA溶解于水性溶液中作为水相；将可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇、聚乙二醇化的脂质或其衍生物溶解于有机溶剂中作为有机相；混合水相与有机相，自组装得到脂质纳米颗粒。
进一步地，所述水性溶液为柠檬酸缓冲液，所述有机溶剂为乙醇。
本发明还提供了上述mRNA、上述脂质纳米颗粒在制备mRNA疫苗中的用途。
本发明首次发现同时表达抗原和GM-CSF、FLT3L、OX40L、4-1BBL、CD70五种分子的mRNA能够诱导强效抗原特异性免疫反应，显著增强免疫疗法的效果，在制备mRNA疫苗中具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为各mRNA变性琼脂糖凝胶电泳图。其中，A中从左到右为C.F.OVA.4.9.7mRNA、C.F.OVAmRNA、C.F.4.9.7mRNA、OVAmRNA、Luciferase mRNA标准参照物和分子量标准；B中从左到右为C.F.4.9.7mRNA和分子量标准；C中从左到右为C.F.NA.4.9.7mRNA和分子量标准。
图2为OVA mRNA-LNPs的粒径(A)和电位的分布(B)。
图3为各OVA mRNA-LNPs治疗模型中小鼠肿瘤生长曲线；其中，A为buffer组；B为OVA组；C为C.F.OVA组；D为C.F.OVA.4.9.7组；E为C.F.4.9.7组。
图4为各OVA mRNA-LNPs治疗模型中小鼠平均肿瘤体积和生存曲线；其中，A为平均肿瘤体积；B为生存曲线。
图5为各CT26 mRNA-LNPs治疗模型中小鼠肿瘤生长曲线；其中，A为buffer组；B为C.F.4.9.7组；C为C.F.NA.4.9.7组。
图6为各CT26 mRNA-LNPs治疗模型中小鼠平均肿瘤体积和生存曲线；其中，A为平均肿瘤体积；B为生存曲线。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1：一种用于增强mRNA免疫疗法效果的含OVA的mRNA-LNPs的制备方法
步骤1：制备线性化DNA模板
1)转录模板为pT7AGA2质粒载体。该质粒载体的序列顺序为T7启动子序列、5’α-globin UTR序列、编码区克隆位点、3’α-globin UTR序列和poly(A)尾序列。按5’到3’的顺序克隆GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、OVA、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区至pT7AGA2质粒载体上的编码区克隆位点，得到C.F.OVA.4.9.7线性化DNA模板。
2)使用限制性内切酶BspQI在poly(A)的末尾处对质粒进行切割得到体外转录所需的C.F.OVA.4.9.7线性化DNA模板(序列如SEQ ID NO:3所示)。
步骤2：制备mRNA
向C.F.OVA.4.9.7线性化DNA模板中加入T7 RNA聚合酶、核苷酸底物、RNA酶抑制剂等原料体外转录线性化DNA模板得到mRNA。在反应过程中用me1Ψ-UTP代替UTP。随后用牛痘病毒加帽酶和二氧甲基转移酶进行转录后加帽，得到具有Cap1结构的C.F.OVA.4.9.7mRNA。最后，用oligo(dT)30磁珠纯化加帽后的mRNA，并用变性琼脂糖凝胶电泳法评估所合成mRNA的品质。
步骤3：制备mRNA-LNPs
将纯化加帽后的C.F.OVA.4.9.7mRNA溶解于含有10mM pH3.0的柠檬酸缓冲液中作为水相；将ALC-0315、DSPC、甾醇和DMG-PEG2000(摩尔比为50：10：38.5：1.5)溶解于乙醇溶液中作为有机相，C.F.OVA.4.9.7mRNA与ALC-0315的N/P为6：1。设置微流控混合器的制备参数为流速比3：1和总流速12mL/min，快速混合水相与有机相，使其自组装形成C.F.OVA.4.9.7mRNA-LNPs初制品，透析过夜得C.F.OVA.4.9.7mRNA-LNPs，透析液为含9％蔗糖的Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 7.4)。
实施例2：一种用于增强mRNA免疫疗法效果的含CT26新抗原的mRNA-LNPs的制备方法
步骤1：制备线性化DNA模板
1)转录模板为pT7AGA2质粒载体。该质粒载体的序列顺序为T7启动子序列、5’α-globin UTR序列、编码区克隆位点、3’α-globin UTR序列和poly(A)尾序列。按5’到3’的顺序克隆GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、CT26新抗原(NA)、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区至pT7AGA2质粒载体上的编码区克隆位点，得到C.F.NA.4.9.7线性化DNA模板。
2)使用限制性内切酶BspQI在poly(A)的末尾处对质粒进行切割得到体外转录所需的C.F.NA.4.9.7线性化DNA模板(序列如SEQ ID NO:4所示)。
步骤2：制备mRNA
向C.F.NA.4.9.7线性化DNA模板中加入T7 RNA聚合酶、核苷酸底物、RNA酶抑制剂等原料体外转录线性化DNA模板得到C.F.NA.4.9.7RNA。在反应过程中用me1Ψ-UTP代替UTP。随后用牛痘病毒加帽酶和二氧甲基转移酶进行转录后加帽，得到具有Cap1结构的C.F.NA.4.9.7mRNA。最后，用oligo(dT)30磁珠纯化加帽后的mRNA，并用变性琼脂糖凝胶电泳法评估所合成mRNA的品质。
步骤3：制备mRNA-LNPs
将纯化加帽后的C.F.NA.4.9.7mRNA溶解于含有10mM pH3.0的柠檬酸缓冲液中作为水相；将ALC-0315、DSPC、甾醇和DMG-PEG2000(摩尔比为50：10：38.5：1.5)溶解于乙醇溶液中作为有机相，mRNA与ALC-0315的N/P为6：1。设置微流控混合器的制备参数为流速比3：1和总流速12mL/min，快速混合水相与有机相，使其自组装形成C.F.NA.4.9.7mRNA-LNPs初制品，透析过夜得C.F.NA.4.9.7mRNA-LNPs，透析液为含9％蔗糖的Tris-HCl缓冲液(20mM，pH7.4)。
以下为对照样品的制备方法。
对照例1：
步骤1：
参照实施例1步骤1的方法，将步骤1中GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、OVA、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区替换为OVA基因的编码区，得到体外转录所需的OVA线性化DNA模板(序列如SEQ ID NO:5所示)。
参照实施例1步骤1的方法，将步骤1中GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、OVA、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区替换为GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、OVA的融合蛋白基因的编码区，得到体外转录所需的C.F.OVA线性化DNA模板(序列如SEQ ID NO:6所示)。
参照实施例1步骤1的方法，将步骤1中GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、OVA、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区替换为GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区，得到体外转录所需的C.F.4.9.7线性化DNA模板(序列如SEQ ID NO:7所示)。
步骤2：
参照实施例1步骤2的方法，分别将C.F.OVA.4.9.7线性化DNA模板替换为上述OVA线性化DNA模板、C.F.OVA线性化DNA模板、C.F.4.9.7线性化DNA模板，得到纯化加帽后的OVAmRNA、C.F.OVA mRNA、C.F.4.9.7mRNA。
步骤3：
参照实施例1步骤3的方法，分别将C.F.OVA.4.9.7mRNA替换为OVA mRNA、C.F.OVAmRNA、C.F.4.9.7mRNA，得到OVA mRNA-LNPs、C.F.OVA mRNA-LNPs、C.F.4.9.7mRNA-LNPs。
对照例2：
步骤1：
参照实施例2步骤1的方法，将步骤1中GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、CT26新抗原(NA)、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区替换为GM-CSF、2A连接肽、FLT3L、2A连接肽、OX40L、2A连接肽、4-1BBL、2A连接肽和CD70融合蛋白基因的编码区，得到体外转录所需的C.F.4.9.7线性化DNA模板。
步骤2：
参照实施例2步骤2的方法，将C.F.NA.4.9.7线性化DNA模板替换为上述C.F.4.9.7线性化DNA模板，得到纯化加帽后的C.F.4.9.7mRNA。
步骤3：
参照实施例2步骤3的方法，将C.F.NA.4.9.7mRNA替换为C.F.4.9.7mRNA，得到C.F.4.9.7mRNA-LNPs。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1：mRNA-LNPs的表征
1.实验方法
取200uL所制备的mRNA-LNPs用Rnase free dd H2O稀释至5倍，检测所制备mRNA-LNPs的粒径、PDI和zeta电位。
按Quant-it RiboGreen RNA assay所示操作指南检测mRNA的包封率。当染料与完整的mRNA-LNPs结合时，测得未包封的mRNA。检测总mRNA浓度时，用Triton X-100作为破膜剂裂解mRNA-LNPs释放所包封的mRNA。按照公式EE％＝(1-C未包封/C总)*100计算所制备各mRNA-LNPs的包封率。
2.实验结果
表1.各mRNA-LNPs粒径、电位和包封率数据
| mRNA-LNPs | 粒径/nm | PDI | 电位/mV | 包封率/％ |
| OVA | 89.53 | 0.072 | -6.81 | 83.26 |
| C.F.OVA | 92.25 | 0.110 | -5.15 | 81.38 |
| C.F.OVA.4.9.7 | 90.98 | 0.129 | -5.39 | 84.34 |
| C.F.4.9.7 | 89.28 | 0.146 | -6.31 | 83.29 |
表2.各mRNA-LNPs粒径、电位和包封率数据
| mRNA-LNPs | 粒径/nm | PDI | 电位/mV | 包封率/％ |
| C.F.4.9.7 | 89.28 | 0.146 | -6.31 | 83.29 |
| C.F.OVA.4.9.7 | 96.56 | 0.100 | -6.26 | 84.21 |
结果如图1-2和表1-2所示。
实验例2：mRNA-LNPs对E.G7-OVA肿瘤模型的治疗效果
1.实验方法
(1)实验样品
实施例1和对照例1制备得到的各mRNA-LNPs。
(2)皮下成瘤
以C57BL/6小鼠为实验动物，采用皮下注射的方式构建荷瘤小鼠。取对数生长期的肿瘤细胞制备单细胞悬液计数,按1×106个/只接种于小鼠背部左侧皮下，此时记为第0天，随后观察并记录肿瘤体积变化。随机将小鼠分为buffer组、OVA组、C.F.OVA组、C.F.OVA.4.9.7组和C.F.4.9.7组，每组8只。
(3)小鼠免疫
第3天时，采用肌肉注射的免疫方式，通过E.G7-OVA肿瘤模型验证mRNA疫苗的抗肿瘤效果。单次接种约含20μgOVA mRNA的mRNA-LNPs于每只小鼠右侧大腿肌肉组织内，随后不再介入治疗，检测肿瘤的长度(L)和宽度(W)，按照公式V＝0.5×L×W2计算肿瘤体积大小。当满足以下任一条件时，对荷瘤小鼠施以安乐死：1)肿瘤体积＞1000mm3，2)肿瘤溃烂或小鼠濒死。
2.实验结果
结果如图3-4所示。可以看出，C.F.OVA.4.9.7组对E.G7-OVA肿瘤模型的治疗效果显著提高。
实验例3：mRNA-LNPs对CT26肿瘤模型的治疗效果
1.实验方法
(1)实验样品
实施例2和对照例2制备得到的各mRNA-LNPs。
(2)皮下成瘤
以BABL/C小鼠为实验动物，采用皮下注射的方式构建荷瘤小鼠。取对数生长期的肿瘤细胞制备单细胞悬液计数,按3×105个/只接种于小鼠背部左侧皮下，此时记为第0天，随后观察并记录肿瘤体积变化。随机将小鼠分为buffer组、C.F.4.9.7组和C.F.NA.4.9.7每组8只。
(3)小鼠免疫
第3天时，采用肌肉注射的免疫方式，通过CT26肿瘤模型验证mRNA疫苗的抗肿瘤效果。单次接种约含20μgC.F.NA.4.9.7mRNA的mRNA-LNPs于每只小鼠右侧大腿肌肉组织内，随后不再介入治疗，检测肿瘤的长度(L)和宽度(W)，按照公式V＝0.5×L×W2计算肿瘤体积大小。当满足以下任一条件时，对荷瘤小鼠施以安乐死：1)肿瘤体积＞1000mm3，2)肿瘤溃烂或小鼠濒死。
2.实验结果
结果如图5-6所示。可以看出，C.F.NA.4.9.7组对CT26肿瘤模型的治疗效果显著提高。
同时表达GM-CSF、FLT3L、OX40L、4-1BBL和CD70五种分子的mRNA所编码的蛋白的示例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1(小鼠来源)：
MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVS
NEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKT
FLTDIPFECKKPGQKRAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMTVLAPAWSPNSSLLLLLLLLSPCLRG
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MQTLLEDVNTEIHFVTSCTFQPLPECLRFVQTNISHLLKDTCTQLLALKPCIGKACQNFSRCLEVQCQ
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GSRPRFKWKKTLRLVVSGIKGAGMLLCFIYVCLQLSSSPAKDPPIQRLRGAVTRCEDGQLFISSYKNE
YQTMEVQNNSVVIKCDGLYIIYLKGSFFQEVKIDLHFREDHNPISIPMLNDGRRIVFTVVASLAFKDK
VYLTVNAPDTLCEHLQINDGELIVVQLTPGYCAPEGSYHSTVNQVPLRAKRGSGATNFSLLKQAGDV
EENPGPMDQHTLDVEDTADARHPAGTSCPSDAALLRDTGLLADAALLSDTVRPTNAALPTDAAYPA
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DVEENPGPMPEEGRPCPWVRWSGTAFQRQWPWLLLVVFITVFCCWFHCSGLLSKQQQRLLEHPEPH
TAELQLNLTVPRKDPTLRWGAGPALGRSFTHGPELEEGHLRIHQDGLYRLHIQVTLANCSSPGSTLQHRATLAVGICSPAAHGISLLRGRFGQDCTVALQRLTYLVHGDVLCTNLTLPLLPSRNADETFFGVQWICP。SEQ IDNO:2(人来源)：
MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVE
VISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENL
KDFLLVIPFDCWEPVQERAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMTVLAPAWSPTTYLLLLLLLSSGLS
GTQDCSFQHSPISSDFAVKIRELSDYLLQDYPVTVASNLQDEELCGGLWRLVLAQRWMERLKTVAGS
KMQGLLERVNTEIHFVTKCAFQPPPSCLRFVQTNISRLLQETSEQLVALKPWITRQNFSRCLELQCQPD
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QNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTD
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AGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQL
ELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV
HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSERAKRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM
PEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQ
QDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP。
C.F.OVA.4.9.7线性化DNA模板序列如SEQ ID NO:3所示，C.F.NA.4.9.7线性化DNA模板序列如SEQ ID NO:4所示，OVA线性化DNA模板序列如SEQ ID NO:5所示，C.F.OVA线性化DNA模板序列如SEQ ID NO:6所示，C.F.4.9.7线性化DNA模板序列如SEQ ID NO:7所示：
编码C.F.OVA.4.9.7的cDNA序列如SEQ ID NO:8所示，编码C.F.NA.4.9.7的cDNA序列如SEQ IDNO:9所示，编码OVA的cDNA序列如SEQ ID NO:10所示，编码C.F.OVA的cDNA序列如SEQ ID NO:11所示，编码C.F.4.9.7的cDNA序列如SEQ ID NO:12所示：
Claims (8)
1.一种mRNA，其特征在于：它是由线性化DNA模板转录而来，所述线性化DNA模板包含抗原、GM-CSF、FLT3L、OX40L、4-1BBL和CD70融合蛋白基因的编码区，编码所述mRNA的cDNA序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。
2.一种制备权利要求1所述mRNA的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：向线性化DNA模板中加入T7 RNA聚合酶、核苷酸底物和RNA酶抑制剂，体外转录，然后加帽和纯化，得到mRNA。
3.一种脂质纳米颗粒，其特征在于：它是以权利要求1所述mRNA、可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇和聚乙二醇化的脂质或其衍生物为原料制备得到的。
4.根据权利要求3所述的脂质纳米颗粒，其特征在于：所述可电离阳离子脂质为ALC-0315，磷脂为DSPC，聚乙二醇化的脂质为DMG-PEG2000；
所述可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇、聚乙二醇化的脂质或其衍生物的摩尔比为(20-60)：(10-50)：(30-60)：(1-5)；
所述mRNA、可电离阳离子脂质的N/P为(1-10)：1。
5.根据权利要求4所述的脂质纳米颗粒，其特征在于：所述可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇、聚乙二醇化的脂质或其衍生物的摩尔比为50：10：38.5：1.5；
所述mRNA、可电离阳离子脂质的N/P为6：1。
6.一种制备权利要求3-5任一项所述脂质纳米颗粒的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：将mRNA溶解于水性溶液中作为水相；将可电离阳离子脂质、磷脂、甾醇、聚乙二醇化的脂质或其衍生物溶解于有机溶剂中作为有机相；混合水相与有机相，自组装得到脂质纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述水性溶液为柠檬酸缓冲液，所述有机溶剂为乙醇。
8.权利要求1所述mRNA、权利要求3-5任一项所述脂质纳米颗粒在制备mRNA疫苗中的用途。
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| Incorporation of a Toll-like receptor 2/6 agonist potentiates mRNA vaccines against cancer and infectious diseases;Yangzhuo Gu;Signal Transduction and Targeted Therapy;20230717;1-12 * |
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