CN116064469A - 一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成nmn的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成NMN的应用。该烟酰胺核糖激酶突变体为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变序列，突变位点至少包括如下位点之一：第6位、第34位或第47位；或者，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列为至少包括上述突变位点之一且与SEQ ID NO:2具有80％以上同一性、具有烟酰胺核糖激酶催化活性的氨基酸序列。应用本发明的技术方案，该突变体可高效催化烟酰胺核糖和ATP转化为NMN，极大地降低了工业上应用生物催化技术生产NMN的成本，具有较高的工业应用价值。

Description

一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成NMN的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物工程领域，特别涉及一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成NMN的应用。

背景技术

NAD⁺是维持生物体生命活动的重要生物大分子，研究发现，NAD⁺水平会随着年龄的增长出现系统性下降，通过补充烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)，可有效恢复NAD⁺水平，改善代谢性疾病、衰老和神经退行性病变等相关疾病的病理状态，具有延缓衰老、延长寿命等功效。这些治疗功效促使开发含有NMN活性成分的功能性食品、保健品和药物具有广阔的应用前景。随着人们对NMN的药用和保健效果的认知在不断增加，市场上对NMN的需求量与日俱增。

而目前生产NMN的方法主要是酶催化法，其中之一是用烟酰胺核糖激酶(nicotinamide riboside kinase,NRK，EC 2.7.1.22)特异性催化烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，NR)和ATP转化为NMN和ADP。但是由于现有的烟酰胺核糖激酶的酶活性较低，将其应用于工业化催化生产NMN时，产率较低，导致生产成本较高，产品缺乏市场竞争力，严重制约了NMN的生物催化技术的工业化应用。因此，提高烟酰胺核糖激酶的催化活力是降低NMN的生物催化成本、提高烟酰胺核糖激酶的工业应用价值、促进生物催化技术在NMN工业化生产中应用的关键因素。

发明内容

本发明旨在提供一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体及其合成NMN的应用，以解决现有技术中烟酰胺核糖激酶的活性较低、工业应用价值较低的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种烟酰胺核糖激酶突变体。该烟酰胺核糖激酶突变体为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变序列，突变位点至少包括如下位点之一：第34位、第6位或第47位；或者，烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列为至少包括上述突变位点之一且与SEQ ID NO:2具有80％以上同一性、具有烟酰胺核糖激酶催化活性的氨基酸序列。

进一步地，突变位点为I6V、S34H或T47V。

进一步地，突变位点为I6V、S34H和T47V。

根据本发明的另一个方面，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种烟酰胺核糖激酶突变体。

根据本发明的再一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒连接有上述DNA分子。

进一步地，重组质粒的载体质粒为pBR327、pAT153、pUC18、pUC19、pET21或pETite；优选为pETite。

根据本发明的又一方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述重组质粒。

进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为BL21(DE3)大肠杆菌；优选真核细胞为酵母细胞或毕赤巴斯德酵母细胞。

根据本发明的再一方面，提供一种生产烟酰胺单核苷酸的方法。该方法包括采用烟酰胺核糖激酶对烟酰胺核糖和ATP、或能够转化成烟酰胺核糖或者ATP的前体物质进行催化反应，烟酰胺核糖激酶为上述任一种烟酰胺核糖激酶突变体。

进一步地，催化反应包括：以烟酰胺核糖和ATP为原料，在烟酰胺核糖激酶突变体的催化作用下制备NMN；或者，以烟酰胺、磷酸核糖焦磷酸和ATP为原料，在以烟酰胺核糖激酶突变体和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化用下制备NMN；或者，以烟酰胺、AMP和焦磷酸或其盐为原料，以烟酰胺核糖激酶突变体和腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下制备NMN；优选的，烟酰胺核糖激酶突变体的使用形式为酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞；优选的，催化反应的温度为36～37℃；优选的，催化反应的pH为7.0～8.0℃；优选的，催化反应底物烟酰胺核糖的浓度为5～60mM。

应用本发明的技术方案，该突变体可高效催化烟酰胺核糖和ATP转化为NMN，极大地降低了工业上应用生物催化技术生产NMN的成本，具有较高的工业应用价值。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了烟酰胺核糖激酶NRK1及其突变体的活性。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

来源于人的烟酰胺核糖激酶NRK1的编码基因长600个碱基(GenBank登录号：AY611480.1，SEQ ID NO:1，ATGAAAACATTTATCATTGGAATCAGTGGTGTGACAAACAGTGGCAAAACAACACTGGCTAAGAATTTGCAGAAACACCTCCCAAATTGCAGTGTCATATCTCAGGATGATTTCTTCAAGCCAGAGTCTGAGATAGAGACAGATAAAAATGGATTTTTGCAGTACGATGTGCTTGAAGCACTTAACATGGAAAAAATGATGTCAGCCATTTCCTGCTGGATGGAAAGCGCAAGACACTCTGTGGTATCAACAGACCAGGAAAGTGCTGAGGAAATTCCCATTTTAATCATCGAAGGTTTTCTTCTTTTTAATTATAAGCCCCTTGACACTATATGGAATAGAAGCTATTTCCTGACTATTCCATATGAAGAATGTAAAAGGAGGAGGAGTACAAGGGTCTATCAGCCTCCAGACTCTCCGGGATACTTTGATGGCCATGTGTGGCCCATGTATCTAAAGTACAGACAAGAAATGCAGGACATCACATGGGAAGTTGTGTACCTGGATGGAACAAAATCTGAAGAGGACCTCTTTTTGCAAGTATATGAAGATCTAATACAAGAACTAGCAAAGCAAAAGTGTTTGCAAGTGACAGCATAA)，该基因全长编码199个氨基酸(序列号：Q9NWW6.1，SEQ ID NO:2，MKTFIIGISGVTNSGKTTLAKNLQKHLPNCSVISQDDFFKPESEIETDKNGFLQYDVLEALNMEKMMSAISCWMESARHSVVSTDQESAEEIPILIIEGFLLFNYKPLDTIWNRSYFLTIPYEECKRRRSTRVYQPPDSPGYFDGHVWPMYLKYRQEMQDITWEVVYLDGTKSEEDLFLQVYEDLIQELAKQKCLQVTA)，理论分子量为23193.44。NRK1的晶体结构(PDB：2QT0)已于2007年获得解析，Asp36和Asp56为该酶的活性位点。本发明通过理性设计和定点突变技术，对NRK1的催化活性进行改造提升，用以工业化高效、低成本合成NMN。

发明人对核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的原始烟酰胺核糖激酶的基因优化密码子后进行理性设计和定点突变，插入到适当的载体中，在LB培养基上筛选，从而获得具有高催化活性的烟酰胺核糖激酶突变体。

本发明提供的烟酰胺核糖激酶突变体的制备过程大致为：首先理性设计突变位点以及突变后的氨基酸种类，优化原始烟酰胺核糖激酶基因的密码子，然后人工合成烟酰胺核糖激酶突变体的全长基因，通过Gibson方法将该全长突变基因组装到适当的载体质粒上构建烟酰胺核糖激酶的重组质粒，并转化适当的宿主细胞，通过Luria broth(LB)+卡那霉素培养基筛选阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，转化表达细胞，通过LB+卡那霉素培养基筛选，从而获得具有高催化活性的烟酰胺核糖激酶突变体。

在本发明一种典型的实施方式中，提供一种烟酰胺核糖激酶突变体。该烟酰胺核糖激酶突变体为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变序列，突变位点至少包括如下位点之一：第6位、第34位或第47位；或者；烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列为至少包括上述突变位点之一且与SEQ ID NO:2具有80％以上(优选85％以上，进一步优选90％以上，最优选95％以上，比如可以是85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％以上，甚至99.9％以上)同一性、具有烟酰胺核糖激酶催化活性的氨基酸序列，即在SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且以烟酰胺核糖和ATP为底物具有比氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的亲本高的烟酰胺核糖激酶催化活性的SEQ ID NO:2的衍生的蛋白质。

应用本发明的技术方案，该突变体可高效催化烟酰胺核糖和ATP转化为NMN，极大地降低了工业上应用生物催化技术生产NMN的成本，具有较高的工业应用价值。

在本发明一种典型的实施方式中，烟酰胺核糖激酶突变体中突变位点为I6V、S34H或T47V；优选为突变位点为I6V、S34H和T47V。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述烟酰胺核糖激酶突变体。该DNA分子编码的上述烟酰胺核糖激酶突变体具有很好的活力。

本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。

虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。

本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，可采用任何适用的载体，例如：可以为克隆载体，如pUC18、pUC19等；可以为原核表达载体，pET21和pETite等。本发明优先选用pETite为载体，载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原核细胞，也可以是包括酵母细胞和毕赤巴斯德酵母细胞在内的真核细胞，本发明优先选用HI-Control BL21(DE3)为表达宿主细胞。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，包括采用烟酰胺核糖激酶对烟酰胺核糖和ATP进行催化反应的步骤，烟酰胺核糖激酶为本发明的上述任一种烟酰胺核糖激酶突变体。该方法可以是生物催化工艺也可以是发酵工艺。

上述制备烟酰胺单核苷酸(NMN)的生物催化工艺具体是指生物催化底物转化成NMN的工艺，其中的生物酶是本发明的烟酰胺核糖激酶突变体或者是本发明的烟酰胺核糖激酶突变体和一种或者多种其他酶的联合使用，其中的底物可以是烟酰胺核糖和ATP，也可以是够转化成烟酰胺核糖或者ATP的前体物质，例如：以烟酰胺核糖和ATP为原料，在本发明的烟酰胺核糖激酶突变体的催化作用下制备NMN；以烟酰胺、磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和ATP为原料，在以本发明的烟酰胺核糖激酶突变体、烟酰胺磷酸核糖转移酶催化用下制备NMN；以烟酰胺、AMP和焦磷酸或其盐为原料，以本发明的烟酰胺核糖激酶突变体和腺呤磷酸核糖转移酶的催化作用下制备NMN；优选地，本发明的烟酰胺核糖激酶突变体的使用形式为酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞。优选的，催化反应的温度为37℃；催化反应的pH为7.0～8.0℃；催化反应底物烟酰胺核糖的浓度为5～60mM。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

以下实施例中所使用的烟酰胺核糖激酶，是来自人的烟酰胺核糖激酶核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的原始烟酰胺核糖激酶优化密码子后经人工设计定点突变获得。

实施例1

含有亲本烟酰胺核糖激酶(NRK1)基因的重组载体和表达菌株的构建

对基因库公布的来自人的亲本烟酰胺核糖激酶(NRK1)的基因序列(GenBank登录号：AY611480.1)先进行密码子优化，优化后的基因长为597个碱基，序列为SEQ ID NO:3：ATGAAGACCTTTATTATCGGTATTAGCGGTGTTACCAATAGCGGTAAAACCACACTGGCAAAAAATCTGCAGAAACATCTGCCGAATTGTAGCGTTATTAGCCAGGATGATTTTTTCAAACCGGAAAGCGAAATCGAAACCGATAAAAATGGTTTCCTGCAGTATGATGTTCTGGAAGCACTGAACATGGAAAAAATGATGAGCGCAATTAGCTGTTGGATGGAAAGCGCACGTCATAGCGTTGTTAGCACCGATCAAGAAAGCGCAGAAGAAATTCCGATTCTGATTATTGAAGGCTTCCTGCTGTTTAACTATAAACCGCTGGATACCATTTGGAACCGTAGCTATTTTCTGACCATTCCGTATGAAGAATGTAAACGTCGTCGTAGCACCCGTGTTTATCAGCCTCCGGATAGTCCGGGTTATTTTGATGGTCATGTTTGGCCGATGTATCTGAAATATCGTCAAGAAATGCAGGACATCACCTGGGAAGTTGTTTATCTGGATGGCACCAAAAGCGAAGAAGATTTATTTCTGCAGGTCTATGAGGATCTGATTCAAGAACTGGCCAAACAGAAATGTCTGCAGGTTACCGCA，然后人工合成NRK1的全长序列nrk1(由商业合成公司完成)。合成的产物通过Gibson自组装法重组到线性化质粒pETite C-His的多克隆位点上，得重组质粒pETite-nrk 1。转化Turbo化学感受态克隆菌株(NEB)，涂布到含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃过夜培养。用质粒提取试剂盒(NEB Monarch)从pETite-nrk 1/Turbo阳性克隆菌株提取质粒，使用引物pETite-T7Forward：ACGACTCACTATAGGGTGTGAG(SEQ ID NO：4)和pETite-T7Reverse：CTCAAGACCCGTTTAGAGGC(SEQ ID NO：5)测序。经DNA测序，确定该亲本烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2

烟酰胺核糖激酶突变体的制备

PCR扩增反应体系为：25μL 2×KOD One PCR Master Mix(Toyobo)，1.5μL 10μmol/L的上游引物，1.5μL 10μmoL/L的下游引物，1.0μL 1.0ng/μL pETite-nrk1质粒，21μLddH₂O。PCR扩增反应条件为：变性98℃，10秒；退火55℃，5秒；延伸68℃，15秒，30个循环，保存4℃。

1、I6V突变体的制备

用如下引物对：nrk1/I6V-F：ATGAAGACCTTTATTGTTGGTATTAGCGGTGTTACCAA(SEQ IDNO：6)，nrk1/I6V-R：CCAACAATAAAGGTCTTCATATGTATATCTCCTTCT(SEQ ID NO：7)，以实施例1构建的质粒pETite-nrk1为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增nrk1/I6V突变体基因，PCR产物用DNA胶回收试剂盒切胶回收，得重组质粒pETite-nrk1/I6V。然后转化Turbo化学感受态克隆菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃过夜培养。用质粒提取试剂盒提取pETite-nrk1/I6V/Turbo阳性克隆菌株质粒，使用引物pETite-T7 Forward：ACGACTCACTATAGGGTGTGAG(SEQ ID NO：4)和pETite-T7Reverse：CTCAAGACCCGTTTAGAGGC(SEQ ID NO：5)测序。经DNA测序，确定为该酰胺核糖激酶突变体I6V的核苷酸序列。

2、S34H突变体的制备

用如下引物对：nrk1/S34H-F：5’AGCGTTATTCATCAGGATGATTTTTTCAAACCGG 3’(SEQID NO：8)，nrk1/S34H-R：5’TCATCCTGATGAATAACGCTACAATTCGGCA 3’(SEQ ID NO：9)，以实施例1构建的质粒pETite-nrk1为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增nrk1/S34H突变体基因，PCR产物用DNA胶回收试剂盒切胶回收，得重组质粒pETite-nrk1/S34H。然后转化Turbo化学感受态克隆菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃过夜培养。用质粒提取试剂盒提取pETite-nrk1/S34H/Turbo阳性克隆菌株质粒，使用引物pETite-T7 Forward：ACGACTCACTATAGGGTGTGAG(SEQ ID NO：4)和pETite-T7 Reverse：CTCAAGACCCGTTTAGAGGC(SEQ ID NO：5)测序。经DNA测序，确定为该酰胺核糖激酶突变体S34H的核苷酸序列。

3、T47V突变体的制备

用如下引物对：nrk1/T47V-F：5’GATAAAAATGGTTTCCTGCAGTATGATGTTC 3’(SEQ IDNO：10)，nrk1/T47V-R：5’TGCAGGAAACCATTTTTATCAACTTCGATTTCGCTTTCCGGTTTG3’(SEQ IDNO：11)，以实施例1构建的质粒pETite-nrk1为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增nrk 1/T47V突变体基因，PCR产物用DNA胶回收试剂盒切胶回收,得重组质粒pETite-nrk1/T47V。然后转化Turbo化学感受态克隆菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃过夜培养。用质粒提取试剂盒提取pETite-nrk1/T47V/Turbo阳性克隆菌株质粒，使用引物pETite-T7 Forward：ACGACTCACTATAGGGTGTGAG(SEQ IDNO：4)和pETite-T7 Reverse：CTCAAGACCCGTTTAGAGGC(SEQ ID NO：5)测序。经DNA测序，确定为该酰胺核糖激酶突变体T47V的核苷酸序列。

4、I6V+S34H+T47V突变体的制备

人工合成nrk1/I6V+S34H+T47V的全长序列(由商业合成公司完成)。合成的产物通过Gibson自组装法重组到线性化质粒pETite C-His的多克隆位点上，得重组质粒pETite-nrk1/I6V+S34H+T47V。转化Turbo化学感受态克隆菌株(NEB)，涂布到含有30μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃过夜培养。用质粒提取试剂盒(NEB Monarch)从pETite-nrk1/I6V+S34H+T47V/Turbo阳性克隆菌株提取质粒，使用引物pETite-T7 Forward：ACGACTCACTATAGGGTGTGAG(SEQ ID NO：4)和pETite-T7 Reverse：CTCAAGACCCGTTTAGAGGC(SEQ ID NO：5)测序。经DNA测序，确定为该酰胺核糖激酶突变体I6V+S34H+T47V的核苷酸序列。

实施例3

酶的诱导表达和分离纯化

分别将含有亲本烟酰胺核糖激酶基因的质粒pETite-nrk 1和含有烟酰胺核糖激酶突变体基因的质粒pETite-nrk1/I6V、pETite-nrk1/S34、ETite-nrk1/T47V和nrk1/I6V+S34H+T47V分别转化表达菌株细胞E.coli HI-Control BL21(DE3)，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上于37℃培养大约20小时。挑取单克隆接种于50mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中于37℃培养大约12～18小时(OD₆₀₀至0.4)，得一级种子液。按2：100体积比将一级种子液接种于100mL的含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、270rpm，培养3～4小时(OD₆₀₀至0.4)，得二级种子液。按2：100体积比将二级种子液接种于500mL的含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm，培养3～4小时(OD₆₀₀至0.4)，然后冷却至18℃，加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导剂，于18℃、200rpm、培养16～18小时，诱导NRK1及其突变体酶表达。于4℃下，通过5000rpm离心5分钟，收集菌体细胞；再用6倍体积的PBS缓冲液重悬菌体细胞，清洗菌体细胞，于4℃下，转速5000rpm离心5分钟，收集菌体细胞，用pH 7.4的50mM Tris-HCl，100mM NaCl缓冲液重悬菌体细胞，得重悬细胞液。然后用超高压低温细胞破碎仪破碎细胞，释放目标酶，于4℃、12000rpm、离心10分钟，收集上清液，即得到亲本烟酰胺核糖激酶NRK1及其系列突变体的粗酶液，用于下一步酶的分离纯化和活性测定。

实施例4

酶的分离纯化

上述粗酶液使用0.45μM孔径的滤膜进行过滤，通过蛋白纯化仪及镍亲和层析进行分离纯化。平衡液A为50mM Tris-HCl,100mM NaCl,5mM Imidiazole,pH 7.4；洗脱液B为100％咪唑溶液，pH 7.4。流速2.0mL/min，30％ B洗脱液(即0.3M咪唑)的洗脱峰为目标蛋白峰，然后用HiPrep 26/10Desalting脱盐柱脱去咪唑，得到纯度较高的NRK1及其突变体酶。用烟酰胺核糖和ATP为底物测定酶活性。以BSA(牛血清白蛋白)为蛋白标准品，用Bradford方法测定酶浓度。

实施例5

酶的活性测定

用pH 7.4的50mM Tris-HCl+50mM NaCl配制以下溶液：60mM的烟酰胺核糖、60mM的ATP、100mM的MgCl₂，分别取60μL进行混匀，然后加入20μL实施例4得到的纯化酶溶液，于37℃、240rpm振荡反应10分钟，加入800μL乙腈水(V:V＝8:2)溶液终止反应。用高效液相色谱仪Waters Alliance e2695/2998和Atlantis HILIC Silica色谱柱(Waters，4.6×150mm，5.0μm粒径)检测底物烟酰胺核糖和产物烟酰胺单核苷酸的含量。进样量为2μL，流速为1.2mL min^-1，柱温为28℃，流动相A：0.1％(g/L)乙酸铵+5％(V:V)乙腈水，流动相B：乙腈，梯度洗脱曲线为0-7min 75％ B,7.1-13min 40％ B，13.1-24min 75％ B，流速为1.2mL/min，检测波长254nm。烟酰胺核糖、ATP和烟酰胺单核苷酸的保留时间分别约为4.0min、7.3min和9.0min。通过高效液相色谱仪(HPLC)检测反应液中底物烟酰胺核糖和产物烟酰胺单核苷酸(NMN)的含量。计算酶的活性，如图1所示。烟酰胺核糖激酶的一个酶活力单位(U)的定义：在37℃和pH 7.4条件下，每分钟转化1.0μmol烟酰胺核糖所需要的烟酰胺核糖激酶的量即为一个酶活力单位。用比酶活(U/mg)表示酶的活性，即每毫克蛋白所具有的酶活力单位。突变体的酶活性也用同样方法进行检测。结果如图1所示为这些突变体I6V、S34H、T47V、I6V+S34H+T47V以烟酰胺核糖和ATP为底物的酶催化活性，分别是其亲本的2.5、3.6、2.3、5.5倍，可应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中。

实施例6

合成NMN的反应工艺：以NRK1的突变体I6V+S34H+T47V的催化反应为例

在反应釜中，加入底物溶液60mL 60mM的烟酰胺核糖和105mL 0.1M的ATP(过量)、15mL 0.8M的MgCl₂(过量)，然后加入浓度为3.0mg/mL的突变体I6V+S34H+T47V纯化酶溶液20mL，混合均匀，维持pH为7.0～7.4，控制反应温度为37℃、转速为180rpm，在30min和60min分别补料0.92g烟酰胺核糖。反应100min后，根据HPLC检测结果，底物烟酰胺核糖的转化率为72％，得到NMN粗产品溶液(含54mM NMN)，经离心、纯化、干燥后可得NMN。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种活性提高的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶突变体为SEQID NO:2所示的氨基酸序列的突变序列，突变位点至少包括如下位点之一：第34位、第6位、或第47位；或者，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列为至少包括上述突变位点之一且与SEQ ID NO:2具有80％以上同一性、具有烟酰胺核糖激酶催化活性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述突变位点为I6V、S34H或T47V。

3.根据权利要求2所述的烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述突变位点为I6V、S34H和T47V。

4.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1至3中任一项所述的烟酰胺核糖激酶突变体。

5.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求4所述的DNA分子。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体质粒为pBR327、pAT153、pUC18、pUC19、pET21或pETite；优选为pETite。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选所述原核细胞为BL21(DE3)大肠杆菌；优选所述真核细胞为酵母细胞或毕赤巴斯德酵母细胞。

9.一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，包括采用烟酰胺核糖激酶对烟酰胺核糖和ATP、或能够转化成烟酰胺核糖或者ATP的前体物质进行催化反应，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶为如权利要求1至3中任一项所述的烟酰胺核糖激酶突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化反应包括：以烟酰胺核糖和ATP为原料，在所述烟酰胺核糖激酶突变体的催化作用下制备NMN；

或者，以烟酰胺、磷酸核糖焦磷酸和ATP为原料，在以所述烟酰胺核糖激酶突变体和烟酰胺磷酸核糖转移酶催化用下制备NMN；

或者，以烟酰胺、AMP和焦磷酸或其盐为原料，以所述烟酰胺核糖激酶突变体和腺嘌呤磷酸核糖转移酶的催化作用下制备NMN；

优选的，所述烟酰胺核糖激酶突变体的使用形式为纯化酶溶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞；

优选的，所述催化反应的温度为36～37℃；

优选的，所述催化反应的pH为7.0～8.0℃；

优选的，所述催化反应底物烟酰胺核糖的浓度为5～60mM。

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