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CN116064366A - 牡丹干细胞在皮肤修复以及抗衰老护肤品中的应用 - Google Patents

牡丹干细胞在皮肤修复以及抗衰老护肤品中的应用 Download PDF

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CN116064366A
CN116064366A CN202210784081.3A CN202210784081A CN116064366A CN 116064366 A CN116064366 A CN 116064366A CN 202210784081 A CN202210784081 A CN 202210784081A CN 116064366 A CN116064366 A CN 116064366A
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CN202210784081.3A
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朱源源
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Guangzhou Jintian Fangyan Cosmetics Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Jintian Fangyan Cosmetics Co ltd
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Abstract

本申请公开了牡丹干细胞在皮肤修复以及抗衰老护肤品中的应用，并公开了一种包含牡丹干细胞以及冻存液的牡丹干细胞冻存液。该所述冻存液包含8～15wt％植物白蛋白、2～2.5wt％甘露醇和1～10wt％二甲基亚砜的植物干细胞完全液体培养基。本申请还通过对分离的牡丹干细胞进行多次继代培养和添加不同的独特培养基以补充干细胞所需营养的技术，使得得到的牡丹干细胞具有表达SOD、CAT和PRX相关的性能，使其具有促进角质形成细胞的迁移和角质形成细胞分化相关基因表达，拓展了其在治疗或保健与皮肤疾病及伤口愈合、以及抗衰老应用中具有潜在的应用价值。

Description

牡丹干细胞在皮肤修复以及抗衰老护肤品中的应用
技术领域
本申请涉及皮肤修复化妆品技术领域，尤其涉及牡丹干细胞在皮肤修复以及抗衰老护肤品中的应用。
背景技术
植物干细胞(plant stem cell)是未分化的细胞，具有很强的自我更新和持续分裂能力。植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。另外，将植物干细胞培养技术用于药学制剂，也可以用于制备功能性饮料，还可以用于化妆品中，例如制备护肤液、乳液、营养霜、按摩霜和面膜将具有广阔的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于至少提供一种牡丹干细胞在在皮肤修复以及抗衰老护肤品中的应用。
第一方面，本申请实施例公开了一种牡丹干细胞冻存液，包含牡丹干细胞以及冻存液，所述冻存液包含8～15wt％植物白蛋白、2～2.5wt％甘露醇和1～10wt％二甲基亚砜的植物干细胞完全液体培养基。
第二方面，本申请实施例公开了所述的牡丹干细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：
获得牡丹幼苗枝杆的形成层组织；
将所述形成层组织置于分离培养基中尿培养，促使形成层细胞分离而不脱分化，得到形成层细胞；
将所述形成层细胞于继代培养基和分离培养基中交底培养，获得具有小液泡结构的牡丹干细胞；
将所述牡丹干细胞悬浮培养，获得所述牡丹干细胞的悬浮液；以及
将所述牡丹干细胞的悬浮液与冻存液混合后进行冻存；
其中，所述冻存液包含8～15wt％植物白蛋白、2～2.5wt％甘露醇和1～10wt％二甲基亚砜的植物干细胞完全液体培养基。
在本申请实施例中，所述牡丹干细胞悬浮培养的步骤具体包括：
将分离的牡丹干细胞转接至初始液体培养基中培养15天后，过滤，静置取下层原液，补充第一继代培养基；
培养10天后，过滤，静置取下层原液，补充第二继代培养基；
培养7天后，过滤，静置取下层原液，补充第三继代培养基；
培养7天后，过滤，静置取下层原液，补充第四继代培养基；
培养5天后，过滤，静置取下层原液，补充第五继代培养基，最后继续培养5 天，即可得最终的牡丹干细胞悬浮液。
在本申请实施例中，所述初始培养基包含2.5wt％蔗糖、0.85mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、0.03mg/L激动素和50mM柠檬酸钠，该培养基pH为5.0～5.9；
所述第一继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.85mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、0.03mg/L激动素、50mg/L柠檬酸钠、5～7.5mM三七皂甙R1、2.5mM KNO3、105μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
在本申请实施例中，所述第二继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.55mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.03mg/L激动素、2.5～5mM三七皂甙R1、 3mM SFPS、2.5mM KNO3、80～105μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
在本申请实施例中，所述第三继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.23mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.01mg/L激动素、3mM SFPS、2.5mM KNO3、 65～105μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，pH为5.0～5.9。
在本申请实施例中，所述第四继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.15mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、3mM SFPS、2.5mM KNO3、105μM Fe-EDTA(Na)、 0.15μM(NH4)6Mo7O24、1.2mM Ca(NO3)2，0.25mM K2SO4、0.25mM MgSO4、2.56μM MnC12、0.12μM ZnSO4、0.14μM CuSO4和15.44μM H3BO3，该培养基pH为5.0～5.9。
在本申请实施例中，所述第五继代培养基包含0.6mM Ca(NO3)2，0.75mM K2SO4、0.15mM MgSO4、1.78μM MnC12、0.06μM ZnSO4、0.08μM CuSO4和7.35μM H3BO3，该培养基pH为5.0～5.9。
第三方面，本申请实施例公开了包含牡丹干细胞冻存液、或所述的制备方法制得的牡丹干细胞冻存液的乳化液。
第四方面，本申请实施例公开了牡丹干细胞冻存液、或所述的制备方法制得的牡丹干细胞冻存液在制备皮肤修复或抗衰老皮肤品中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请通过对牡丹种子进行皿上培养，得其幼苗，再对幼苗的形成层组织进行分离，于分离培养基上成功分离培养得到牡丹干细胞，并且使用了多次继代培养和添加不同的独特培养基以补充干细胞所需营养的技术，使得得到的牡丹干细胞具有表达 SOD、CAT和PRX相关的性能，继而通过体外试验和体内试验这些表达的酶活能够促进角质形成细胞的迁移和角质形成细胞分化相关基因表达，为其促进皮肤屏障功能修复和皮肤抵抗氧化功能提供帮助；并为牡丹干细胞拓展了其在治疗或保健与皮肤屏障受损相关的皮肤疾病及伤口愈合、以及抗衰老应用中具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本申请实施例1提供的牡丹种子培养皿种子种植后发芽图。
图2为本申请实施例1提供的牡丹种子萌发过程发育图(图A至E)。
图3为本申请实施例1提供的牡丹种子萌发后的幼苗图。
图4为本申请实施例1提供的形成层细胞图。
图5为本申请实施例1提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图6为本申请实施例2提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图7为本申请实施例3提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图8为本申请实施例4提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图9为本申请实施例5提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图10为本申请实施例6提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图11为本申请对比例1提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图12为本申请对比例2提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
图13为本申请对比例3提供的悬浮培养的牡丹干细胞图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请实施例所涉及的试剂以及仪器，未详细说明的均为可从商业途径获得。
本申请发明人通过实践创造性发现，通过牡丹皿上发育的幼苗分离得到形成层干细胞，经过悬浮培养，能够获得抗氧化相关酶的表达，并且通过体外和体内试验证实了其具有修复皮肤屏障受损的特性，拓展了其在治疗或保健与皮肤疾病及伤口愈合、以及抗衰老应用中具有潜在的应用价值。
为此，本申请实施例公里了一种牡丹干细胞冻存液，包含牡丹干细胞以及冻存液，所述冻存液包含8～15wt％植物白蛋白、2～2.5wt％甘露醇和1～10wt％二甲基亚砜的植物干细胞完全液体培养基。其中，植物白蛋白选择自牡丹白蛋白、玫瑰白蛋白、玉米白蛋白、大豆白蛋白和白蛋白植物肽中的至少一种。植物干细胞完全液体培养可以为 GibcoEssential 8培养基。
其中，牡丹干细胞为经过丹皿上发育的幼苗分离得到形成层干细胞，以及悬浮培养得到。下方将结合具体实施例进行详细说明，所涉及的试剂和仪器若无特别说明，均可从商业途径得到。
牡丹花干细胞的分离以及培养
为详细说明本申请提供的牡丹花干细胞的培养过程，下方先以实施例1的实施过程进行说明，具体如下：
一、培养方法
1、牡丹培养皿上播种以及幼苗培养
1)将牡丹种子(洛阳市洛龙区天泽牡丹繁育基地)用75％的乙醇清洗2min后，再用100％乙醇和无菌水换洗后，用无菌滤纸吸干种子表面水分。
2)点种：用牙签或移液枪将种子按均匀平铺于1/2MS培养基上，每一个平皿上平铺约25颗种子，种子间隔0.75cm。
3)春化：将播完的培养皿置于4℃冰箱黑暗条件下放置3d。
4)萌发：将春化后的培养皿置于光照培养箱培养，培养条件为：长日照25℃、18h光照时长、15℃6h黑暗时长，60～80％相对湿度和120μmol·s-2·M-1的光照弧度，7天后即可取材用于干细胞组织培养。
2、干细胞的分离
从上述培养中选取牡丹幼苗，从其枝杆的木质部轻轻剥去含有形成层、韧皮部、皮层和表皮的组织，获得形成层组织，期间通过间苯三酚-HCl染色检测形成层组织中的木质素含量，筛选木质素含量较低的形成层组织。
具体的实施例1中，为便于将形成层组织在从木质部中剥离处理，本实施例将选取的枝杆先浸泡在包含0.25wt％葡萄糖和20v/v％乙醇的无菌水溶液中处理24h。
将获取的形成层组织置于分离培养基上培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，而其他组织细胞死亡或是不分裂，培养6～16天后获得初步分离出来的形成层细胞。其中，分离培养基包含有生长素0.1～2mg/L、蔗糖1～6％、琼脂7.5～8.5g/L 的MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9；生长素选自二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IBA)中至少一种。
将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5～16天，然后转移至分离培养基中培养5～16天，再转移至继代培养基进行重复交替地培养，交替培养后获得的大量细胞中仍然含有大量小液泡结构，这些细胞即为来自于牡丹茎部形成层的植物干细胞；
继代培养基为含1～6％蔗糖、0.2～1.2mg/L 2,4-D、0.01～0.5mg/L激动素KT、0.5～2mg/L NAA、7.5～8.5g/L琼脂、0.08～0.12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH 为5.0～5.9。
3、牡丹干细胞悬浮培养
选取经过分离培养和继代培养得到的生长旺盛、疏松、易散状态的细胞，用于悬浮培养体系的起始细胞。首先将这些细胞用镊子轻轻打散，接种于液体培养基中进行震荡培养。第一次继代培养，培养15天后用80目的不锈钢筛对悬浮液进行过滤，除去大的细胞团，以保留分散程度好的小细胞团及单细胞后；继续将分散的细胞转接于液体培养基中继代培养，每次继代时先将培养物静置20～30min，倒去2/3上层培养液，保留1/3原液，再用新鲜培养基补充至原先刻度。随着细胞密度的增大，继代的间隔也要逐渐的缩短。本实施例中总共进行了5次继代培养，第一次和第二次继代培养间隔时间为15天，第二次继代培养间隔时间为10天，第三次和第四次继代培养间隔时间为7天，第四次和第五次继代培养间隔时间为5天，第5次继代培养5天后即可收获牡丹干细胞的悬浮液。
并且，本实施例初始液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.85mg/L 2,4-D、60mg/L 苯丙氨酸、0.03mg/L激动素和50mM柠檬酸钠，该培养基pH为5.0～5.9。
第一次继代培养补充的液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.85mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、0.03mg/L激动素、50mg/L柠檬酸钠、5mM三七皂甙R1(分析标准品，≥98％(HPLC)，阿拉丁)、2.5mM KNO3、105μM Fe-EDTA(Na)和0.15 μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
第二次以及后续的继代培养补充的液体培养基均与第一次继代培养补充的液体培养基成分相同。
作为一个实施例2的制备过程：其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例 1相同，其干细胞悬浮培养过程也与实施例1大致相同，其第一次继代培养补充的液体培养基也与实施例1相同，不同之处在于第二次继代培养补充的液体培养基包含： 2.5wt％蔗糖、0.55mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.03mg/L激动素、5mM三七皂甙R1、3mM羊栖菜多糖(简称为SFPS，纯度：98％，深圳市森迪生物科技有限公司)、2.5mM KNO3、105μMFe-EDTA(Na)和0.15 μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。实施例2的第三次以及后续的继代培养补充的液体培养基均与第二次继代培养补充的液体培养基成分相同。
作为一个实施例3的制备过程：其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例2相同，其干细胞悬浮培养过程也与实施例2大致相同，其第一次、第二次继代培养补充的液体培养基也与实施例2相同，不同之处在于第三次继代培养补充的液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.23mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.01 mg/L激动素、3mMSFPS、2.5mM KNO3、105μM Fe-EDTA(Na)和0.15 μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。实施例3的第四次、第五次继代培养补充的液体培养基均与第三次继代培养补充的液体培养基成分相同。
作为一个实施例4的制备过程：其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例 3相同，其干细胞悬浮培养过程也与实施例3大致相同，其第一次、第二次和第三次继代培养补充的液体培养基也与实施例3相同，不同之处在于第四次继代培养补充的液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.15mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、3mM SFPS、2.5mMKNO3、105μM Fe-EDTA(Na)、0.15μM(NH4)6Mo7O24、1.2mM Ca(NO3)2，0.25mM K2SO4、0.25mMMgSO4、2.56μM MnC12、0.12μM ZnSO4、0.14 μM CuSO4和15.44μM H3BO3，该培养基pH为5.0～5.9。实施例4的第五次继代培养补充的液体培养基均与第四次继代培养补充的液体培养基成分相同。
作为一个实施例5的制备过程：其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例 4相同，其干细胞悬浮培养过程也与实施例4大致相同，其第一次、第二次、第三次和第四次继代培养补充的液体培养基也与实施例4相同，不同之处在于第五次继代培养补充的液体培养基包含：0.6mM Ca(NO3)2，0.75mM K2SO4、0.15mM MgSO4、 1.78μM MnC12、0.06μM ZnSO4、0.08μM CuSO4和7.35μM H3BO3，该培养基pH为 5.0～5.9。
作为一个实施例6的制备过程：其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例 1相同，其干细胞的悬浮培养过程与实施例1大致相同，不同之处在于其5次继代培养添加的培养基：
第一继代培养补充的液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.85mg/L 2,4-D、60mg/L 苯丙氨酸、0.03mg/L激动素、50mg/L柠檬酸钠、7.5mM三七皂甙R1、2.5mM KNO3、 105μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
第二次继代培养补充的液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.55mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.03mg/L激动素、2.5mM三七皂甙R1、3mM SFPS、 2.5mM KNO3、80μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
第三次继代培养补充的液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.23mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.01mg/L激动素、3mM SFPS、2.5mM KNO3、65μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
第四次继代培养补充的液体培养基包含：2.5wt％蔗糖、0.15mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、3mM SFPS、2.5mM KNO3、105μM Fe-EDTA(Na)、 0.15μM(NH4)6Mo7O24、1.2mM Ca(NO3)2，0.25mM K2SO4、0.25mM MgSO4、2.56μM MnC12、0.12μM ZnSO4、0.14μMCuSO4和15.44μM H3BO3，该培养基pH为5.0～5.9。
第五次继代培养补充的液体培养基包含：0.6mM Ca(NO3)2，0.75mM K2SO4、 0.15mMMgSO4、1.78μM MnC12、0.06μM ZnSO4、0.08μM CuSO4和7.35μM H3BO3，该培养基pH为5.0～5.9。
作为对比例1：其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例1相同，其干细胞悬浮培养过程并未进行5次继代培养，而是直接采用初始培养基进行悬浮培养。
作为对比例2：其其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例1相同，其干细胞悬浮培养过程也与实施例1大致相同，其悬浮培养的5次继代培养添加的培养基与初始培养基成分相同。
作为对比例3：其其牡丹幼苗培养、干细胞的分离过程均与实施例1相同，其干细胞悬浮培养过程也与实施例1大致相同，其悬浮培养的5次继代培养添加的培养基为：2.5wt％蔗糖，0.75mg/L 2,4-D，0.2mg/L激动素KT，1.5mg/L NAA,，该培养基 pH为5.0～5.9。
5、悬浮培养体系细胞密度的测定
用12％的三氧化铬水溶液稀释细胞悬浮液5倍，匀浆处理稀释液，将细胞团打散为单个细胞，然后将混合液70℃水浴40min，使细胞完成染色并发生质壁分离。再使用镜台测微尺测量显微镜(普密斯)在4×物镜下的视野半径进行测量。
6、细胞染色
为了检测细胞核，采用4,6-二氨基2-盐酸苯林酯(DAPI)染色，用4％的多聚甲醛固定，然后向固定细胞中加入4，6-二胺-2-苯林多尔二盐酸酯(MilliporeS7113 1:1000)，室温保存30分钟，置于荧光显微镜下观察，激发波长360～400nm。
7、酶活性测定
取采样时所得的细胞悬浮培养液，用5倍体积的预冷生理盐水稀释后，用全自动组织破碎仪制备组织匀浆，冰水浴条件下，2 500r/min离心10min，取上清液用于 SODs、PRXs和CAT活性的测定，所有样品在12h内测定完毕。采用采用普天同创公司试剂盒进行测定SODs、CAT活性，采用江莱生物提供的试剂盒测定PRXs活性。
8、相关蛋白的表达分析
1)RNA提取采用液氮研磨法，具体实验操作步骤见艾德莱生物EASYspin P1 PlantRNA Kit EASYspin Plus Plant植物RNA快速提取试剂盒的说明书。
2)单链cDNA的合成
本实验反转录合成的cDNA可用作普通克隆和荧光定量PCR的模板。反转录实验步骤如下:①去除基因组DNA反应：
去除基因组DNA的反应体系：5×gDNA Eraser Buffer 2.0μL、gDNA Eraser 1.0μL、 totalRNA 1μg，加ddH2O至10μL，充分混匀，40℃金属浴2min，4℃冷却后进行反转录反应。
反转录反应利用<
Figure BDA0003731145660000081
Green qPCR法>，反应体系为：上述去除基因组DNA 的反应液10μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、RT Primer Mix 1μL、5×PrimeScriptBuffer 2 4μL、ddH2O 4μL，充分混匀，37℃金属浴15min，85℃金属浴5s、4℃核酸检测仪检测。
以反转录的cDNA稀释20倍为模板，β-actin为看家基因。荧光定量PCR的操作步骤参照如下进行，每一个样品有3次生物学重复。RT-PCR反应体系：SYBR Premix Ex-TaqII 10μL、PRX-F 0.4μL、PRX-R 0.4μL、20×cDNA2μL，补充ddH2O7.2 μL；RT-PCR反应程序：95℃、30s；95℃、5s；(65℃、30s和95℃、15s)40个循环；60℃、30s；95℃、15s。
反应引物如下：
PRX3-F:tgtattgttgtcactggagg，如SEQ ID NO.1所示；PRX3-R:gaaaatgatgaacagtgggc，如SEQ ID NO.2所示；
PRX4-F:ttctctccttcgcctccatttc，如SEQ ID NO.3所示；PRX4-R:gttttagaatccctgcgtccaa，如SEQ ID NO.4所示；
CAT-F:gccatctttgattggaatgg，如SEQ ID NO.5所示；CAT-R:ggtgccacaaccttgatctt，如SEQ ID NO.6所示；
SOD-F:tgtgacgacccaagtctccctt，如SEQ ID NO.7所示；SOD-R:ctgtggctctcctccaccattc，如SEQ ID NO.8所示；
9、数据处理和统计分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较。
二、结果
1、悬浮培养细胞形态观察
如图1为平板培养的牡丹种子发育图，图2为其发育过程图，图3示出了牡丹幼苗形态，图4为其形成层细胞，可见其并未明显液泡形成，而经过悬浮培养后可见大量液泡(图5-10所示)，而对比例1-3悬浮培养的细胞液泡量不及实施例1-6。
2、酶活性
表1
Figure BDA0003731145660000091
Figure BDA0003731145660000101
表1列出了各实施例和对比例制备的牡丹干细胞悬浮培养液的相关酶活性。实施例1-6对应的SOD、CAT和PRX活性均显著高于对比例1-3，这表明本申请实施例制备的牡丹干细胞悬浮培养液具有更佳的抗氧化酶活性，而这种差别主要取决于在对牡丹干细胞的悬浮培养过程中，比如实施例1-6采用了继代培养技术，并且在继代培养过程中采用不同的培养基。
3、相关蛋白表达水平
表2
Figure BDA0003731145660000102
表2进一步列出了上述各实施例和对比例制备的牡丹干细胞相关基因的表达水平结果。实施例1-6对应的SOD、CAT、PRX3和PRX4的基因表达水平均显著高于对比例1-3，进一步验证了本申请实施例制备的牡丹干细胞悬浮培养液具有更佳的抗氧化酶活性，在悬浮培养过程中采用了继代培养技术及在继代培养过程中采用不同的培养基，能够促进相关抗氧化基因的表达，为其进一步作为抗氧化、皮肤修复制品的原料提供了可能。
体外及体内试验
皮肤老化、湿疹和特应性皮炎等皮肤病的发生本身就伴有表皮屏障功能的受损，如果皮肤的屏障功能得不到及时修复，会使机体处于一种慢性炎症的状态，进而诱导其他疾病的发生。因此，维持和修复表皮屏障功能不仅有助于预防和治疗皮肤疾病，还能够缓解皮肤疾病诱发进一步的感染和慢性炎症。为验证本申请实施例提供的牡丹干细胞对于皮肤表面功能的修复作用，下述实施方式将通过动物试验进行说明。
一、试验方法
1、制备牡丹干细胞冻存液及乳化液制备
本申请实施例进一步制备了上述的牡丹干细胞的制剂，例如冻存制剂。
实施例1的制备过程物：将上述过程进行悬浮培养(不低于1×106个/mL)得置于4℃预冷后，加入4倍体积的冻存液进行冻存；其中，冻存液为包含10wt％植物白蛋白(赛默飞)、2.5wt％甘露醇(赛默飞)和含5wt％二甲基亚砜的Gibco Essential 8培养基，并加入冰块混匀，放入生物安全柜，将冰块放到混匀摇摆器上，一边摇摆一边用注射器吸取适量的冻存液缓慢加入冻存袋中。混合均匀，封口、贴标签。将冻存袋传出进入程序降温仪以1.25℃/min速率进行降温(以免过快的减速导致细胞活性降低)至-20℃。降温完毕将冻存袋转移到液氮罐中进行长期储存，待需使用时，只需将其转入4℃条件静置至温度为4℃即可。
(1)水相制备：于无菌环境中将上述保存的牡丹干细胞冻存液转入4℃条件静置至温度为4℃，后用10倍体积的0.85％的生理盐水稀释待用。
(2)油相制备：按照1:1.5将聚山梨酯80与丙二醇混合，充分混匀待用。
(3)乳化：根据1:1体积比将油相加入水相中，搅拌使两相初步混匀后，得到乳化液。
各实施例2～6和对比例1～3的乳化液制备方法均为参照上述方法进行。
2、体外试验
2.1、对角质形成细胞的迁移影响
(1)在6孔板背面每隔1cm垂直画3条线。
(2)将HaCaT细胞(尚恩生物)以1×105个/mL接种于6孔细胞板，细胞生长到80-90％融合时，用含有5μg/ml丝裂霉素的完全培养液处理HaCaT细胞2h。
(3)吸弃培养基，用10μL灭菌枪头垂直于细胞平面划线，用PBS轻柔洗涤三次。
(4)加入含25μL上述实施例至的牡丹干细胞的冻存液的完全培养基(Gibco中国)2mL常规培养。
(5)不同时间点在倒置显微镜下观察并拍照，用软件Image J计算划痕损伤面积愈合率。
(6)迁移率＝(原面积－划痕后面积)/原面积×100％。
2.2、对角质形成细胞分化相关基因mRNA表达水平影响
以1×105个/mL将HaCaT细胞接种于6孔细胞培养板，加入含25μL上述实施例至的牡丹干细胞的冻存液的完全培养基(Gibco中国)2mL常规培养48h后吸弃培养基后，提取RNA，进行相关mRNA的定性和定量检测，同时设置空白组。
RNA的提取采用TRIzol RNA试剂盒(赛默飞)进行，RNA的定性检测采用琼脂糖凝胶电泳机械能，若如在胶块上能看到28S和18S两条带，且18S处的条带明显低于8S，表明提取的RNA样本符合要求；如在胶块的顶部出现条带，则说明有基因组污染；如果出现5S条带，说明RNA样本有降解，均应该舍弃。
参照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书进行逆转录，按照SYBR.Premix ExTaqTM II说明书进行qPCR，所涉及的引物均有上海生工提供。具体为Filaggrin-F：tgaggcatacccagaggact，如SEQ ID NO.9所示；Filaggrin-R：ctgtatcgcggtgagaggat，如SEQ ID NO.10所示；Caspase 14-F：accgcacatcaggatctctc，如SEQ ID NO.11所示；Caspase 14-R：ggcttagaggcaagggtgag，如SEQ ID NO.12所示；Involucrin-F：gggtggttatttatgtttgggtgg，如SEQ ID NO.13所示；Involucrin-R：gccaggtccaagacattcaac，如SEQ ID NO.14所示；GAPDH-F：tgcaccaccaactgcttagc，如SEQID NO.15所示； GAPDH-R：ggcatggactgtggtcatgag，如SEQ ID NO.16所示；以GAPDH为内参基因。
3、体内试验
3.1、构建小鼠皮肤屏障损伤模型
(1)购买ICR小鼠(江苏艾菱菲)，SPF级，体重15～20g，剃除小鼠颈背部毛发后再进行脱毛，1天后开始造模。
(2)将小鼠随机分成4组，每组10只，分为即正常对照组、模型组、阳性组、给药组(上述制备的乳化液)。
(3)用强力胶带反复粘贴小鼠背部皮肤，用Vapo Meter测定仪(芬兰Delfin)检测造模处的经皮水分散失量(TEWL)，待TWEL达到60mg/cm2/h即可停止粘贴，形成造模区。
(4)用移液器吸取200μL的上述各实施例和对比例涂抹于造模区作为给药组，阳性组组涂抹某市售的皮肤修复乳液(理肤泉B5修复面霜)，模型组不做涂抹，正常组小鼠并未机械能造模处理。
(5)涂抹3次/天，并测量TWEL及角质层含水量。
3.2、经皮水分散失量(Transepidermal water loss,TEWL)测定
于室温为20～25℃，空气相对湿度50～60％的条件下，将Vapo Meter测定仪与待测部位皮肤表面(小鼠造模区)尽量垂直并完全接触，每一部位测定8次，取平均值。 3.3、角质层含水量(Capacitance,CAP)测定
于室温为20～25℃，空气相对湿度50～60％的条件下，MoistureMeter SCCompact 测定仪与小鼠造模区皮肤表面尽量垂直并完全接触，每一部位测定8次，取平均值。 3.4、皮肤组织制备及HE染色
取造模后第1天，3天和8天的小鼠背部造模区皮肤组织，用4％的多聚甲醛固定液进行固定，制作皮肤石蜡切片和进行HE染色(委托麟美生物公司完成)。
3.5、表皮厚度测量
于40倍镜下观察皮肤组织切片并拍摄图片，显微镜标尺每移动一张图片，图片用Image-Pro plus 6.0形态学分析软件进行数据处理，个点测量表皮厚度，并取平均值。
4、数据处理和统计分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较。
二、试验结果
1、体外试验
表3
Figure BDA0003731145660000131
Figure BDA0003731145660000141
表3列出了上述各实施例和对比例制备的冻存液对角质形成细胞的迁移以及其相对基因表达影响。表3中的迁移率为采用上述试验方法进行的48h的迁移率，实施例1-6制备的冻存液对角质形成细胞的迁移率显著高于对比例，而对比例1-3的迁移率与空白组相当，几乎无明显作用，由此说明本申请实施例提供的牡丹干细胞冻存液能够促进角质形成细胞的迁移。
表3还进一步列出了上述试验方法制备的乳化液对角质形成细胞的相关挤压的表达情况。实施例1-6制备的乳化液对角质形成细胞的Involucrin,Filaggrin和 Caspase-14基因表达，而这三种基因为角质形成细胞的分化标志物，其表达上调说明本申请实施例提供的牡丹干细胞乳化液能够促进角质形成细胞的分化，提供其相关角质化包膜蛋白的表达，从而形成角质层的屏障。
2、体内试验
表4
Figure BDA0003731145660000142
通过前面的上述体外实验发现，本申请实施例提供的牡丹干细胞乳化液能够促进角质形成细胞的增殖与迁移，同时还能够促进角质化包膜组成蛋白Filaggrin和Involucrin的表达，这提示其可能对受损的皮肤屏障有一定的修复作用。因此，本申请进一步采用胶带粘贴法构建了小鼠皮肤屏障损伤模型并进行了动物实验，结果如表 4可知。
表4中，正常小鼠的背部皮肤的TEWL值约在10g/m2/h左右，而造模后小鼠皮肤的TEWL值均大于45g/m2/h，并且可观察到在造模后6h小鼠皮肤发亮并且明显变红，并在第3天皮肤可见结痴，说明胶带粘贴法可以造成小鼠背部皮肤屏障功能的受损。在造模后第8d，模型组和阳性组的造模位置仍没有完全恢复，但是给压组，尤其是实施例1-6组在造模后第6d皮肤结痴己脱落，并在第8d皮肤发红明显消失，说明给药组能够加快小鼠模型区的皮肤受损。
经皮水分散失量(TEWL)是客观反应皮肤屏障功能的重要指标。正常的皮肤具有保水能力，当皮肤屏障损伤后，保水能力下降，水分蒸发增多，皮肤的经皮水分丢失量上升，因而通过检测TEWL值的变化可以判断皮肤屏障的恢复程度。根据上述试验方法，尽管模型组和阳性组的小鼠造模位置表观皮肤受损得到了恢复，但是其恢复速率不及给药组，因此表4中列出来第3天对小鼠造模区皮肤进行给药后的TWEL 值。结果可知，模型组的TWEL值显著高于正常对照组，说明在成功，而阳性对照组和对比例1-3制备的乳化液对小鼠造模区皮肤的TWEL值改善作用明显不及实施例 1-6，说明实施例1-6制备的乳化液具有更好地促进小鼠皮肤屏障恢复速率。
另外，还可通过CAP即皮肤角质层含水量来反应皮肤功能状况，含量越低表面皮肤的屏障功能降低，皮肤会出现干燥和脱屑的症状，而维持较高的皮CAP值一方面依赖于皮肤分泌的吸水成分如透明质酸含量，另一方面还依赖于皮肤自身的屏障功能。表4进一步列出了各组试验后的小鼠CAP值，其中给药组合和阳性组均为涂抹 10h后的皮肤CAP值。结果表明，实施例1-6制备的乳化液能够显著提升小鼠受损皮肤的CAP值，而对比例1-3和阳性组对小鼠造模区的受损皮肤角质层水分提升作用不明显，由此说明本申请实施例提供的牡丹干细胞乳化液能够保持小鼠皮肤角质层含水量，修复其皮肤屏障功能。
进一步，本申请实施例还通过组织切片观察了上述动物实验各组的小鼠皮。正常的表皮约由4-6层的角质细胞层和活性表皮细胞组成，在用胶带粘贴法造模后，可看到角质层被完全剥离。在造模后第4d，模型组开始出现角质层，并在第8d角质层与正常组相比基本恢复，但是表皮层厚度却明显增加，表皮层的增厚可能是由角质形成细胞过度增殖引起的。结果由表4可知，对比例1-3和阳性组对应的表皮厚度显著高于正常对照组，说明其与模型组出现相同趋势，表皮层过多增厚，而这将不利于皮肤屏障功能的修复，使得其丧失皮肤的正常组织功能，而实施例1-6对应的表皮厚度略高于正常对照组，缓解了这种受损皮肤的过多角质层增厚的趋势。
综上所述，本申请实施例通过对牡丹种子进行皿上培养，得其幼苗，再对幼苗的形成层组织进行分离，于分离培养基上分离培养得到牡丹干细胞，最后还对得到的牡丹干细胞进行悬浮培养，使用了继代培养技术，并且使用了多次继代培养和添加不同的独特培养基以补充干细胞所需营养的技术，使得得到的牡丹干细胞具有表达SOD、 CAT和PRX相关的性能，继而通过体外试验和体内试验这些表达的酶活能够促进角质形成细胞的迁移和角质形成细胞分化相关基因表达，为其促进皮肤屏障功能修复和皮肤抵抗氧化功能提供帮助。并且还通过动物试验证明利用该牡丹干细胞制备的乳化液对小鼠皮肤屏障功能的修复作用明显由于现有的商品化修复面霜，为牡丹干细胞拓展了其在治疗或保健与皮肤疾病及伤口愈合、以及抗衰老应用中具有潜在的应用价值。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牡丹干细胞冻存液，包含牡丹干细胞以及冻存液，所述冻存液包含8～15wt％植物白蛋白、2～2.5wt％甘露醇和1～10wt％二甲基亚砜的植物干细胞完全液体培养基。
2.权利要求1所述的牡丹干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得牡丹幼苗枝杆的形成层组织；
将所述形成层组织置于分离培养基中尿培养，促使形成层细胞分离而不脱分化，得到形成层细胞；
将所述形成层细胞于继代培养基和分离培养基中交底培养，获得具有小液泡结构的牡丹干细胞；
将所述牡丹干细胞悬浮培养，获得所述牡丹干细胞的悬浮液；以及
将所述牡丹干细胞的悬浮液与冻存液混合后进行冻存；
其中，所述冻存液包含8～15wt％植物白蛋白、2～2.5wt％甘露醇和1～10wt％二甲基亚砜的植物干细胞完全液体培养基。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述牡丹干细胞悬浮培养的步骤具体包括：
将分离的牡丹干细胞转接至初始液体培养基中培养15天后，过滤，静置取下层原液，补充第一继代培养基；
培养10天后，过滤，静置取下层原液，补充第二继代培养基；
培养7天后，过滤，静置取下层原液，补充第三继代培养基；
培养7天后，过滤，静置取下层原液，补充第四继代培养基；
培养5天后，过滤，静置取下层原液，补充第五继代培养基，最后继续培养5天，即可得最终的牡丹干细胞悬浮液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述初始培养基包含2.5wt％蔗糖、0.85mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、0.03mg/L激动素和50mM柠檬酸钠，该培养基pH为5.0～5.9；
所述第一继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.85mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、0.03mg/L激动素、50mg/L柠檬酸钠、5～7.5mM三七皂甙R1、2.5mM KNO3、105μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第二继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.55mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.03mg/L激动素、2.5～5mM三七皂甙R1、3mM SFPS、2.5mM KNO3、80～105μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，该培养基pH为5.0～5.9。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第三继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.23mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、0.01mg/L激动素、3mM SFPS、2.5mMKNO3、65～105μM Fe-EDTA(Na)和0.15μM(NH4)6Mo7O24，pH为5.0～5.9。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第四继代培养基包含2.5wt％蔗糖、0.15mg/L 2,4-D、60mg/L苯丙氨酸、25mg/L柠檬酸钠、3mM SFPS、2.5mM KNO3、105μM Fe-EDTA(Na)、0.15μM(NH4)6Mo7O24、1.2mM Ca(NO3)2，0.25mM K2SO4、0.25mM MgSO4、2.56μMMnC12、0.12μM ZnSO4、0.14μM CuSO4和15.44μM H3BO3，该培养基pH为5.0～5.9。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述第五继代培养基包含0.6mM Ca(NO3)2，0.75mM K2SO4、0.15mM MgSO4、1.78μM MnC12、0.06μM ZnSO4、0.08μM CuSO4和7.35μMH3BO3，该培养基pH为5.0～5.9。
9.一种包含权利要求1所述的牡丹干细胞冻存液、或权利要求2-8任一项所述的制备方法制得的牡丹干细胞冻存液的乳化液。
10.权利要求1所述的牡丹干细胞冻存液、或权利要求2-8任一项所述的制备方法制得的牡丹干细胞冻存液在制备皮肤修复或抗衰老皮肤品中的应用。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140041249A (ko) * 2012-09-27 2014-04-04 (주)세포바이오 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물
WO2018002029A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Oriflame Cosmetics Ag Cell line cultures from plants belonging to the harpagophytum genus
CN108721203A (zh) * 2018-08-09 2018-11-02 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及其制备方法
CN109517787A (zh) * 2018-11-05 2019-03-26 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种快速冻存和复苏子宫内膜干细胞的方法
CN109602006A (zh) * 2019-01-09 2019-04-12 山东贝世康生物科技有限公司 一种含有牡丹干细胞活性物的培养提纯方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140041249A (ko) * 2012-09-27 2014-04-04 (주)세포바이오 식물 유래의 재조합 인간 혈청 알부민, 지질 및 식물 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 또는 일차배양세포의 동결보존용 조성물
WO2018002029A1 (en) * 2016-06-29 2018-01-04 Oriflame Cosmetics Ag Cell line cultures from plants belonging to the harpagophytum genus
CN108721203A (zh) * 2018-08-09 2018-11-02 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 一种含牡丹干细胞提取物的美白修复护肤品及其制备方法
CN109517787A (zh) * 2018-11-05 2019-03-26 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种快速冻存和复苏子宫内膜干细胞的方法
CN109602006A (zh) * 2019-01-09 2019-04-12 山东贝世康生物科技有限公司 一种含有牡丹干细胞活性物的培养提纯方法及应用

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