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CN116046502A - 多细胞染色试剂组、盒及多细胞染色方法 - Google Patents

多细胞染色试剂组、盒及多细胞染色方法 Download PDF

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CN116046502A
CN116046502A CN202310242801.8A CN202310242801A CN116046502A CN 116046502 A CN116046502 A CN 116046502A CN 202310242801 A CN202310242801 A CN 202310242801A CN 116046502 A CN116046502 A CN 116046502A
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CN
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staining
reagent
mol
dyeing
concentration
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CN202310242801.8A
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王志平
梅高接
汪椿树
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Shenzhen Anlu Medical Technology Co ltd
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Shenzhen Anlu Medical Technology Co ltd
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Abstract

用于多种血细胞同时快速染色的多细胞染色试剂组、盒及多细胞染色方法中，染色试剂C包括染色剂A10、调节盐C10和水；染色剂A10即新亚甲蓝浓度为0.8×10‑4g/ml～8.0×10‑4g/mL；调节盐C10提供渗透压范围是150～220mosmol/kg的低渗透压和pH值7‑8的碱性环境；染色试剂A中包括染色试剂C和抗凝促染剂A20即EDTA盐；EDTA盐促进染色剂A10进入细胞对磷酸基团染色，起到细胞核及细胞内核酸物质染色增强的作用；能促进细胞内核酸类物质在细胞悬浮液中的染色。配合低渗透压和pH值7‑8的弱碱性环境，采用一种染料就能实现多种细胞的同时快速染色，大大提升了染色的效率。

Description

多细胞染色试剂组、盒及多细胞染色方法
技术领域
本申请属细胞明场识别用的染色技术领域，尤其涉及一种在细胞悬浮液状态下进行血液细胞中多种细胞同时染色，尤其是白细胞和红细胞同时快速染色，以便同时识别出多种不同类型细胞的染色试剂组、盒及细胞染色方法。
背景技术
血液细胞中同时存在多种细胞，以哺乳动物的血液细胞为例，通常包括红细胞、白细胞、血小板。对哺乳动物血液来说，血液中的成熟红细胞不存在细胞核物质也无需染色，在明场显微放大的情况下，都能被看见并能被识别，而白细胞却需要在染色后才能进行准确的细胞类型识别。然而白细胞的种类识别对不同的疾病状态的指征意义又特别大，不同类型的白细胞的浓度和状态意味着不同的病症感染状态和进程。
在基于血液细胞悬浮液显微放大成像后进行细胞种类识别的时候，是需要基于染色过程将不同的细胞形态呈现，才能基于染色后的显微放大图像进行细胞种类的识别；因此染色的效率和质量对后续的识别是至关重要的。
采用常规单一染色剂配方的染色剂，对血液细胞悬浮液进行染色时，通常是白细胞被染色了，但是其他类型的红细胞还没有染上色，不足以同时进行多种细胞的明场识别。如果要分别进行不同种类细胞的染色以便识别，耗时耗力，并不经济。即使能同时对不同种类的细胞染色，其染色的质量也会有所偏差，对更精细的细胞类型识别比如白细胞的六分类并不足够。白细胞中包括了中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞；其中中性粒细胞又包括中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞；白细胞的6分类是指分别对中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞进行识别。
在细胞悬浮液状态下进行细胞染色，挑战之一是，悬浮液中的离子浓度调节。以细胞膜当作半透膜，若细胞悬浮液的离子浓度处于高渗状态，细胞会萎缩难以保持原来的形态，也会影响到后续细胞的识别；当悬浮液中的离子浓度处于较为低渗状态下，细胞很容易被胀大，严重时甚至会破裂，最终无法维持细胞形态，使得染色效果无法保持到细胞观察完成；尤其是不同细胞的细胞膜特性有差异时，更难；且低渗状态下，需要被染色突出的细胞核以及核酸物质也处于趋于扩散，难以被染色团聚，会对基于细胞核以及核酸类物质形态的后续识别带来困扰；即使在低渗状态下完成了染色，要维持住染色的效果也并不容易，越低渗的溶液越难维持住染色效果。
若要采用单一染料将不同类型的白细胞都染到可以用于明场显微成像并用于细胞类型的识别，对染色试剂配方提出了巨大的挑战。
名词解释：
核酸物质是指，细胞内存在的具有遗传特性的物质即DNA或RNA或及其片段。
EDTA盐是指，乙二胺四乙酸盐；乙二胺四乙酸盐会与血液中的钙离子结合形成配位化合物，从而阻止血凝。EDTA盐常规用作血液抗凝剂。
渗透压：隔以半透膜，一方为溶酶的水，另一方为溶液，水通过半透膜向溶液一方渗透；为阻止水的移动在溶液侧所加的压力称为渗透压。水的运动之所以停止，是该压力与通过膜的水的化学势能相等所致。渗透压以渗透压摩尔浓度作为单位，该单位通常以每千克溶剂中溶质的毫渗透压座尔来表示渗透压。
本申请中的部分物质的CAS编号如下：
物质名称 CAS编号
磷酸氢二钠 10039-32-4
磷酸二氢钾 7778-77-0
NaCl 2647-14-5
<![CDATA[EDTA·K<sub>2</sub>]]> 2001-94-7
<![CDATA[EDTA·K<sub>3</sub>]]> 17572-97-3
<![CDATA[EDTA·Na<sub>2</sub>]]> 6381-92-6
新亚甲蓝 229-516-6
水 7732-18-5
商品化37％甲醛溶液 50-00-0
商品化50％戊二醛溶液 111-30-8
(CASRegistryNumber或称CASNumber,CASRn,CAS#)，又称CAS登录号或
CAS登记号码，是某种物质(化合物、高分子材料、生物序列
(Biologicalsequences)、混合物或合金)的唯一的数字识别号码。
本申请中的水，是纯化水。纯化水是指符合《中国药典(2015版)》纯化水标准的水，其主要参数为：使用离线电导率仪检测，25℃温度下，标示装量不大于10ml(毫升)时，电导率不大于25μS/cm(微西门子每厘米)的水。
《GB/T6686-2006染料分类》中将碱性染料归入阳离子染料中，“碱性染料：
旧称碱性染料的品种，是在水溶液中能解离生成阳离子色素的染料；阳离子染料：是一类在水溶液中能解离生成阳离子色素的染料，该类染料可在弱酸性染浴中对含有阴离子染席的物质进行染色。
发明内容
为了提供一种高效实现多种不同类型细胞同时染色的染色试剂系统和方法，本发明提出了一种多细胞染色试剂组和试剂盒及制备方法和细胞染色方法。
本申请解决上述技术问题的技术方案是一种多细胞染色试剂组，用于多种血细胞同时快速染色，包括染色试剂C，染色试剂C包括染色剂A10、调节盐C10和水；染色剂A10为新亚甲蓝；新亚甲蓝浓度为0.8×10-4g/ml～8.0×10-4g/mL；调节盐C10，用于提供低渗透压环境和pH值7-8的碱性环境；低渗透压环境中，渗透压摩尔浓度范围140mosmol/kg～210mosmol/kg；染色试剂A中包括染色试剂C；染色试剂A中还包括抗凝促染剂A20；抗凝促染剂A20包括EDTA盐，用于促进染色剂A10进入细胞对磷酸基团染色。
抗凝促染剂A20包括EDTA盐；染色试剂A中EDTA盐浓度范围为2.0×10-4mol/L～2.0×10-3mol/L；EDTA盐包括EDTA·K2，EDTA·K3或EDTA·Na2。
染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；用于人类或犬类染色的染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是140mosmol/kg～180mosmol/kg；pH值为7.0～7.6；磷酸氢二钠浓度为3.0×10-2mol/L～4.8×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为5.8×10-3mol/L～1.5×10-2mol/L。
染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；用于猫类的染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是170mosmol/kg～210mosmol/kg；pH值为7.2～8.0；磷酸氢二钠浓度为4.3×10-2mol/L～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为7.0×10-3mol/L～2.0×10-2mol/L。
调节盐C10还包括NaCl；NaCl浓度为2.2×10-2mol/L～3.5×10-2mol/L。
所述多细胞染色试剂组，还包括稳定试剂B；稳定试剂B包括促染稳定剂B10、缓冲盐B20和水；稳定试剂B在染色试剂A与样本混合后使用；稳定试剂B中的促染稳定剂B10包括醛类物质。
用于人类或犬类染色的稳定试剂B中，缓冲盐B20包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是渗透压范围是180mosmol/kg～240mosmol/kg；pH值为6.5～7.0；磷酸氢二钠浓度为2.5×10-2mol/L～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为2.4×10-2mol/L～5.4×10- 2mol/L；所述促染稳定剂B10包括甲醛和戊二醛；甲醛浓度为1.5×10-2mol/L～2.1×10- 2mol/L；戊二醛浓度为6.0×10-3mol/L～8.0×10-3mol/L。
用于猫类的稳定试剂B中，缓冲盐B20包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是160mosmol/kg～210mosmol/kg；pH值为6.5～7.0；稳定试剂B中，磷酸氢二钠浓度为2.5×10-2mol/L～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为2.4×10-2mol/L～5.0×10-2mol/L；所述促染稳定剂B10包括甲醛和戊二醛；甲醛浓度为0.9×10-2mol/L～1.8×10-2mol/L；戊二醛浓度为4.0×10-3mol/L～7.5×10-3mol/L。
每500ml稳定试剂B中包括0.5mL的proClean950溶液即防腐剂；每500ml染色试剂A中包括0.5mL的proClean950溶液即防腐剂。
本申请解决上述技术问题的技术方案还可以是一种细胞染色试剂盒，包括：第一容器与第二容器；在第一容器中包括上述的染色试剂A；在第二容器中包括上述的稳定试剂B。所述第一容器中染色试剂A的体积与第二容器中稳定试剂B的体积比为2:3至3:2。
本申请解决上述技术问题的技术方案还可以是一种多细胞染色方法，用于多种血细胞同时快速染色，包括步骤10：取标准样本与染色试剂A混合，形成染色混合液1；步骤20：等待染色M秒；等待染色时间M为60秒至180秒；步骤30：染色混合液1与稳定试剂B混匀，形成染色混合液2；所述染色试剂A包括新亚甲蓝；所述稳定试剂B包括含醛类物质，含醛类物质包括戊二醛和/或甲醛。
所述多细胞染色方法，取标准样本体积与染色试剂A体积的比率范围是5：400至20：400；所述染色试剂A的体积与稳定试剂B的体积比为2:3至3:2；所述染色试剂A为上述一种染色试剂A；所述稳定试剂B为上述一种稳定试剂B。
本申请解决上述技术问题的技术方案还可以是一种多细胞染色方法，基于上述多细胞染色试剂组中的染色试剂C；包括以下步骤：步骤B10：取标准样本与EDTA盐混合，形成混合液C1；EDTA盐包括EDTA·K2，EDTA·K3或EDTA·Na2；步骤B20：混合液C1与染色试剂C混合形成染色混合液1；染色混合液1中EDTA盐浓度范围为2.0×10-4mol/L～2.0×10-3mol/L；步骤B30：等待染色M秒；等待染色时间M为60秒至180秒；步骤B40：染色混合液1与稳定试剂B混匀，形成染色混合液2；所述染色试剂C包括新亚甲蓝；所述稳定试剂B包括含醛类物质，所述含醛类物质包括戊二醛和/或甲醛。
所述多细胞染色方法中，取标准样本体积与染色试剂C体积的比率范围是5：
400至20：400；所述染色试剂C体积与稳定试剂B体积比为2:3至3:2；所述稳定试剂B为上述的稳定试剂B。
上述技术方案的技术效果之一：抗凝促染剂A20即EDTA盐作为常规的抗凝剂，会与血液中的钙例子结合形成配位化合物，从而阻止血凝。而在本申请的配方中，抗凝促染剂A20并不起抗凝的作用，而是起到细胞核以及细胞内核酸物质染色增强的作用；能促进核酸类物质在悬浮液中的染色。配合低渗透压和pH值7-8的弱碱性的环境，使得能采用一种染料就能实现多种细胞的同时快速染色，大大提升了染色的效率。
上述技术方案的技术效果之二：经过大量的实验，抗凝促染剂A20即加入EDTA盐之后，使染色剂A10对各种不同类型细胞的细胞核以及细胞内的核酸物质的染色效果增强，能使得具有核红细胞或者含有核酸物质的红细胞和白细胞同时被染色到能用明场显微镜观看到的技术效果。
上述技术方案的技术效果之三：通过巧妙设计的低渗环境，借助细胞内外的离子浓度差，能促进水溶性的染色剂中的染料穿越细胞膜进入细胞内，使染料容易进入细胞膜内部与细胞内的核物质结合，完成细胞核物质的染色；采用一种染料就能完成6种不同类型的白细胞以及有核红细胞以及其他含有核酸的红细胞的染色。渗透压处于一个非常微妙的平衡状态，使染色过程中，会略微使细胞胀大，但又能维持住细胞形态。细胞略微涨大后还增加了细胞核核细胞膜中其他细胞质的区分，更有利于不同细胞类型的识别核区分。同时低渗环境有利于细胞内的核酸物质的快速染色，加上正电和负电的基团结合，确保了快速染色的同时，还能维持染色效果的时间足够长；在低渗状态还能维持足够长的染色维持时间。
上述技术方案的技术效果之四：染色试剂A和稳定试剂B以特定的时序间隔加入，恰好给了网织红细胞中核酸物质染色提供了恰到好处的染色时间窗口。M取值范围是60-180秒，即1-3分钟内就能同时完成多种细胞的染色。
上述技术方案的技术效果之五：采用阳离子染料，该类染料带正电的特性使其方便与细胞内带负电的磷酸基团结合，一方面确保染色效果能保持的时间更久；另一方面让磷酸基团间的负电荷减少，使细胞内的核酸物质完成染色的同时还有团聚或凝缩的效果，凝缩后显现出细胞内部结构，更容易被看见和识别，特别适合细胞内遗传物质基团的染色质量的提升，有利于不同类型细胞的更进一步的细分分类识别。
上述技术方案的技术效果之六：促染稳定剂B10中的醛类物质，会与细胞膜表面的蛋白质发生反应，形成蛋白质交联网络，从而稳定和固定细胞形态，延长细胞在低渗状态下保持形态的时间，不至于细胞破裂。
上述技术方案的技术效果之七：不同物种的细胞体积大小略有差异，根据细胞的大小来调整醛类物质的含量；比如，犬的细胞体积比猫的大放入了更多的醛。
上述技术方案的技术效果之八：采用仅含有单一染料的试剂配方实现不同类型的多细胞区分染色，大大提高了染色效率，降低了染色的成本，使得染色后利用机器进行识别成本足够低，且使染色试剂配方的制备更简单，成本更低。
附图说明
图1是基于多细胞染色试剂组的细胞染色方法流程示意图；
图2是基于多细胞染色试剂组的多个实施例和对比例的组分示意表格；
图3是实施例1、实施例2、实施例3应用在犬血液细胞染色后，对染色后样本进行显微放大观察到的其中部分的网织红细胞的图片集合；
图4是实施例2和对比例1中多细胞染色试剂组分别对犬类血液细胞染色后，对染色后样本进行显微放大观察到的6种白细胞的图片集合；
图5是实施例11、实施例12、实施例13应用在猫血液细胞染色后，对染色后样本进行显微放大观察到的其中部分的网织红细胞的图片集合；
图6是实施例12和对比例5中多细胞染色试剂组分别对猫类血液细胞染色后，对染色后样本进行显微放大观察到的6种白细胞的图片集合。
实际应用中，对多细胞染色时，多种细胞同时存在，在一张图中展示的同类细胞数量有限，因此截取了单个细胞的图片汇集成图片集合，如图3至图6，方便对比查看。
具体实施方式
以下结合各附图对本申请内容做进一步详述。需要说明的是，以下是本发明较佳实施例的说明，并不对本发明构成任何限制。本发明较佳实施例的说明只是作为本发明一般原理的说明。本发明中涉及的“第一”“第二”以及“A”“B”这样的编号只是为了说明的方便，并不代表时间或空间上的顺序关系。
如图2，本申请中各实施例的组分表格中所示，在用于多种血细胞同时快速染色的一种多细胞染色试剂组的实施例中，包括染色试剂A，染色试剂A包括染色剂A10、调节盐C10和水；染色剂A10包括阳离子染料，带正电的阳离子染料用于和细胞中带负电的磷酸基团结合，形成染色后的磷酸基团；调节盐C10，用于提供渗透压，渗透压范围是140～210mosmol/kg；用于提供低渗透压和pH值7-8的碱性的环境；染色试剂A中还包括抗凝促染剂A20；抗凝促染剂A20促进染色剂A10进入细胞，促进染色剂A10对磷酸基团染色；抗凝促染剂A20包括EDTA盐。抗凝促染剂A20包括EDTA盐；染色试剂A中EDTA盐浓度范围为2.0×10-4～2.0×10- 3mol/L，EDTA盐包括EDTA·K2，EDTA·K3或EDTA·Na2。染色剂A10为新亚甲蓝；新亚甲蓝浓度为0.8×10-4g/ml～8.0×10-4g/mL；染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；所述调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，用于提供渗透压和7.0-8.0的pH值。
如图2所示的用于多种血细胞同时快速染色的多细胞染色试剂组实施例中，用于人类或犬类染色的染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是140～180mosmol/kg；pH值为7.0～7.6；磷酸氢二钠浓度为3.0×10-2～4.8×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为5.8×10-3～1.5×10-2mol/L。
如图2所示的用于多种血细胞同时快速染色的多细胞染色试剂组实施例中，用于猫类的染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是170～210mosmol/kg；pH值为7.2～8.0；磷酸氢二钠浓度为4.3×10-2～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为7.0×10-3～2.0×10-2mol/L。
调节盐C10还包括NaCl；NaCl浓度为2.2×10-2～3.5×10-2mol/L。
如图2所示的用于多种血细胞同时快速染色的多细胞染色试剂组实施例中，还包括稳定试剂B；稳定剂B包括促染稳定剂B10、缓冲盐B20和水；稳定试剂B在染色试剂A与样本混合后使用；稳定试剂B中的促染稳定剂B10包括醛类物质。不同物种的细胞体积大小略有差异，根据细胞的大小来调整醛类物质的含量；比如，犬的细胞体积比猫的大放入了更多的醛。
如图2所示的用于多种血细胞同时快速染色的多细胞染色试剂组实施例中，用于人类或犬类染色的稳定试剂B中，缓冲盐B20包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是渗透压范围是180～240mosmol/kg；pH值为6.5～7.0；磷酸氢二钠浓度为2.5×10-2～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为2.4×10-2～5.4×10-2mol/L；所述促染稳定剂B10包括甲醛和戊二醛；甲醛浓度为1.5×10-2～2.1×10-2mol/L；戊二醛浓度为6.0×10-3～8.0×10-3mol/L。
如图2所示的用于多种血细胞同时快速染色的多细胞染色试剂组实施例中，用于猫类的稳定试剂B中，缓冲盐B20包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是160～210mosmol/kg；pH值为6.5～7.0；稳定试剂B中，磷酸氢二钠浓度为2.5×10-2～6.0×10- 2mol/L，磷酸二氢钾浓度为2.4×10-2～5.4×10-2mol/L；所述促染稳定剂B10包括甲醛和戊二醛；甲醛浓度为0.9×10-2～1.8×10-2mol/L；戊二醛浓度为4.0×10-3～7.5×10-3mol/L。
如图2的表格中，共涉及20组实施例；以及6组对比例；20组实施例中包括10组用于人和犬血液细胞染色的实施例；10组用于猫血液细胞染色的实施例。
如图3所示是实施例1、实施例2、实施例3用于犬血液细胞染色后，截取了其中部分网织红细胞的放大示意图。从图中可见，网织红细胞能被染色区分。经过大量的实验，抗凝促染剂A20即加入EDTA盐之后，使染色剂A10对各种不同类型细胞的细胞核以及细胞内的核酸物质的染色效果增强，能使得具有核红细胞或者含有核酸物质的红细胞和白细胞同时被染色到能用明场显微镜观看到的技术效果。因此网织红细胞也能被很好的实现染色区分。采用阳离子染料，该类染料带正电的特性使其方便与细胞内带负电的磷酸基团结合，一方面确保染色效果能保持的时间更久；另一方面让磷酸基团间的负电荷减少，使细胞内的核酸物质完成染色的同时还有团聚或凝缩的效果，凝缩后显现出细胞内部结构，更容易被看见和识别，特别适合细胞内遗传物质基团的染色质量的提升，有利于不同类型细胞的更进一步的细分分类识别。
图4是实施例2和对比例1中多细胞染色试剂组分别对犬类血液细胞染色后，对染色后样本进行显微放大观察到的6种白细胞的图片集合。如图4可见，相对于对比例1来说，实施例2中的染色效果更好，更容易实现6中不同类型白细胞的区分，实现了一种染料就能实现多种细胞的同时染色区分。在试剂组分中是否包含EDTA，其染色的效果大大不同，不加EDTA时候的染色效果不明显，难以同时实现多种细胞的同时区分。抗凝促染剂A20即EDTA盐作为常规的抗凝剂，会与血液中的钙例子结合形成配位化合物，从而阻止血凝。而在本申请的配方中，抗凝促染剂A20并不起抗凝的作用，而是起到细胞核以及细胞内核酸物质染色增强的作用；能促进核酸类物质在悬浮液中的染色。配合低渗透压和pH值7-8的弱碱性的环境，使得能采用一种染料就能实现多种细胞的同时快速染色，大大提升了染色的效率。通过巧妙设计的低渗环境，借助细胞内外的离子浓度差，能促进水溶性的染色剂中的染料穿越细胞膜进入细胞内，使染料容易进入细胞膜内部与细胞内的核物质结合，完成细胞核物质的染色；采用一种染料就能完成6种不同类型的白细胞以及有核红细胞以及其他含有核酸的红细胞的染色。渗透压处于一个非常微妙的平衡状态，使染色过程中，会略微使细胞胀大，但又能维持住细胞形态。细胞略微涨大后还增加了细胞核核细胞膜中其他细胞质的区分，更有利于不同细胞类型的识别核区分。同时低渗环境有利于细胞内的核酸物质的快速染色，加上正电和负电的基团结合，确保了快速染色的同时，还能维持染色效果的时间足够长；在低渗状态还能维持足够长的染色维持时间。
在一些附图中没有展示的多细胞染色试剂组的实施例中，每500ml稳定试剂B中包括0.5mL的proClean950溶液即防腐剂；每500ml染色试剂A中包括0.5mL的proClean950溶液即防腐剂。
在一些附图中没有展示的一种试剂盒的实施例中，包括：第一容器与第二容器；在第一容器中包括上述的染色试剂A；在第二容器中包括上述的稳定试剂B。所述第一容器中染色试剂A体积与第二容器中稳定试剂B体积比为2:3至3:2。
如图1所示的一种多细胞染色方法的实施例中，包括步骤10：取标准样本与染色试剂A混合，形成染色混合液1；步骤20：等待染色M秒；等待染色时间M为60秒至180秒；步骤30：染色混合液1与稳定试剂B混匀，形成染色混合液2；所述染色试剂A包括新亚甲蓝；所述稳定试剂B包括含醛类物质，所述含醛类物质包括戊二醛和/或甲醛。取标准样本体积与染色试剂A体积的比率范围是5：400至20：400；所述染色试剂A体积与稳定试剂B体积比为2:3至3:2。所述染色试剂A为上述的染色试剂A；所述稳定试剂B为上述的稳定试剂B。
在另外一些附图中没有展示的一种多细胞染色方法的实施例中，基于上述的染色试剂C；包括以下步骤：步骤B10：取标准样本与EDTA盐混合，形成混合液C1；
EDTA盐包括EDTA·K2，EDTA·K3或EDTA·Na2；步骤B20：混合液C1与染色试剂C混合形成染色混合液1；染色混合液1中EDTA盐浓度范围为2.0×10-4～2.0×10-
3mol/L；步骤B30：等待染色M秒；等待染色时间M为60秒至180秒；步骤B40：染色混合液1与稳定试剂B混匀，形成染色混合液2；所述染色试剂C包括新亚甲蓝；所述稳定试剂B包括含醛类物质，所述含醛类物质包括戊二醛和/或甲醛。所述多细胞染色方法中，取标准样本体积与染色试剂C体积的比率范围是5：400至20：400；所述染色试剂C体积与稳定试剂B体积比为2:3至3:2；所述稳定试剂B为上述的稳定试剂B。相对于如图1所示的一种多细胞染色方法的实施例，其区别在于，在步骤10之前，已有往标准样本中加入EDTA盐的步骤。标准样本包括按照正常采血流程完成的血液样本。两种方法获取的最终的染色混合液2中的EDTA盐浓度相同，只是加入EDTA盐的时机不同。
染色试剂A和稳定试剂B以特定的时序间隔加入，恰好给了网织红细胞中核酸物质染色提供了恰到好处的染色时间窗口。M取值范围是60-180秒，即1-3分钟内就能同时完成多种细胞的染色。促染稳定剂B10中的醛类物质，会与细胞膜表面的蛋白质发生反应，形成胶体聚层，从而稳定和固定细胞形态，延长细胞在低渗状态下保持形态的时间，不至于细胞破裂。采用仅含有单一染料的试剂配方实现不同类型的多细胞区分染色，大大提高了染色效率，降低了染色的成本，使得染色后利用机器进行识别成本足够低，且使染色试剂配方的制备更简单，成本更低。
用于多种血细胞同时快速染色的多细胞染色试剂组、盒及细胞染色方法的中，染色试剂C包括染色剂A10、调节盐C10和水；染色剂A10即新亚甲蓝浓度为0.8×10-4g/ml～8.0×10-4g/mL；调节盐C10提供渗透压范围是140～210mosmol/kg的低渗透压和pH值7-8的碱性环境；染色试剂A中包括染色试剂C和抗凝促染剂A20即EDTA盐；EDTA盐促进染色剂A10进入细胞对磷酸基团染色，起到细胞核及细胞内核酸物质染色增强的作用；能促进细胞内核酸类物质在细胞悬浮液中的染色。配合低渗透压和pH值7-8的弱碱性环境，采用一种染料就能实现多种细胞的同时快速染色，大大提升了染色的效率。
本发明虽然根据优选实施例和若干备选方案进行说明和描述，但发明不会被在本说明书中的特定描述所限制。其他另外的替代或等同组件也可以用于实践本发明。

Claims (14)

1.一种多细胞染色试剂组，其特征在于，用于多种血细胞同时快速染色，
包括染色试剂C，染色试剂C包括染色剂A10、调节盐C10和水；
染色剂A10为新亚甲蓝；新亚甲蓝浓度为0.8×10-4g/ml～8.0×10-4g/mL；
调节盐C10，用于提供低渗透压环境和pH值7-8的碱性环境；低渗透压环境中，渗透压摩尔浓度范围140mosmol/kg～210mosmol/kg；
染色试剂A中包括染色试剂C；染色试剂A中还包括抗凝促染剂A20；抗凝促染剂A20包括EDTA盐，用于促进染色剂A10进入细胞对磷酸基团染色。
2.根据权利要求1所述多细胞染色试剂组，其特征在于，
抗凝促染剂A20包括EDTA盐；
染色试剂A中EDTA盐浓度范围为2.0×10-4mol/L～2.0×10-3mol/L；
EDTA盐包括EDTA·K2，EDTA·K3或EDTA·Na2中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述多细胞染色试剂组，其特征在于，
染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；
用于人类或犬类染色的染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是140mosmol/kg～180mosmol/kg；pH值为7.0～7.6；磷酸氢二钠浓度为3.0×10- 2mol/L～4.8×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为5.8×10-3mol/L～1.5×10-2mol/L。
4.根据权利要求1所述多细胞染色试剂组，其特征在于，
染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；
用于猫类的染色试剂A中，调节盐C10包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是170mosmol/kg～210mosmol/kg；pH值为7.2～8.0；磷酸氢二钠浓度为4.3×10-2mol/L～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为7.0×10-3mol/L～2.0×10-2mol/L。
5.根据权利要求3或4所述多细胞染色试剂组，其特征在于，
调节盐C10还包括NaCl；NaCl浓度为2.2×10-2mol/L～3.5×10-2mol/L。
6.根据权利要求1所述多细胞染色试剂组，其特征在于，
还包括稳定试剂B；稳定试剂B包括促染稳定剂B10、缓冲盐B20和水；
稳定试剂B在染色试剂A与样本混合后使用；
稳定试剂B中的促染稳定剂B10包括醛类物质。
7.根据权利要求6所述多细胞染色试剂组，其特征在于，
用于人类或犬类染色的稳定试剂B中，缓冲盐B20包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是180mosmol/kg～240mosmol/kg；pH值为6.5～7.0；磷酸氢二钠浓度为2.5×10- 2mol/L～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为2.4×10-2mol/L～5.4×10-2mol/L；
所述促染稳定剂B10包括甲醛和戊二醛；甲醛浓度为1.5×10-2mol/L～2.1×10-2mol/L；戊二醛浓度为6.0×10-3mol/L～8.0×10-3mol/L。
8.根据权利要求6所述多细胞染色试剂组，其特征在于，
用于猫类的稳定试剂B中，缓冲盐B20包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾；渗透压范围是160mosmol/kg～210mosmol/kg；pH值为6.5～7.0；稳定试剂B中，磷酸氢二钠浓度为2.5×10-2mol/L～6.0×10-2mol/L，磷酸二氢钾浓度为2.4×10-2mol/L～5.4×10-2mol/L；
所述促染稳定剂B10包括甲醛和戊二醛；甲醛浓度为0.9×10-2mol/L～1.8×10-2mol/L；戊二醛浓度为4.0×10-3mol/L～7.5×10-3mol/L。
9.根据权利要求7或8所述多细胞染色试剂组，其特征在于
每500ml稳定试剂B中包括0.5mL的proClean950溶液即防腐剂；
每500ml染色试剂A中包括0.5mL的proClean950溶液即防腐剂。
10.一种细胞染色试剂盒，其特征在于，用于多种血细胞同时快速染色，
包括：第一容器与第二容器；
在第一容器中包括权利要求1至5中任意一种染色试剂A；
在第二容器中包括权利要求6至9中任意一种稳定试剂B；
第一容器中染色试剂A的体积与第二容器中稳定试剂B的体积比为2:3至3:2。
11.一种多细胞染色方法，其特征在于，用于多种血细胞同时快速染色，包括，步骤10：取标准样本与染色试剂A混合，形成染色混合液1；
步骤20：等待染色M秒；等待染色时间M为60秒至180秒；
步骤30：染色混合液1与稳定试剂B混匀，形成染色混合液2；
所述染色试剂A包括新亚甲蓝；
所述稳定试剂B包括含醛类物质，含醛类物质包括戊二醛和/或甲醛。
12.根据权利要求11所述多细胞染色方法，其特征在于，
取标准样本体积与染色试剂A体积的比率范围是5：400至20：400；
所述染色试剂A的体积与稳定试剂B的体积比为2:3至3:2；
所述染色试剂A为权利要求1至5中任意一种染色试剂A；
所述稳定试剂B为权利要求6至9中任意一种稳定试剂B。
13.一种多细胞染色方法，其特征在于，用于多种血细胞同时快速染色，
基于权利要求1中所述多细胞染色试剂组中的染色试剂C；包括以下步骤：
步骤B10：取标准样本与EDTA盐混合，形成混合液C1；
EDTA盐包括EDTA·K2，EDTA·K3或EDTA·Na2；
步骤B20：混合液C1与染色试剂C混合形成染色混合液1；
染色混合液1中EDTA盐浓度范围为2.0×10-4mol/L～2.0×10-3mol/L；
步骤B30：等待染色M秒；等待染色时间M为60秒至180秒；
步骤B40：染色混合液1与稳定试剂B混匀，形成染色混合液2；
所述染色试剂C包括新亚甲蓝；
所述稳定试剂B包括含醛类物质，所述含醛类物质包括戊二醛和/或甲醛。
14.根据权利要求13所述多细胞染色方法，其特征在于，
取标准样本体积与染色试剂C体积的比率范围是5：400至20：400；
所述染色试剂C体积与稳定试剂B体积比为2:3至3:2；
所述稳定试剂B为权利要求6至9中任意一种稳定试剂B。
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