CN116042568A - 内含肽Crv Rpb2变体、编码基因及其在制备六肽-九中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内含肽Crv Rpb2变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。还公开了其编码基因以及在制备六肽‑九中的应用、还公开了Crv Rpb2变体‑(GPQ)2融合蛋白、相应的编码基因、表达载体及表达宿主菌。本发明中提供了一种新的内含肽Crv Rpb2变体，可将其与六肽‑九组成融合蛋白，表达获得高纯度的无修饰六肽‑九。本发明中的六肽‑九可以基于内含肽Crv Rpb2变体‑(GPQ)2重组表达载体得到，其制备方法简单，仅需经过细胞破碎、内含肽切割等简单的步骤，就可以高效地获得高纯度的六肽‑九，且构建成功后可持续生产，产出量大，适用于六肽‑九的大规模工业化量产，具有较大的市场价值。

Description

内含肽Crv Rpb2变体、编码基因及其在制备六肽-九中的应用

技术领域

本发明涉及一种内含肽Crv Rpb2变体、编码基因及其在制备六肽-九中的应用，属于蛋白表达技术领域。

背景技术

六肽-9是由GPQ(甘氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺)二聚体组成的非常稳定的胶原蛋白六肽。这种肽的结构在人体的胶原蛋白Ⅳ和ⅩⅦ(两种关键基膜胶原蛋白)的结构中同时存在。六肽-9由于含有这种结构而表现出全面且显著的抗皱修复功效，并且对于痘印的修复有非常奇特的效果。另外，六肽-9还有明显去除眼部皱纹和眼角鱼尾纹等美容功效。六肽-九具有多种功效与作用：1)增加I型胶原蛋白；2)增加IV型胶原蛋白；3)增加层粘连蛋白-5；4)增加整联蛋白；5)促进表皮细胞的分化成熟；6)促进皮肤再生；7)减少皱纹等。因此六肽-九具有重要的市场应用价值。但是，目前关于六肽-九的工业化合成主要依赖于化学合成，这种合成方法副产物多、产率低、污染大、成本高。而且，采用化学合成会带来很多合成副产物，有些副产物甚至具有较大的细胞毒性，从而使得六肽-九的生产和提纯消耗大量的成本，且容易带来严重的污染，极大地限制了六肽-九的进一步开发与应用。生物合成可以有效解决化学合成的缺陷，具有产率高、成本低和节能环保等优点。但对于复杂结构的六肽-九，目前并没有高效的生物合成途径。因此，开发一种更加绿色经济且高效的合成方式，是六肽-九工业化生产所急需的。

发明内容

本发明公开了一种内含肽Crv Rpb2变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

上述的内含肽Crv Rpb2变体的编码基因。

优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还公开了上述的内含肽Crv Rpb2变体在制备六肽-九中的应用。

本发明还公开了一种Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白，其特征在于含有SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列以及六肽-九的氨基酸序列，所述六肽-九为GPQ二聚体。

优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，还包括修饰序列，所述修饰序列包括his标签序列、GST标签序列、Flag标签序列、Halo标签序列、HA标签序列、Myc标签序列、Snap标签序列中的至少一种。

本发明还公开了上述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白的编码基因，其DNA序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还公开了上述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白的表达载体。

优选的，所述表达载体为PET28a。

优选的，所述表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

12.权利要求5-7中任一项所述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白的表达宿主菌。

优选的，所述表达宿主菌为大肠杆菌。

本发明还公开了一种六肽-九的制备方法，其特征在于其步骤包括：

(1)构建上述的表达载体；

(2)将表达载体转化到大肠杆菌宿主菌；选出阳性克隆；

(3)培养阳性克隆，诱导内含肽突变体-六肽-九融合蛋白的表达；

(4)表达产物置于层析柱中进行内含肽切割，收集流通液即为六肽-九。

优选的，步骤(4)具体为：

4.1收集阳性克隆的菌体细胞并进行细胞破碎，离心，取细胞破碎后的上清液，过滤除去菌体碎片；

4.2过滤后的上清液过Ni-NTA亲和层析柱；

4.3Ni-NTA亲和层析柱中加入磷酸缓冲液混匀后室温孵育过夜，收集流通液，即得纯化后的六肽-九。

优选的，所述磷酸缓冲液为pH 6.0，浓度50mM的磷酸缓冲液。

本发明还公开了一种内含肽Crv Rpb2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述的内含肽Crv Rpb2的编码基因。

优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

以及上述的内含肽Crv Rpb2在制备六肽-九中的应用。

六肽-九是甘氨酸G、脯氨酸P和谷氨酰胺Q组成的串联三肽二聚体(GPQ二聚体)。通过利用天然生物系统中“中心法则”里的mRNA翻译成多肽链，其能有序的按照基因编码信息实现氨基酸添加，使得GPQ二聚体可以通过体外制备好的遗传信息转入到细胞系统中获得稳定表达该遗传信息产物的工程生命体表达得到。从而在技术角度上相比化学合成具有至少以下优势：1)操作简单，只要构建出表达特定肽类的工程菌，就可以持续的进行肽类的表达；2)成本低，底物都是一些最基础的营养物质，不需要昂贵的材料；3)副产物少，提纯容易，基本没有合成副产物，只有生命体代谢的产物，容易分离和提纯；4)清洁环保，几乎无污染；5)效率高，合成效率高效，可以大规模生产和获得。因此，可以看出，本发明中的相关应用相较于化学合成具有显著的技术优势。但现有技术中的问题在于没有GPQ二聚体生物合成的案例，这是因为GPQ二聚体肽链太短，难以在生物培养物中检测和分离。虽然有方法提及可以利用包含蛋白酶切割位点的寡肽融合蛋白来提高寡肽的肽链的长度，使其易于在表达过程中检测寡肽的产量，并利用亲和标签来降低寡肽的纯化难度。但这种办法需要在蛋白纯化后引入额外的蛋白内切酶来进行寡肽的释放和分离。这增加了寡肽的生产复杂程度，降低了寡肽的产能。同时还容易引入额外的氨基酸残基，导致寡肽的性能或功能改变。而本发明中的内含肽能够有效地解决上述问题。内含肽是一类能够通过自催化完成切割的氨基酸序列，其能够在特定的条件完成自身和蛋白之间的分离。而本发明中的内含肽能够针对GPQ二聚体实现定向切割，实现特定蛋白上各类蛋白标签的有效去除。

本发明的有益效果：

1.本发明中提供了一种新的内含肽Crv Rpb2，通过将其与六肽-九(GPQ二聚体)组成融合蛋白，表达获得高纯度的无修饰九肽-1。

2.本发明中提供了一种新的内含肽Crv Rpb2变体，在前述的内含肽Crv Rpb2基础上进化而成，通过将其与六肽-九(GPQ二聚体)组成融合蛋白，在导入载体质粒后制备得到高效、稳定的GPQ二聚体的重组表达载体，在转入细菌得到工程菌后，通过诱导表达能够获得高纯度的无修饰GPQ二聚体。且相较于进化前的内含肽Crv Rpb2具有更高的切割效率和更高的产量。

3.本发明中的GPQ二聚体是基于内含肽Crv Rpb2-(GPQ)2重组表达载体得到的，其制备方法简单，仅需经过细胞破碎、内含肽切割等简单的步骤，就可以高效地获得高纯度的六肽-九，且生物合成方法能够有效降低污染和有毒有害副产物的产生，产出量大，适用于六肽-九的大规模工业化量产，从而获得高品质的六肽-九，具有较大的市场价值。

附图说明

图1进化前后内含肽Crv Rpb2的活性测试图。

图2进化前后内含肽Crv Rpb2切割生产六肽-九的HPLC检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。

Crv Rpb2内含肽的氨基酸序列为：

QKYDTLVLTHLGWIKLGEIDITIHKVATLDKHDNIIYVYPTSKFEFDYDGDFYEHKNNSI DIECTINHKLYCKYNLSSSFTLIPADKVYGNKVIMKNMENEVIWTDPSKEQIHNYKGKVYCIEVPDSHIYYMKTSSITPPVWIGN(SEQ ID NO:1)，来自GenBank:YP_003969856中第995-1089位的氨基酸残基片段。

其核苷酸序列为：

cagaaatacgataccctggtgctgactcacctgggttggatcaaactgggtgagattgacatcaccatccataaagtcgcaacgctggacaaacatgataacatcatttacgtttacccgacttctaagttcgaatttgattacgacggtgatttttacgaacacaaaaacaactctatcgacatcgagtgcaccatcaaccacaaactgtactgcaaatacaacctgagctcctctttcaccctgattccggctgacaaggtttacggtaacaaagttatcatgaaaaacatggagaacgaagttatctggaccgatccgtctaaggaacagatccacaactacaaaggcaaagtgtactgtattgaagttccggacagccacatctactacatgaagacctcctccatcaccccgccagtttggattggtaac(SEQ ID NO:2)，为Cafeteria roenbergensis virus BV-PW1的Rpb2基因中的片段。

我们利用噬菌体辅助定向进化技术对其进行了定向进化，获得的内含肽变体序列为：

QKYDTLVLTHLGWIKLGEIDITIHKVATLDKHENIIYVYPTSKFEFDYDGDFYEHQSNSI DIECTINHKLYCKYNLSSSFTLIPADKVYGNKVIMKNMENEVIWTDPSKEQIHNYKGKVYCIEVPDSHIYYMKTSSISPPVWIGN(SEQ ID NO:3)

其核苷酸序列为：

cagaaatacgataccctggtgctgactcacctgggttggatcaaactgggtgagattgacatcaccatccataaagtcgcaacgctggacaaacatgaaaacatcatttacgtttacccgacttctaagttcgaatttgattacgacggtgatttttacgaacaccaatccaactctatcgacatcgagtgcaccatcaaccacaaactgtactgcaaatacaacctgagctcctctttcaccctgattccggctgacaaggtttacggtaacaaagttatcatgaaaaacatggagaacgaagttatctggaccgatccgtctaaggaacagatccacaactacaaaggcaaagtgtactgtattgaagttccggacagccacatctactacatgaagacctcctccatctccccgccagtttggattggtaac(SEQ ID NO:4)。

内含肽活性检测：我们将内含肽序列插入到GFP蛋白的中间，利用内含肽的自切割来生成完整的GFP，结果见图1，进化后的内含肽具有更高的切割效率。

Crv Rpb2内含肽的的构建：

为了进一步提高Crv Rpb2内含肽在蛋白纯化上的应用效果与价值，基于SEQ IDNO:3所示序列，在C端融合六肽-九序列。融合蛋白的氨基酸序列为：

QKYDTLVLTHLGWIKLGEIDITIHKVATLDKHENIIYVYPTSKFEFDYDGDFYEHQSNSI DIECTINHKLYCKYNLSSSFTLIPADKVYGNKVIMKNMENEVIWTDPSKEQIHNYKGKVYCIEVPDSHIYYMKTSSISPPVWIGNGPQGPQ(SEQ ID NO:5)。

SEQ ID NO:5对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

gcacagaaatacgataccctggtgctgactcacctgggttggatcaaactgggtgagattgacatcaccatccataaagtcgcaacgctggacaaacatgaaaacatcatttacgtttacccgacttctaagttcgaatttgattacgacggtgatttttacgaacaccaatccaactctatcgacatcgagtgcaccatcaaccacaaactgtactgcaaatacaacctgagctcctctttcaccctgattccggctgacaaggtttacggtaacaaagttatcatgaaaaacatggagaacgaagttatctggaccgatccgtctaaggaacagatccacaactacaaaggcaaagtgtactgtattgaagttccggacagccacatctactacatgaagacctcctccatctccccgccagtttggattggtaacggtccgcagggtccgcag(SEQ ID NO:6)。

SEQ ID NO:6的合成交由广州艾基生物科技有限公司。当然，本领域技术人员也可以根据实际情况选择其他本领域常规方式按照上述序列组成进行合成。

在SEQ ID NO:6的5’端使用酶切位点BamH I进行切割，3’端使用酶切位点Xho I进行切割，得到切割片段。然后取1μg同样经过BamH I和XhoI酶切处理后的空白pET28a质粒(使用2％琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，即可得到线性化的酶切后的质粒)。使用T4 DNA连接酶对切割片段和pET28a骨架进行连接过夜，连接方法参考pET28a质粒使用说明或本领域中常规技术手册进行。连接后的产物转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，将转化后的大肠杆菌涂布在含卡那霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。挑取阳性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，震荡培养后进行测序鉴定。

进化后的内含肽Crv Rpb2-(GPQ)2表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。基于同样的方法，构建了进化前的内含肽Crv Rpb2-(GPQ)2表达载体。

将上述实施例中的进化前及进化后的内含肽Crv Rpb2-(GPQ)2表达载体转化到BL21(DE3)表达菌株中，挑取单克隆菌株至LB培养基中扩大培养中OD600值为0.8，加入1/20体积的1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和终浓度为1mM的IPTG，37℃，200rpm继续培养4-6h。4℃，10000rpm离心20min，收集菌体。收集得到的菌体用PBS清洗2次。

(2)菌体破碎：

将洗涤后的菌体重悬在裂解缓冲液(由终浓度20mM Tris和终浓度500mM NaCl组成，pH 8.0)中，使用压力或超声进行菌体破碎，直至镜检染色确认没有明显的菌体。4℃，12000rpm离心20min，收集上清，0.45μm滤膜过滤。

(3)亲和层析：

Ni-NTA亲和层析柱用20倍柱体积裂解缓冲液充分平衡后，加入过滤后的细菌裂解液以0.5mL/min流速移入Ni-NTA亲和层析柱中，再用5倍柱体积的含20mM咪唑的裂解缓冲液充分清洗。

(4)内含肽切割：

加入pH 6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温孵育过夜，收集流通液，即得纯化后的六肽-九。

使用HPLC检测纯化的目的蛋白的含量和纯度。结果见图2。

可以发现，通过内含肽切割后，流通液中的六肽-九的含量可达3mg/L菌液，纯度在97％以上(图2)。上述结果表明本发明中的方法能够快速高效获得纯化六肽-九，且进化后的内含肽Crv Rpb2变体生产效率明显高于进化前的内含肽Crv Rpb2。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (20)

1.一种内含肽Crv Rpb2变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的内含肽Crv Rpb2变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.权利要求1所述的内含肽Crv Rpb2变体在制备六肽-九中的应用。

5.一种Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白，其特征在于含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列以及六肽-九的氨基酸序列，所述六肽-九为GPQ二聚体。

6.根据权利要求5所述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

7.根据权利要求5或6所述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白，其特征在于还包括修饰序列，所述修饰序列包括his标签序列、GST标签序列、Flag标签序列、Halo标签序列、HA标签序列、Myc标签序列、Snap标签序列中的至少一种。

8.权利要求5所述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白的编码基因，其特征在于其DNA序列如SEQ ID No.6所示。

9.权利要求5-7中任一项所述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白的表达载体。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为PET28a。

11.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于所述表达载体的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。

12.权利要求5-7中任一项所述的Crv Rpb2变体-(GPQ)2融合蛋白的表达宿主菌。

13.根据权利要求12所述的表达宿主菌，其特征在于所述表达宿主菌为大肠杆菌。

14.一种六肽-九的制备方法，其特征在于其步骤包括：

(1)构建权利要求10或11所述的表达载体；

(2)将表达载体转化到大肠杆菌宿主菌；选出阳性克隆；

(3)培养阳性克隆，诱导内含肽突变体-六肽-九融合蛋白的表达；

(4)表达产物置于层析柱中进行内含肽切割，收集流通液即为六肽-九。

15.根据权利要求14所述的六肽-九的制备方法，其特征在于步骤(4)具体为：

4.1收集阳性克隆的菌体细胞并进行细胞破碎，离心，取细胞破碎后的上清液，过滤除去菌体碎片；

4.2过滤后的上清液过Ni-NTA亲和层析柱；

4.3Ni-NTA亲和层析柱中加入磷酸缓冲液混匀后室温孵育过夜，收集流通液，即得纯化后的六肽-九。

16.根据权利要求15所述的六肽-九的制备方法，其特征在于所述磷酸缓冲液为pH6.0，浓度50mM的磷酸缓冲液。

17.一种内含肽Crv Rpb2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

18.权利要求17所述的内含肽Crv Rpb2的编码基因。

19.根据权利要求18所述的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

20.权利要求1所述的内含肽Crv Rpb2在制备六肽-九中的应用。

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