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CN116036372B - 一种口腔用骨填充物的制备方法 - Google Patents

一种口腔用骨填充物的制备方法 Download PDF

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CN116036372B CN202310207968.0A CN202310207968A CN116036372B CN 116036372 B CN116036372 B CN 116036372B CN 202310207968 A CN202310207968 A CN 202310207968A CN 116036372 B CN116036372 B CN 116036372B
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Abstract

本发明涉及骨填充物技术领域，具体为一种口腔用骨填充物的制备方法。包括以下步骤：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷；(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，得到重组胶原蛋白溶液；(3)配置EDC溶液，配置NHS溶液；(4)将重组胶原溶液使用NaOH溶液调节pH＝5.5±2，缓慢滴加EDC溶液，边滴加边搅拌；接着滴加NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；(5)将混合溶液放入恒温摇床中，预交联，取出，得到预交联溶液；(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，交联，取出，过滤出固体颗粒；(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。

Description

一种口腔用骨填充物的制备方法
技术领域
本发明涉及骨填充物技术领域，具体为一种口腔用骨填充物的制备方法。
背景技术
天然生物材料(动物胶原蛋白)具有良好生物相容性，越来越多的研究者将动物胶原蛋白应用到骨修复领域中。但动物胶原蛋白也存在一些问题，如提取过程无法消除疯牛病等病毒隐患。此外，人胶原在提取过程中也无法消除艾滋病等传染危险。并且，动物胶原蛋白水溶性差，在溶于酸和碱的过程中，容易产生细胞毒性。综上，动物源型和人源型胶原蛋白存在的这些问题让其在骨修复等领域中的应用受到限制。而重组胶原蛋白是在人胶原蛋白基因的基础上，通过基因工程技术生产的高分子生物蛋白，具有生物相容性好、易溶于水、细胞毒性低、排异反应低、细胞黏附性好等优点。因此，重组胶原蛋白可以作为传统骨修复材料中动物胶原的替代物质。
现有技术中，胶原蛋白骨修复材料大多呈块状，虽然具有较好的机械强度，但可塑性较差，无法适用各种骨损伤部位或不规则骨缺损部位的修复。此外，目前报道的胶原蛋白骨修复材料大多通过共混法、共沉淀法制备；存在无机材料(羟基磷灰石/β-磷酸三钙)易团聚，分布不均，与胶原界面结合欠佳等缺陷。
综上，解决上述问题，制备一种口腔用骨填充物，使其能够具有更好的生物活性和不同的临床应用途径具有重要价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种口腔用骨填充物的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种口腔用骨填充物的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷；
(2)溶解胶原：将重组胶原加入蒸馏水中，溶解，得到重组胶原溶液；
(3)配置交联剂：将碳二亚胺盐酸盐加入蒸馏水中，溶解，得到EDC溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺加入蒸馏水中，溶解，得到NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用NaOH溶液调节pH＝5.5±2，缓慢滴加EDC溶液，边滴加边搅拌；接着滴加NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，预交联，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，交联，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
较为优化地，步骤(2)中，所述重组胶原溶液的浓度为80～300mg/mL。
较为优化地，步骤(3)中，所述EDC溶液的浓度为50～200mg/mL；NHS溶液的浓度为20～100mg/mL。
较为优化地，步骤(4)中，EDC溶液占混合溶液的0.05～1wt％；NHS溶液占混合溶液的0.01～1wt％。
较为优化地，步骤(5)中，预交联过程中，温度调至30～40℃，震荡频率调至100～220rpm，预交联30～50分钟；步骤(6)中，交联过程中，温度调至30～40℃，震荡频率调至100～220rpm，交联时间为3～4小时。
较为优化地，步骤(6)中，多孔双相磷酸钙陶瓷的加入量占混合溶液的10～30wt％。
较为优化地，所述多孔双相磷酸钙陶瓷的粒度为0.25～1mm或1～2mm。
较为优化地，所述多孔双相磷酸钙陶瓷由质量比为2:8的羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成。
较为优化地，所述一种口腔用骨填充物的制备方法制备得到的骨填充物。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
(1)本申请中制备的骨填充物是一种重组胶原型骨填充物，塑型性强，可以任意改变形状，用以填充各种不规则骨缺损部位。
(2)本申请中将不同粒度的多孔双相磷酸钙陶瓷(BCP颗粒：羟基磷灰石/磷酸三钙混合物)加入至经过交联剂预交联的重组胶原溶液中，使得交联的重组胶原蛋白与多孔双相磷酸钙陶瓷表面和内部界面结合，使得交联分布均匀。该种结构特性使其能够具有更好的生物活性以及不同的临床应用途径。
(3)本申请中，可以改变重组胶原溶液的浓度、改变双相磷酸钙陶瓷的粒度，从而制备得到不同性能参数的重组胶原型骨填充物，使其适用于各种骨损伤部位或不规则骨缺损部位的修复。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图2是实施例2制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图3是实施例3制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图4是实施例4制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图5是实施例5制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图6是实施例6制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图7是对比例1制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图8是对比例2制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图9是对比例3制备的骨填充物的SEM扫描电镜图；
图10是实施例6制备的骨填充物的宏观图；
图11是对比例1制备的骨填充物的宏观图；
图12是A组大鼠骨粉植入部位Micro-CT图；
图13是B组大鼠骨粉植入部位Micro-CT图；
图14是C组大鼠骨粉植入部位Micro-CT图；
图15是三组SD大鼠骨粉植入部位骨密度结果；
图16是三组SD大鼠骨粉植入部位新生骨体积百分比；
图17是三组SD大鼠骨粉植入部位骨表面积和组织体积的比值；
图18是实施例3的骨粉体外降解累积失重率％；
图19是实施例6的骨粉体外降解累积失重率％。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为0.25～1mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，搅拌溶解，配置得80mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌，接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.2wt％，NHS溶液占混合溶液的0.2wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至150rpm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至150rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
实施例2：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为0.25～1mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置得170mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌，接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.12wt％，NHS溶液占混合溶液的0.12wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至130rpm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至130rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
实施例3：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为0.25～1mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置得280mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌，接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.1wt％，NHS溶液占混合溶液的0.1wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
实施例4：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为1～2mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置得80mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌，接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.2wt％，NHS溶液占混合溶液的0.2wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至150rpm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至150rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
实施例5：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为1～2mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置得170mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌，接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.12wt％，NHS溶液占混合溶液的0.12wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至130rpm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至130rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
实施例6：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为1～2mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置得280mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌，接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.1wt％，NHS溶液占混合溶液的0.1wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
对比例1：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为1～2mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置得280mg/mL的重组胶原溶液；
(3)称取双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占重组胶原溶液的20wt％，配置100mg/mL的EDC溶液，配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将称量好的双相磷酸钙陶瓷BCP加至重组胶原溶液，放入恒温摇床中，温度调至37℃，振荡频率调至120rpm，预混合30min，得到预混溶液；
(5)用0.4mol/L的NaOH溶液将预混溶液的pH值调至5.5，缓慢滴加100mg/ml的EDC交联剂溶液，边滴加边搅拌，接着缓慢滴加20mg/ml的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合总溶液的0.1wt％，NHS溶液占混合总溶液的0.1wt％；
(6)将混合溶液放入恒温摇床，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，交联反应3.5h，过滤出固体颗粒；
(7)将步骤(6)中过滤出的固体样品冷冻干燥。
对比例2：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为1～2mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置得400mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌；接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.1wt％，NHS溶液占混合溶液的0.1wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120pm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
对比例3：(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白：重组一型胶原蛋白(厂家：江苏创健医疗科技股份有限公司，重组胶原蛋白的氨基酸序列、基因表达序列如专利号CN110964099A中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷(粒度为1～2mm，羟基磷灰石与β-磷酸三钙的质量比为2:8)；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，配置40mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置100mg/mL的EDC溶液；配置20mg/mL的NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用0.4mol/L的NaOH溶液调节pH＝5.5，缓慢滴加100mg/mL的EDC溶液，边滴加边搅拌；接着缓慢滴加20mg/mL的NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；其中，EDC溶液占混合溶液的0.1wt％，NHS溶液占混合溶液的0.1wt％；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，预交联30分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷BCP，使其占混合溶液的20wt％，加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至37℃，震荡频率调至120rpm，交联3.5小时，取出，过滤出固体颗粒；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
实验部分：
实验1：将实施例和对比例中制备得到的骨填充物进行胶原蛋白含量测定、SEM扫描电镜检测，同时，并对实施例6和对比例1中所得产物进行了实物拍摄，所得数据如下表所示：
结论：实施例1～实施例6中由SEM扫描电镜图表明：胶原蛋白呈条状分布在多孔双相磷酸钙陶瓷BCP之间。
将对比例1与实施例6对比，其中，对比例1和实施例6的工艺步骤和参数大致相同，区别在于实施例6是先将重组胶原溶液交联，然后将BCP颗粒浸泡于交联溶液中，即先交联后浸泡；而对比例1是先将BCP颗粒浸泡于重组胶原溶液中，预混合30min后，再与重组胶原溶液一起交联，即先浸泡后交联。从图10和图11的，可以看出：实施例6先交联后浸泡工艺得到的骨填充物呈颗粒状，而对比例1先浸泡后交联工艺得到的骨填充物呈块状。再对比图6和图7可以看出：实施例6的骨填充物中，胶原蛋白呈条带状分布在BCP颗粒之间，避免了BCP被完全包裹，因此得到的骨填充物为小颗粒状，塑形性强，可任意改变形状以填充各种不规则的骨缺损部位。而对比例1的骨填充物中，胶原蛋白呈膜状将BCP颗粒完全包裹，难以分离。
将对比例2与实施例6对比，其中，对比例2和实施例6的工艺大致相同，区别在于对比例2初始配置的重组胶原溶液浓度更高。因此，对比例2的骨填充物的胶原含量高于实施例6的含量。而对比图6和图8，可以看出：对比例2的骨填充物中，胶原蛋白呈膜状将BCP颗粒完全包裹，无法分离，难以应用于各种不规则的骨缺损部位。
将对比例3与实施例6对比，其中，对比例3和实施例6的工艺大致相同，区别在于对比例3初始配置的重组胶原溶液浓度较低。因此，对比例3的骨填充物的胶原含量明显远低于实施例6的骨填充物的胶原含量。而对比图6与图9，可以看出：对比例3的骨填充物中，未见明显的胶原蛋白存在。
实验2：将实施例3所制备的骨填充物进行动物实验。
a.动物实验前准备：
(1)将15只成年雄性SD大鼠随机分为3组(A组、B组、C组)，每组5只分开饲养；
(2)材料准备：将实施例3制备的骨粉通过环氧乙烷灭菌处理，并准备盖氏Bio-oss骨粉(0.25-1mm粒度)作为对照。
(3)手术器械准备：将必要的手术器械用布料包好放入金属容器，用高压蒸汽灭菌锅做灭菌处理。
(4)麻药的制备：将称量好的2g戊巴比妥钠粉末加入少量生理盐水中充分溶解，并用无菌滤嘴过滤成无菌溶液后注入100mL生理盐水中，配成2％戊巴比妥钠-生理盐水溶液。
b.SD大鼠颅骨缺损模型的建立：
用1mL注射器在SD大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠-生理盐水溶液1mL做麻醉，SD大鼠麻醉后用电动剃须刀将大鼠头顶部毛发剃掉，碘伏消毒2遍，于大鼠头盖骨上方颅骨正中线做一个1.5cm切口，依次切开表皮、皮下筋膜、骨膜，可看到颅骨人字缝，若暴露不充分可适当延长切口。统一在人字缝旁以一直径为6cm的模具做点状划痕，并沿着划痕制造等大的全层骨缺损，注意勿伤及大脑，出血时及时按压止血，以免影响修复效果。骨缺损制造完成后，如下表所示，在相应组中植入相应的材料(A组未植入骨粉、B组植入实施例3制备的骨粉、C组植入盖氏Bio-oss骨粉)，术后直接缝合皮下、皮肤，注射5mL葡萄糖并白炽灯下保暖观察半小时，便可放回饲养笼内。术后前3天每天给实验大鼠注射葡萄糖溶液及青霉素液抗炎，观察手术伤口有无感染现象并及时处理，于术后2月观察取材进行相关检测。
c.结果处理(检测)：
在给SD大鼠颅骨缺损模型做材料修复术后2月，进行动物标本Micro-CT扫描。使用2％戊巴比妥钠麻醉两组SD大鼠后用颈椎脱臼法处死，将大鼠头盖骨完整取出，并用甲醛浸泡1周后，进行Micro-CT扫描。
d.结果与讨论
Micro-CT扫描结果如图12～14所示，分别依次为A组(无骨粉植入)，B组(植入实例3骨粉)以及C组(植入Bio-oss骨粉)大鼠的Micro-CT图，可以看出：A组(无骨粉植入)大鼠新骨生成最少，B组(植入实例3骨粉)大鼠新生骨较多且致密，优于C组(植入Bio-oss骨粉)大鼠。
而图15～17为三组SD大鼠骨粉植入部位的骨密度结果、新生骨体积百分比、骨表面积和组织体积的比值，图中数据可以看出：不管是骨密度还是新生骨体积百分比数据，植入实例3骨粉的B组大鼠在新骨生成方面都表现优异，优于A组(无骨粉植入)和C组(植入Bio-oss骨粉)大鼠。
实验3：将实施例3、实施例6进行体外降解实验，将制备的骨粉样品放入pH值为7的模拟体液SBF溶液中，于37℃的恒温摇床内，低速摇动，每隔7d取出，放于烘箱内40℃干燥、称重，计算骨粉累积失重率。
结论：实施例3的降解实验数据如图18所示，图中数据表明：实施例3制备骨粉体外降解3个月后，累积失重率小于15％，降解速率慢，满足口腔用骨填充材料的降解要求。
实施例6的降解实验数据如图19所示，图中数据表明：数据表明：实施例6制备的骨粉体外降解3个月后，累积失重率小于10％，降解速率较慢，满足口腔用骨填充材料的降解要求。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种口腔用骨填充物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)原料的选择：a.重组胶原蛋白；b.无机材料：多孔双相磷酸钙陶瓷；
(2)溶解胶原：将重组胶原蛋白加入蒸馏水中，溶解，得到浓度为80～300mg/mL的重组胶原溶液；
(3)配置交联剂：将碳二亚胺盐酸盐加入蒸馏水中，溶解，得到EDC溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺加入蒸馏水中，溶解，得到NHS溶液；
(4)将重组胶原溶液使用NaOH溶液调节pH＝5.5±2，缓慢滴加EDC溶液，边滴加边搅拌；接着滴加NHS溶液，边滴加边搅拌，得到混合溶液；
(5)将混合溶液放入恒温摇床中，温度调至30～40℃，震荡频率调至100～220rpm，预交联30～50分钟，取出，得到预交联溶液；
(6)称取多孔双相磷酸钙陶瓷加入到预交联溶液中，继续放入恒温摇床中，温度调至30～40℃，震荡频率调至100～220rpm，交联3～4小时，取出，过滤出固体颗粒；多孔双相磷酸钙陶瓷的加入量占混合溶液的10～30wt％；
(7)将固体颗粒冷冻干燥，得到骨填充物。
2.根据权利要求1所述一种口腔用骨填充物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述EDC溶液的浓度为50～200mg/mL；NHS溶液的浓度为20～100mg/mL。
3.根据权利要求1所述一种口腔用骨填充物的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，EDC溶液占混合溶液的0.05～1wt％；NHS溶液占混合溶液的0.01～1wt％。
4.根据权利要求1所述一种口腔用骨填充物的制备方法，其特征在于：所述多孔双相磷酸钙陶瓷的粒度为0.25～1mm或1～2mm。
5.根据权利要求1所述一种口腔用骨填充物的制备方法，其特征在于：所述多孔双相磷酸钙陶瓷由质量比为2:8的羟基磷灰石与β-磷酸三钙组成。
6.根据权利要求1～5任一项所述一种口腔用骨填充物的制备方法制备得到的骨填充物。
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