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CN116027048A - 一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒及其应用 Download PDF

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CN116027048A
CN116027048A CN202310067903.0A CN202310067903A CN116027048A CN 116027048 A CN116027048 A CN 116027048A CN 202310067903 A CN202310067903 A CN 202310067903A CN 116027048 A CN116027048 A CN 116027048A
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CN
China
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kit
cytokine storm
inflammatory factors
detection
cytokine
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Pending
Application number
CN202310067903.0A
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English (en)
Inventor
杜家杰
胡晓明
张春杰
赵凤
焦楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Zhonghong Special Inspection Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shandong Zhonghong Special Inspection Biotechnology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒及其应用,所述试剂盒包括4种炎症因子TNF‑α、IL‑6、PGE2和PAF的生物素标记检测抗体。本发明试剂盒可以通过对4种炎症因子的联合定量检测,用于细胞因子风暴综合征的诊断,本发明的试剂盒具有指标覆盖全面、灵敏度高、特异性好等优点,仅通过4种炎症因子的联合检测就可以提高细胞因子风暴综合征诊断的准确性,临床使用更方便快捷。

Description

一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物诊断技术领域,具体而言,本发明涉及一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒及其应用。
背景技术
在很多疾病中,包括流感、败血症或者免疫治疗的部分病例中,可能出现一类特殊的临床综合症,即伴随发热、低血压、缺氧和体液中多种细胞因子迅速大量产生,这一系列临床与实验症状称作细胞因子释放综合征,也被称之为细胞因子风暴(cytoki ne storm)。
细胞因子风暴相关的细胞因子是免疫细胞在被激活、与靶细胞相互作用的时候释放的。相关的细胞因子(白介素、干扰素等)主要来源于激活的免疫细胞,而且又重新作用于免疫细胞的激活(包括T-细胞,单核细胞和巨噬细胞等),触发急性炎症反应诱导上皮及组织损伤,导致微血管渗漏、心衰甚至死亡。多种细胞因子迅速大量产生的现象,也是引起急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭的重要原因。在发生严重副作用之前检测患者血清样本中细胞因子风暴相关细胞因子,对临床诊断和治疗有重要指导意义。
根据研究文献,部分细胞因子水平等在血清中的增高与患者发生细胞因子风暴具有明确的相关性。例如,中国授权发明专利CN112034187B公开了一组用于预测2019冠状病毒病细胞因子释放综合征和血栓风暴的标志物及其应用、试剂盒和试剂盒的制备方法,所述标志物分别为VEGF D、TNF α、SCF、LI F、I L 2、I L 4、I L 6、I L 8、I L 10、I L 15、I L17A、I L 18、I L 1β和I FN γ。利用该发明提供的VEGF D、TNFα、SCF、LI F、I L 2、I L4、IL 6、I L 8、I L 10、I L 15、I L 17A、I L 18、I L 1β、I FN γ一组标志物或者其制备得到的试剂盒进行2019冠状病毒病(COVI D 19)细胞因子释放综合征和血栓风暴的预测,具有检测快速、准确、费用低等优点,应用前景广阔。然而,上述发明专利涉及的是单个相关指标分别进行检测,只能反映细胞因子风暴的某个方面,缺乏全面性,并不能准确诊断细胞因子风暴,其最高预测准确率也只有83.6%。
针对上述问题,中国发明专利申请CN107870233A公开了一种细胞因子风暴相关细胞因子的检测,是一种用于进行免疫疗法或其他产生细胞因子风暴疾病的预后检测指标组合。该细胞因子组合覆盖了能够检测细胞因子风暴的9个指标(IFN-γ、TNF-α、IL-2R、IL-6、IL-10、GM-CSF、CRP、MIP-1α、MIP-1β),可以通过固相芯片/液相芯片/ELISA试剂盒法实现血清微量样品高灵敏度检测,通过9项指标的联合检测,绘制ROC曲线,可使细胞因子风暴诊断的灵敏度达到90%,特异性达到100%。
然而,上述检测需要同时检测9个指标,存在操作难度大,检测成本高的缺陷。因此,本发明通过对检测细胞因子风暴的指标进行优化,既能够准确的诊断细胞因子风暴,又能够降低诊断成本,提高诊断效率。
发明内容
本发明主要提供了一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒及其应用。为了实现本发明的目的,拟采用如下技术方案:
本发明一方面涉及一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒,所述试剂盒包括4种炎症因子TNF-α、IL-6、PGE2和PAF的生物素标记检测抗体。
在本发明的一个优选实施方式中,所述试剂盒为固相芯片、液相芯片或ELISA试剂盒。
在本发明的一个优选实施方式中,所述试剂盒可以定量检测血清中4种炎症因子TNF-α、IL-6、PGE2和PAF的含量。
在本发明的一个优选实施方式中,所述试剂盒不包括除了上述4种炎症因子之外的其它炎症因子的检测抗体。
本发明另一方面涉及一种细胞因子风暴综合征诊断标志物,所述标志物包括4种炎症因子TNF-α、I L-6、PGE2和PAF。
在本发明的一个优选实施方式中,所述诊断标志物不包括其它炎症因子。
本发明另一方面还涉及上述试剂盒或标志物的应用,所述标志物用于制备诊断细胞因子风暴综合征诊断试剂盒中的应用。
本发明另一方面还涉及上述试剂盒或标志物的应用,所述标志物用于制备预测细胞因子风暴综合征诊断试剂盒中的应用。
本发明的有益效果
本发明试剂盒可以通过对4种炎症因子的联合定量检测,用于细胞因子风暴综合征的诊断,本发明的试剂盒具有指标覆盖全面、灵敏度高、特异性好等优点,仅通过4种炎症因子的联合检测就可以提高细胞因子风暴综合征诊断的准确性,临床使用更方便快捷。
附图说明
图1为细胞因子风暴相关因子指标结果展示图(以健康志愿者的监测结果的平均值为100%作为计算基准);
图2为联合指标ROC曲线分析图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一、用于细胞因子风暴诊断的固相芯片
·包括检测TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、I L-6(白细胞介素-6)、PGE2(前列腺素E2)和PAF(血小板激活因子)指标的芯片,捕获指标的抗体点制在芯片上;
·对应TNF-α、I L-6、PGE2和PAF的4种生物素标记检测抗体;
·链霉亲和素-荧光(SA-Cy3);
·配套试剂:标准品混合物、样品稀释液、封闭液、洗脱液I、洗脱液I I;
·其他设备耗材:离心管、4℃离心机、常温离心机、酶标仪、漩涡振荡器、摇床、芯片小型离心机、芯片扫描仪、软件GenePix Pro 6.0。
二、利用固相芯片对上述4个指标组合进行检测
(一)芯片实验前准备
1、提前从-80℃冰箱取出所有试剂,放置平衡至室温。
2、样品组成与准备
样品组成:健康人35例,接受免疫治疗患者70例,标准化收集血清。
样本准备:离心血清样本,10,000rpm,4℃离心15mi n,取上清。离心后样本与样品稀释液按照1:1稀释至终体积100uL上样。
3、标准品准备
在细胞因子标准品混合物中加入500μL样品稀释液,轻轻混匀,使粉末彻底溶解。将试管标记为Std1。标记6个干净的空离心管为Std2-Std7。每管加200μL样品稀释液。从Std1中吸取100μL加入Std2,轻轻混匀。再从Std2中吸取100μL至Std3中,以此类推。另取一离心管加入100μL样品稀释液,标记为CNTRL。CNTRL中不加细胞因子标准品或样品,作为阴性对照。
(二)芯片检测操作
1、样品孵育
将固相芯片从4℃冰箱取出,使用前室温干燥2h。
每个孔加入100μL封闭液,室温封闭30mi n。
2、样品杂交及洗涤
完全移除每个孔中的封闭液;每孔加入稀释的相应标准品和样品100μL,贴上胶条,置于水平摇床,4℃过夜。
完全移除孔中样品,加150μL洗脱液I,室温轻摇洗涤5次,每次2mi n。
将芯片放入洗涤盒中,加足够量的洗脱液I,室温轻摇洗涤2次,每次5mi n。
完全移除洗脱液I,加150μL洗脱液I I,室温轻摇洗涤2次,每次5mi n。
取出生物素标记检测抗体,短暂离心后加入1400μL样品稀释液进行稀释,轻摇混匀。每孔加入80μL稀释后的生物素标记检测抗体,室温孵育2hr。
从每个孔中完全移除生物素标记检测抗体,按步骤2-4洗涤。
取出链霉亲和素-荧光,短暂离心后,加入1400μL封闭液,轻摇混匀。
每孔加80μL链霉亲和素-荧光,贴上胶条,铝箔避光,室温孵育2hr。
从每孔中完全移除链霉亲和素-荧光,按步骤2洗涤。
3、检测
完全移除洗脱液I,将芯片从框架中卸下。
在洗涤盒中加入足够量的洗脱液I,室温轻摇洗涤2次,每次10min。
移除洗脱液I,在洗涤盒中加入足够量的洗脱液II,室温轻摇洗涤10min。
移除洗脱液II,在30mL离心管中加入足够量的Milli-Q水,洗涤。
1000rpm离心3min,甩干芯片。
(三)芯片数据采集
本次实验检测的样品与标准品经扫描仪检测后,对检测获得的荧光由软件GenePix Pro 6.0自动进行计算与优化,形成输出文件。
(四)数据分析与结果展示
1、标准曲线
根据标准品检测到的信号值进行对数标准曲线的拟合,本次实验中,4个指标的标准曲线R2>0.95,说明标准曲线拟合良好。
2、免疫治疗患者细胞因子风暴相关指标数据分析
对70例免疫治疗患者及35例健康志愿者的细胞因子风暴相关指标进行比较和统计学分析,结果显示70例患者中有42例患者1周后出现发病症状,细胞因子风暴相关细胞因子较健康对照组以及另外28例未出现发病症状的患者有显著差异(P<0.05),表达水平显著升高,如图1所示。
3、细胞因子风暴相关因子诊断效果评价
通过4项指标的联合检测,绘制ROC曲线,可使细胞因子风暴诊断的灵敏度达到92%,特异性达到100%,如图2所示。
上述实验结果显示,通过检测血清中细胞因子风暴相关的4个指标的变化,并且对4个指标进行联合分析可以判断细胞因子风暴发生的风险,为针对性的治疗提供依据。可以防止细胞因子风暴的进一步恶化,改善患者预后,对临床应用有重要意义。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种细胞因子风暴综合征诊断试剂盒,所述试剂盒包括4种炎症因子TNF-α、IL-6、PGE2和PAF的生物素标记检测抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,所述试剂盒为固相芯片、液相芯片或ELISA试剂盒。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,所述试剂盒可以定量检测血清种4种炎症因子TNF-α、IL-6、PGE2和PAF的含量。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,所述试剂盒不包括除了上述4种炎症因子之外的其它炎症因子的检测抗体。
5.一种细胞因子风暴综合征诊断标志物,所述标志物包括4种炎症因子TNF-α、IL-6、PGE2和PAF。
6.根据权利要求5所述的诊断标志物,所述诊断标志物不包括其它炎症因子。
7.权利要求1-4任意一项所述的试剂盒或权利要求5或6所述的诊断标志物的应用,所述试剂盒或标志物用于制备诊断细胞因子风暴综合征诊断试剂盒中的应用。
8.权利要求1-4任意一项所述的试剂盒或权利要求5或6所述的诊断标志物的应用,所述试剂盒或标志物用于制备预测细胞因子风暴综合征诊断试剂盒中的应用。
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