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CN116018954B - 一种饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法 - Google Patents

一种饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法 Download PDF

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CN116018954B CN202211281389.2A CN202211281389A CN116018954B CN 116018954 B CN116018954 B CN 116018954B CN 202211281389 A CN202211281389 A CN 202211281389A CN 116018954 B CN116018954 B CN 116018954B
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Abstract

本发明属于植物‑微生物交叉技术领域，具体涉及一种饲草高粱‑巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法；所述方法包括如下步骤：在母本柱头抽出2~3 d时，用巨大芽孢杆菌菌液喷雾于柱头，再用父本花药抽出后2~5 d的花粉授粉，收获成熟种子，即可。本发明还保护一种快速鉴定巨大芽孢杆菌BM18‑2的CAPS标记，主要包括针对SNP位点设计的引物对及内切酶BspT104 I，所述引物对的上游引物和下游引物分别如SEQ ID No：1~2所示。本发明提供了首个含内生巨大芽孢杆菌饲草高粱良种繁育方法，生产的种子能显著提高盐含量≤8‰土壤中生长的植株生物量、粗蛋白、可溶性糖含量和粗饲料分级指数GI；本发明的鉴定巨大芽孢杆菌BM18‑2的CAPS标记能够实现巨大芽孢杆菌BM18‑2的快速定性鉴定。

Description

一种饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法
技术领域
本发明具体涉及一种饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法，属于植物-微生物交叉技术领域。
背景技术
高粱属牧草因苗期生长快、饲用品质好，是国内外广泛种植的暖季型禾本科牧草，1987-2020年，我国通过国家草品种审定的高粱属苏丹草、高粱和高粱－苏丹草杂交种、苏丹草-拟高粱杂交种共28个，其中具有耐盐碱特性的品种12个，耐盐性强的3个品种，分别为：“天农2号”高粱-苏丹草杂交种、“天农青饲1号”高粱-苏丹草杂交种和“宁农”苏丹草，均在盐(NaCl)含量≤4‰的土壤中生长良好，但是总体而言，耐盐碱特性品种相对较少，繁育方法也有待改进。
已有的研究表明，耐盐性是数量性状，受多基因控制，且与植物的形态适应和生化适应有关，因而通过常规育种和基因转化途径获得耐盐植物材料是非常困难的。近年来，植物育种思维发生了根本改变，把“植物作为一种共生功能体，包含寄主和微生物群系的生态和进化单元”的育种策略，已成为国内外研究前沿(Vandenkoornhuyse,P.et al.Theimportance of the microbiome of the plant holobiont，New Phytologist，2015，206(4)，1196–1206；Zhong Wei，Alexandre Jousset.Plant Breeding Goes Microbia，Trendin Plant Scienc，2017，22(7)：555-558)。内生真菌共生体一直是国内外研究的热点，但内生细菌共生体育种的正式报道极少，仅见奥地利Birgit Mitter团队把特定的内生菌通过花导入，获得了含内生细菌P.phytofirmansPsJN(伯克霍尔德菌)的辣椒、大豆、玉米、小麦共生体F1代种子(Mitter B et al.A new approach to modify plant microbiomes andtraits by introducing beneficial bacteria at flowering into progenyseeds.Frontiers in Microbilogy，2017，8：11)，这些植物均属于粮食作物，与高粱属杂交种差异较大。
巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)是芽胞杆菌属的一种重要的细菌，自然界广泛存在，对人畜和环境友好。已有研究表明，巨大芽孢杆菌作为微生物菌肥，通过种植前浸根、种植后灌根或叶面喷雾方式，内生于植株的巨大芽孢杆菌可通过固氮、溶磷、产生生长激素等方式促进植物生长，提高寄主植物对盐胁迫的耐受性(胡小加，江木兰，巨大芽胞杆菌(A6)在红黄壤中对油菜的促生作用.中国油料作物学报，2003(04):107-108；罗欢，伍辉军，谢永丽，等，巨大芽胞杆菌CJLC2菌株对盐胁迫下番茄生长及耐盐生理生化指标的影响.植物保护学报，2013，40(05)：431-436；Xia Li,XiaoyanGeng，RongrongXie,et al.Theendophytic bacteria isolated from elephant grass(Pennisetum purpureumSchumach)promote plant growth and enhance salt tolerance of HybridPennisetum.Biotechnology for biofuels,2016,9:190:1-12.)。但是，现有巨大芽孢杆菌外施效果受环境影响大、对施用人员规范操作要求较高。2018年，钟小仙等公开了一株富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌BM18-2(专利号：ZL201810143961.6)。
有关禾本科牧草内生巨大芽孢杆菌共生体良种繁育及其在盐土改良中的应用，国内外均未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法，并对不同盐胁迫下菌草共生体的草产量和饲用品质进行评价，以期为盐土改良提供新的策略；
本发明的第二个目的是提供前文所述的饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法得到的种子；
本发明的第三个目的是提供前文所述的饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法在盐土改良中的应用；
本发明的第四个目的是提供巨大芽孢杆菌，或含有巨大芽孢杆菌的菌剂，或含有巨大芽孢杆菌的培养物，或含有巨大芽孢杆菌的微生物肥料，在内生细菌共生体育种中的应用；
本发明的第五个目的是提供一种快速鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2的CAPS标记。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明保护一种饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法，包括如下步骤：在母本柱头抽出2～3d时，用含有巨大芽孢杆菌的菌液喷雾于柱头，再用父本花药抽出后2～5d的花粉授粉，收获成熟种子，即可。
在本申请的一些优选技术方案中，所述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌BM18-2。
所述巨大芽孢杆菌BM18-2，专利号：ZL201810143961.6，2017年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017679。
优选的，本发明使用的巨大芽孢杆菌BM18-2为含有巨大芽孢杆菌BM18-2的产品，有效活菌数≥2.0亿/mL，为委托扬州绿源生物化工有限公司生产微生物肥料产品。
其中，巨大芽孢杆菌BM18-2使用时，将有效活菌数≥2.0亿/mL的巨大芽孢杆菌BM18-2菌液产品稀释300-1000倍喷雾于母本柱头上。
在本申请的一些优选技术方案中，所述母本为苏丹草-拟高粱杂交种。
优选的，所述母本为四倍体苏丹草-拟高粱杂交种SS2010-2。
在本申请的一些优选技术方案中，所述父本为甜高粱。
优选的，所述父本为甜高粱SS2015。
本发明提供了首个含内生巨大芽孢杆菌的多年生饲草高粱良种繁育方法，生产的种子能显著提高盐含量≦8‰土壤中的生物量、粗蛋白、可溶性糖含量和粗饲料分级指数GI。
第二方面，本发明还保护前文所述的饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法得到的种子。
第三方面，本发明还保护前文所述的饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育方法，前文所述的种子，在盐土改良中的应用。
本发明的繁育方法得到的种子，不但能在盐(NaCl)含量≤4‰的土壤中生长良好，在盐含量≦8‰土壤中也生长良好，其中生物量、粗蛋白、可溶性糖含量和粗饲料分级指数GI均显著高于对照组，为盐土改良提供了新的思路。
第四方面，本发明还保护巨大芽孢杆菌，或含有巨大芽孢杆菌的菌剂，或含有巨大芽孢杆菌的培养物，或含有巨大芽孢杆菌的微生物肥料，在内生细菌共生体育种中的应用。
优选的，所述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌BM18-2；
优选的，内生细菌共生体育种为饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育。
具体的，本发明保护巨大芽孢杆菌BM18-2，或含有巨大芽孢杆菌BM18-2的菌剂，或含有巨大芽孢杆菌BM18-2的培养物，或含有巨大芽孢杆菌BM18-2的微生物肥料，在饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育中的应用。
第五方面，本发明还保护一种快速鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2的CAPS标记，主要包括针对SNP位点设计的引物对及内切酶BspT104 I；
所述引物对的上游引物和下游引物如下：
上游引物F：GTATTACTTGAAGGCAATCGTCCAGC，如SEQ ID No：1所示；
下游引物R：AGCGTCTTCAGCAATGATGACTTCC，如SEQ ID No：2所示。
PCR扩增时，扩增产物含有限制性内切酶BspT104 I的TTCGAA酶切位点。
本发明还保护前文所述的CAPS标记，在如下(A1)-(A4)中任一所述的应用；
(A1)鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2；
(A2)制备检测巨大芽孢杆菌BM18-2的试剂盒中；
(A3)确定待测样品中是否含有巨大芽孢杆菌BM18-2；
(A4)辅助内生细菌共生体育种。
所述内生细菌共生体育种，为作物-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育；
所述作物如农作物，牧草等；所述农作物，如玉米，大豆，水稻等；所述牧草，如饲草高粱；所述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌BM18-2。
具体的，在研究巨大芽孢杆菌BM18-2，或含有巨大芽孢杆菌BM18-2的菌剂，或含有巨大芽孢杆菌BM18-2的培养物，或含有巨大芽孢杆菌BM18-2的微生物肥料，在饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育中的应用时，需要鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2，可以使用前文所述的CAPS标记。
作为本申请的优选技术方案，鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2，包括如下具体步骤：
(1)利用前文所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)用前文所述的限制性内切酶BspT104 I对PCR扩增产物进行酶切获得酶切产物；
(3)电泳所述酶切产物，根据电泳获得的条带类型，判断是否含有巨大芽孢杆菌BM18-2。
本发明还保护一种快速鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2的试剂盒，其含有前文所述的CAPS标记。
有益效果
本发明提供了首个含内生巨大芽孢杆菌的多年生饲草高粱良种繁育方法，生产的种子能显著提高盐含量≦8‰土壤中的生物量、粗蛋白、可溶性糖含量和粗饲料分级指数GI。
本发明提供了一种快速鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2的CAPS标记，该标记的酶切位点经NCBI数据库查询仅存在于巨大芽孢杆菌菌株BM18-2中。
附图说明
图1为多年生饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体大田良种繁育过程图；其中，A为四倍体不育系苏丹草-拟高粱杂交种SS2010-2(母本)；B为二倍体甜高粱SS2015(父本)；
图2为多年生饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体种子；
图3为巨大芽孢杆菌BM18-2的3％琼脂糖电泳图；
其中，1-5泳道为特异引物PCR产物未加限制性内切酶酶切，7-11泳道为特异引物PCR产物加入限制性内切酶BspT104I酶切后的产物，6泳道为DL1500Ladder(TAKARA)；其中，1和7泳道DNA为菌株BM18，2和8泳道DNA为菌株BM18-2，3和9泳道DNA为大肠杆菌，4和10泳道DNA为土壤微生物，5和11泳道为空白对照；
如图3所示，未酶切DNA样品的PCR产物中，菌株BM18和BM18-2均有521bp特征带，但其他菌属DNA样品中无扩增；限制性内切酶BspT104I酶切后的产物中，仅菌株BM18-2有418bp的特征带，BM18特征带仍为521bp。
图4为盐(8g/kg NaCl)胁迫对饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体及其对照生长的影响；其中，1～3：饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体；4～6：饲草高粱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1
(1)饲草高粱亲本选择
四倍体不育系苏丹草-拟高粱杂交种SS2010-2(母本)：以二倍体一年生苏丹草2098与多年生拟高粱杂交F1代秋水仙素诱导体细胞染色体加倍获得(公知公用，崔莉莉，四倍体苏丹草新种质组织结构特性和能源利用潜力初探，南京农业大学硕士学位论文，2013年)，多年生；甜高粱SS2015(父本):2015年由江苏省农业科学院畜牧研究所顾洪如研究员从江苏省如东县新店镇采集的农家种单穗，编号为SS2015，2016-2019年将采集的单穗种子进行大田扩繁，一年生。
(2)巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2菌液生产
菌株BM18-2为授权专利菌株(钟小仙；钱晨；刘智微；吴娟子；张建丽；潘玉梅，一株富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌BM18-2及其应用，专利号：ZL201810143961.6)，2017年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017679，委托扬州绿源生物化工有限公司生产微生物肥料产品，巨大芽孢杆菌BM18-2的有效活菌数≧2.0亿/ml。
(3)多年生饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育
2020年10月上旬，盆栽生长的母本多年生四倍体苏丹草-拟高粱杂交种SS2010-2柱头抽出2-3d时，用有效活菌数≧2.0亿/ml的巨大芽孢杆菌BM18-2菌液产品稀释300-1000倍喷雾于柱头，用父本一年生甜高粱SS2015花药抽出后2-5d的花粉授粉，2020年11月上中旬，收获成熟种子。
(4)构建巨大芽孢杆菌BM18-2的精准鉴定方法
BM18-2是由野生型BM18在高镉胁迫培养基中诱变分离而得，通过基因组测序比对发现，该菌株在编码基因RNA聚合酶存在Q→E的SNP有义突变。依据该SNP位点设计并筛选出高特异性PCR扩增引物F：GTATTACTTGAAGGCAATCGTCCAGC，如SEQ ID No：1所示；R：AGCGTCTTCAGCAATGATGACTTCC，如SEQ ID No：2所示，该引物在巨大芽孢杆菌野生型BM18和突变株BM18-2中均有521bp的片段扩增，在其他菌属细菌中均无扩增。因以上C→G的DNA单核苷酸突变，造成仅BM18-2的PCR扩增片段中含有可被限制性内切酶BspT104 I酶切的TTCGAA识别位点，而且野生型BM18引物PCR扩增片段中的TTCCAA不能被相应的识别酶切。最终仅菌株BM18-2引物扩增产物酶切后存在418bp的酶切片段，因此可精准鉴定BM18-2菌株。
(5)多年生饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体种子BM18-2检测
收获(3)良种繁育的种子表面消毒后，无菌条件下单粒研磨，接种于LB培养基、30℃生长箱中培养72～96h，无菌条件下用10μl移液枪头挑取培养皿中的菌斑，混合于18μlPCR反应液中，反应液体系为：2×Rapid Taq Master Mix(P222-AA，诺唯赞)8.6μl、10μm的F引物0.4μl、10μm的R引物0.4μl、ddH2O8.6μl，其中F引物为：GTATTACTTGAAGGCAATCGTCCAGC、R引物为：AGCGTCTTCAGCAATGATGACTTCC，菌液PCR程序为：95℃3min、95℃15sec、60℃15sec、72℃15sec，35个循环后，72℃退火5min；PCR产物酶切反应：将以上PCR产物分为两部分，其中一部分加入内切酶BspT104 I(1225A，TAKARA)，以不加酶的反应体系为对照，37℃反应30min，酶切体系为：菌液PCR产物8μl、10×L Buffer 1μl、BspT104 I内切酶1μl，对照体系为：菌液PCR产物8μl、10×L Buffer 1μl、ddH2O 1μl；酶切产物电泳鉴定：用3％琼脂糖对上酶切产物与对照进行电泳，菌株BM18-2可见418bp特异特征带。
(6)多年生饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体耐盐性评价
2021年，在江苏省农业科学院国家牧草育种创新基地玻璃温室，地处东经118°57ˊ、北纬32°03ˊ，4月2日播种(3)繁育的饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体种子，并同时播种正常繁育的多年生饲草高粱种子为对照，4月28日分别取3-4叶期、生长相对一致的共生体和对照幼苗移栽至塑料盆钵，每钵3株，钵体直径17cm、高20cm，土壤为基质土(主要成分为白泥炭pH＝6.0，土壤结构为中粗)按照重量比与化学纯NaCl混合均匀，试验处理NaCl浓度分别为0、4g/kg、6g/kg、8g/kg，每个处理重复3次，6月15日收获植株地上部分，茎叶分离后，105℃杀青30min后，70℃烘干至恒重称量。取烘干样采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量(CP)、索氏提取法测定粗脂肪含量、Van Soets法测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维含量(ADF)、采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，根据CP、NDF、ADF含量，计算粗饲料分级指数GI(张吉鹍，卢德勋,刘建新,等.粗饲料品质评定指数的研究现状及其进展[J].草业科学,2004，21(9):7.)，GI(Mcal)＝ME(Mcal/kg)×DMI(kg/d)×CP(％DM)/NDF(％DM)，其中ME＝4.2014+0.0236×(ADF/10)+0.1794×(CP/10)，DMI(％DM)＝120/(NDF/10)。
结果表明，与对照饲草高粱相比，相同浓度盐胁迫下饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体的茎、叶干重和植株地上部分总干重均极显著提高，NaCl浓度0、4、6、8g/kg胁迫下，饲草高粱-巨大芽孢菌共生体植株地上部分总干重分别比对照提高7.73％、10.01％、16.34％和18.24％，差异极显著(P＜0.01)。
表1不同浓度NaCl胁迫下饲草高粱-巨大芽孢共生体与对照干物质重差异
注：同列不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，下同。
饲草高粱-巨大芽孢菌共生体植株的粗蛋白、可溶性糖含量均显著高于对照饲草高粱(表2)，其中，NaCl浓度为0、4、6、8g/kg时，共生体粗蛋白含量比对照分别显著提高10.581％、16.17％、10.97％、4.33％，可溶性糖含量分别显著提高17.20％、13.14％、17.90％、13.36％；NaCl浓度为4、6g/kg时，粗脂肪含量分别显著提高9.05％、6.50％。
表2不同浓度NaCl胁迫下饲草高粱-巨大芽孢共生体与对照饲用品质差异
NaCl浓度为0、6、8g/kg时，饲草高粱-巨大芽孢菌共生体植株的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量和体外消化率差异均不显著，NaCl浓度为4g/kg时，共生体中性洗涤纤维含量显著高于对照、酸性洗涤纤维显著低于对照。NaCl浓度为0、4、6、8g/kg时，共生体粗饲料分级指数GI比对照分别提高9.56％、18.04％、15.49％、6.62％，差异显著或极显著(表3)。
表3不同浓度NaCl胁迫下饲草高粱-巨大芽孢共生体与对照饲用品质差异
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (4)

1.巨大芽孢杆菌，或含有巨大芽孢杆菌的菌剂，或含有巨大芽孢杆菌的培养物，或含有巨大芽孢杆菌的微生物肥料，在内生细菌共生体育种中的应用；
所述巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌BM18-2；
所述内生细菌共生体育种为饲草高粱-巨大芽孢杆菌共生体良种繁育。
2. 一种快速鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2的CAPS标记，其特征在于，主要包括针对SNP位点设计的引物对及内切酶BspT104 I；
所述引物对的上游引物和下游引物如下：
上游引物F：GTATTACTTGAAGGCAATCGTCCAGC，如SEQ ID No：1所示；
下游引物R：AGCGTCTTCAGCAATGATGACTTCC，如SEQ ID No：2所示。
3.权利要求2所述的CAPS标记，在如下（A1)-（A4）中任一的应用；
（A1）鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2；
（A2）制备检测巨大芽孢杆菌BM18-2的试剂盒中；
（A3）确定待测样品中是否含有巨大芽孢杆菌BM18-2；
（A4）辅助内生细菌共生体育种。
4.一种快速鉴定巨大芽孢杆菌BM18-2的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的CAPS标记。
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