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CN115998894A - 一种硫属元素杂环化合物和胰岛素组装形成的团聚体及其制备方法和胰岛素口服制剂 - Google Patents

一种硫属元素杂环化合物和胰岛素组装形成的团聚体及其制备方法和胰岛素口服制剂 Download PDF

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CN115998894A CN202111228794.3A CN202111228794A CN115998894A CN 115998894 A CN115998894 A CN 115998894A CN 202111228794 A CN202111228794 A CN 202111228794A CN 115998894 A CN115998894 A CN 115998894A
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chalcogen
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刘正
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Fuzhou University
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Abstract

本发明提供了一种团聚体及其制备方法和胰岛素口服制剂。具体提供了一种团聚体，为硫属元素杂环化合物与胰岛素组装形成的团聚体。所述团聚体可以进一步制备得到胰岛素口服制剂。该口服制剂可以用于降低哺乳动物的血糖水平，作为糖尿病治疗方案的一部分。通过该方法制备的胰岛素口服制剂中的硫属元素杂环化合物可有效保护胰岛素克服口服摄入途径的三大生理屏障，在胃肠道环境中稳定，通过表面的聚多硫属元素分子键与肠液中肠黏蛋白以及上皮细胞膜内、外侧蛋白的巯基发生动态化学交换反应，从肠上皮细胞进入循环系统，起到降血糖的作用。该胰岛素口服制剂通过口服施用时，生物利用度高，在哺乳动物体内具有良好的降血糖效果，可用于糖尿病的治疗。

Description

一种硫属元素杂环化合物和胰岛素组装形成的团聚体及其制 备方法和胰岛素口服制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种硫属元素杂环化合物和胰岛素组装形成的团聚体及其制备方法和胰岛素口服制剂。
背景技术
糖尿病是一种严重威胁人类生命与健康的普遍性慢性疾病。由国际糖尿病联盟发布的最新版全球糖尿病地图(第9版)数据显示，至2019年全球已有4.63亿人患有糖尿病。随着人们物质生活水平的提高、饮食习惯与生活方式的改变，糖尿病患者数量持续逐年增加，预计到2045年糖尿病人数将跃升至7亿人。临床上，糖尿病以高血糖为主要特点，持续的高血糖与长期代谢的紊乱会导致各种并发症，如心血管疾病、外周血管疾病、神经系统疾病、视网膜病、肾病及肾衰竭、溃疡和截肢、代谢并发症、口腔并发症、抑郁等，最终导致患者丧失劳动力，甚至是致死致残。
胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，它用于糖尿病的治疗已有百年历史。胰岛素不仅是治疗胰岛素依赖性I型糖尿病的首选药物，也是II型糖尿病中晚期治疗的辅助药物；并且临床研究数据表明，对于新诊断的II型糖尿病患者早期采取胰岛素强化治疗，可以使约半数患者得到2年的临床缓解期；表明胰岛素在I型和II型糖尿病治疗中均非常重要。自问世至今，胰岛素治疗糖尿病的给药方式以皮下或静脉注射为主，患者每天需要注射2～4次，甚至更多次。对于需要长期用药的糖尿病患者，频繁地注射胰岛素不仅会给病人带来极大的痛苦与不便，而且注射的剂量不易掌控，极易导致大范围血糖波动；长期注射还会导致患者依从性差、注射部位组织坏死、微生物感染、胰岛素血症、神经损伤等许多不良反应；此外，注射方式摄入的胰岛素与胰腺分泌胰岛素的生理输送途径不一致，肝脏不能得到所必需的胰岛素浓度以控制血糖，会导致高胰岛素血症的发生。因此，研究和开发使用方便、安全可靠的非注射给药的胰岛素制剂，对于改善糖尿病患者的健康和生活质量具有十分重要的临床意义，也是国内外医药界普遍关注的重大问题。
在不同的非注射给药方式中，口服给药途径是最为传统、方便、易于被病人接受的一种给药方式；相比注射制剂，口服给药制剂要求低、存储稳定、携带和使用方便、成本相对较低；此外，口服途径摄入胰岛素，可以在药代动力学上更好地模仿胰腺分泌的胰岛素，因为它们都通过门静脉进入肝脏后输送到外周循环。但是，胰岛素属于多肽类药物，通过口服摄入途径进入循环系统而发挥降血糖作用的胰岛素口服制剂需要克服三大生理屏障：(1)胃部强酸性环境和胃肠道中消化酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、肽酶等)易使胰岛素发生变性和降解，丧失生物活性；(2)肠胃黏液层中黏性糖蛋白通过二硫键或非共价作用形成致密网络结构，排斥阻碍胰岛素制剂的扩散与渗透，使其难以接近肠上皮细胞，限制了胰岛素的吸收；(3)相比小分子药物，胰岛素分子量较大，被肠上皮细胞吸收的效率低，肠上皮细胞间的胞间连接蛋白以及细胞内的溶酶体降解作用会阻碍胰岛素通过旁细胞途径(paracellular)或跨细胞途径(transcellular)进入循环系统，制约胰岛素的生物利用度。
为了克服这些屏障，提高胰岛素通过口服途径摄入的生物利用度，目前已报道了使用不同的包埋方法制备胰岛素口服制剂，但是仍存在一系列问题。首先，目前报道的胰岛素口服制剂的制备方法都十分复杂，需要大量的化学合成或物理处理过程进行胰岛素的修饰、包埋剂的制备以及胰岛素的包埋；其次，除了包埋剂和胰岛素，还需要添加吸收促进剂、稳定剂、酶抑制剂、增渗剂、pH调节剂、粘液蛋白溶解剂或黏附剂、细胞渗透肽等添加剂中的一种或几种辅助克服口服摄入途径的三大生理屏障，这些添加剂容易引起胃肠道的正常生理功能的损伤及感染，生物安全问题仍需要大量临床上的系统研究；再次，一种制剂含有多种功能组分，不仅增加胰岛素口服制剂的成本，还导致胰岛素的包埋率降低；这些因素限制了胰岛素口服制剂向临床的推广使用。因此，亟需发展一种简单有效而且能够同时克服口服途径三大生理屏障的胰岛素口服制剂，降低制备成本，改善胰岛素口服摄入的药代学和药效学性质，提高口服胰岛素的生物利用度和降血糖效果。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种硫属元素杂环化合物和胰岛素组装形成的团聚体及其制备方法和胰岛素口服制剂，所述胰岛素口服制剂通过口服施用时，具有较高的生物利用度。
本发明提供了一种团聚体，为硫属元素杂环化合物与胰岛素组装形成的团聚体；
所述硫属元素杂环化合物具有式Ⅰ所示结构：
A—L—B 式Ⅰ；
其中，A为含有两个或两个以上相同和/或不同硫属元素原子的杂环基团，所述硫属元素为硫(S)、硒(Se)或碲(Te)；
B为与胰岛素分子相互作用的基团；
L为A、B的连接基团。
本发明中，所述杂环基团A可以是只包含一种硫属元素，也可以是上述三种硫属元素的随机组合。
所述杂环基团A优选为4～100元环。
本发明优选的，所述A具有以下任一结构：
Figure BDA0003315221480000031
本发明中，所述L为官能团A与官能团B之间的连接基团(linker)。
优选的，所述L选自碳-碳键、碳-硼键、碳-氮键、碳-磷键、碳-氧键、碳-硫键、碳-硒键、碳-碲键、金属配位键、硼酯键、二硫键、成环基团、氢键、可切割的化学键、超分子主客体作用或配体-受体识别作用；
上述基团为L与A的键连方式或L与B的键连方式。L与A的键连方式和L与B的键连方式可以相同或不同。
本发明中，所述官能团B与胰岛素分子通过分子间相互作用，驱动式I所示化合物与胰岛素组装成团聚体，所述分子间作用力可以为共价键，也可以为非共价键，也可以为同时存在共价键和非共价键；所述共价键可以为酰胺键、酯键、配位键、点击化学键、醚键、酯酰胺、酰亚胺键、硼酯键、二硫键，碳-碳单键、碳-碳双键、碳-碳三键中的一种或几种；所述非共价键可以为静电作用、范德华力、疏水作用、主客体超分子作用、配体-受体识别作用、盐桥键中的一种或几种。
优选的，所述B选自识别胰岛素的化学/生物分子、DNA互补链、适配体、形成coiledcoils/拉链结构/超结构的多肽、以及以下化学基团中的一种或多种：
Figure BDA0003315221480000041
进一步优选的，所述硫属元素杂环化合物具有式Ⅱ所示结构：
Figure BDA0003315221480000051
其中，X1、X2、X3、X4中的至少两个独立的选自S、Se或Te，其余为C；
R1、R2、R3独立的选自碳原子、酰胺基团或亚氨基；
R4选自羧基、氨基、
Figure BDA0003315221480000052
n1、n2、n3、n4独立的选自1～6的任意整数。
本发明上述结构式中，弯线
Figure BDA0003315221480000053
表示连接位置；单键“—”表示甲基。
环基或芳环基的单键，例如
Figure BDA0003315221480000054
分别表示甲基或乙基可以连接于环基或芳环基的任意位置。
环基或芳环基的取代基，例如
Figure BDA0003315221480000055
分别表示取代基可以连接于环基或芳环基的任意位置。
在本发明的一些具体实施例中，所述硫属元素杂环化合物选自以下结构中的一种或多种：
Figure BDA0003315221480000056
本发明中，所述胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体中，硫属元素杂环化合物可以为一种，也可以为两种及两种以上。
本发明对所述胰岛素的种类并无特殊限定，可以为未经修饰改性的胰岛素、胰岛素类似物和修饰的胰岛素中的一种或多种。
优选的，所述未经修饰改性的胰岛素选自人胰岛素、人重组胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛素、半合成胰岛素和生物合成胰岛素中的一种或多种。
优选的，所述胰岛素类似物选自赖脯胰岛素、赖谷胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、德谷胰岛素中的一种或多种。
优选的，所述修饰的胰岛素选自化学分子修饰、生物分子修饰、基因工程改造的胰岛素中的一种或多种。
本发明中，所述胰岛素的类型包括：胰岛素、餐时胰岛素、超速效胰岛素、速效胰岛素、中效胰岛素、长效胰岛素和预混胰岛素中的一种或多种。
本发明优选的，所述硫属元素杂环化合物与胰岛素的摩尔比为1～200:1。
本发明优选的，所述团聚体的粒径为10～500nm。
本发明中，上述胰岛素与硫属元素杂环化合物的团聚体，在模拟胃、肠液中稳定性高，可避免胰岛素在酸性环境和消化酶环境中的降解及泄露。
本发明提供了上述团聚体的制备方法，包括以下步骤：
S1)将胰岛素溶液与硫属元素杂环化合物溶液混合孵育，经过组装形成团聚体。
具体的，首先将胰岛素溶液与硫属元素杂环化合物溶液混合孵育，进行组装，形成团聚体胶体颗粒；然后除去未参与组装形成团聚体的游离硫属元素杂环化合物和/或胰岛素，得到胰岛素与硫属元素杂环化合物组装团聚体的悬浮液。
所述混合孵育的时间优选为30min。
上述混合孵育的过程可使硫属元素杂环化合物与胰岛素分子通过分子间相互作用，组装成粒径为10～500nm的团聚体胶体颗粒，实现胰岛素的包封，包封效率高达～70％。
本发明对上述除去未参与组装形成团聚体的游离硫属元素杂环化合物和/或胰岛素的方法并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的方法，包括但不限于透析或离心。
本发明公开的制备方法条件温和，方法简单，而且制备的胰岛素口服制剂不需要其他功能的添加剂，成本较低。
上述团聚体形成过程中胰岛素与硫属杂环化合物之间相互作用，使其局部浓度大大提高，杂环基团紧密靠近，并发生开环聚合反应，形成聚多硫属元素分子键，最终硫属元素杂原子化合物可以以单体、短链寡聚物、长链聚合物或三种化合物任意两种及以上的混合物形式存在。
本发明对上述团聚体组装过程中的温度、时间、所用的缓冲溶液、溶剂并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的条件。
本发明提供了上述团聚体在制备降血糖药物中的应用。
本发明中，可以将所述胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体的水性悬浮液，直接对哺乳动物实施口服。
基于此，本发明提供了一种胰岛素口服制剂，包括上述团聚体，和药学上可接受的辅剂。
本发明对所述口服制剂的剂型并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的口服剂型。
本发明可以将所述胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体利用药学上可接受的辅料，制备成肠溶包衣胶囊、散剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂等肠溶制剂经口服施用；优选地，将所述胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体的干粉与药学上可接受肠溶包衣胶囊组合，经口服施用。
本发明对所述辅剂的种类并无特殊限定，本领域技术人员可以根据剂型进行相应的选择。
本发明中，上述胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体，表面的聚多硫属元素分子键可以与胃肠道中黏液蛋白及其他糖蛋白表面的巯基发生动态交换化学反应，促进团聚体在肠粘膜层中的快速渗透；所述的聚多硫属元素分子键，包括多硫键、多硒键、多碲键，可以是一种以上硫属元素形成的混合聚多硫属元素分子键。
本发明中，所述的胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体，不会破坏上皮细胞间紧密连接蛋白，团聚体表面的多硫属元素可以与上皮细胞膜表面的巯基发生动态交换化学反应，以非内吞的转细胞(transcellular)途径进入细胞质，避免被溶酶体降解；随后通过与上皮细胞膜内侧的巯基发生动态交换化学反应，从肠上皮细胞进入循环系统；该过程促进胰岛素被上皮细胞吸收，发挥较高的生物利用度和较快的降血糖效果。
本发明中，所述的胰岛素与硫属元素杂环化合物组装团聚体，进入血液循环后，经门静脉循环至肝窦部位，被肝窦处的谷胱甘肽解聚后释放出胰岛素，起到降血糖的作用。所述的解聚为谷胱甘肽与聚多硫属元素分子键发生交换反应，导致团聚体中硫属元素杂原子化合物的短链寡聚物或长链聚合物，降解成单体或更短链的寡聚物，而不能形成稳定的团聚体。
本发明提供了一种降低哺乳动物血糖水平的方法，通过给哺乳动物口服施用上述胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体的悬浮液，或给哺乳动物口服施用上述胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体的干粉(如冻干粉)与药学上可接受的辅料的组合物之后，哺乳动物血糖浓度降低。
本发明中，施用所述的口服胰岛素制剂的施用对象为哺乳动物，其中所述的哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、羊、猪、牛、马、猴、人；优选地，所述施用对象为需要降低血糖的人，如患有糖尿病的病人。
本发明中，所述哺乳动物中血糖降低，是在对哺乳动物口服施用治疗有效量的胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体之后15分钟内，哺乳动物的血糖降低至少7％，优选至少30％。更优选地，对哺乳动物施用该团聚体之后，在15分钟～840分钟的整个期间内，哺乳动物血糖浓度降低至少30％，优选至少45％，更优选至少75％。
本发明中，对所述胰岛素的施用量并无特殊限定。胰岛素的施用量因哺乳动物的种类、哺乳动物的体重、团聚体的组成、所需血糖降低的值、身体状况以及其它因素而异。总之，胰岛素的量可以根据实际需求而变化。
因此，本发明提供了通过口服施用上述的胰岛素口服制剂而在需要降低血糖的病人中治疗糖尿病的方法。
本发明通过口服施用上述口服制剂，可以使需要降低血糖的人，如患有糖尿病的病人，血糖降低达到治疗效果。
在本发明的一些具体实施例中，所述胰岛素的治疗有效量是10U～1000U的人重组胰岛素/毫升团聚体悬浮液。
在本发明的一些具体实施例中，所述胰岛素口服制剂进入门静脉循环所需时间约15分钟或更短时间。
本发明中，所述的糖尿病包括但不限于胰岛素依赖性的耐糖量降低、早期糖尿病、晚期糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、特殊类型糖尿病等。
本发明提供了一种治疗方法，该方法用于治疗糖尿病和降低与长期使用胰岛素有关的全身性高胰岛素血症的发生率。
本发明中，所述胰岛素口服制剂的服用时间可以是但不限于餐前、餐后、夜间、需要降低血糖时。
本发明中，对病人施用上述胰岛素口服制剂的周期，可以根据病情发展状态而定，针对慢性糖尿病患者可以为至少两周或更长时间，对于妊娠糖尿病患者可以在整个孕期或在血糖不稳定的时间内施用，针对需要终身血糖控制的患者可以终身施用。
不应该认为，本发明所用的口服制剂限于上述的优选实施方案。可以将其它基质材料，例如微孔性颗粒，与胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体组合成口服药物，进行口服施用。
本发明中，所述胰岛素口服制剂还包括其他治疗剂；
所述其他治疗剂选自皮下注射型降血糖药物和/或其他口服型降血糖药物。
即本发明所述的胰岛素口服制剂可以与降糖药联合使用，通过联合治疗达到更佳的降血糖疗效；所述的降血糖药可以为皮下注射型，包括但不受限于胰高血糖素样多肽-1、胰高血糖素样多肽-1受体激动药(如艾塞那肽、利拉鲁肽)、葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽；也可以为口服型，包括但不受限于磺脲类药物、格列奈类药物、二甲双胍类、α-糖苷酶抑制药、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶-4等。
本发明中，用于胰岛素或者其它基于蛋白质药物的口服制剂制备的团聚体可以通过任何适宜的方法进行制备。优选地，团聚体通过本文描述的任何实施方案的方法进行制备，优选但非必须。
本发明中，优选将团聚体干粉(如冻干粉)与肠溶包衣胶囊组合作为药物组合物来提供，将所述的组合物中胰岛素的剂量作为定制剂量对哺乳动物进行口服施用。所述采用的口服胶囊的大小，与所施用的哺乳动物的种类有关，因为不同哺乳动物的咽部大小不一样。
本发明的另一个优选方面，将所述的组合物放置于容器中，优选容器中胰岛素的量被定制为对哺乳动物进行单次或多次口服施用的剂量。该容器可以是符合药品包装材料有关规定的可以容纳口服胶囊的容器，例如泡罩包装、塑料瓶、玻璃瓶和/或其他合适的容器，并附有使用说明书。
应该提到的是，所述的口服施用的组合物也可以为团聚体干粉与药学上可接受的辅料一起压制成药片，经口服施用。
本发明提供了一种定制剂量的胰岛素口服制剂，该口服制剂包含上述胰岛素与硫属元素杂环化合物组装形成的团聚体，其中，将所述团聚体中胰岛素的剂量定制为对人进行口服施用的剂量。
在本发明的一些具体实施例中，上述口服制剂包含胰岛素与硫属元素杂环化合物组装形成的团聚体的水性悬浮液，其中胰岛素的量为治疗有效量。
在本发明的一些具体实施例中，上述口服制剂包含治疗有效量的胰岛素与硫属元素杂环化合物组装形成的团聚体、药学上可接受的包衣和胶囊。
在本发明的一些具体实施例中，上述口服制剂可以是由治疗有效量的胰岛素与硫属元素杂环化合物组装形成的团聚体和药学上可接受的辅料制备成的药片。
在本发明的一些具体实施例中，上述口服制剂装载于容器中，其胰岛素的量被定制为对人单次或多次口服施用的剂量。
图1为本发明中硫属元素杂环化合物制备胰岛素口服制剂的方法过程以及通过装载肠溶包衣胶囊之后口服施用用于降血糖的示意图。如图1所示，本发明中，以人重组胰岛素为例，与硫属元素杂环化合物自组装形成团聚体，经肠溶包衣胶囊口服实施进入胃肠道之后，在小肠部位，通过硫醇交换途径直接进入细胞质，随后再次通过硫醇交换途径从肠上皮细胞进入血液，经门静脉循环到肝窦，团聚体中多硫键被肝窦处和血液中的谷胱甘肽切割后释放出胰岛素，起到降血糖的作用。
与现有技术相比，本发明提供了一种团聚体，为硫属元素杂环化合物与胰岛素组装形成的团聚体。所述团聚体可以进一步制备得到胰岛素口服制剂。所述胰岛素口服制剂具有以下有益效果：
(1)本发明提供的胰岛素口服制剂，制备方法是利用胰岛素与硫属元素杂环化合物组装形成团聚体，其中式I所示硫属元素杂环化合物中B基团与胰岛素通过分子间作用，使式I所示硫属元素杂环化合物紧密接近而使其局部浓度提高，利于化合物中A基团发生开环聚合，使化合物以单体、短链寡聚物、长链聚合物或三种化合物任意两种及以上的混合物形式存在，最终与胰岛素形成稳定的组装团聚体胶体颗粒，实现胰岛素的包封。该制备过程条件温和，方法简单，不需要其他功能的添加剂，生产成本低。
(2)本发明的胰岛素口服制剂，是由胰岛素与硫属元素杂环化合物自组装形成的团聚体，与脂质体包载胰岛素、两亲性胰岛素胶束及其他包埋方法制得的胰岛素口服制剂相比，所述的胰岛素与硫属元素杂环化合物组装团聚体在酸性条件下和模拟胃肠液中具有更好的稳定性，可避免胃部强酸性和胃肠道消化酶的降解。
(3)本发明的胰岛素口服制剂进入哺乳动物的胃肠道后，团聚体表面的聚多硫属元素分子键可以与胃肠道中黏液蛋白及其他糖蛋白表面的巯基发生动态交换化学反应，促进团聚体在肠粘膜层中的快速渗透；所述胰岛素与硫属元素杂环化合物组装团聚体不会破坏上皮细胞间紧密连接蛋白，表面的聚多硫属元素分子键可以与上皮细胞膜表面的巯基发生动态交换化学反应，以非内吞的转细胞途径进入细胞质，避免被溶酶体的降解；随后通过与上皮细胞膜内侧的巯基发生动态交换化学反应，从肠上皮细胞进入循环系统；经门静脉循环至肝窦部位，被肝窦处的谷胱甘肽解聚后释放出胰岛素；该过程促进胰岛素被上皮细胞的吸收，有效模仿胰腺分泌胰岛素的生理输送途径，发挥较高的生物利用度，较快和较长的降血糖效果，可用于糖尿病的治疗。
(4)本发明的胰岛素与硫属元素杂环化合物自组装形成的团聚体可以与不同的药学上可接受的辅料和成型技术灵活结合，制备成肠溶包衣胶囊、散剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂等不同形式的口服制剂，方便不同服药习惯的病人使用。
因此，本发明的硫属元素杂环化合物制备胰岛素口服制剂能够更有效地用于糖尿病的治疗。
附图说明
图1为本发明中硫属元素杂环化合物制备胰岛素口服制剂的方法过程以及通过装载肠溶包衣胶囊之后口服施用用于降血糖的示意图；
图2为硫属元素杂环化合物1的核磁共振波谱；
图3为胰岛素与硫属元素杂环化合物1组装形成团聚体1的透射电子显微镜图片；标尺：100nm；
图4为(a)胰岛素与硫属元素杂环化合物1组装形成团聚体1在模拟胃肠液及含7mM谷胱甘肽缓冲液中的胰岛素释放动力学曲线；(b)从团聚体1中释放的胰岛素的圆二色谱曲线；
图5为(a)胰岛素与硫属元素杂环化合物1组装形成团聚体1在外肠道模型中跨细胞转运胰岛素的透过效率与时间的关系曲线；(b)外肠道模型中所用单细胞层在与团聚体1、游离胰岛素、癸酸钠之后跨上皮电阻的变化与时间的关系曲线；
图6为糖尿病模型小鼠口服施用胰岛素与硫属元素杂环化合物1组装形成团聚体1混悬液、游离胰岛素溶液、生理盐水和皮下注射胰岛素之后，血糖水平随时间变化的曲线；
图7为糖尿病模型小鼠口服施用装载胰岛素与硫属元素杂环化合物1组装形成团聚体1冻干粉的肠溶包衣胶囊、装载游离胰岛素冻干粉的肠溶包衣胶囊和皮下注射胰岛素之后，血糖水平随时间变化的曲线；
图8为(a)糖尿病模型猪口服施用装载胰岛素与硫属元素杂环化合物1组装形成团聚体1冻干粉的肠溶包衣胶囊之后；(b)装载游离胰岛素冻干粉的肠溶包衣胶囊之后血糖水平随时间变化的曲线。箭头表示在该时间点给糖尿病模型猪喂食；
图9为硫属元素杂环化合物4的核磁共振波谱；
图10为胰岛素与硫属元素杂环化合物4组装形成团聚体2的透射电子显微镜图片；标尺：100nm；
图11为糖尿病模型小鼠口服施用胰岛素与硫属元素杂环化合物4组装形成团聚体2混悬液、游离胰岛素溶液、生理盐水和皮下注射胰岛素之后，血糖水平随时间变化的曲线；
图12为胰岛素与硫属元素杂环化合物10组装形成团聚体3的透射电子显微镜图片；标尺：100nm；
图13为糖尿病模型小鼠口服施用胰岛素与硫属元素杂环化合物10组装形成团聚体3混悬液、游离胰岛素溶液、生理盐水和皮下注射胰岛素之后，血糖水平随时间变化的曲线。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的硫属元素杂环化合物和胰岛素组装形成的进行详细描述。
以下具体实施方式中涉及的实验用品及相关验证方法如下：
(1)化学与生物试剂：实施例中化学合成硫属元素杂环化合物1所涉及的反应试剂与有机溶剂均为市售品，由市场购得。超纯水由Milli-Q水净化系统制备(18.2MΩ)。链脲佐菌素STZ购自上海阿拉丁生化科技公司。人重组胰岛素购自上海源培生物科技股份有限公司。肠黏蛋白(来源于猪胃，typeⅢ)购自西格玛奥德里奇公司。Transwell膜嵌套小室购自康宁公司。小鼠口服胶囊和猪口服胶囊购自美国Torpac公司。肠溶包衣尤特奇L30 D-55购自上海昌为医药辅料公司。
(2)细胞系和细胞培养：人结肠癌细胞Caco-2购于中国科学院上海细胞库。Caco-2细胞培养于MEM培养基(Corning)添加终浓度20％胎牛血清(Hyclone)和终浓度100IU/mL青霉素-链霉素，在37℃含5％CO2的气氛中进行培养。
(3)哺乳动物：C57BL/6J小鼠，巴马小型猪，购于吴氏实验动物公司。
下述实施例中提及到的胰岛素为重组胰岛素，团聚体中人重组胰岛素与化合物的比值均为物质的量比。
实施例1
实施例1中采用结构式如下所述的化合物1，
Figure BDA0003315221480000131
所述化合物1的合成步骤如下：
Figure BDA0003315221480000132
首先将化合物2和N,N'-羰基二咪唑溶于二氯甲烷溶液，然后滴加到放置于冰水浴中的含乙二胺的二氯甲烷溶液中，搅拌40分钟，再在室温搅拌30分钟；将反应后的溶液用盐水洗涤，有机相部分用无水硫酸钠除水干燥，然后进行减压浓缩，得到黄色油状物，得化合物3。将化合物3溶于二氯甲烷，加入1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，室温搅拌4小时，减压蒸馏除去溶剂，并将残余物溶于甲醇，再加入乙醚诱导沉淀，收集固体，并用乙醚洗涤，得到浅黄色固体，即为本实验中所述的化合物1。
产物结构经核磁共振表征，结果如图2所示。
利用硫属元素杂环化合物1制备胰岛素口服制剂的方法与表征：(1)将重组人胰岛素与硫属元素杂环化合物1按照1:50的物质的量比，在20mM Tris-HCl，pH 7.0缓冲液中混合孵育30分钟；(2)将第一步所得悬浮液进行透析或离心，除去未反应的游离胰岛素、游离的化合物1及游离的寡聚物，得到胰岛素与硫属元素杂环化合物1的组装团聚体。虽然不希望受到特定的理论限制，但是基于实验研究，本发明人认为，在该方法中，化合物1的带正电的胍基基团与胰岛素的羧基基团之间静电或/和盐桥作用，使化合物1紧密接近，增加化合物1的局部有效浓度，进而利于硫属元素杂环官能团发生开环聚合形成寡聚物，同时与胰岛素自组装形成团聚体，实现胰岛素的包封。
如图3所示，本实施例中制得的团聚体在透射电子显微镜下观察到的粒径大小平均为～50nm，胰岛素的包封效率达～70％。
胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚在不同条件下胰岛素释放动力学的研究：
(1)将标记有FITC的团聚体分散于模拟胃液、模拟肠液和模拟肝窦处谷胱甘肽浓度为7mM的生理缓冲溶液中，并放置于微型透析装置的透析杯中，在微型透析装置的容纳管中装有等渗的溶液。(2)在指定的时间点，从透析杯外取出50μL溶液，并向微型透析装置中补充等量的溶液。(3)在50μL溶液稀释至200μL，用荧光分光光度计测量溶液的荧光强度和标准曲线，测定每个时间点胰岛素的释放量。
如图4a所示，团聚体在模拟肠液中孵育12小时期间，几乎没有胰岛素从团聚体中释放出来；在模拟胃液中有缓慢、少量的释放；在含7mM谷胱甘肽的生理缓冲溶液中，胰岛素可以快速释放。此外，如图4b所示，圆二色谱表征发现胰岛素释放后保持完整的二级结构，这是胰岛素生物活性保持的标志之一。模拟胃液和模拟肠液常用作为模型研究口服制剂在口服施用后的稳定性，此实验结果表明本实施例中获得的团聚体可以在胃肠道环境中保持稳定。
胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体在体外肠道模型中跨细胞转运情况和上皮细胞层完整性：
(1)将Caco-2细胞接种到24孔Transwell培养小室里，培养21天，用Millicell电阻仪检测细胞单层的跨上皮电阻(TEER)，大于300Ω·cm2，说明Caco-2细胞间形成紧密连接，体外肠上皮细胞单层模型构建成功。(2)在Transwell上室中加入20μg/mL团聚体，每隔1小时，取Transwell下室液体测胰岛素浓度，并测TEER，连续监测12小时。
实验结果：如图5a所示，人重组胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体跨细胞转运胰岛素的效率为～43％，但是对照实验中使用游离人重组胰岛素几乎没有跨上皮细胞运输。
如图5b所示，实验发现团聚体没有引起TEER的显著变化，说明团聚体跨细胞转运不会破坏细胞间的紧密连接，不走细胞旁路途径；为了更好的说明上皮细胞层完整性，在对照实验中加入促渗剂癸酸钠，发现TEER急剧降低，说明上皮细胞层完整性被破坏。
给糖尿病模型小鼠口服施用胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体悬浮液后体内血糖变化的研究:
(1)对6-8周龄的C57BL/6J小鼠连续五天腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，诱导其胰岛B细胞损伤，距首次注射后第17天，测小鼠血糖浓度，高于300mg/dL认为糖尿病小鼠模型构建成功。(2)将上述中所得团聚体悬浮液，给糖尿病模型小鼠口服施用80U/kg剂量的胰岛素之后，在不同的时间点，从小鼠尾静脉取血，监测血糖变化情况；作为对照1实验，给糖尿病模型小鼠口服施用等剂量的游离胰岛素；作为对照2实验，给糖尿病模型小鼠口服施用等体积的生理盐水；作为对照3实验，给糖尿病模型小鼠皮下注射5U/kg胰岛素。
实验结果：如图6所示，口服施用团聚体之后，糖尿病模型小鼠在15分钟内表现出显著的血糖降低，所述的显著降低血糖为约20％，60分钟后血糖降低约30％；在15分钟～600分钟的整个期间内，糖尿病模型小鼠血糖浓度降低66％。对照实验1和2中，施用游离胰岛素或生理盐水的糖尿病模型小鼠，血糖值基本没有降低。对照实验3中，糖尿病模型小鼠皮下注射胰岛素15分钟之后，表现出显著的血糖降低，但是维持血糖降低时间比较短，仅在15分钟～180分钟的期间内，表现出30％～50％的降低。
以上结果表明，在团聚体悬浮液进入胃肠道之后，胰岛素被其表面的硫属元素杂环化合物包埋之后，可以有效地避免肠胃环境中强酸性和消化酶的破坏，并且团聚体表面的聚多硫属元素分子键可以与上皮细胞膜表面的巯基发生动态交换化学反应，以非内吞的转细胞途径进入细胞质，避免被溶酶体的降解；随后通过与上皮细胞膜内侧的巯基发生动态交换化学反应，从肠上皮细胞进入循环系统；经门静脉循环至肝窦部位，被肝窦处的谷胱甘肽解聚后释放出胰岛素；该过程促进胰岛素被上皮细胞的吸收，具有较高的生物利用度；经过这些过程，该胰岛素口服制剂发挥较快和较长的降血糖效果。
给糖尿病模型小鼠口服施用肠溶包衣胶囊装载的胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体后体内血糖变化的研究：
(1)将上述所得团聚体做成冻干粉，灌入肠溶包衣胶囊；作为对照实验1，将等剂量的游离胰岛素灌入肠溶包衣胶囊。(2)对上述相同方法构建的糖尿病模型小鼠，口服施用20U/kg剂量的重组胰岛素之后，在不同的时间点，从小鼠尾静脉取血，监测血糖变化情况。作为对照实验2，给糖尿病模型小鼠皮下注射5U/kg胰岛素。
实验结果：如图7所示，口服施用团聚体之后，糖尿病模型小鼠在30分钟内表现出显著的血糖降低，所述的显著降低血糖为约30％，60分钟后血糖降低约45％；在30分钟～600分钟的整个期间内，糖尿病模型小鼠血糖浓度降低约75％。对照实验1中，口服施用肠溶包衣胶囊装载的糖尿病模型小鼠，血糖值基本没有降低。对照实验2中，小鼠在皮下注射胰岛素15分钟后，表现出显著的血糖降低，但是维持血糖降低时间比较短，仅在15分钟～180分钟的期间内，表现出30％～50％的降低。
给糖尿病模型猪口服施用肠溶包衣胶囊装载的胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体后体内血糖变化的研究：
(1)对4月龄的巴马小型猪静脉灌注150mg/kg链脲佐菌素(STZ，使用浓度为75mg/mL)，诱导其胰岛B细胞损伤，距首次注射后第7天，测猪血糖浓度，高于300mg/dL认为糖尿病猪模型构建成功。(2)将上述所得团聚体做成冻干粉，灌入肠溶包衣胶囊；作为对照实验1，将等剂量的游离胰岛素灌入肠溶包衣胶囊。(3)给糖尿病模型猪口服施用20U/kg剂量的组胰岛素之后，在不同的时间点，从猪的颈静脉取血，监测血糖变化情况。(4)在服药后第3小时和第8小时，给予糖尿病模型猪正常进食，15分钟后撤去食盆。
实验结果，如图8所示，糖尿病模型猪在30分钟内表现出显著的血糖降低，所述的显著降低血糖为约7％，60分钟后血糖降低35％；在30分钟～840分钟的整个期间内，糖尿病模型猪血糖浓度表现出降低；实验期间两次进餐后血糖上升，随后又表现出降低；所述的降低血糖为55％～60％。对照实验1中，口服施用肠溶包衣胶囊装载的游离胰岛素的糖尿病模型猪，血糖值基本没有降低。
实施例2
实施例2中采用结构式如下所述的化合物4，
Figure BDA0003315221480000171
本发明中所述的化合物4的合成，步骤如下：
Figure BDA0003315221480000172
化合物4由化合物3制备得到。将盐酸与无水乙醇混合，搅拌至均匀。将化合物3加到溶液中，再加入等摩尔当量的双氰胺。将混合物在恒定搅拌下加热回流12小时。过柱得化合物4。
产物结构经核磁共振表征，结果如图9所示。
利用硫属元素杂环化合物4制备胰岛素口服制剂的方法与表征：(1)将重组人胰岛素与硫属元素杂环化合物4按照1:50的物质的量比，在20mM Tris-HCl，pH 7.0缓冲液中混合孵育10分钟；(2)将第一步所得悬浮液进行透析或离心，除去未反应的游离胰岛素、游离的化合物4及游离的寡聚物，得到胰岛素与硫属元素杂环化合物4的组装团聚体2。
如图10所示，本实施例中制得的团聚体2的在透射电子显微镜下观察到的粒径大小为30～50nm，胰岛素的包封效率达～70％。
给糖尿病模型小鼠口服施用胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体悬浮液后体内血糖变化的研究:将上述中所得团聚体2混悬液，给糖尿病模型小鼠口服施用50U/kg剂量的胰岛素之后，在不同的时间点，从小鼠尾静脉取血，监测血糖变化情况；作为对照1实验，给糖尿病模型小鼠口服施用等体积的生理盐水；作为对照2实验，给糖尿病模型小鼠皮下注射5U/kg胰岛素。
实验结果：如图11所示，口服施用团聚体2之后，糖尿病模型小鼠在30分钟内表现出显著的血糖降低，所述的显著降低血糖为约20％，60分钟后血糖降低约30％；在15分钟～600分钟的整个期间内，糖尿病模型小鼠血糖浓度降低约50％。对照实验1中，施用生理盐水的糖尿病模型小鼠，血糖值基本没有降低。对照实验2中，糖尿病模型小鼠皮下注射胰岛素15分钟之后，表现出显著的血糖降低，但是维持血糖降低时间比较短，仅在15分钟～180分钟的期间内，表现出30％～50％的降低。
实施例3
实施例3中采用结构式如下所述的化合物10，
Figure BDA0003315221480000181
本发明中所述的化合物10的合成，步骤如下：
Figure BDA0003315221480000191
首先制备硒辛酸8。将化合物5加入到圆底烧瓶中，随后依次加入无水乙醇，2倍摩尔当量的氢氧化钠和水，50℃下反应2小时，得化合物6。在2小时内用注射泵逐滴加入二硒化钠水溶液，此过程中温度维持在70℃，滴加完毕后保持70℃反应3小时，得化合物7。降温至40℃，加入活性炭搅拌30分钟，趁热过滤，除去未反应的杂质和活性炭。滤液置于冰水混合物上，冷却至0℃，快速搅拌下滴加5％稀盐酸，调节pH至2，析出大量棕褐色固体，抽滤、干燥，得到化合物8(硒辛酸)。
将化合物8和N,N'-羰基二咪唑溶于二氯甲烷溶液，然后滴加到放置于冰水浴中的含乙二胺的二氯甲烷溶液中，搅拌40分钟，再在室温搅拌30分钟；将反应后的溶液用盐水洗涤，有机相部分用无水硫酸钠除水干燥，然后进行减压浓缩，得到黄色油状物，得化合物9。随后，将盐酸与无水乙醇混合，搅拌至均匀。将化合物9加到溶液中，再加入等摩尔当量的双氰胺。将混合物在恒定搅拌下加热回流12小时。过柱得化合物10。
产物结构经核磁共振波谱验证。
利用硫属元素杂环化合物10制备胰岛素口服制剂的方法与表征：(1)将重组人胰岛素与硫属元素杂环化合物10按照1:50的物质的量比，在20mM Tris-HCl，pH 7.0缓冲液中混合孵育10分钟；(2)将第一步所得悬浮液进行透析或离心，除去未反应的游离胰岛素、游离的化合物10及游离的寡聚物，得到胰岛素与硫属元素杂环化合物10的组装团聚体3。
如图12所示，本实施例中制得的团聚体3的在透射电子显微镜下观察到的粒径大小为～50nm，胰岛素的包封效率达～65％。
给糖尿病模型小鼠口服施用胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体悬浮液后体内血糖变化的研究:将上述中所得团聚体3混悬液，给糖尿病模型小鼠口服施用50U/kg剂量的胰岛素之后，在不同的时间点，从小鼠尾静脉取血，监测血糖变化情况；作为对照1实验，给糖尿病模型小鼠口服施用等体积的生理盐水；作为对照2实验，给糖尿病模型小鼠皮下注射5U/kg胰岛素。
实验结果：如图13所示，口服施用团聚体3之后，糖尿病模型小鼠在30分钟内表现出显著的血糖降低，所述的显著降低血糖为约20％，60分钟后血糖降低约30％；在15分钟～600分钟的整个期间内，糖尿病模型小鼠血糖浓度表现约55％。对照实验1中，施用生理盐水的糖尿病模型小鼠，血糖值基本没有降低。对照实验2中，糖尿病模型小鼠皮下注射胰岛素15分钟之后，表现出显著的血糖降低，但是维持血糖降低时间比较短，仅在15分钟～180分钟的期间内，表现出30％～50％的降低。
由于小鼠和猪等哺乳动物是药物试验中人的常用模型，可以证明，含有胰岛素与硫属元素杂环化合物团聚体的诸如悬浮液、肠溶包衣胶囊、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂等组合物在口服使用时均可以有效降低人类的血糖水平，特别是可用于糖尿病患者的治疗。
因此，利用硫属元素杂环化合物制备胰岛素口服制剂，方法简单、成本较低；并且，显著地改善了胰岛素口服施用的药代学和药效学性质，生物利用度高、具有良好的降血糖效果，在糖尿病治疗方面具有广阔的应用前景。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (14)

1.一种团聚体，其特征在于，为硫属元素杂环化合物与胰岛素组装形成的团聚体；
所述硫属元素杂环化合物具有式Ⅰ所示结构：
A—L—B 式Ⅰ；
其中，A为含有两个或两个以上相同和/或不同硫属元素原子的杂环基团，所述硫属元素为硫、硒或碲；
B为与胰岛素分子相互作用的基团；
L为A、B的连接基团。
2.根据权利要求1所述的团聚体，其特征在于，所述A具有以下任一结构：
Figure FDA0003315221470000011
所述L选自碳-碳键、碳-硼键、碳-氮键、碳-磷键、碳-氧键、碳-硫键、碳-硒键、碳-碲键、金属配位键、硼酯键、二硫键、成环基团、氢键、可切割的化学键、超分子主客体作用或配体-受体识别作用；
所述B选自识别胰岛素的化学/生物分子、DNA互补链、适配体、形成coiled coils/拉链结构/超结构的多肽、以及以下化学基团中的一种或多种：
Figure FDA0003315221470000012
Figure FDA0003315221470000021
3.根据权利要求1所述的团聚体，其特征在于，所述硫属元素杂环化合物具有式Ⅱ所示结构：
Figure FDA0003315221470000022
其中，X1、X2、X3、X4中的至少两个独立的选自S、Se或Te，其余为C；
R1、R2、R3独立的选自碳原子、酰胺基团或亚氨基；
R4选自羧基、氨基、
Figure FDA0003315221470000023
n1、n2、n3、n4独立的选自1～6的任意整数。
4.根据权利要求1所述的团聚体，其特征在于，所述硫属元素杂环化合物选自以下结构中的一种或多种：
Figure FDA0003315221470000031
5.根据权利要求1所述的团聚体，其特征在于，所述胰岛素选自未经修饰改性的胰岛素、胰岛素类似物和修饰的胰岛素中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的团聚体，其特征在于，所述未经修饰改性的胰岛素选自人胰岛素、人重组胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛素、半合成胰岛素和生物合成胰岛素中的一种或多种；
所述胰岛素类似物选自赖脯胰岛素、赖谷胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素、德谷胰岛素中的一种或多种；
所述修饰的胰岛素选自化学分子修饰、生物分子修饰、基因工程改造的胰岛素中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的团聚体，其特征在于，所述硫属元素杂环化合物与胰岛素的摩尔比为1～200:1。
8.根据权利要求1所述的团聚体，其特征在于，所述团聚体的粒径为10～500nm。
9.权利要求1～8任一项所述的团聚体的制备方法，包括以下步骤：
S1)将胰岛素溶液与硫属元素杂环化合物溶液混合孵育，经过组装形成团聚体。
10.权利要求1～8任一项所述的团聚体在制备降血糖药物中的应用。
11.一种胰岛素口服制剂，包括权利要求1～8任一项所述的团聚体，和药学上可接受的辅剂。
12.根据权利要求11所述的胰岛素口服制剂，其特征在于，所述口服制剂为肠溶包衣胶囊、散剂、片剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸剂中的一种或多种。
13.根据权利要求11所述的胰岛素口服制剂，其特征在于，还包括其他治疗剂；
所述其他治疗剂选自皮下注射型降血糖药物和/或其他口服型降血糖药物。
14.根据权利要求13所述的胰岛素口服制剂，其特征在于，所述其他治疗剂选自胰高血糖素样多肽-1、胰高血糖素样多肽-1受体激动药、葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽、磺脲类药物、格列奈类药物、二甲双胍类、α-糖苷酶抑制药、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶-4中的一种或多种。
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