CN115991778A - 抗pd-l1抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供与PD‑L1蛋白或CD137蛋白结合的抗体、其抗原结合片段或变体，以及既可与PD‑L1蛋白相结合又可与CD137蛋白结合的双特异性抗体。所述的双特异性抗体对PD‑L1蛋白和CD137蛋白的特异性识别能力强，可以增强T细胞活性。还提供了所述抗体或其抗原结合片段或变体和所述双特异性抗体在预防和治疗肿瘤中的应用。
Description
本申请是申请日为2018年8月27日、申请号为201880044363.1、发明名称为“抗PD-L1抗体及其用途”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种抗PD-L1抗体，还涉及其与抗CD137抗体联合用药用于治疗癌症的方法，还涉及其与抗CD137抗体形成的双特异抗体。
背景技术
程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1，又名CD279)与其配体PD-L1(又名B7-H1，CD274)和PD-L2(又名B7-DC，CD273)共同提供负性共刺激信号调节T细胞活化。缺乏共刺激信号时，T细胞难以感受抗原刺激，不能产生有效免疫应答，还可导致对异源抗原的衰竭或耐受。PD-1可在T细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、激活的单核细胞和树突状细胞(DCs)上表达。PD-1可由被活化的，但未被刺激的人CD4+和CD8+T细胞、B细胞和骨髓细胞表达。PD-L1和PD-L2在表达模式上有所不同。PD-L1可表达于造血细胞，也可在多种非造血细胞表达，而PD-L2的表达主要限于树突状细胞和巨噬细胞。B7.1(CD80)也是PD-L1的受体，它表达于激活的B细胞，T细胞，巨噬细胞和树突状细胞。作为PD-1和B7.1的配体，PD-L1还选择性表达于多种肿瘤细胞。抑制PD-L1信号转导，包括阻断PD-L1与PD-1、B7.1任一或两者的相互作用，从而阻止PD-L1发送负性共刺激信号给T细胞和其它抗原呈递细胞，这可能增强对感染(如急性和慢性)应答的免疫以及肿瘤免疫。
CD137(又名4-1BB，TNFRSF9等)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质。研究表明CD137激动型单克隆抗体在许多模型中增加共刺激分子表达，并且显著增强细胞溶解性T淋巴细胞应答，发挥抗肿瘤作用。CD137靶向疗法的抗肿瘤作用通过利用激动型抗小鼠CD137单克隆抗体的小鼠体内抗肿瘤疗效研究证实。
目前已批准的PD-L1抗体可用于治疗部分癌症，已有的CD137抗体展示出治疗多种肿瘤的潜力。已有报道利用荷瘤小鼠动物模型研究了PD-1抗体和CD137抗体的组合抗肿瘤疗效，结果表明两种抗体联合应用显示出比两者单用显著增强的抑瘤活性，但从顺应性和疼痛的角度给患者带来不便，并且增加了治疗费用。研制这两种单克隆抗体的双特异抗体(Bispecific antibody，BsAb)因其含有两种特异性抗原结合位点可解决以上问题。因此，亟待开发新的抗PD-L1抗体使其具有更加的药效和更低的免疫原性，以及PD-L1/CD137双特异性抗体以获得更好的抗肿瘤效果。
发明内容
本申请提供了一种PD-L1抗体、其抗原结合片段或变体，其具有下列性质中的一种或多种：1)能够以较高的亲和力和特异性结合PD-L1蛋白；2)能够抑制PD-1蛋白与PD-L1蛋白的结合；3)能够缓解或治疗肿瘤。本申请也提供了一种双特异性抗体具有下列性质中的一种或多种：1)能够以较高的亲和力和特异性结合PD-L1蛋白；2)能够以较高的亲和力和特异性结合CD137蛋白；3)能够增强T细胞功能；4)能够缓解或治疗肿瘤。本申请还提供了所述PD-L1抗体、其抗原结合片段或变体、双特异性抗体的制备方法和应用。
一方面，本申请提供了一种抗体、其抗原结合片段或变体，其以3×10-9M或更低的KD与PD-L1蛋白相结合。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体轻链或其片段，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列TGTX1SX2VGGYX3X4VS；其中X1是S、R或V；X2是D、E或S；X3是N或R；X4是Y或E，且其中所述LCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。
在某些实施方式中，所述LCDR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54-58。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列X1NSX2RPS，其中X1是G或E；X2是N或I，且其中所述LCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。在某些实施方式中，所述LCDR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60-61。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列：QSYDSSLSGX1V，其中X1是S或T，且其中所述LCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。在某些实施方式中，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。在某些实施方式中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:71。在某些实施方式中，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:72。在某些实施方式中，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:73-75。在某些实施方式中，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:76。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区，且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体重链或其片段，所述抗体重链或其片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列：X1YAIS，其中X1是S或T，且其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，且其中所述HCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列：TMX1X2YX3X4GNX5DY，其中X1是D、E或G，X2是G或E，X3是S或G，X4是Y或F，X5是F或Y，且其中所述HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。在某些实施方式中，所述HCDR3包含选自下组所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:50-52。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。在某些实施方式中，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。在某些实施方式中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:65-67。在某些实施方式中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:68。在某些实施方式中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:69。在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:70。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:35。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区，且所述人恒定区包括人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36。
在某些实施方式中，所述PD-L1蛋白选自下组：人PD-L1蛋白、猴PD-L1蛋白和鼠PD-L1蛋白。
另一方面，本申请提供了一种抗体、其抗原结合片段或变体，其以5×10-9M或更低的KD与CD137蛋白相结合。
在某些实施方式中，所述抗体、其抗原结合片段或变体以3×10-9M或更低的KD与CD137蛋白相结合。
在某些实施方式中，所述抗体、其抗原结合片段或变体可缓解或治疗肿瘤。在某些实施方式中，所述抗体、其抗原结合片段或变体可缓解或治疗结肠癌。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体轻链或其片段。在在某些实施方式中，所述轻链或其片段包含LCDR1-3，所述LCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:80-82所示。在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还包括框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。在某些实施方式中，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。在某些实施方式中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:89。在某些实施方式中，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:90。在某些实施方式中，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:91。在某些实施方式中，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:92。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:20。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:23。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体重链或其片段，所述重链或其片段包含HCDR1-3，所述HCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:77-79所示。在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包括框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。在某些实施方式中，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。在某些实施方式中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:84-85。在某些实施方式中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:86。在某些实施方式中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:87。在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:88。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:25。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区，且所述人恒定区包括人IgG恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段包含选自以下组的氨基酸序列：SEQID NO:21和SEQ ID NO:27。
在某些实施方式中，所述CD137蛋白包括人CD137蛋白。
另一方面，本申请提供了一种双特异性抗体，其以2×10-9M或更低的KD值与PD-L1蛋白相结合，且以8×10-9M或更低的KD值与CD137蛋白相结合。
在某些实施方式中，所述的双特异性抗体包含特异性结合所述PD-L1蛋白的第一靶向部分，其中所述第一靶向部分包含所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
在某些实施方式中，所述的双特异性抗体包含特异性结合所述CD137蛋白的第二靶向部分，其中所述第二靶向部分包含结合所述CD137蛋白的抗体、其抗原结合片段或变体。在某些实施方式中，所述结合CD137蛋白的抗体包含scFv，且所述scFv包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:83。在某些实施方式中，所述的双特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区，所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区，以及所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区；且所述第二多肽链包含所述结合PD-L1蛋白的抗体的轻链可变区。
在某些实施方式中，在所述第一多肽链中，所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端，且所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端；或者，所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端，且所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
在某些实施方式中，第一多肽链中所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区与所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区构成scFv。
在某些实施方式中，所述第一多肽链中还包含人IgG恒定区，所述人IgG恒定区位于所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端；或者，所述人IgG恒定区位于所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
在某些实施方式中，所述第一多肽链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。在某些实施方式中，所述第二多肽链包括选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:34。
另一方面，本申请提供一种或多种核酸分子，其编码所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体。
另一方面，本申请提供一种载体，其包含所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供一种细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
另一方面，本申请提供一种制备所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括在使得所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体表达的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体，所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供一种所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体，所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备缓解或治疗肿瘤的药物中的应用。
另一方面，本申请提供一种抑制PD-L1蛋白和PD-1蛋白结合的方法，其包括施用所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体，所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物。
在本申请中，所述抗体CDR的位置根据抗体Kabat定义法确定。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述PD-L1抗体重链可变区和轻链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比。下划线处为根据Kabat定义法确定的CDR。
图2.显示的是本申请所述PD-L1抗体抑制人PD-L1与人PD-1结合的结果。
图3.显示的是本申请所述PD-L1抗体抑制食蟹猴PD-L1与食蟹猴PD-1结合的结果。
图4.显示的是本申请所述PD-L1抗体抑制小鼠PD-L1与小鼠PD-1的结合的结果。
图5.显示的是本申请所述各抗体对C57BL/6小鼠中MC38肿瘤生长的影响(*,P<0.05；***,P<0.001；Unpaired t检验)。
图6.显示的是本申请所述CD137抗体重链可变区和轻链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比，下划线处为根据Kabat定义法确定的CDR。
图7.显示的是本申请所述CD137抗体对转入人CD137基因的C57BL/6雌性小鼠中MC38肿瘤生长的影响(*,P<0.05；**,P<0.01；Unpaired t检验)。
图8.显示的是本申请PD-L1抗体重链可变区和轻链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比，下划线处为根据Kabat定义法确定的CDR，阴影部分为根据IMGT定义法确定的CDR。进行亲和力成熟时YN003各CDR区(包括CDR区中部分氨基酸残基及与CDR区临近的FR区中个别氨基酸残基)随机化靶向的氨基酸残基以斜体字母表示。
图9.显示的是本申请PD-L1抗体重链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比，下划线处为根据Kabat定义法确定的CDR，阴影部分为根据IMGT定义法确定的CDR。
图10.显示的是本申请PD-L1抗体轻链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比，下划线处为根据Kabat定义法确定的CDR，阴影部分为根据IMGT定义法确定的CDR。
图11.显示的是本申请PD-L1抗体结合稳定表达人PD-L1的CHO细胞的情况。
图12.显示的是本申请PD-L1抗体抑制人PD-1与人PD-L1结合的情况。
图13.显示的是本申请PD-L1抗体结合稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞的情况。
图14.显示的是本申请PD-L1抗体抑制小鼠PD-1与小鼠PD-L1结合的情况。
图15.显示的是本申请PD-L1抗体结合MDA-MB-231细胞的情况。
图16.显示的是本申请PD-L1抗体及PD-L1/CD137双特异抗体结合稳定表达人PD-L1的CHO细胞的情况。
图17.显示的是本申请PD-L1抗体及PD-L1/CD137双特异抗体抑制人PD-1与人PD-L1结合的情况。
图18.显示的是本申请PD-L1抗体及PD-L1/CD137双特异抗体结合稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞的情况。
图19.显示的是本申请PD-L1抗体及PD-L1/CD137双特异抗体抑制小鼠PD-1与小鼠PD-L1结合的情况。
图20.显示的是本申请CD137抗体及PD-L1/CD137双特异抗体结合稳定表达人CD137的293T细胞的情况。
图21.显示的是SDS-PAGE分析本申请所述抗体的分子量情况。a,非还原；b，还原。
图22.显示的是本申请所述各抗体刺激表达人CD137以及稳定整合萤光素酶报道基因的293T细胞的萤光素酶活性的结果。
图23.显示的是本申请所述抗体对转入人CD137基因的C57BL/6雌性小鼠中MC38肿瘤生长的影响(*,P<0.05；Unpaired t检验)。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
在本申请中，术语“PD-L1蛋白”通常是指程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)蛋白的配体。PD-1是Ig超级家族的受体，其通过与特异性配体(PD-L)相互作用负调节T细胞抗原受体信号传导，并建议在维持自身耐受中起作用。缺乏共刺激信号时，T细胞难以感受抗原刺激，不能产生有效免疫应答，还可导致对异源抗原的衰竭或耐受。PD-L1可表达于造血细胞，也可在多种非造血细胞表达。B7.1(CD80)也是PD-L1的受体，它表达于激活的B细胞，T细胞，巨噬细胞和树突状细胞。作为PD-1和B7.1的配体，PD-L1还选择性表达于多种肿瘤细胞。抑制PD-L1信号转导，包括阻断PD-L1与PD-1、B7.1任一或两者的相互作用，从而阻止PD-L1发送负性共刺激信号给T细胞和其它抗原呈递细胞，这可能增强对感染(如急性和慢性)应答的免疫以及肿瘤免疫。
在本申请中，术语“CD137蛋白”，又名4-1BB或TNFRS9，通常是指肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的一种跨膜蛋白质，是激活诱导的共刺激分子是免疫应答的重要调节剂。研究表明CD137激动型单克隆抗体在许多模型中增加共刺激分子表达，并且显著增强细胞溶解性T淋巴细胞应答，发挥抗肿瘤作用。CD137靶向疗法的抗肿瘤作用可以通过利用激动型抗小鼠CD137单克隆抗体的小鼠体内抗肿瘤疗效研究证实。CD137已经成为免疫细胞的有力激活剂，并成为治疗各种疾病的重要候选抗原。(参见Vinay,Dass S.,and ByoungS.Kwon."4-1BB(CD137),an inducible costimulatory receptor,as a specific targetfor cancer therapy."BMB reports 47.3(2014):122.)
在本申请中，术语“NFκB”是指核因子活化B细胞κ轻链增强子(nuclear factorkappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NFκB)。这是一种控制DNA转录的蛋白复合体。NFκB几乎存在于所有类型的动物细胞中并参与细胞对诸多刺激的响应，这些刺激包括应激、细胞因子、自由基、紫外线照射、氧化LDL及细菌或病毒抗原。在针对感染的免疫反应中，NFκB起到了重要的调节作用(κ轻链是免疫球蛋白的重要组成部分)。NFκB的调控失常与癌症、炎症和自身免疫病、感染性休克、病毒感染以及免疫发育异常有关。NFκB亦与突触可塑性及记忆过程有着密切关系。NFκB的主要靶细胞是趋化因子，免疫受体，黏附分子，应激反应基因，凋亡调节剂，转录因子，生长因子，酶和细胞周期调节剂。此外，NFκB对几种病毒启动子/增强子(例如HIV-1和CMV)的转录有重要的影响(参见Tergaonkar,Vinay."NFκB pathway:A good signaling paradigm and therapeutic target."Theinternational journal of biochemistry&cell biology 38.10(2006):1647-1653.)。
在本申请中，术语“KD”可与“KD”互换使用，通常是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，单位为M(mol/L)。KD可通过物质AB和其解离得到的物质A和物质B的浓度来计算：KD＝c(A)*c(B)/c(AB)。由该公式可知，KD值越大，说明解离越多，代表物质A、B之间的亲和力越弱；反之，KD值越小，说明解离越少，代表物质A、B之间的亲和力越强。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指一群基本同源的抗体的抗体，即包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇修饰语"单克隆"不是被解释为需要通过任何特殊方法产生抗体。例如，所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述的技术进行。
在本申请中，术语“单链抗体”通常是指(scFv)通常是指通常是指是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接子(linker)连接而成的分子。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指使用遗传工程技术将衍生自非人物种(例如小鼠或大鼠)的抗体、免疫球蛋白结合蛋白和多肽对人体的免疫原性降低，同时仍保留原始抗体的抗原结合特性的改造抗体。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature321:522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988Science239:1534-1536；Riechmann,et al.,1988Nature 332:323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol 1991 9:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989ProcNatl Acad Sci USA 86:10029-10033；Co,et al.,1991Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co,et al.,1992J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark,etal.,“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion:moleculardefinition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指抗体所有全部(包括抗体的恒定区部分，CH和CL区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。
在本申请中，术语“双特异抗体(Bispecific antibody，BsAbs)”通常是指在其结合臂中具有双重特异性的抗体或抗体构建体。天然存在的抗体是单特异性的，并且在它们的抗原结合臂中具有相同的特异性。双特异性抗体是从两种不同来源获得，并通过重组DNA或细胞融合技术构建而成，使得它们保留原始抗体的两种特异性。双特异性抗体携带两个不同的抗原结合位点。双特异性抗体的Fc部分不同于任意亲本单特异性抗体中的Fc部分。由于双特异性抗体对于药物和肿瘤细胞都具有双重特异性，理论上其可导致在肿瘤中药物积累高于在体内无肿瘤部位的积累。大部门双特异新抗体可以重定向细胞毒性效应细胞(如Tc细胞，NK细胞，嗜中性粒细胞)至靶向细胞(例如肿瘤细胞)。双特异性抗体能够同时阻断在发病机制中发挥独特或重叠功能的两种不同介质/通路，还可能通过与两种不同细胞表面抗原而不是一种相互作用而增加结合特异性。(Fanger,Michael W.,and PaulM.Guyre."Bispecific antibodies for targeted cellular cytotoxicity."Trends inbiotechnology,1991:375-380),(Fan,Gaowei,et al."Bispecific antibodies andtheir applications."Journal of hematology&oncology,2015:130)
在本申请中，术语“序列同源性”通常是指同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性。
在本申请中，术语“表位”通常是指抗原决定簇，即指分子中被免疫系统识别(例如被抗体识别)的部分。例如，表位是被免疫系统识别的抗原上不连续的三维位点。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位根据结构，可分为构象表位和非构象表位(线性表位)。构象表位与非构象表位的区别在于在变性溶剂存在下前者丧失结合，而后者则不会。只位于抗原物质表面、易与抗原识别受体或抗体结合的表位可称为功能性表位；位于分子内部、无免疫原性的表位可称为隐藏性表位。表位可以由连续的残基构成，或者由被抗原聚合物的折叠造成领近的不连续残基形成。在蛋白质中连续氨基酸所形成的表位通常在暴露到变性溶剂时仍被保持，然而不连续氨基酸所形成的表位通常会在所述暴露后丧失。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指完整抗体的一部分，例如，完整抗体的抗原结合区和/或可变区。在某些实施方式中，所述抗原结合片段可包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段。在某些实施方式中，本申请所述的抗体可包括双链抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。由木瓜蛋白酶消化具有完整结构的抗体后(例如，去除了Fc区和铰链区)而产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段。Fab片段由完整的轻链、重链可变区(VH)和重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的，即它具有单一的抗原结合位点。F(ab)2抗体片段最初作为成对的Fab片段产生，在它们之间有半胱氨酸相连接。由胃蛋白酶消化具有完整结构的抗体后产生单一的大的F(ab')2片段，其粗略地相当于两个通过二硫键相连具有不同的抗原结合活性的Fab片段，且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。
在本申请中，术语“变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合PD-L1)，且与其具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合PD-L1)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在本申请中，术语“同一性”通常是指候选序列与特定肽或多肽序列相比，相同的氨基酸残基的数目占所有的氨基酸残基的数目的百分比。
在本申请中，术语“IgG”通常是指免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)。IgG是人的免疫球蛋白之一，其他还有lgA、lgM、IgD和lgE。IgG是血清主要的抗体成分，约占血清Ig的75％。根据IgG分子中的γ链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。IgG在免疫中发挥重要的作用。在本申请中，术语“IgG1”通常是指IgG中占比最高的一类亚型，与Fc受体有较高亲和性。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中，术语“重组宿主细胞”通常指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“癌症”通常是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征在于细胞增殖或存活失调。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病以及淋巴恶性肿瘤。例如，可以为淋巴瘤。
在本申请中，术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
抗体或其抗体结合片段
在一个方面，本申请提供了一种抗体或其抗原结合片段或变体，其以3×10-9M以下(例如，所述KD的值不高于约3×10-9M、不高于约2×10-9M、不高于约1×10-9M、不高于约9×10-10M、不高于约8×10-10M、不高于约7×10-10M、不高于约6×10-10M、不高于约5×10-10M、不高于约4×10-10M、不高于约3×10-10M、不高于约2×10-10M、不高于1×10-10M、不高于约9×10-11M、不高于约8×10-11M、不高于约7×10-11M、不高于约6×10-11M、不高于约1×10-11M或以下)的KD值与PD-L1蛋白相结合。例如，所述的抗体、其抗原结合片段或变体可以以8×10-11M以下的KD值与PD-L1蛋白相结合。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段或变体可抑制PD-L1与PD-1的结合。
本申请所述的抗体或其抗原结合片段或变体可缓解或治疗与肿瘤相关的疾病。所述肿瘤包括结肠癌。
本申请中，所述抗体可选自以下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在本申请中，所述的抗原结合片段可选自以下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
在本申请中，所述变体可以为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合PD-L1)，且与其具有至少85％以上(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合PD-L1)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。又例如，本申请中所述变体可以选自以下组：在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和与所述抗体或所述其抗原结合片段具有85％以上(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体可包含抗体轻链或其片段，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列TGTX1SX2VGGYX3X4VS；其中X1是S、R或V；X2是D、E或S；X3是N或R；X4是Y或E，且其中所述LCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR1，且所述LCDR1包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:54-58。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQID NO:59所示的氨基酸序列X1NSX2RPS，其中X1是G或E；X2是N或I，且其中所述LCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2，且所述LCDR2包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:60-61。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQID NO:62所示的氨基酸序列：QSYDSSLSGX1V，其中X1是S或T，且其中所述LCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR3，且所述LCDR3包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64。
在某些实施方式中，所述抗体轻链或其片段还可包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。例如，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端可直接或间接相连，所述L-FR1包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:71。所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:72。所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:73-75。所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:76。在某些实施方式中，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体的轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:11，SEQID NO:33，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。
在本申请所述的抗体或其抗原结合片段或变体中，所述抗体轻链或其片段还可包含人恒定区，且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段可包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42。
在本申请中，本申请所述抗体可包含抗体重链或其片段，所述抗体重链或其片段可包含HCDR1，且所述HCDR1可包含选自SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列：X1YAIS，其中X1是S或T，且其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体重链或其片段可包含HCDR1，且所述HCDR1包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:47。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含HCDR2，且所述HCDR2包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:48，且其中所述HCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含HCDR3，且所述HCDR3包含选自SEQ IDNO:49所示的氨基酸序列：TMX1X2YX3X4GNX5DY，其中X1是D、E或G，X2是G或E，X3是S或G，X4是Y或F，X5是F或Y,且其中所述HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体重链或其片段可包含HCDR3，且所述HCDR3包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:50～52。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。例如，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67。所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:68。所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:69。所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:70。在某些实施方式中，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
本申请所述的抗体重链或其片段可包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH可包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:31，和SEQID NO:35。在本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中，所述抗体重链或其片段还可包含人恒定区。例如，所述人恒定区可包括人IgG恒定区。例如，所述人IgG恒定区可包含人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段可包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:32，和SEQ ID NO:36。
在某些实施方式中，本申请所述抗体包含抗体轻链或其片段，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列TGTX1SX2VGGYX3X4VS；其中X1是S、R或V；X2是D、E或S；X3是N或R；X4是Y或E，且其中所述LCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR1，且所述LCDR1包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:54-58。所述抗体轻链或其片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQID NO:59所示的氨基酸序列X1NSX2RPS，其中X1是G或E；X2是N或I，且其中所述LCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2，且所述LCDR2包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:60-61。所述抗体轻链或其片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列：QSYDSSLSGX1V，其中X1是S或T，且其中所述LCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR3，且所述LCDR3包含选自下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:63-64。并且，本申请所述抗体包含抗体重链或其片段，所述抗体重链或其片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列：X1YAIS，其中X1是S或T，且其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。例如，所述抗体重链或其片段可包含HCDR1，且所述HCDR1包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47。例如，所述抗体重链或其片段可包含HCDR2，且所述HCDR2包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:48，且其中所述HCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。又例如，所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列：TMX1X2YX3X4GNX5DY，其中X1是D、E或G，X2是G或E，X3是S或G，X4是Y或F，X5是F或Y,且其中所述HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。所述抗体重链或其片段可包含HCDR3，且所述HCDR3包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:50～52。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:54或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:63或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-002或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段或变体中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:73或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:65或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-002与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4或其变体；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-002或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-002或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合PD-L1蛋白(例如，人PD-L1蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:54或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:63或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-002或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:73或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:65或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-002或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:4或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:2或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-002或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:8所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:6所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-002或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:54或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:63或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:46或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-003或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段或变体中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:66或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-003或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11或其变体；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-003或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-003或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合PD-L1蛋白(例如，人PD-L1蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:54或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:63或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:46或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:50或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-003或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:66或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-003或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:11或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:9或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-003或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:15所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:13所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-003或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:55或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:51或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-035或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段或变体中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-035或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-035或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-035或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合PD-L1蛋白(例如，人PD-L1蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:55或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:51或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-035或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-035或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:31或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-035或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:34所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:32所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-035或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:55或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-036或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段或变体中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-036或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-036或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-036或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合PD-L1蛋白(例如，人PD-L1蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:55或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:60或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-036或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:74或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-036或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:33或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-036或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:34所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-036或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:56或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-037或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段或变体中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-037或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37或其变体；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-037或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-037或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合PD-L1蛋白(例如，人PD-L1蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:56或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-037或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-037或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:37或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-037或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:38所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-037或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:57或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-038或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段或变体中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-038或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39或其变体；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-038或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-038或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合PD-L1蛋白(例如，人PD-L1蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:57或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-038或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-038或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:39或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-038或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:40所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-038或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:58或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-039或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些情形中，所述抗体、其抗原结合片段或变体中L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；且H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-039或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41或其变体；且其中重链可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-039或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示且所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-039或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合PD-L1蛋白(例如，人PD-L1蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:58或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:61或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:64或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:52或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-039或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体包含L-FR1-4及H-FR1-4，且L-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:71或其变体；L-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:72或其变体；L-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:75或其变体；L-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:76或其变体；且H-FR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:67或其变体；H-FR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:68或其变体；H-FR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:69或其变体；H-FR4的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:70或其变体。例如，该抗体或其抗原结合片段可包括抗体YN-039或与其具有相同的LCDR1-3、HCDR1-3、L-FR1-4及H-FR1-4的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:41或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:35或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-039或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:42所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:36所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-039或与其具有相同的轻链及重链。
本申请中，所述PD-L1蛋白选自以下组：人PD-L1蛋白、猴PD-L1蛋白和鼠PD-L1蛋白。
在另一方面，本申请还提供了一种抗体、其抗原结合片段或变体，其以5×10-9M以下(例如，所述KD的值不高于约5×10-9M、不高于约4×10-9M、不高于约3×10-9M、不高于约2×10-9M、不高于约1×10-9M或不高于约1×10-10M或以下)的KD值与CD137蛋白相结合。例如，以3×10-9M以下的KD值与CD137蛋白相结合。
本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可缓解或治疗肿瘤。例如，所述肿瘤可包括结肠癌。
在本申请中，所述抗体可选自以下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
本申请中，所述抗原结合片段可选自以下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
本申请中，所述变体可为与所述抗体具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合CD137)，且与其具有至少85％以上(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能(例如，能够特异性结合CD137)，且在其基础上包含一个或多个(例如，1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个或更多个)氨基酸的添加、缺失或置换的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体可包含抗体轻链或其片段。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR1，且所述LCDR1可包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:80。例如，所述抗体轻链或其片段可包含LCDR2，且所述LCDR2包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQID NO:81。又例如，所述抗体轻链或其片段包含LCDR3或其变体，且所述LCDR3可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:82。
在某些实施方式中，所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段还包括框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。例如，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:89。所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:90。所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:91。所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:92。
在某些实施方式中，所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL可包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:20。
在本申请中，所述抗体轻链或其片段还可包含人恒定区，且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
在本申请中，所述抗体的所述轻链或其片段可包含以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:23。
在某些实施方式中，所述的抗体可包含抗体重链或其片段。所述抗体重链或其片段包含HCDR1，且所述HCDR1可包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:77。所述抗体重链或其片段包含HCDR2，且所述HCDR2可包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:78。所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3可包含以下的氨基酸序列或其变体：SEQ IDNO:79。
在某些实施方式中，所述抗体重链或其片段还可包括框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:84-85。所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:86。所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:87。所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:88。
本申请所述的抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH可包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:18或SEQ ID NO：25。
在本申请的抗体、其抗原结合片段或变体中，所述抗体重链或其片段还可包含人恒定区。例如，所述人恒定区可包括人IgG恒定区。例如，所述人IgG恒定区可包含人IgG1恒定区。
在本申请中，所述抗体重链或其片段可包含选自以下组的氨基酸序列或其变体：SEQ ID NO:21或SEQ ID NO：27。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:80或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:81或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:77或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:79或其变体。例如，所述抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-005或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体；且其重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:18或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-005或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:21所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-005或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:80或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:81或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:77或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:79或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-005或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO 18或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-005或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:21所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-005或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体中LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:80或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:81或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:77或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:79或其变体。例如，所述抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-006或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体；且其重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:25或其变体。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-006或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:27所示。例如，该抗体、其抗原结合片段或变体可包括抗体YN-006或与其具有相同的轻链及重链。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体与参比抗体竞争结合CD137蛋白(例如，人CD137蛋白)。所述参比抗体可包含LCDR1-3和HCDR1-3，且其LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:80或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:81或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体；其HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:77或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:79或其变体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体YN-006或与其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体；且所述重链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO 25或其变体。例如，该参比抗体可包括抗体YN-006或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。在某些实施方式中，所述参比抗体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且所述重链的氨基酸序列可如SEQ ID NO：27所示。例如，该参比抗体可包括抗体YN-006或与其具有相同的轻链及重链。
在本申请中，所述CD137蛋白可包括人CD137蛋白。
在另一方面，本申请还提供了一种双特异性抗体，其以2×10-9M以下(例如，所述KD的值不高于约2×10-9M、不高于约1×10-9M、不高于约1×10-10M或不高于约8×10-11M或以下)的KD值与PD-L1蛋白相结合，且其以8×10-9M以下(例如，所述KD的值不高于约8×10-9M、不高于约7×10-9M、不高于约6×10-9M、不高于约5×10-9M、不高于约4×10-9M、不高于约3×10-9M、不高于约2×10-9M、不高于约1×10-9M或不高于约1×10-10M或以下)的KD值与CD137蛋白相结合。
在本申请中，所述PD-L1蛋白选自以下组：人PD-L1蛋白、猴PD-L1蛋白和鼠PD-L1蛋白；且所述CD137蛋白包括人CD137蛋白。
在本申请中，所述的双特异性抗体包含特异性结合所述PD-L1蛋白的第一靶向部分，其中所述第一靶向部分可包含结合PD-L1的所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
例如，所述第一靶向部分中所述抗原结合片段可选自以下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。又例如，所述第一靶向部分中所述变体可选自以下组：在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和与所述抗体或所述其抗原结合片段具有85％以上(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。所述抗体、其抗原结合片段或变体可以是结合所述PD-L1蛋白的抗体、其抗原结合片段或变体。
在某些实施方式中，所述的双特异性抗体中结合PD-L1蛋白的抗体可包含轻链或其片段。例如，所述轻链或其片段包含LCDR1-3，所述LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:54～58；所述LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:60～61；和，所述LCDR3的氨基酸序列选自以下组：SEQ ID NO:63-64。在某些实施方式中，所述轻链或其片段可包含轻链可变区，且所述轻链可变区的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:33，SEQ IDNO:37，SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。在某些实施方式中，所述抗体的轻链或其片段可包含人恒定区，且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
在某些实施方式中，所述轻链或其片段可包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:8，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42。
在某些实施方式中，所述结合PD-L1蛋白的抗体可包含重链或其片段。例如，所述重链或其片段包含HCDR1-3，所述HCDR1的氨基酸序列选自以下组：SEQ ID NO:46～47；所述HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:48；和，所述HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:50～52。
在某些实施方式中，所述重链或其片段可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35。
在某些实施方式中，所述重链或其片段还可包含人恒定区，且所述人恒定区可包括人IgG恒定区。例如，所述人IgG恒定区为人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述重链或其片段可包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36。
在某些实施方式中，所述的双特异性抗体包含特异性结合所述CD137蛋白的第二靶向部分，其中所述第二靶向部分可包含结合所述CD137蛋白的抗体、其抗原结合片段或变体。在某些实施方式中，所述抗原结合片段选自以下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。在某些实施方式中，所述变体选自以下组：在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和与所述抗体或所述其抗原结合片段具有85％以上(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在某些实施方式中，所述结合CD137蛋白的抗体可包含轻链或其片段。例如，所述轻链或其片段包含LCDR1-3，所述LCDR1-3的氨基酸序列可依次为SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81和SEQ ID NO:82。在某些实施方式中，所述轻链或其片段可包含轻链可变区，且所述轻链可变区包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:20。
在某些实施方式中，所述结合CD137蛋白的抗体可包含重链或其片段。在某些实施方式中，所述抗体的重链或其片段可包含HCDR1-3，所述HCDR1-3的氨基酸序列可依次为SEQID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79。在某些实施方式中，所述抗体的重链或其片段可包含重链可变区，且所述重链可变区的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:25。
在某些实施方式中，所述结合CD137蛋白的抗体可包含scFv，且所述scFv可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:83。
在本申请中，所述的双特异性抗体可包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链可包含所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区，所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区，以及所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区；且所述第二多肽链可包含所述结合PD-L1蛋白的抗体的轻链可变区。
例如，在所述第一多肽链中，所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区可位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端，且所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区可位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端。又例如，在所述第一多肽链中，所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区可位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端，且所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区可位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
例如，所述第一多肽链中所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区可与所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区构成scFv。例如，所述scFv可包含以下的氨基酸序列：SEQID NO:83。
所述第一多肽链还可包含人IgG恒定区。例如，所述人IgG恒定区可以为人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述人IgG恒定区可位于所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且可位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端；或者，所述人IgG恒定区可位于所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且可位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
在某些实施方式中，所述第一多肽链可包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。
在某些实施方式中，所述第二多肽链还可包含人Igλ恒定区。
在本申请中，所述第二多肽链可包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:34。
例如，在本申请所述的双特异抗体的第一靶向部分中，LCDR1的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58或其变体；LCDR2的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61或其变体；LCDR3的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:48或其变体；HCDR3的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:50～52或其变体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可变区的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQID NO:41或其变体；且其重链可变区的氨基酸序列可选自以下组：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35或其变体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:42且所述重链氨基酸序列可选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36。
例如，在本申请所述的双特异抗体的第二靶向部分中，LCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:80或其变体；LCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:81或其变体；LCDR3的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:82或其变体；且HCDR1的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:77或其变体；HCDR2的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:78或其变体；HCDR3的氨基酸序列可包括SEQ IDNO:79或其变体。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体的轻链可变区的氨基酸序列可包括SEQ ID NO:20或其变体；且其重链可变区的氨基酸序列可选自以下组或其变体：SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:25。在某些实施方式中，本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体可包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列可如SEQ ID NO:23所示且所述重链氨基酸序列可如SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:27所示。
例如，在本申请所述的双特异抗体中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。该双特异性抗体可包括抗体YN-007或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中，所述第一多肽中，可包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；且，所述第二多肽中，可包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
又例如，在本申请所述的双特异抗体中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，以及所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。该双特异性抗体可包括抗体YN-051或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和如SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列；且，所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
又例如，在本申请所述的双特异抗体中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，以及所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。该双特异性抗体可包括抗体YN-052或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列和如SEQ IDNO:36所示的氨基酸序列；且，所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
例如，在本申请所述的双特异抗体中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。该双特异性抗体可包括抗体YN-007或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中，所述第一多肽中，可包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列和如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；且，所述第二多肽中，可包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
又例如，在本申请所述的双特异抗体中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，以及所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。该双特异性抗体可包括抗体YN-051或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列；且，所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
又例如，在本申请所述的双特异抗体中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，以及所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。该双特异性抗体可包括抗体YN-052或与其具有相同的第一多肽及第二多肽。其中，所述第一多肽可包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列、如SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列；且，所述第二多肽可包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
核酸、载体、宿主细胞和制备方法
在另一个方面，本申请还提供了一种分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗体或其抗原结合片段，也可以编码其中一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其中包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
在另一个方面，本申请提供了细胞，所述细胞可包含本申请所述的核酸分子和/或本申请所述的载体。所述细胞可以是宿主细胞。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
在另一个方面，本申请提供了所述的一种或多种宿主细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
在另一个方面，本申请提供了制备所述抗体或其抗原结合片段或变体，或所述双特异性抗体的方法。所述方法可包括，在使得所述抗体、其抗原结合片段或变体，或所述双特异性抗体表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。且任选地收获所述抗体、其抗原结合片段或变体。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
药物组合物、应用
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其可包含所述抗体、其抗原结合片段或变体，或所述双特异性抗体，所述的核酸分子，所述的载体和/或所述的宿主细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药，肌肉内给药，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
另一方面，本申请提供了所述抗体、其抗原结合片段或变体，或所述双特异性抗体，所述的核酸分子，所述的载体，所述的宿主细胞和/或所述药物组合物在制备缓解或治疗肿瘤的药物中的应用。其中，所述肿瘤包括结肠癌。
另一方面，本申请提供了增强T细胞功能的方法，其包括向有需要的受试者施用所述结合PD-L1蛋白的抗体、其抗原结合片段或变体，所述结合CD137蛋白的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体，所述的核酸分子、所述的载体、所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。其中所述T细胞为肿瘤相关的功能失调T细胞。
另一方面，本申请提供了抑制PD-L1蛋白和PD-1蛋白结合的方法，其包括向有需要的受试者施用所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或所述的双特异性抗体，所述的核酸分子、所述的载体所述的宿主细胞和/或所述的药物组合物。
在本申请中，所述抗体CDR的位置可以根据抗体Kabat定义法确定。
本申请还包括以下的实施方式：
1.抗体、其抗原结合片段或变体，其以3×10-9M或更低的KD值与PD-L1蛋白相结合。
2.根据实施方案1所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其以8×10-11M或更低的KD与PD-L1蛋白相结合。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其抑制PD-L1与PD-1的结合。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其可缓解或治疗与肿瘤相关的疾病。
5.根据实施方案4所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述肿瘤包括结肠癌。6.根据实施方案1-5中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体选自以下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗原结合片段选自以下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述变体选自以下组：
1)在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和
2)与所述抗体或所述其抗原结合片段具有90％以上序列同源性的蛋白质或多肽。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其与参比抗体竞争结合所述PD-L1蛋白，其中所述参比抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1-3，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1-3，所述LCDR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54-58；所述LCDR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60-61；和，所述LCDR3包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:63-64；且，所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1-3，所述HCDR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:46-47；所述HCDR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:48；和，所述HCDR3包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50-52。
10.根据实施方案9所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其中所述参比抗体的轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQIDNO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41，且所述参比抗体的重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35。
11.根据实施方案9-10中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其中所述参比抗体的轻链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42；且所述参比抗体的重链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36。
12.根据实施方案1-11所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体包含抗体轻链或其片段，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列TGTX1SX2VGGYX3X4VS；其中X1是S、R或V；X2是D、E或S；X3是N或R；X4是Y或E，且其中所述LCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。
13.根据实施方案12所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述LCDR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54-58。
14.根据实施方案11-13中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列X1NSX2RPS，其中X1是G或E；X2是N或I，且其中所述LCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。
15.根据实施方案14所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述LCDR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:60-61。
16.根据实施方案11-15中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列：QSYDSSLSGX1V，其中X1是S或T，且其中所述LCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。
17.根据实施方案11-16中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段还包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
18.根据实施方案17所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
19.根据实施方案17-18中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:71
20.根据实施方案17-19中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:72。
21.根据实施方案17-20中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:73-75。
22.根据实施方案17-21中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:76。
23.根据实施方案12-22中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含选自以下组的氨基酸序列：SEQID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41。
24.根据实施方案12-23中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区，且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
25.根据实施方案12-24中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体包含抗体重链或其片段，所述抗体重链或其片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含选自SEQ IDNO:45所示的氨基酸序列：X1YAIS，其中X1是S或T，且其中所述HCDR1根据抗体Kabat编号的索引确定。
27.根据实施方案26所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，且其中所述HCDR2根据抗体Kabat编号的索引确定。
28.根据实施方案26-27中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列：TMX1X2YX3X4GNX5DY，其中X1是D、E或G，X2是G或E，X3是S或G，X4是Y或F，X5是F或Y,且其中所述HCDR3根据抗体Kabat编号的索引确定。
29.根据实施方案28所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述HCDR3包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:50-52。
30.根据实施方案26-29中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段还包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
31.根据实施方案30所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
32.根据实施方案30-31中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:65-67。
33.根据实施方案30-32中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:68。
34.根据实施方案30-33中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:69。
35.根据实施方案30-34中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:70。
36.根据实施方案26-35中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含选自以下组的氨基酸序列：SEQID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35。
37.根据实施方案26-36中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区，且所述人恒定区包括人IgG1恒定区。
38.根据实施方案26-37中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述PD-L1蛋白选自下组：人PD-L1蛋白、猴PD-L1蛋白和鼠PD-L1蛋白。
40.抗体、其抗原结合片段或变体，其以5×10-9M或更低的KD与CD137蛋白相结合。
41.根据实施方案40所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其以3×10-9M或更低的KD与CD137蛋白相结合。
42.根据实施方案40-41中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其具有CD137激动活性。
43.根据实施方案40-42中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其可缓解或治疗肿瘤。
44.根据实施方案43所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述肿瘤包括结肠癌。
45.根据实施方案40-44中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体选自以下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
46.根据实施方案40-45中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗原结合片段选自以下组：Fab，Fab’，F(ab)2和Fv片段。
47.根据实施方案40-46中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述变体选自以下组：
1)在所述抗体或所述其抗原结合片段中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽；和
2)与所述抗体或所述其抗原结合片段具有90％以上序列同源性的蛋白质或多肽。
48.根据实施方案40-47中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其与参比抗体竞争结合所述CD137蛋白，其中所述参比抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1-3，所述LCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:80-82所示，且，所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1-3，所述HCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ IDNO:77-79所示。
49.根据实施方案48所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其中所述参比抗体的轻链可变区包含选自SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，且所述参比抗体的重链可变区包含选自SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
50.根据实施方案48-49中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，其中所述参比抗体的轻链包含选自SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；且所述参比抗体的重链包含选自SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
51.根据实施方案40-50中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体包含抗体轻链或其片段。
52.根据实施方案51所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含LCDR1，且所述LCDR1包含选自SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列。
53.根据实施方案51-52中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含LCDR2，且所述LCDR2包含选自SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列。
54.根据实施方案51-53中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含LCDR3，且所述LCDR3包含选自SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列。
55.根据实施方案51-54中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段还包括框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
56.根据实施方案55所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
57.根据实施方案55-56中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，所述L-FR1包含选自SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。
58.根据实施方案55-57中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，所述L-FR2包含选自SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
59.根据实施方案55-58中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，所述L-FR3包含选自SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
60.根据实施方案55-59中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接相连，所述L-FR4包含选自SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
61.根据实施方案51-60中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含选自SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
62.根据实施方案51-61中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段还包含人恒定区且所述人恒定区包括人Igλ恒定区。
63.根据实施方案51-62中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含选自SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。
64.根据实施方案40-63中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体包含抗体重链或其片段。
65.根据实施方案64述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含HCDR1，且所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列。
66.根据实施方案64-65中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含HCDR2，且所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列。
67.根据实施方案64-66中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含HCDR3，且所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列。
68.根据实施方案64-67中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段还包括框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。
69.根据实施方案68所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述框架区选自以下组：人共有框架序列和人种系序列。
70.根据实施方案68-69中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，所述H-FR1包含选自SEQ ID NO:84-85所示的氨基酸序列。
71.根据实施方案68-70中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，所述H-FR2包含选自SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列。
72.根据实施方案68-71中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，所述H-FR3包含选自SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列。
73.根据实施方案68-72中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接相连，所述H-FR4包含选自SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列。
74.根据实施方案68-73中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含选自SEQ ID NO:18或SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列。
75.根据实施方案64-74中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段还包含人恒定区，且所述人恒定区包括人IgG恒定区。
76.根据实施方案75所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述IgG恒定区包含人IgG1恒定区。
77.根据实施方案64-76中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含选自SEQ ID NO:21或SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。
78.根据实施方案40-77中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述CD137蛋白包括人CD137蛋白。
79.双特异性抗体，其以2×10-9M或更低的KD值与PD-L1蛋白相结合，且以8×10-9M或更低的KD值与CD137蛋白相结合。
80.根据实施方案30所述的双特异性抗体，其包含特异性结合所述PD-L1蛋白的第一靶向部分，其中所述第一靶向部分包含实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
81.根据实施方案30-31中任一项所述的双特异性抗体，其包含特异性结合所述CD137蛋白的第二靶向部分，其中所述第二靶向部分包含实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体。。
82.根据实施方案79-81中任一项所述的双特异性抗体，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区，所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区，以及所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区；且所述第二多肽链包含所述结合PD-L1蛋白的抗体的轻链可变区。
83.根据实施方案82所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽链中，所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端，且所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端；或者，
所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端，且所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
84.根据实施方案82-83中任一项所述的双特异性抗体，所述第一多肽链中所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区与所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区构成scFv。
85.根据实施方案82-84中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽链中还包含人IgG恒定区，所述人IgG恒定区位于所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且位于所述结合CD137蛋白的抗体的轻链可变区的N端；或者，所述人IgG恒定区位于所述结合PD-L1蛋白的抗体的重链可变区的C端且位于所述结合CD137蛋白的抗体的重链可变区的N端。
86.根据实施方案82-85中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。
87.根据实施方案82-86中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二多肽链包括选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:34。
88.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或实施方案79-87中任一项所述的双特异性抗体。
89.载体，其包含根据实施方案88所述的核酸分子。
90.细胞，其包含根据实施方案88所述的核酸分子或根据实施方案89所述的载体.
91.制备实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或实施方案79-87中任一项所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括在使得实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或实施方案79-87中任一项所述的双特异性抗体表达的条件下，培养根据实施方案90所述的细胞。
92.药物组合物，其包含实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或实施方案79-87中任一项所述的双特异性抗体，实施方案88所述的核酸分子、实施方案89所述的载体和/或实施方案90所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
93.实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或实施方案79-87中任一项所述的双特异性抗体，实施方案88所述的核酸分子、实施方案89所述的载体、实施方案90所述的细胞和/或实施方案92所述的药物组合物在制备缓解或治疗肿瘤的药物中的应用。
94.根据实施方案93所述的应用，其中所述肿瘤包括结肠癌。
95.抑制PD-L1蛋白和PD-1蛋白结合的方法，其包括施用实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或实施方案79-87中任一项所述的双特异性抗体，实施方案88所述的核酸分子、实施方案89所述的载体、实施方案90所述的细胞和/或实施方案92所述的药物组合物。
96.增强T细胞功能的方法，其包括施用实施方案1-39中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，实施方案40-78中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或实施方案79-87中任一项所述的双特异性抗体，实施方案88所述的核酸分子、实施方案89所述的载体、实施方案90所述的细胞和/或实施方案92所述的药物组合物。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的装置、方法和系统的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1利用噬菌体抗体文库筛选抗PD-L1抗体
利用人PD-L1-Fc蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司)为抗原，进行噬菌体天然人源性抗体文库(上海原能细胞医学技术有限公司)分选。用含有20μg/ml(第一、二轮)或10μg/ml(第三、四轮)PD-L1蛋白的CBS缓冲液在4℃包被酶联免疫管过夜。该管随后用PBS缓冲液洗涤，向其中加入10％的脱脂奶粉封闭免疫管，然后加入1ml封闭过的phage，在室温(20±5℃)孵育1小时。用PBST充分洗涤后，加入800μl pH2.2的Gly-HCl缓冲液洗脱，随后立即加400μl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液中和。然后加入到20ml处于对数生长期的E.coli SS320中，E.coli的OD值约0.8，混匀后在37℃静置1小时。取出500μl菌液进行噬菌体滴度测定及甘油保菌，剩余菌液用来涂平板，在37℃过夜培养。次日，将平板上的菌按比例接入到80ml2YT-Amp培养基中，使菌液OD值等于0.2。培养数小时，当OD值达到0.8时，加入160μl helperphage混匀，在37℃静置1小时。然后加入IPTG、Kan抗生素，在250rpm，30℃振荡过夜培养。随后收集上清，用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，重悬于1.5ml的PBS缓冲液中进行富集筛选。
分别用含有1μg/ml的人PD-L1-Fc蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司)和小鼠PD-L1-Fc蛋白(M5251，购自北京百普赛斯生物科技有限公司)在4℃包被96孔ELISA板过夜。该板随后用10％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，充分洗涤后，取单克隆的噬菌体上清加入96孔板，在37℃孵育2小时。充分洗涤后，每孔加入HRP标记的抗M13抗体(27-9421-01，GEhealtcare)，在37℃反应45分钟。充分洗涤后，每孔加入TMB显色，在室温(20±5℃)反应5-10分钟后，每孔加入硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处测定各孔OD值。
通过ELISA鉴定获得了一株能既能特异性结合人PD-L1又能特异性结合小鼠PD-L1的噬菌体抗体克隆1B10。测序结果显示，编码所述噬菌体抗体1B10的重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，噬菌体抗体1B10的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；编码所述噬菌体抗体1B10的轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，噬菌体抗体1B10的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2抗PD-L1全人源完整抗体的表达和纯化
设计引物对噬菌体抗体1B10的VH进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双酶切的pCMV-IgG1NDL载体；设计引物对噬菌体抗体1B10的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-λ载体。测序正确后将重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，并通过ProteinA柱纯化，得到噬菌体抗体1B10的完整IgG1,λ抗体，将此抗PD-L1全人源抗体命名为YN-002。
测序结果显示，编码抗体YN-002的VH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，抗体YN-002的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。编码抗体YN-002的VL的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，抗体YN-002的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。编码抗体YN-002的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，YN-002的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。编码抗体YN-002的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，抗体YN-002的轻链的氨基酸序列如SEQID NO:8所示。
实施例3抗PD-L1全人源抗体YN-002的种系形式(germlined version)
对比抗体YN-002重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列，证实抗体YN-002重链利用来自人种系IGHV1-69*09的VH节段、来自人种系IGHD5-18*01的D节段及来自人种系IGHJ4*02的JH节段。
对比抗体YN-002轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列，证实抗体YN-002轻链利用来自人种系IGLV2-14*01的VL节段，来自人种系IGLJ2*01的JL节段。
使用Kabat系统分析抗体YN-002的CDR区序列(参见图1)。
测序结果显示，抗体YN-002的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:60和SEQ ID NO:63所示；且其HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:50所示。
为了使抗体YN-002的免疫原性最小化，可将一些氨基酸残基突变回种系序列。抗体YN-003是抗体YN-002的一种种系形式(germlined version)，是通过将YN-002重链可变区的FR1区中的1个氨基酸突变回种系序列，以及将YN-002轻链可变区中FR2区中1个氨基酸和FR3区中6个氨基酸突变回种系序列而制备得到的(参见图1)。抗PD-L1全人源抗体YN-003的重链表达载体在上述构建的YN-002的重链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变而获得。YN-003轻链表达载体是在YN-002轻链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变而获得。
抗体YN-003VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，其可通过突变抗体YN-002VH的氨基酸序列中1个氨基酸残基而得到，编码YN-003VH的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。抗体YN-003VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，其可通过突变抗体YN-002VL的氨基酸序列中7个氨基酸残基而得到，编码YN-003VL对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。抗体YN-003重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；编码YN-003重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；抗体YN-003轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；编码抗体YN-003轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
YN-003抗体的表达、纯化参照实施例2中YN-002抗体的表达、纯化的步骤。
实施例4抗PD-L1抗体的结合亲和力检测
使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)测量抗体YN-002和抗体YN-003针对重组的人、食蟹猴、小鼠、犬PD-L1蛋白的结合亲和力。用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,Pierce,21327)标记以下蛋白：重组的人PD-L1-Fc、重组的食蟹猴PD-L1-Fc(90251-C02H，购自北京义翘神州生物技术有限公司)、重组的小鼠PD-L1-Fc(M5251，购自北京百普赛斯生物科技有限公司)、重组的犬PD-L1-Fc(70110-D02H，购自北京义翘神州生物技术有限公司)。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)，使用含有0.1％ BSA和0.02％ Tween20的PBS缓冲液，进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM经过biotin偶联的抗原蛋白与SA传感器(Pall ForteBio公司)固定，以1500rpm结合10分钟；然后再与对倍稀释的抗体溶液以1500rpm结合10分钟，最后以1500rpm解离10分钟。得到的结果将通过Octet Data Analysis9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。
测量得到的抗PD-L1抗体YN-002和YN-003的结合亲和力结果参见表1-4。
表1 PD-L1抗体与人PD-L1-Fc的结合亲和力
表2 PD-L1抗体与小鼠PD-L1-Fc的结合亲和力
表3 PD-L1抗体与食蟹猴PD-L1-Fc的结合亲和力
表4 PD-L1抗体与犬PD-L1-Fc的结合亲和力
实施例5：PD-L1抗体抑制人PD-L1和人PD-1之间的结合
用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人PD-1-Fc蛋白(北京百普赛斯生物科技有限公司，H5257)，用亚饱和浓度生物素标记的人PD-1-Fc加入1×106/ml的稳定表达人PD-L1的CHO细胞中，随后立即加入五倍比稀释的各抗体，混匀后孵育(4℃，1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R-PE Conjugate(life technology，SA10041)，孵育(4℃，30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。结果如图2所示：YN-002和YN-003均能有效抑制人PD-1与表达人PD-L1的CHO细胞的结合。
实施例6：PD-L1抗体抑制食蟹猴PD-L1和食蟹猴PD-1之间的结合
使用Octet RED384仪器((Pall ForteBio公司)评估抗PD-L1抗体YN-002和YN-003阻断食蟹猴PD-L1-Fc(北京义翘神州生物技术有限公司，90251-C02H)和食蟹猴PD-1-Fc(北京义翘神州生物技术有限公司，90311-C02H)结合的能力。首先，用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,Pierce,21327)标记食蟹猴PD-1-Fc。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用fortebio octet RED384仪器(PALL)分子相互作用分析仪来进行PD-L1抗体抑制食蟹猴PD-L1和食蟹猴PD-1之间的结合动力学分析(抗原、抗体稀释均使用0.1％BSA及0.02％tween20的PBS缓冲液)。使用浓度为100nM经过biotin偶联的重组的人PD-1-Fc与SA传感器固定，1500rpm/min，结合10min；终浓度75nM的食蟹猴PD-L1与三倍比稀释的抗体溶液混合，孵育60分钟后上机结合10min，1500rpm/min。最后进行解离10分钟，1500rpm/min。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall Fortebio公司)进行数据分析。结果如图3所示：YN-002和YN-003均能有效抑制食蟹猴PD-L1-Fc与食蟹猴PD-1-Fc的结合。
实施例7：PD-L1抗体抑制小鼠PD-L1和小鼠PD-1之间的结合
用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记小鼠PD-1-Fc(北京百普赛斯生物科技有限公司，M5259)，用亚饱和浓度生物素标记的小鼠PD-1-Fc加入1×106/ml的稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞中，随后立即加入五倍比稀释的各抗体，混匀后孵育(4℃，1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R-PE Conjugate(life technology，SA10041)，孵育(4℃，30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。结果如图4所示：YN-002和YN-003均能有效抑制小鼠PD-1与表达小鼠PD-L1的CHO细胞的结合。
实施例8:抗PD-L1单克隆抗体在结肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤作用研究
在第0天时，用3×106个MC38小鼠结直肠癌细胞(上海林渊生物科技有限公司)皮下接种6-8周龄C57BL/6雌性小鼠。在第3天时将小鼠平均分为7组，每组8-9只，给每组荷瘤小鼠分别腹腔注射人抗体IgG-Fc蛋白(10mg/kg，每周二次，共两周)，YN-003抗体(10mg/kg，每周二次，共两周)、Atezolizumab(10mg/kg，每周二次，共两周)。定期观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化。实验结果表明：与对照IgG1-Fc相比，YN-003和Atezolizumab均可有效抑制肿瘤生长，其中YN-003的抗肿瘤作用更为显著(图5)。
实施例9：利用噬菌体抗体文库筛选抗CD137抗体
利用CD137蛋白(购自北京义翘神州科技有限公司)为抗原，进行噬菌体天然人源性抗体文库(上海原能细胞医学技术有限公司)分选。用含有20μg/ml(第一、二轮)或10μg/ml(第三、四轮)CD137蛋白的CBS缓冲液在4℃包被酶联免疫管过夜。该管随后用PBS缓冲液洗涤，向其中加入10％的脱脂奶粉封闭免疫管，然后加入1ml封闭过的phage，在室温(20±5℃)孵育1小时。用PBST充分洗涤后，加入800μl pH2.2的Gly-HCl缓冲液洗脱，随后立即加400μl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液中和。然后加入到20ml处于对数生长期的E.coli SS320中，E.coli的OD值约0.8，混匀后在37℃静置1小时。取出500μl菌液进行噬菌体滴度测定及甘油保菌，剩余菌液用来涂平板，在37℃过夜培养。次日，将平板上的菌按比例接入到80ml2YT-Amp培养基中，使菌液OD值等于0.2。培养数小时，当OD值达到0.8时，加入160μl helperphage混匀，在37℃静置1小时。然后加入IPTG、Kan抗生素，在250rpm，30℃振荡过夜培养。随后收集上清，用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，重悬于1.5ml的PBS缓冲液中进行富集筛选。
用含有1μg/ml人CD137蛋白在4℃包被96孔ELISA板过夜。该板随后用10％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，充分洗涤后，取单克隆的噬菌体上清加入96孔板，在37℃孵育2小时。充分洗涤后，每孔加入HRP标记的抗M13抗体(27-9421-01，购自GE healtcare)，在37℃反应45分钟。充分洗涤后，每孔加入TMB显色，在室温(20±5℃)反应5-10分钟后，每孔加入硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处测定各孔OD值。
通过ELISA鉴定获得了一株能特异性结合人CD137的噬菌体抗体克隆1A6，测序后获得VH和VL基因序列。测序结果显示，编码噬菌体抗体1A6的VH的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，噬菌体抗体1A6的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；编码噬菌体抗体1A6的VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，噬菌体抗体1A6的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
实施例10抗CD137全人源完整抗体的表达和纯化
设计引物对噬菌体抗体1A6的VH进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双酶切的pCMV-IgG2载体；设计引物对噬菌体抗体1A6的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-λ载体。测序正确后将重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，并通过ProteinA柱纯化，将1A6的完整IgG2,λ抗体，将此抗CD137全人源完整抗体命名为YN-005。
测序结果显示，抗体YN-005VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，编码抗体YN-005VH的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；且抗体YN-005VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，编码抗体YN-005VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。抗体YN-005重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，编码抗体YN-005重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；抗体YN-005轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，编码抗体YN-005轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO:24所示。
实施例11：抗CD137全人源抗体YN-005的种系形式(germlined version)
对比抗体YN-005重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列，证实抗体YN-005重链利用来自人种系IGHV3-23*04的VH节段、来自人种系IGHD7-27*01的D节段及来自人种系IGHJ3*02的JH节段。
对比YN-005轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列，证实抗体YN-005轻链利用来自人种系IGLV1-44*01的VL节段，来自人种系IGLJ1*01的JL节段。
使用Kabat系统分析抗体YN-005的CDR区序列(参见图6)，测序结果显示抗体YN-005的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79。抗体YN-005的LCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82所示。
为了使抗体YN-005的免疫原性最小化，可将一些氨基酸残基突变回种系序列。抗体YN-006是抗体YN-005的一种种系形式(germlined version)，是通过将YN-005重链可变区的FR1区中的1个氨基酸突变回种系序列(参见图6)。抗CD137全人源抗体YN-006的重链表达载体在上述构建的YN-005的重链表达质粒的基础上利用突变试剂盒(天根点突变试剂盒，KM101)定点突变获得。
测序显示，抗体YN-006VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，编码YN-006VH的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。抗体YN-006VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，编码抗体YN-006VL的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。抗体YN-006重链的氨基酸序列如SEQ IDNO:27所示；编码抗体YN-006重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；且抗体YN-006轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，编码YN-006轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
YN-006抗体的表达、纯化参照实施例9中YN-005抗体的表达、纯化的具体步骤。
实施例12：测定抗CD137抗体的结合亲和力
使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)测量抗体YN-005和YN-006针对重组的人CD137-His蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司)的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自PallForteBio公司)，使用含有0.1％ BSA和0.02％ Tween20的PBS缓冲液，进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定，以1500rpm结合5分钟；然后再与对倍稀释的重组人CD137-His蛋白抗原溶液(100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56nM)以1500rpm结合5分钟，最后以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复使用。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。测量得到的CD137抗体YN-005和YN-006的结合亲和力结果参见表5。
表5 CD137抗体与人CD137-His的亲和力
实施例13:CD137单克隆抗体在结肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤作用研究
在第0天时，用1.5×106个MC38小鼠结直肠癌细胞(上海林渊生物科技有限公司)皮下接种6-8周龄的转入人CD137基因的C57BL/6雌性小鼠(B-hTNFRSF9(4-1BB)mice，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)。在第3天时将小鼠平均分为3组，每组7只，给每组荷瘤小鼠分别腹腔注射人抗体IgG-Fc蛋白(3mg/kg，每周二次，共两周)，CD137抗体YN-006抗体(3mg/kg，每周二次，共两周)、CD137抗体Utomilumab(3mg/kg，每周二次，共两周)。定期观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化。实验结果表明：与对照IgG1-Fc相比，YN-006和Utomilumab均可有效抑制肿瘤生长，值得注意的是，YN-006的抗肿瘤作用显著强于Utomilumab(如图7所示)。
实施例14：构建抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007
利用抗PD-L1抗体YN-003的重链基因和抗人CD137抗体YN-006的重、轻链基因通过Overlap PCR、定点突变等分子克隆方法构建抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007的第一多肽基因，并将其通过重组克隆至经AgeI和BamHI双酶切的pCMV-IgG1AEM载体，构建成YN-007的第一多肽表达载体。
YN-007的第二多肽基因与YN-003的轻链基因相同。YN-007的第二多肽表达载体为上述构建的YN-003的轻链表达载体。
测序结果正确后将第一多肽、第二多肽表达载体共转染至293F细胞进行瞬时表达，并通过ProteinA柱纯化获得抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007。
编码抗体YN-007的第一多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示，抗体YN-007的第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；且编码抗体YN-007第二多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，抗体YN-007第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
实施例15：测定抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007的结合亲和力
使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)测量抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007分别针对重组的人PD-L1-Fc蛋白和重组的小鼠PD-L1-Fc的结合亲和力。用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin,Pierce,21327)标记重组的人PD-L1-Fc和重组的小鼠PD-L1-Fc。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪(OctetRED384，购自Pall ForteBio公司)，使用含有0.1％ BSA和0.02％ Tween20的PBS缓冲液，进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM经过biotin偶联的抗原蛋白与SA传感器(Pall ForteBio公司)固定，以1500rpm结合10分钟；然后再与对倍稀释的YN-007抗体溶液以1500rpm结合10分钟，最后以1500rpm解离10分钟。得到的结果将通过Octet DataAnalysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。
测量得到的YN-007与人PD-L1-Fc的结合亲和力结果参见表6。
测量得到的YN-007与小鼠PD-L1-Fc的结合亲和力结果参见表7。
表6.抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007与人PD-L1-Fc的结合亲和力
表7.抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007与小鼠PD-L1-Fc的结合亲和力
使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)测量抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007针对重组的人CD137-His蛋白的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)，使用含有0.1％ BSA和0.02％ Tween20的PBS缓冲液，进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定，以1500rpm结合5分钟；然后再与对倍稀释的重组人CD137-His蛋白抗原溶液(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56nM)以1500rpm结合5分钟，最后以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复使用。得到的结果将通过OctetData Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，计算出抗原与抗体的结合强度，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。
测量得到的抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007对人CD137的结合亲和力结果参见表8。
表8抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007与人CD137-His的结合亲和力
实施例16：PD-L1抗体YN-003的亲和力成熟
设计引物利用重叠PCR构建PD-L1抗体YN-003的单链抗体(ScFv)基因，并将其克隆到pDF噬菌粒载体，记作pDF-YN-003ScFv。以pDF-YN-003ScFv为模板设计简并引物利用重叠PCR对抗体YN-003的六个CDR区(包括CDR区中部分氨基酸残基及与CDR区临近的FR区中个别氨基酸残基)分别进行随机化(如图8所示)。
将重叠PCR获得的CDR区随机化后的scFv基因片段用BssHII和NheI双酶切后，与经BssHII和NheI双酶切的pDF噬菌粒载体连接，将1μg连接产物电穿孔转入TG1电转感受态细胞中，倍比稀释后凃2YT+AG平板，次日将菌苔从平板上刮下，扩大至300ml 2YT+Amp培养基，37℃培养至OD 0.8左右，加入helper phage混匀后静置1小时，加入终浓度为1mM IPTG，50μg/ml的卡纳，30℃振摇过夜。次日离心收上清，0.45滤膜过滤除菌，加入1/5体积的PEG-NaCl沉淀phage，离心取沉淀，1/10体积的PBS重悬沉淀，测OD260计算噬菌体pfu，4℃保存，该噬菌体抗体库可直接用于后期淘选。
利用人PD-L1-His蛋白(上海原能细胞医学技术有限公司)为抗原用于以上噬菌体抗体库分选。酶联免疫管中使用CBS缓冲液包被抗原PD-L1 1ml，PD-L1浓度为100nM(第一、二轮)或5nM(第三轮)，4℃过夜；次日用含10％的脱脂奶粉的PBS缓冲液2ml封闭免疫管；将1ml的封闭过的phage加入到免疫管中，室温孵育1h；PBST洗涤20次(第一轮)、50次(第二轮)或100次(第三轮)；加入pH2.2的Gly-HCl缓冲液800μl洗脱，立即加400μl的pH8.0的Tris-HCl缓冲液中和；加入到20ml对数生长期OD约0.8的E.coli TG1中，混匀37℃静置1h；取出500μl用来测定噬菌体滴度及甘油保菌；剩余菌液涂平板，培养箱中37℃过夜培养；第二天刮下平板的菌，按一定比例接入80ml的2YT-Amp培养基中，使OD等于0.2，培养数小时以OD达到0.8时，加入160μl的helper phage，然后混匀37℃静置1h；加入IPTG、Kan抗生素，250rpm，30℃，振荡培养过夜；收集上清，用PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，重悬于1.5ml的PBS缓冲液中；重悬的噬菌体用于下一轮的富集筛选，3轮淘选之后，观察到显著的富集。利用ELISA对淘选得到的噬菌体抗体克隆进行鉴定：在96孔ELISA板上包被人PD-L1-His蛋白，浓度1μg/ml，4℃过夜。然后用10％脱脂奶粉封闭非特异性结合位点，充分洗涤后，取单克隆的噬菌体上清加入96孔板，37℃孵育2小时。充分洗涤后，加入HRP标记的抗M13抗体(GE healtcare，27-9421-01)，37℃作用45min，充分洗涤后加入TMB显色，室温下作用5-10min后，最后用硫酸终止反应，于450nm处测定各孔OD值，选择OD450值高的噬菌体抗体克隆进行测序。获得各噬菌体抗体克隆的重、轻链可变区基因序列后，将各噬菌体抗体重新设计成全长IgG1，λ抗体：设计引物对各噬菌体抗体克隆的VH进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和SalI双酶切的pCMV-IgG1NDL抗体重链表达载体；设计引物对各噬菌体抗体克隆的的VL进行PCR扩增，将PCR产物通过重组克隆至经AgeI和BsiWI双酶切的pCMV-λ抗体轻链表达载体。测序正确后分别将各抗体的重、轻链表达载体共转染293F细胞进行瞬时表达，用无血清培养基培养7天后收集细胞培养上清通过ProteinA柱纯化获得抗体蛋白，将纯化抗体用PBS进行透析，最后用BCA Protein Assay Kit定量(Pierce，23225)。使用分子相互作用分析仪(OctetRED384，购自Pall ForteBio公司)测量以上全长抗体针对重组的人PD-L1-His蛋白(上海原能医学技术有限公司)的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)，使用含有0.1％ BSA和0.02％ Tween20的PBS缓冲液，进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定，以1500rpm结合5分钟；然后再与对倍稀释的抗原溶液(50，25，12.5，6.25，3.125，1.56nM),7个浓度梯度，以1500rpm结合5分钟。最后在以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复使用。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。筛选获得的亲和力提高的各突变体克隆后，将不同CDR区中亲和力提高的氨基酸突变点利用Overlapping PCR等方法进行组合，然后再按照以上方法表达、纯化抗体蛋白并测定亲和力。经过多轮筛选和组合，将亲和力最高的5个YN-003抗体突变体克隆分别命名为YN-035抗体、YN-036抗体、YN-037抗体、YN-038抗体、YN-039抗体。这5个抗体通过以上方法测定获得的亲和力数值参见表9。结果显示YN-035抗体、YN-036抗体、YN-037抗体、YN-038抗体、YN-039抗体的亲和力均高于抗PD-L1抗体Atezolizumab和Avelumab。
表9 PD-L1抗体与人PD-L1-His的结合亲和力
YN-035抗体重链可变区(YN-035VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，YN-035抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，YN-035抗体轻链可变区(YN-035VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，YN-035抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
YN-036抗体重链可变区(YN-036VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，YN-036抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，YN-036抗体轻链可变区(YN-036VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，YN-036抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
YN-037抗体重链可变区(YN-037VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，YN-037抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，YN-037抗体轻链可变区(YN-037VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，YN-037抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
YN-038抗体重链可变区(YN-038VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，YN-038抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，YN-038抗体轻链可变区(YN-038VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，YN-038抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示。
YN-039抗体重链可变区(YN-039VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，YN-039抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，YN-039抗体轻链可变区(YN-039VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，YN-039抗体轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
图9显示了抗体YN003、YN035～YN039的重链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比，其中下划线处为根据Kabat定义法确定的CDR。图10显示了抗体YN003、YN035～YN039的轻链可变区与相关种系序列的氨基酸序列对比，其中下划线处为根据Kabat定义法确定的CDR。其中，抗体YN003的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，YN035～YN039的HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示；抗体YN003的HCDR2的氨基酸序列和抗体YN035～YN039的HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示；YN-003的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示；YN-035的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示；抗体YN036～YN039的HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。
抗体YN003的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示，抗体YN035和抗体YN036的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示，抗体YN037的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示，抗体YN038的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示，抗体YN039的LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示；抗体YN003、抗体YN035～YN036的LCDR2的氨基酸序列如SEQID NO:60所示；抗体YN037～YN039的LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示；抗体YN003的LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示；抗体YN035～YN039的LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示。
用流式细胞术检测PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039与人PD-L1的结合活性：1×106/ml稳定表达人PD-L1的CHO细胞中分别加入两倍比稀释的各PD-L1抗体，混匀后于4℃孵育1小时，洗细胞后加入Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(DyLight650)(ab98593，Abcam)，于4℃孵育30分钟，洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQueScreener)检测荧光强度。试验结果如图11所示：YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039均能有效结合表达人PD-L1的CHO细胞。
用流式细胞术检测PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039对人PD-L1/人PD-1结合的抑制能力：用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人PD-1-Fc蛋白(上海原能医学技术有限公司)，用亚饱和浓度生物素标记的人PD-1-Fc加入1×106/ml的稳定表达人PD-L1的CHO细胞中，随后立即加入两倍比稀释的各抗体，混匀后孵育(4℃，1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R-PE Conjugate(life technology，SA10041)，孵育(4℃，30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。实验结果如图12所示：PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039均能有效抑制人PD-1与表达人PD-L1的CHO细胞的结合。
用流式细胞术检测PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039与小鼠PD-L1的结合活性：1×106/ml稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞中分别加入两倍比稀释的各PD-L1抗体，混匀后于4℃孵育1小时，洗细胞后加入Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(DyLight650)(ab98593)，于4℃孵育30分钟，洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图13所示：YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039均能有效结合表达小鼠PD-L1的CHO细胞。
用流式细胞术检测PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039对小鼠PD-L1/小鼠PD-1结合的抑制能力：用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记小鼠PD-1-Fc(上海原能医学技术有限公司)，用亚饱和浓度生物素标记的小鼠PD-1-Fc加入1×106/ml的稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞中，随后立即加入两倍比稀释的各抗体，混匀后孵育(4℃，1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R-PE Conjugate(life technology，SA10041)，孵育(4℃，30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。结果如图14所示：PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-037、YN-038、YN-039均能有效抑制小鼠PD-1与稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞的结合。
实施例17：构建和鉴定抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051和YN-052
利用抗PD-L1抗体YN-035的重链基因和抗人CD137抗体YN-006的重、轻链基因通过Overlap PCR、定点突变等分子克隆方法构建抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051的第一多肽基因，并将其通过重组克隆至经AgeI和BamHI双酶切的pCMV-IgG1AEM载体，构建成YN-051的第一多肽表达载体。YN-051的第二多肽基因与YN-035的轻链基因相同。YN-035的第二多肽表达载体为YN-035的轻链表达载体。
测序结果正确后将抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051的第一多肽、第二多肽表达载体共转染至293F细胞进行瞬时表达，用无血清培养基培养7天后收集细胞培养上清通过ProteinA柱纯化获得抗体蛋白，将纯化抗体用PBS进行透析，最后用BCA Protein AssayKit定量(Pierce，23225)。
YN-051的第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，YN-051第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
利用抗PD-L1抗体YN-036的重链基因和抗人CD137抗体YN-006的重、轻链基因通过Overlap PCR、定点突变等分子克隆方法构建抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-052的第一多肽基因，并将其通过重组克隆至经AgeI和BamHI双酶切的pCMV-IgG1AEM载体，构建成YN-052的第一多肽表达载体。YN-052的第二多肽基因与YN-036的轻链基因相同。YN-052的第二多肽表达载体为YN-036的轻链表达载体。
测序结果正确后将抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-052的第一多肽、第二多肽表达载体共转染至293F细胞进行瞬时表达，用无血清培养基培养7天后收集细胞培养上清通过ProteinA柱纯化获得抗体蛋白，将纯化抗体用PBS进行透析，最后用BCA Protein AssayKit定量(Pierce，23225)。
YN-052的第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，YN-052第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)测量抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051和YN-051针对重组的人PD-L1-His蛋白(上海原能医学技术有限公司)的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪(OctetRED384，购自Pall ForteBio公司)，使用含有0.1％ BSA和0.02％ Tween20的PBS缓冲液，进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定，以1500rpm结合5分钟；然后再与对倍稀释的抗原溶液(50，25，12.5，6.25，3.125，1.56nM),7个浓度梯度，以1500rpm结合5分钟。最后在以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复使用。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。测量得到的YN-007与人PD-L1-Fc的结合亲和力结果参见表10。
表10.抗PD-L1/CD137双特异抗体与人PD-L1-His的结合亲和力
使用分子相互作用分析仪(Octet RED384，购自Pall ForteBio公司)测量抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051和YN-052针对重组的人CD137-His蛋白(上海原能医学技术有限公司)的结合亲和力。通过生物膜干涉(BLI)技术，使用分子相互作用分析仪(OctetRED384，购自Pall ForteBio公司)，使用含有0.1％ BSA和0.02％ Tween20的PBS缓冲液，进行抗原抗体结合动力学分析。使用浓度为50nM的抗体与AHC传感器固定，以1500rpm结合5分钟；然后再与对倍稀释的重组人CD137-His蛋白抗原溶液(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56nM)以1500rpm结合5分钟，最后以1500rpm解离10分钟。AHC传感器通过甘氨酸脉冲再生后重复使用。得到的结果将通过Octet Data Analysis 9.0软件(Pall ForteBio公司)进行数据分析，得到KD值，Kon(1/Ms)值和Koff(1/s)值。
测量得到的抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051和YN-052对人CD137的结合亲和力结果参见表11。
表11抗PD-L1/CD137双特异抗体与人CD137-His的结合亲和力
人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(上海中科院细胞库)高表达人PD-L1分子。用流式细胞术检测PD-1抗体YN-035、YN-036及抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051和YN-052与MDA-MB-231细胞的结合：1×106/ml的MDA-MB-231细胞中分别加入两倍比稀释的各抗体，混匀后于4℃孵育1小时，洗细胞后加入Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(DyLight 650)(ab98593，abcam)，于4℃孵育30分钟，洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图15所示：YN-035、YN-036、YN-051和YN-052均能有效结合MDA-MB-231细胞。
用流式细胞术检测PD-1抗体YN-035、YN-036及抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051和YN-052与人PD-L1的结合活性：1×106/ml稳定表达人PD-L1的CHO细胞中分别加入两倍比稀释的各抗体，混匀后于4℃孵育1小时，洗细胞后加入Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(DyLight 650)(ab98593，abcam)，于4℃孵育30分钟，洗细胞后用流式细胞仪(IntellicytiQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图16所示：YN-035、YN-036、YN-051、YN-052、YN007均能有效结合表达人PD-L1的CHO细胞。
用流式细胞术检测PD-1抗体YN-035、YN-036及抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051、YN-052、YN007对人PD-L1/人PD-1结合的抑制能力：用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记人PD-1-Fc蛋白，用亚饱和浓度生物素标记的人PD-1-Fc加入1×106/ml的稳定表达人PD-L1的CHO细胞中，随后立即加入两倍比稀释的各抗体，混匀后孵育(4℃，1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R-PE Conjugate(life technology，SA10041)，孵育(4℃，30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。实验结果如图17所示：PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-051、YN-052、YN007均能有效抑制人PD-1与表达人PD-L1的CHO细胞的结合。
用流式细胞术检测PD-1抗体YN-035、YN-036及抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007、YN-051和YN-052与小鼠PD-L1的结合活性：1×106/ml稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞中分别加入两倍比稀释的各抗体，混匀后于4℃孵育1小时，洗细胞后加入Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(DyLight 650)(ab98593，abcam)，于4℃孵育30分钟，洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图18所示：YN-035、YN-036、YN-051、YN-052、YN007均能有效结合表达小鼠PD-L1的CHO细胞。
用流式细胞术检测PD-1抗体YN-035、YN-036及抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007、YN-051和YN-052对小鼠PD-L1/小鼠PD-1结合的抑制能力：用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，21327)标记小鼠PD-1-Fc，用亚饱和浓度生物素标记的小鼠PD-1-Fc加入1×106/ml的稳定表达小鼠PD-L1的CHO细胞中，随后立即加入两倍比稀释的各抗体，混匀后孵育(4℃，1小时)。洗细胞后加入Streptavidin R-PE Conjugate(life technology，SA10041)，孵育(4℃，30分钟)。洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。结果如图19所示：PD-L1抗体YN-035、YN-036、YN-051、YN-052、YN007均能有效抑制小鼠PD-1与表达小鼠PD-L1的CHO细胞的结合。
用流式细胞术检测CD137抗体YN-006及抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-007、YN-051和YN-052与人CD137的结合活性：1×106/ml的稳定表达人CD137的293T细胞中分别加入两倍比稀释的各抗体，混匀后于4℃孵育1小时，洗细胞后加入Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(DyLight 650)(ab98593，abcam)，于4℃孵育30分钟，洗细胞后用流式细胞仪(Intellicyt iQue Screener)检测荧光强度。试验结果如图20所示：YN-006、YN-007、YN-051和YN-052均能有效结合表达人CD137的293T细胞。
实施例18：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
上述纯化后的抗体YN-003、YN-006、YN-007、YN-035、YN-036、YN-051、YN-052分别在还原和非还原条件下用SDS-PAGE检测其分子量大小，结果如图21所示：在非还原条件下(如图21a所示)，单克隆抗体YN-003、YN006、YN-035、YN-036均呈现为分子量大小约150kDa的一条条带，而双特异抗体YN-007、YN-051、YN-052均呈现为分子量大小约为200kDa的一条条带；在还原条件下(如图21b所示)，单克隆抗体YN-003、YN006、YN-035、YN-036均呈现为分子量大小约55kDa和25kDa的两条条带，而双特异抗体YN-007、YN-051、YN-052均呈现为分子量大小约为75kDa和25kDa的两条条带。
实施例19：抗PD-L1/CD137双特异抗体的激动剂活性(萤光素酶活性测定)
制备表达人CD137以及稳定整合的NFκB萤光素酶报道基因的293T细胞。收获细胞，洗涤及重悬浮于无酚红完全培养基(含有10％胎牛血清，HEPES缓冲液，非必需氨基酸及L-谷氨酰胺的DMEM培养基)，密度为6×105个细胞/mL。96孔平板(购自PerkinElmer)铺板，每孔加入50μl细胞悬液。以2.5:1的比率加入交联抗体(山羊抗人IgG Fc)，随后分别加入YN-006(10μg/ml)、YN-035(10μg/ml)、YN-035+YN-006(10μg/ml+10μg/ml)、YN-051(10μg/ml)、YN-003+YN006(10μg/ml+10μg/ml)、YN-007(10μg/ml)、及对照抗体IgG Fc(10μg/ml)，在37℃孵育5小时。然后加入75μL的Bright-Glo Luciferase试剂(购自Promega)，使用酶标仪(购自Tecan)测量萤光素酶活性。比较各抗体处理细胞组与未经抗体处理组的细胞荧光值之比(参见图22)。结果表明，与对照IgG Fc相比，YN-006、YN035+YN006、YN003+YN006、YN-007、YN-051均具有明显的激动活性，而抗PD-L1抗体YN-035则无激动活性(参见图22)。
实施例20:抗PD-L1/CD137双特异抗体在结肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤作用研究
在第0天时，用3×106个小鼠结直肠癌细胞MC38(上海林渊生物科技有限公司)皮下接种6-8周龄的转入人4-1BB基因的C57BL/6雌性小鼠(B-hTNFRSF9(4-1BB)mice，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)。在第6天时将小鼠平均分为8组，每组荷瘤小鼠分别腹腔注射PBS(每周二次，共两周)、对照抗体人IgG-Fc蛋白(7.5mg/kg，每周二次，共两周)、CD137抗体YN-006抗体(3mg/kg，每周二次，共两周)、PD-L1抗体YN-035(7.5mg/kg，每周二次，共两周)、CD137抗体YN-006抗体(3mg/kg，每周二次，共两周)+PD-L1抗体YN-035(7.5mg/kg，每周二次，共两周)、抗PD-L1/CD137双特异抗体YN-051(7.5mg/kg，每周二次，共两周)、抗PD-L1抗体Atezolizumab(7.5mg/kg，每周二次，共两周)、抗PD-L1抗体Avelumab(7.5mg/kg，每周二次，共两周)。除了PBS组5只小鼠，其余7组每组6只。定期观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化。实验结果如图23和表12所示。图23显示与PBS组或对照抗体人IgG-Fc组相比，YN006、YN035、YN006+YN035、YN051、Atezolizumab、Avelumab均具有显著抑瘤活性。其中，YN006+YN035及YN051的抗肿瘤活性明显强于YN006、YN035、Atezolizumab、Avelumab。表12显示本动物实验结束时，YN051组有5只小鼠肿瘤完全消退，而YN006+YN035组只有1只小鼠肿瘤完全消退，表明YN051的治疗效果优于YN006+YN035。
表12.各治疗组肿瘤完全消退小鼠数量
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
Claims (14)
1.抗体、其抗原结合片段或变体，其能够与CD137蛋白相结合，所述抗体包含抗体轻链或其片段，所述轻链或其片段包含LCDR1-3，且所述LCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ IDNO:80-82所示。
2.根据权利要求1所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含轻链可变区VL，且所述轻链可变区VL包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:20。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体轻链或其片段包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:23。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体包含抗体重链或其片段，所述重链或其片段包含HCDR1-3，所述HCDR1-3的氨基酸序列依次如SEQ IDNO:77-79所示。
5.根据权利要求4所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含重链可变区VH，且所述重链可变区VH包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:25。
6.根据权利要求4-5中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，所述抗体重链或其片段包含选自以下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:27。
7.抗体、其抗原结合片段或变体，其能够以3×10-9M或更低的KD值与PD-L1蛋白相结合。
8.双特异性抗体，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体或权利要求7所述的抗体、其抗原结合片段或变体。
9.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，权利要求7所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或权利要求8所述的双特异性抗体。
10.载体，其包含根据权利要求9所述的核酸分子。
11.细胞，其包含根据权利要求9所述的核酸分子或根据权利要求10所述的载体。
12.制备权利要求1-6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，权利要求7所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或权利要求8所述的双特异性抗体的方法，所述方法包括在使得权利要求1-6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，权利要求7所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或权利要求8所述的双特异性抗体表达的条件下，培养根据权利要求11所述的细胞。
13.药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，权利要求7所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或权利要求8所述的双特异性抗体，权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的载体和/或权利要求11所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
14.权利要求1-6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或变体，权利要求7所述的抗体、其抗原结合片段或变体，或权利要求8所述的双特异性抗体，权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的细胞和/或权利要求13所述的药物组合物在制备缓解或治疗肿瘤的药物中的应用。
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